ag：FAM-TCCCCCTCAAAGTTGCGGATGG-TRAMA 熒光探針通過(guò)TAKARA公司的引物標(biāo)記服務(wù)，在熒光探針的5'端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)FAM，3'端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)TAMRA，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為136bp。
[0032]TaqMan熒光探針?lè)≒CR反應(yīng)體系和程序同實(shí)施例1，檢測(cè)的6種不同鯉魚(yú)組織 樣品的擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖4和圖5,其中圖4為采用本發(fā)明的N基因TaqMan熒光探針實(shí)時(shí)定 量PCR檢測(cè)鯉魚(yú)組織樣品的擴(kuò)增曲線圖譜；圖5為采用鯉春病毒血癥檢疫技術(shù)規(guī)范SN/T 1152-2011中的針對(duì)G基因的引物和熒光探針實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)鯉魚(yú)組織樣品的擴(kuò)增曲線 圖譜。
[0033] 為了計(jì)算組織樣品中病毒拷貝數(shù)，從而制作了標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0034] 上述的用于制備含有目的擴(kuò)增片段的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品以繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線： 利用PrimerExpress3. 0軟件，設(shè)計(jì)N基因的陽(yáng)性質(zhì)粒，PCR引物序列為： SVCV-NF：ATCATGAGTGTCATTCGGATC； SVCV-NR:CTTACCCATAGGITTGmTATCC。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為 1261bp。
[0035] 通過(guò)常規(guī)PCR擴(kuò)增鯉春病毒血癥病毒SVCV-265株N基因片段，連接T載體后，構(gòu) 建含有目的片段的質(zhì)粒，命名為PMD/SVCV-N。用分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒濃度為173. 4ng/y 1， PMD18-T載體長(zhǎng)度為2692bp，插入片段長(zhǎng)度為1261bp，每對(duì)堿基的平均分子量為660g/mol， 根據(jù)阿伏加德羅常量，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為4X 101°拷貝/y1。將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍依次 稀釋?zhuān)謩e得到濃度4X 109、4X 10S、4X 107、4X 106、4X 105、4X 104、4X 103、4X 102、4X IO1 拷貝/y I的標(biāo)準(zhǔn)品。選取4X IO7到40范圍標(biāo)準(zhǔn)品為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)， 每個(gè)濃度做三個(gè)平行樣，通過(guò)定量PCR儀器自動(dòng)繪制出熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0036] 7500Fast熒光定量PCR儀會(huì)在反應(yīng)過(guò)程中自動(dòng)收集熒光，反應(yīng)結(jié)束后，利用儀 器自帶軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，擴(kuò)增曲線圖譜結(jié)果見(jiàn)圖6。反應(yīng)體系中標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為 4X107-40個(gè)拷貝，結(jié)果表明，7個(gè)數(shù)量級(jí)的范圍內(nèi)擴(kuò)增曲線都為平滑的"S"型，表明本實(shí)時(shí) 定量PCR檢測(cè)范圍廣，檢測(cè)下限為40個(gè)拷貝。儀器自動(dòng)繪制熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖7,其中 模板濃度與Ct值的線性關(guān)系為：y=-3. 397x+44. 2,相關(guān)系數(shù)R2=O.999,呈現(xiàn)良好的線性關(guān) 系。
[0037] 結(jié)果表明，人工感染鯉魚(yú)樣品的各組織都含有鯉春病毒血癥病毒，其中采用本發(fā) 明的N基因TaqMan熒光探針實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)各組織樣品相對(duì)于采用G基因TaqMan熒光 探針?biāo)柩h(huán)數(shù)更少，基因拷貝數(shù)更高(見(jiàn)表1)。表明本發(fā)明的特異性引物和探針比目前廣 泛使用的鯉春病毒血癥檢疫技術(shù)規(guī)范SN/T1152-2011中的針對(duì)G基因的熒光探針和引物 更加靈敏。
[0038] 表1鯉魚(yú)各組織鯉春病毒血癥病毒熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果
實(shí)施例4、 分析鯉春病毒血癥病毒SYBRGREENI實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的特異性。
[0039] 采用本發(fā)明的特異性引物，利用SYBRGREENI實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法檢測(cè)鯉 春病毒血癥病毒和其他水生病毒：傳染性脾腎壞死病毒（ISKNV)，錦鯉皰疹病毒（KHV)，草 魚(yú)呼腸孤病毒（GCRV)，對(duì)蝦白斑綜合征病毒（WSSV)和傳染性皮下及造血器官壞死病毒 (IHHNV)0
[0040] 檢測(cè)過(guò)程同實(shí)施例2,只是將待測(cè)樣品的CDNA換成傳染性脾腎壞死病毒（ISKNV)， 錦鯉皰疹病毒（KHV)，草魚(yú)呼腸孤病毒（GCRV)，對(duì)蝦白斑綜合征病毒（WSSV)和傳染性皮下 及造血器官壞死病毒（IHHNV)的cDNA或DNA。
[0041]SYBRGREENI實(shí)時(shí)熒光PCR的熔解曲線見(jiàn)圖8,其中鯉春病毒血癥病毒擴(kuò)增產(chǎn)物 的Tm值為78. 64°C，其他5種病毒的Tm值均不在78. 5-79. 4°C的Tm值范圍，且熔解曲 線的熒光信號(hào)值遠(yuǎn)低于陽(yáng)性對(duì)照，因此表明采用本發(fā)明的特異性引物，利用SYBRGREENI 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)鯉春病毒血癥病毒不會(huì)與其他水生病毒發(fā)生交叉反應(yīng)。
[0042] 結(jié)果判定依據(jù)為：若采用SYBRGREENI熒光染料，當(dāng)待測(cè)樣品的熒光信號(hào)大于閾 值且Ct值彡37. 0,并有"S"型擴(kuò)增曲線，同時(shí)Tm值介于78. 5°C-79. 4°C之間時(shí)，判定待 測(cè)樣品中含有鯉春病毒血癥病毒。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種鯉春病毒血癥病毒的熒光定量PCR檢測(cè)方法，其特征在于以針對(duì)病毒N 基因設(shè)計(jì)的特異性N-TFl和N-TRl作為正向引物和反向引物，以N-tagl作為熒光 探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，其中，N-TFl: ATCAGGCCGATTATCCTTCCA ;N-TR1: AGATAAGCATTCACATGCTGTAT ；N-tagl-.5'-FAM-TCTCCACCAGTCCCATATAGAC ATATTGCCT-TAMRA-3'。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鯉春病毒血癥病毒的熒光定量PCR檢測(cè)方法，其特征 在于采用TaqMan熒光探針?lè)ǘ縋CR反應(yīng)體系由以下組分組成：10 ??L 2 X SYBR Premix Ex Taq，10 ymol/L 正向引物、反向引物各 0.4 ??L;0.4 yl ROX reference dye II， 100ng/??L待測(cè)樣品的cDNA 1-2 ??L，補(bǔ)充雙蒸水至20 ??L。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鯉春病毒血癥病毒的熒光定量PCR檢測(cè)方法，其特征在 于采用SYBR GREEN I熒光染料法定量PCR反應(yīng)體系由以下組分組成：10 ??L 2 X Probe qPCR Premix Ex Taq，10 ymol/L 正向引物、反向引物各 0.4 ??L，0.8 ??L 10 ymol/L 熒 光探針，0.4 yl ROX reference dye II，100ng/??L 待測(cè)樣品的cDNA 1-2 ??L，補(bǔ)充雙蒸 水至20 ??L。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鯉春病毒血癥病毒的熒光定量PCR檢測(cè)方法，其特征在 于TaqMan熒光定量PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4° C 30 s ;之后94。C 3 s、60° C 30 s進(jìn)行40 到45個(gè)循環(huán)；SYBR GREEN I熒光染料法PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5° C 30 s ;之后95° C 5 s、 60° C 30 s、72° C 30 s進(jìn)行40到45個(gè)循環(huán)，結(jié)束后，儀器會(huì)進(jìn)行熔解曲線分析并計(jì)算待 測(cè)樣品Tm值。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鯉春病毒血癥病毒的熒光定量PCR檢測(cè)方法，其特征在 于結(jié)果判定依據(jù)為：若采用SYBR GREEN I熒光染料，當(dāng)待測(cè)樣品的熒光信號(hào)大于閾值且Ct 值彡37. 0,并有"S"型擴(kuò)增曲線，同時(shí)Tm值介于78. 5° C-79. 4° C之間時(shí)，判定待測(cè)樣品 中含有鯉春病毒血癥病毒；若采用熒光探針，若待測(cè)樣品熒光信號(hào)超過(guò)閾值且Ct < 37.0， 同時(shí)擴(kuò)增曲線為平滑的"S"型，則可以判定待測(cè)樣品中含有鯉春病毒血癥病毒。
【專(zhuān)利摘要】一種鯉春病毒血癥病毒的熒光定量PCR檢測(cè)方法，屬于水生病毒檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了檢測(cè)鯉春病毒血癥病毒的特異引物探針組，由針對(duì)鯉春病毒血癥病毒的特異引物對(duì)以及熒光探針組成。采用本發(fā)明提供的引物對(duì)鑒定鯉春病毒血癥病毒具有良好的靈敏性和特異性。本發(fā)明能檢測(cè)鯉春病毒血癥病毒感染的病魚(yú)組織，也能檢測(cè)無(wú)癥狀的鯉春病毒血癥病毒攜帶魚(yú)和鯉春病毒血癥病毒感染的細(xì)胞，在對(duì)進(jìn)出境水生動(dòng)物進(jìn)行快速檢測(cè)和疫病監(jiān)控中具有極大的應(yīng)用前景。
【IPC分類(lèi)】C12Q1/68, C12Q1/70, C12R1/93
【公開(kāi)號(hào)】CN105002298
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510264774
【發(fā)明人】邵玲, 肖雨
【申請(qǐng)人】上海市水產(chǎn)研究所
【公開(kāi)日】2015年10月28日
【申請(qǐng)日】2015年5月21日