專利名稱：重組羧肽酶g2表達(dá)載體及制備重組羧肽酶g2的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及新的表達(dá)羧肽酶G2的重組表達(dá)載體，及其大腸桿菌表達(dá)宿主。本發(fā)明還涉及利用該大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)制備重組羧肽酶G2的方法。
背景技術(shù)：
羧肽酶G2(Carboxypeptidase G2,簡稱CPG2)是羧肽酶G家族成員之一，最初是從假單胞菌屬菌株RS-16中分離得到的一種細(xì)菌酶(1^^& Goldman 1967)。羧肽酶G家族酶可水解葉酸C端谷氨酸殘基、葉酸的聚谷氨酰衍生物、葉酸類似物，例如氨甲喋呤(MTX)、以及葉酸的亞片段如對氨基苯甲酰谷氨酸(Chabneret al. 1972; Goldman 1975; Kalghatgl & Bertino 1981)。 CPG2在物理特性與動力學(xué)特征上與羧肽酶G家族另一成員羧肽酶G1(CPG1)類似，但對MTX的親和力要高于CPG1。
合成的葉酸類似物MTX自1948年已用于臨床(Bleyer 1978)，是用于治療腫瘤的多種化療藥物的重要成分。MTX及其活性代謝產(chǎn)物的細(xì)胞毒性效應(yīng)均是通過抑制二氫葉酸還原酶(DHFR)而導(dǎo)致DNA合成、修復(fù)和細(xì)胞復(fù)制的抑制。增值活躍的組織如惡性癌細(xì)胞通常對這種MTX的干擾更為敏感。此外，MTX具有免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)，可用于如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、多發(fā)性硬化癥(MS)和牛皮癬的治療。高劑量MTX通常以長時間輸注的方式給藥，經(jīng)常用于治療非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)以及軟組織腫瘤。在對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生毒性的同時，以劑量和時間依賴的方式對健康細(xì)胞產(chǎn)生毒性。另外，MTX會誘導(dǎo)腎小管阻塞進(jìn)而引起腎功能障礙而導(dǎo)致患者死亡(Kintzel 2001; Condit 1969)。
由于MTX毒性的致命性后果，在MTX治療方案中通常包括解救措施。如
4亞葉酸拯救，但是在高濃度MTX時，亞葉酸鈣很難阻止全身毒性的產(chǎn)生(CoWman 1975; Pinedo 1976); MTX由亞葉酸鈣逆轉(zhuǎn)是競爭性的，當(dāng)MTX濃度升高時需要更高的濃度，當(dāng)MTX濃度達(dá)到100uM時，即使高IO倍的亞葉酸鈣(1000 uM)也很難保護(hù)骨髓細(xì)胞不受毒性影響(Pinedo 1976)。另外就是通過水合和堿化的方式增強(qiáng)MTX的水溶性來降低MTX腎毒性，可以將毒性影響范圍降低到1.5%，但是仍有可能發(fā)生因MTX清除延長而導(dǎo)致全身毒性。而CPG2是目前被證明用于MTX大劑量治療最有效的解救藥，CPG2可以特異迅速裂解MTX為谷氨酸和2，4-二氨基-N10-甲基蝶酸(DAMPA)，且不透過血-腦屏障(BBB)，即使BBB的通透性異常時也不透過該細(xì)胞膜，因而不會抵消細(xì)胞內(nèi)MTX的作用。CPG2作為MTX治療解救藥國外已完成III期臨床，將發(fā)展成為替代亞葉酸作為大劑量應(yīng)用MTX的最有效解救途徑。
CPG2還被用于抗體導(dǎo)向酶-前藥療法(ADEPT)。 ADEPT利用抗體作為載體攜帶前藥的專一性活化酶，選擇性地結(jié)合于腫瘤部位，使前藥可以區(qū)域特異性地在腫瘤組織內(nèi)轉(zhuǎn)化為活性細(xì)胞毒分子，起到專一殺傷腫瘤的作用(Bagshawe1989)。目前用于ADEPT系統(tǒng)活化酶大多數(shù)尚處于早期研究階段，只有CPG2已用于臨床研究階段。最初合成的前藥是苯甲酸氮芥的谷氨酰胺衍生物，被活化酶CPG2羧化為活性的苯甲酸氮芥，兩者活性差異在100倍以上。后來的研究用活性更強(qiáng)的2-甲磺酰胺來取代一個或兩個氯乙基，單2-甲磺酰胺復(fù)合物(MMCl)比雙2-甲磺酰胺復(fù)合物毒性更強(qiáng)，與活化酶選擇性更強(qiáng)(Springer 1990)。
CPG2還應(yīng)用于基因?qū)蛐悦盖绑w藥物療法(GDEPT)。目前GDEPT的研究已成為腫瘤防治研究中的一個活躍領(lǐng)域，被廣泛應(yīng)用于各種腫瘤的治療研究亦稱自殺基因療法(suicide gene thempy)，成為腫瘤生物治療最引人注目的研究領(lǐng)域。GDEPT的治療機(jī)制很簡單，即將非哺乳類動物的基因特異轉(zhuǎn)導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，當(dāng)它在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)時可將全身給藥的無毒性或毒性極低的藥物前體轉(zhuǎn)變成毒性代謝產(chǎn)物，在腫瘤局部殺傷腫瘤細(xì)胞，避免了全身或局部直接給藥的副作用。CPG2具有將氮芥類前藥活化成細(xì)胞毒性藥物的功能，這在ADEPT療法中已得到驗證，讓CPG2基因在腫瘤細(xì)胞靶向表達(dá)，就可以使系統(tǒng)給藥的前藥在腫瘤細(xì)胞位置特異活化成毒性物質(zhì)，實現(xiàn)特異殺傷腫瘤細(xì)胞，而對成正常
5細(xì)胞無害，GDEPT是ADEPT療法進(jìn)一步發(fā)展(Douglas et al. 2007; Schepelmann et al. 2005)。
CPG2全序列為415個氨基酸，其中包含一個25氨基酸的信號肽序列和390氨 基酸的成熟蛋白序列。CPG2活性分子為同源二聚體，分子量83000-84000道爾頓， 活性需Zn2、每個單體分子包含4個Zi^+。最初CPG2的制備是從原始菌株假單胞 菌RS-16發(fā)酵而來，但表達(dá)量僅為200-300 U/L，且CPG2表達(dá)量低于可溶蛋白的 0.1%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足研究開發(fā)的需要(Sherwoodetal. 1985)。因此，用基因工程 的方法生產(chǎn)重組羧肽酶G2(rCPG2)是唯一的選擇。
利用基因工程技術(shù)，以微生物為載體，生產(chǎn)外援蛋白具有廣闊的應(yīng)用前景。 到目前為止，已發(fā)展多種蛋白表達(dá)系統(tǒng)。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是研究得最清楚的 一套原核表達(dá)系統(tǒng)(l)遺傳背景和生化特性研究的很透徹，易于控制和操作， 是應(yīng)用最成熟和廣泛的一套表達(dá)系統(tǒng)；(2)生長迅速、周期短、營養(yǎng)需求簡單及 表達(dá)量大；(3)但是缺少翻譯后加工過程，對以表達(dá)一些高級結(jié)構(gòu)復(fù)雜、需要糖 基化的蛋白無能為力，且往往以包涵體形式表達(dá)，復(fù)性難度大。酵母作為一種 簡單的單細(xì)胞真核生物，兼有原核生物和真核生物的某些特點(l)酵母是單細(xì) 胞低等真核生物，培養(yǎng)條件普通，生長繁殖速度快，能耐受較高的流體靜壓， 表達(dá)基因工程產(chǎn)品時，可以大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)，有效降低生產(chǎn)成本；(2)酵母表達(dá) 外源基因具有一定的翻譯后加工能力，具有一定程度的折疊加工和糖基化修飾， 特別適合于穩(wěn)定表達(dá)真核生物基因和制備有功能的重組蛋白；(3)酵母表達(dá)系統(tǒng) 具有分泌表達(dá)功能，能將表達(dá)的外源蛋白分泌到胞外，使純化簡便；(4)但是對 于不同的蛋白，在酵母系統(tǒng)中表達(dá)量差別很大，往往成為一個瓶頸問題。哺乳 動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)是近年發(fā)展起來的高級表達(dá)系統(tǒng)，應(yīng)用比較成熟的是中國倉 鼠卵巢細(xì)胞(Chinese Hamster Ovary Cell, CHO)表達(dá)系統(tǒng)(l)準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄后修飾 功能，表達(dá)的糖基化蛋白藥物分子在結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面接近天 然蛋白分子；(2)胞外分泌表達(dá)，CHO屬于成纖維細(xì)胞，很少分泌內(nèi)源蛋白，便 于純化；(3)貼壁生長，有較高的耐受剪切力和滲透壓能力，可進(jìn)行懸浮培養(yǎng)或 在無血清培養(yǎng)基中高密度培養(yǎng)，體積可以達(dá)到1000L以上；(4)但是重組CHO細(xì)胞 生產(chǎn)效率低，表達(dá)產(chǎn)物濃度低，某些糖基化產(chǎn)物不穩(wěn)定，使純化難度增大；表達(dá)周期長，重組細(xì)胞培養(yǎng)費用昂貴，使得成本增加。
不同的基因重組表達(dá)系統(tǒng)具有特定的優(yōu)缺點，只有根據(jù)目標(biāo)蛋白本身的特
點來選擇最適宜的表達(dá)系統(tǒng)。CPG2是來源于細(xì)菌的蛋白，分子沒有糖基化，也
沒有二硫鍵，用原核表達(dá)系統(tǒng)是首選。近年來，隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，
CPG2基因已被克隆，并用基因工程的方法表達(dá)重組CPG2(Minton et al. 1983; Mintonetal. 1984)。 CPG2的重組在國外已研究多年，但是在原核系統(tǒng)中表達(dá)量 最高只能占可溶蛋白的20。/。左右(Chanbers et al. 1988; Lancaster et al.1989; Mintonetal. 1983)。 CPG2作為藥用開發(fā)研究己越來越廣泛，CPG2必須已以二 聚體形式存在才具有完全的生物學(xué)活性。因此在大腸桿菌中以可溶形式表達(dá) CPG2，自發(fā)形成同源二聚體；在保持生物學(xué)活性的同時，提高表達(dá)量，是大腸 桿菌表達(dá)rCPG2進(jìn)行藥用開發(fā)研究必須考慮的因素。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于本發(fā)明提供了新的含有重組羧肽酶G2的表達(dá)載體及其 轉(zhuǎn)化的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)(也稱為表達(dá)宿主)。
本發(fā)明的另一目的在于提供利用本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)制備重組羧肽酶G2的 方法。
本發(fā)明所述的重組羧肽酶G2表達(dá)載體，包含羧肽酶G2基因片段和表達(dá)載 體，該表達(dá)載體優(yōu)選為PET-30a-c(+)。
本發(fā)明還提供上述的重組羧肽酶G2表達(dá)載體的構(gòu)建方法，主要包含步驟
1) 合成羧肽酶G2基因；
2) 合成PCR引物SEQ ID NO:l-2，以步驟1)合成的羧肽酶G2基因為模 板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得PCR產(chǎn)物；
3) 將歩驟2)所得PCR產(chǎn)物酶切后，與表達(dá)載體PET-30a-c(+)連接，即構(gòu)
建得到重組羧肽酶G2表達(dá)載體。
其中步驟3)所述構(gòu)建得到的重組羧肽酶G2表達(dá)載體為PET30-CPG2重組
7表達(dá)載體。
本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，上述PET30-CPG2重組表達(dá)載體將羧肽酶G2成熟 蛋白編碼序列通過多克隆位點，例如BglII/Notl位點連接入PET-30a-c(+)載體構(gòu)
建而成。
根據(jù)本發(fā)明所述的方法，上述羧肽酶G2成熟蛋白N端氨基酸序列為 QKRDNVL-。
本發(fā)明還提供一種重組羧肽酶G2表達(dá)系統(tǒng)，其由上述的重組羧肽酶G2表 達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主構(gòu)建而成。
本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，上述大腸桿菌宿主為BL21(DE3)或 BL21(DE3)pLysS。
本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，上述重組羧肽酶G2表達(dá)系統(tǒng)可以為 PET30-CPG2/BL21 (DE3)或PET3 0-CPG2/BL21 (DE3)pLysS 。
本發(fā)明還提供上述的重組羧肽酶G2表達(dá)載體表達(dá)重組羧肽酶G2的方法， 其主要包含步驟
a) 按照上述重組羧肽酶G2表達(dá)載體的構(gòu)建方法構(gòu)建重組羧肽酶G2表達(dá)載
體；
b) 將步驟a)所得的重組羧肽酶G2表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主，得重組羧 肽酶G2大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)；
c) 培養(yǎng)步驟b)所得重組羧肽酶G2大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，獲得重組羧肽酶G2。
d) 提取、純化步驟c)所得的重組羧肽酶G2。
本發(fā)明構(gòu)建的含有CPG2的質(zhì)粒表達(dá)載體PET30-CPG2，是在CPG2成熟蛋 白N端引入腸激酶切割位點(-DDSKQKRD-)，以便純化時將融合部分去除；插 入PET-30a-c(+)載體BglII、 Notl位點，保證閱讀框正確，這樣N端融合了載體 上自身攜帶的HisTag和STag，在增加可溶表達(dá)量的同時，利于后續(xù)純化。此 表達(dá)載體表達(dá)的rCPG2與天然的CPG2具有相同的N端序列。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)勢就是能大量表達(dá)所需要的目標(biāo)蛋白，但往往易形成 包涵體表達(dá)，包涵體復(fù)性困難，且復(fù)性后很難得到具有天然活性的蛋白，同時
增加成本。本發(fā)明針對大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)設(shè)計的表達(dá)載體，構(gòu)建了表達(dá)CPG2
的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，不僅可以高效可溶地表達(dá)目標(biāo)蛋白，而且表達(dá)產(chǎn)物具有 天然蛋白結(jié)構(gòu)和天然活性。大腸桿菌培養(yǎng)體系經(jīng)濟(jì)、簡便、生長周期短，高密
度發(fā)酵一般可到達(dá)600克濕重/L培養(yǎng)液，可提高產(chǎn)率，降低生產(chǎn)成本，適合于 大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明提供了一種用大腸桿菌可溶表達(dá)具有天然蛋白結(jié)構(gòu)和生物活性的 rCPG2的新的表達(dá)系統(tǒng)，該表達(dá)系統(tǒng)具有以下優(yōu)點
① 表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建簡單，容易實現(xiàn)；
② 表達(dá)產(chǎn)率高；
③ 產(chǎn)物以可溶方式表達(dá)，具有天然結(jié)構(gòu)和生物活性，無需變性和復(fù)性；
④ 培養(yǎng)基簡單、低廉；
⑤ 產(chǎn)物收率高，生產(chǎn)成本低。
上述優(yōu)勢使本發(fā)明具有明顯的技術(shù)創(chuàng)新性與工藝先進(jìn)性，適合于工業(yè)化生 產(chǎn)重組羧肽酶G2。按照本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)和方法，CPG2表達(dá)量不低于可溶蛋 白的30%，最終得率為500mg/L，可以制備純度大于98%，生物比活性高于 400U/mg蛋白的重組CPG2。
為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實 施例，對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處說描述的具體實施例僅僅以 解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。


圖1為本發(fā)明構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒PET30-CPG2的結(jié)構(gòu)圖2為本發(fā)明獲得的CPG2的cDNA序列測定結(jié)果及對應(yīng)的氨基酸序列， 眾表示終止密碼子；
9圖3為CPG2純化后的SDS-PAGE圖。泳道1是蛋白Marker,泳道2是表 達(dá)系統(tǒng)PET30-CPG2/BL21(DE3)表達(dá)的rCGP2純化后樣品，泳道3是表達(dá)系統(tǒng) PET30-CPG2/BL21(DE3)pLysS表達(dá)的rCPG2純化后樣品；
圖4為CPG2純化后的天然PAGE電泳圖。泳道1、 2是表達(dá)系統(tǒng) PET30-CPG2/BL21(DE3)表達(dá)的rCGP2純化后樣品，泳道4、 5是表達(dá)系統(tǒng) PET30-CPG2/BL21(DE3)pLysS表達(dá)的rCPG2純化后樣品，泳道3是BSA對照；
圖5為表達(dá)系統(tǒng)PET30-CPG2/BL21(DE3)表達(dá)的rCGP2純化后樣品的HPLC 分析圖譜，目的蛋白峰保留時間為16.209min;
圖6為表達(dá)系統(tǒng)PET30-CPG2/BL21(DE3)pLysS表達(dá)的rCPG2純化后樣品 HPLC分析圖譜，目的蛋白峰保留時間為16.222min。
具體實施例方式
總技術(shù)方案
根據(jù)本方面的一方面，含有重組羧肽酶G2的質(zhì)粒表達(dá)載體PET30-CPG2具 有如圖l所示結(jié)構(gòu)，是將CPG2成熟蛋白基因序列插入PET-30a-c(+)載體中構(gòu)建 而成。其中PET-30a-c(+)是可購買的商業(yè)化載體，多克隆位點含有單一的BglII 和Notl酶切位點。將CPG2成熟蛋白基因序列插入BglII和Notl酶切位點之間， 并在蛋白N端引入腸激酶切割位點(DDDDK-)，進(jìn)行融合表達(dá)，在胞內(nèi)獲得可溶 且具有高生物活性的rCPG2。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供含有本發(fā)明的質(zhì)粒載體的大腸桿菌表達(dá)宿主， 將本發(fā)明構(gòu)建的表達(dá)載體PET30-CPG2轉(zhuǎn)化大腸桿菌即可獲得本發(fā)明的表達(dá) CPG2的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。適用于PET載體的商業(yè)化宿主菌有多種，本發(fā)明 選用BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS作為優(yōu)選的宿主菌。
根據(jù)本發(fā)明的再一方面，提供制備rCPG2的方法，包括下述步驟
1)將編碼CPG2成熟蛋白的基因可操作地連接于表達(dá)載體PET-30a-c(+)， 構(gòu)建表達(dá)CPG2的重組表達(dá)載體；
102) 用所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主菌，構(gòu)建表達(dá)CPG2的大腸桿菌 表達(dá)系統(tǒng)；
3) 培養(yǎng)所述的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，獲得rCPG2。 其中，所述步驟l)包含下述步驟
1.1) 根據(jù)GenBnak中登錄的CPG2基因序歹U(登錄號M12599)進(jìn)行全基因 合成；
1.2) 將表達(dá)載體PET-30a-c(+)用BglII/Notl進(jìn)行雙酶切，回收純化備用；
1.3) 合成下述引物依次為SEQIDNO:l-2 引物l:
引物2:
5 ，>ATAGTTTAGCGGCCGCTC ACTTACCTGCACCCAGATC<3'
以步驟l.l)中合成的CPG2基因為模板，用引物1和引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 產(chǎn)物純化后用BglII/Notl雙酶切，電泳分離，切膠回收酶切基因片段，與步驟 1.2) BglII/Notl雙酶切載體連接，轉(zhuǎn)化DH5a，測序驗證，構(gòu)建CPG2融合表達(dá) 載體PET30-CPG2。
上述歩驟2)中包含下述步驟
2.1) 提取純化歩驟1)中構(gòu)建的表達(dá)載體PET30-CPG2;
2.2) 將融合表達(dá)載體PET30-CPG2分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)宿主菌 BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS，依次得到工程菌PET30-CPG2/BL21(DE3)和 PET30-CPG2/BL21(DE3)pLysS。
上述步驟3)中包含下述步驟
3.1)培養(yǎng)2.3)中構(gòu)建的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)工程菌株P(guān)ET30-CPG2/BL21(DE3) 和PET30-CPG2/BL21 (DE3)pLysS;3.2)從宿主胞質(zhì)中提取、純化rCPG2。
本發(fā)明所用的試驗材料如無特別說明均為市售購買產(chǎn)品，各種試劑和培養(yǎng) 基的成分和配制方法可以參見常規(guī)試驗手冊中的描述。
實施例l重組羧肽酶G2大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建
1. 基因合成
根據(jù)GenBnak中登錄的CPG2基因序列(登錄號M12599)進(jìn)行全基因合成 (上海生工完成)，序列見圖2。
2. PET30-CPG2表達(dá)載體構(gòu)建 2.1 PCR擴(kuò)增
以合成CPG2基因為模板，用引物1和引物2，高保真Taq酶進(jìn)行PCR擴(kuò) 增。弓i物l引入BglII酶切位點和腸激酶切割位點，引物2引入Notl酶切位點。 PCR擴(kuò)增參數(shù)為94 °C預(yù)變性5分鐘，然后經(jīng)過35個循環(huán)(94。C 30秒，50 °C 30秒，72°C1.5分鐘)，72T延伸IO分鐘結(jié)束反應(yīng)。
引物l:
，BglII DDDDK腸激酶位點 引物2:
5 ，- ATAGTTTAGCGGCCGCTCACTTACCTGCACCCAGATC -3'
Notl
2.2基因及載體的酶切
PCR產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后，用BglII/Notl雙酶切，同時將 PET-30a-c(+)載體用BglII/Notl雙酶切。在lxTAE配制的1.2%瓊脂糖凝膠上電 泳，目標(biāo)帶分離較好時，用刀片將目標(biāo)帶所在的膠塊切下，盡量切去多余的膠， 放在干凈的1.5mleppendorf管中。用凝膠回收試劑盒回收純化基因及載體。
2.3連接及轉(zhuǎn)化
12將切膠回收的經(jīng)過BglII/Notl雙酶切的基因及載體，用T4 DNA連接酶16°C 連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)，篩選轉(zhuǎn)化菌株，并進(jìn)行測序驗證，構(gòu) 建得到表達(dá)載體PET30-CPG2，具體結(jié)構(gòu)見圖1，保存于DH5a菌株中，命名為 PET30-CPG2認(rèn)5a。
實施例2重組羧肽酶G2大腸桿菌表達(dá)工程菌株的構(gòu)建
1. BL21(DE3)及BL21(DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞制備
采用氯化鈣法制備大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，其方法如下
挑取BL21(DE3)單菌落于25ml LB液體培養(yǎng)基中，37°C ， 250 r/min過夜培 養(yǎng)；第二天取lml過夜培養(yǎng)液接種于100ml LB中，37°C ， 250 r/min培養(yǎng)至OD600 為0.375左右，約2.5小時；將培養(yǎng)液分裝到預(yù)冷無菌的聚丙烯管中，于冰上放 置5-10分鐘，然后于4。C， 2000 r/min離心7分鐘；棄上清，用10ml冰冷的 CaCl2溶液重懸菌體沉淀，4"C， 1600r/min離心5分鐘；棄上清，用10ml冰冷 的CaCl2溶液重懸菌體沉淀，冰上放置過夜，讓菌體自然沉降備用。
BL21(DE3)pLysS感受態(tài)制備方法同BL21(DE3)。
2. 質(zhì)粒PET30-CPG2的制備
接種PET30-CPG2/DH5a菌株到20mlLB液體(含卡那霉素50ug/mL)， 37°C， 250rpm培養(yǎng)過夜。收集3mL菌體，用質(zhì)粒純化試劑盒制備質(zhì)粒。
3. 工程菌構(gòu)建
將制備的BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，次日用移液器將大部分上清去掉，剩下 約1 ml溶液，輕輕混勻，取100 新鮮制備的感受態(tài)細(xì)胞到1.5 ml離心管中， 加入l pl制備的PET30-CPG2質(zhì)粒，輕混勻，冰上放置30分鐘。然后在42°C 水浴中熱休克90秒，立即放于冰上2分鐘，加入800iil室溫液體LB培養(yǎng)基于 37°C ， 150r/min培養(yǎng)1.5小時。取50-200^1菌液涂布LB平板(含卡那霉素50ug/mL): 37t;培養(yǎng)16-20小時h。挑取單菌落PCR驗證，構(gòu)建得到大腸桿菌表達(dá)工程菌 株P(guān)ET30-CPG2/BL21(DE3)。
13大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)PET30-CPG2/BL21(DE3)pLysS的構(gòu)建方法同 PET30-proCPG2/BL21 (DE3)。
實施例3重組羧肽酶G2的表達(dá)及純化
挑取工程菌PET30-CPG2/BL21(DE3)接種到20ml LB(Kan 50ug/mL)液體培 養(yǎng)基中，37°C， 250rpm，過夜培養(yǎng)。次日，按1%的比例接種母液到200ml LB(Kan 50ug/mL)液體培養(yǎng)基，在1L的錐形瓶中，37°C， 250rpm培養(yǎng)，到006()()達(dá)到 0.6后，加入100 mM的IPTG至終濃度為0.4 mM， 30°C繼續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)2-3小 時。將搖瓶置于冰上5分鐘，5000g ， 4°C，離心5分鐘收集菌體。
發(fā)酵液菌體按1: 5 (w/w)懸浮于裂解液(20mM Tirs-HCl, 0.2mM Zn2+， pH8.0)中，超聲破壁，8,000 rpm離心5min收集上清；將此破菌液上清上樣于經(jīng) 0.2M NiS04處理并以20mM Tris-HCl(pH8.0)平衡的Ni2+-Chelating Sepharose Fast Flow(GE Healthcare)螯合層析介質(zhì)，分別以50mM和lOOmM咪唑(含20mM Tris-HCl， pH8.0)洗脫，目的蛋白集中于lOOmM咪唑洗脫部分；收集的目的蛋 白以截留分子量10kDa離心超濾管超濾脫鹽，置換緩沖為25mM Tris-HCl(含 0.2mMZn2+，pH8.0)，按每lmg蛋白加入0.5U腸激酶(50mM Tris-HCl, 2mM CaC12， 0.1%Tween-20， pH8.0)在4。C條件下酶切融合蛋白約16h，融合蛋白酶切率達(dá)到 約80%;此酶切目的蛋白上樣于25mM， pH8.5 Tirs-HCl, 0.2mM Zn2+平衡的 Q-Sepharose Fast Flow (GE Healthcare),用25mM， pH8.5 Tris-HCl緩沖液再沖洗 5-6個柱床體積后，用50mM Tris-HCl(pH8.0)洗脫雜蛋白，再以0.1 M Tris-HCl, pH7.5，0.2mMZn2+—次性洗脫目的蛋白，收集洗脫蛋白峰。SDS-PAGE檢測分子 量約42kD，純度大于95%。反相HPLC分析純度大于98%。收集到的目的蛋白 經(jīng)檢測具有催化MTX降解活性，比活力可達(dá)400 U/mg。凝膠過濾HPLC及天 然PAGE電泳分析rCPG2為天然的同源二聚體結(jié)構(gòu)。
CPG2大腸桿菌表達(dá)工程菌株P(guān)ET30-CPG2/BL21(DE3)pLysS的表達(dá)純化方 法同上。
具體結(jié)果請參照圖3、圖4、圖5和圖6。其中圖3為CPG2純化后的SDS-PAGE 圖，泳道1是蛋白Marker,泳道2是表達(dá)系統(tǒng)PET30-CPG2/BL21(DE3)表達(dá)的rCGP2純化后樣品，泳道3是表達(dá)系統(tǒng)PET30-CPG2/BL21(DE3)pLysS表達(dá)的 rCPG2純化后樣品。圖4為CPG2純化后的天然PAGE電泳圖，泳道1、 2是表 達(dá)系統(tǒng)PET30-CPG2/BL21(DE3)表達(dá)的rCGP2純化后樣品，泳道4、 5是表達(dá)系 統(tǒng)PET30-CPG2/BL21(DE3)pLysS表達(dá)的rCPG2純化后樣品，泳道3是BSA對 照。圖5為表達(dá)系統(tǒng)PET30-CPG2/BL21(DE3)表達(dá)的rCGP2純化后樣品的HPLC 分析圖譜，目的蛋白峰保留時間為16.209min，純度大于98%。圖6為表達(dá)系統(tǒng) PET30-CPG2/BL21(DE3)pLysS表達(dá)的rCPG2純化后樣品HPLC分析圖譜，目的 蛋白峰保留時間為16.222min，純度大于98%。
實施例4 cpg2酶活性測定
取2.82ml0.1mol/LTris-HCl， pH7.3， 0.2 mmol/L ZnCl2，加入180h1 1 mmol/L 氨甲蝶呤(MTX，中國藥品生物制品檢定所)，即最終3ml反應(yīng)體系中含0.1mol/L Tris-HCl， PH7.3， 0.2mMZn2+， 0.06mMMTX。快速加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣 品(適當(dāng)稀釋，使其中含0.03-0.06U羧肽酶)，并混勻，倒入比色杯中，于320nm 處測其吸光值，每間隔0.25min (即15s)檢測一次。用蒸餾水調(diào)零。記錄吸光
值變化。以吸光值A(chǔ)對時間(min)作圖，得線性曲線斜率，并按照下式計算活性
AAxVtxdf 癡= ￡xAtxVs =-kx7.349xdf
AA—每分鐘吸光值變化值
e—摩爾吸光系數(shù)(L/mol'cm)， 8300 L/mol'cm=8.3 mL/Vmol'cm
Vt—反應(yīng)總體積(L)， 3050|iL
At—測定時間(min)
Vs—反應(yīng)樣品總體積(ml)， 50(iL
df—樣品稀釋倍數(shù)
k一吸光值變化曲線的斜率
注加入反應(yīng)體系中的酶量以lmin吸光值變化在0.0204-0.0782之間為宜， 否則重新稀釋。
15活性定義 一個活力單位定義為，37°C， pH7.3條件下，每分鐘催化l.(Himol 氨甲蝶呤水解所需要的酶量。
雖然本發(fā)明已以較佳實施例披露如上，然其并非用以限定本發(fā)明，任何所 屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明之精神和范圍內(nèi)，當(dāng)可作些許之更動 與改進(jìn)，因此本發(fā)明之保護(hù)范圍當(dāng)視權(quán)利要求所界定者為準(zhǔn)。序列表
<110>重慶科潤生物醫(yī)藥研發(fā)有限公司
〈120〉重組羧肽酶G2表達(dá)載體及采用該表達(dá)載體制備重組羧肽酶G2的方法
<130>
<160〉 2
<170〉 Patentln version 3. 3
<210> 1 <211> 43 <212〉 DNA
<213>合成羧肽酶G2基因的PCR引物 〈400〉 1
tgaagatctg gacgacgacg acaagcagaa gcgcgacaac gtg 43
<210〉 2 <211> 37 <212> DNA
<213>合成羧肽酶G2基因的PCR引物 <400> 2
atagtttagc ggccgctcac ttacctgcac ccagatc 3權(quán)利要求
1. 一種重組羧肽酶G2表達(dá)載體，其特征在于包含羧肽酶G2基因片段和表達(dá)載體，該表達(dá)載體為PET-30a-c(+)。
2. 權(quán)利要求1所述的重組羧肽酶G2表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于包 含步驟1) 合成羧肽酶G2基因；2) 合成PCR引物SEQ ID NO:l-2，以步驟l)合成的羧肽酶G2基因為模 板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得PCR產(chǎn)物；3) 將步驟2)所得PCR產(chǎn)物酶切后，與表達(dá)載體PET-30a-c(+)連接，即構(gòu)建得到重組羧肽酶G2表達(dá)載體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟3)所述構(gòu)建得到的重組 羧肽酶G2表達(dá)載體為PET30-CPG2重組表達(dá)載體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述PET30-CPG2重組表達(dá)載 體將合成羧肽酶G2成熟蛋白編碼序列通過多克隆位點連接入PET-30a-c(+)載體 構(gòu)建而成。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述羧肽酶G2成熟蛋白N端 氨基酸序列為QKRDNVL-。
6. —種重組羧肽酶G2表達(dá)系統(tǒng)，其特征在于由權(quán)利要求1所述的重組羧 肽酶G2表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主構(gòu)建而成。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組羧肽酶G2表達(dá)系統(tǒng)，其特征在于所述大腸 桿菌宿主為BL21(DE3)或BL21(DE3)pLysS。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組羧肽酶G2表達(dá)系統(tǒng)，其特征在于所述重組 羧肽酶 G2 表達(dá)系統(tǒng)為 PET30-CPG2/BL21(DE3) 或 PET30-CPG2/BL21 (DE3)pLysS 。
9. 采用權(quán)利要求1所述的重組羧肽酶G2表達(dá)載體表達(dá)重組羧肽酶G2的方 法，其特征在于包含步驟a) 按照權(quán)利要求2所述的方法構(gòu)建重組羧肽酶G2表達(dá)載體；b) 將步驟a)所得的重組羧肽酶G2表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主，得重組羧 肽酶G2大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)；c) 培養(yǎng)步驟b)所得重組羧肽酶G2大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，獲得重組羧肽酶G2。d) 提取、純化步驟c)所得的重組羧肽酶G2。
全文摘要
本發(fā)明提供了重組羧肽酶G2表達(dá)載體及制備重組羧肽酶G2的方法，該重組羧肽酶G2表達(dá)載體包含羧肽酶G2基因片段和表達(dá)載體，其中表達(dá)載體為PET-30a-c(+)。本發(fā)明還提供上述重組羧肽酶G2表達(dá)載體的構(gòu)建方法以及包含該重組羧肽酶G2表達(dá)載體的表達(dá)系統(tǒng)，以及利用該表達(dá)系統(tǒng)制備重組羧肽酶G2的方法。本發(fā)明所述的重組羧肽酶G2表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)物具有天然結(jié)構(gòu)和生物活性，無需變性和復(fù)性；培養(yǎng)基簡單、價廉，生產(chǎn)成本低，產(chǎn)率高等優(yōu)點。
文檔編號C12N15/70GK101509012SQ20091010352
公開日2009年8月19日 申請日期2009年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月3日
發(fā)明者于廷和, 但國平, 杰 劉, 偉 張, 曹莉君, 李曉麗, 李樹剛, 渝 辛, 峰 馬, 龔會英 申請人:重慶科潤生物醫(yī)藥研發(fā)有限公司