專利名稱：一種羧肽酶b的制備方法及其組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酶學(xué)、含有酶的組合物及分離或純化方法技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種羧肽酶B的制備方法及其組合物。
背景技術(shù)：
羧肽酶B(carboxypeptidase B，簡稱CPB，EC3.4.17.2)是一種含鋅的胰外肽酶，特異性水解肽鏈C末端的堿性氨基酸精氨酸、賴氨酸或鳥氨酸。羧肽酶B含307個氨基酸殘基，分子量35KDa。豬胰臟中存在的羧肽酶B是由前羧肽酶原B(preprocarboxypeptidase B)產(chǎn)生的。前羧肽酶原B的N末端包含108個氨基酸的片斷(其中13個氨基酸為信號肽序列、95個氨基酸殘基組成活性肽部分)與C末端的羧肽酶B相連，前羧肽酶原B在轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的過程中，信號肽被剪切得到不具有活性的羧肽酶原B(procarboxypeptidase B)從細(xì)胞中分泌出來，然后通過胰蛋白酶酶解為具有活性的羧肽酶B和活性肽部分。
羧肽酶B廣泛用于蛋白質(zhì)及肽類C末端氨基酸測序，或用于蛋白質(zhì)或多肽的C末端堿性氨基酸殘基的修飾。在醫(yī)學(xué)上用于診斷胰腺炎。目前在基因工程領(lǐng)域獲得了越來越廣泛的應(yīng)用，特別在重組人胰島素的生產(chǎn)過程中，羧肽酶B為不可或缺的雙酶之一，其比活性的高低及穩(wěn)定性是影響胰島素原活化收率的一個重要參數(shù)〖周穎、楊樺、肖尚志、喬德水，羧肽酶B的穩(wěn)定性考察，中國生化藥物雜志，2002，23(4)185-186〗。
現(xiàn)有的從動物胰臟提取羧肽酶B的生產(chǎn)方法是動物胰臟勻漿激活、分級鹽析、透析、離子交換層析，再鹽析、透析，最后加鹽凍存，其中鹽析和透析周期長，效率低；而且離子交換層析通常經(jīng)過三步，回收率大為降低。文獻(xiàn)報(bào)道了采用勻漿、硫酸銨鹽析的方法進(jìn)行初步提取，然后采用疏水層析、離子交換層析的方法進(jìn)行純化，顯著提高了羧肽酶B的活力及得率〖王偉剛、曹雪梅、溫傳彬、戴素霞、楊樺、孔毅，從豬胰臟中提取及純化羧肽酶B工藝改進(jìn)，武漢工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，(2)P16-17、21〗。但是該方法由于是在勻漿后進(jìn)行鹽析操作，勻漿液中存在的脂類不利于后續(xù)的抽提操作，羧肽酶B的得率較低，而且鹽析后活性羧肽酶B存在于清液中不利于長期保存，必須立即進(jìn)行后續(xù)單元操作。
現(xiàn)有技術(shù)中羧肽酶B在離子交換層析后，加鹽濃縮凍存，其穩(wěn)定性差，保存時間僅為2月。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服羧肽酶B制備方法的現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，發(fā)明人進(jìn)行了廣泛而深入的研究。發(fā)明人比較了多種羧肽酶B的抽提方法及其純化工藝，通過使用丙酮破碎胰臟、制備丙酮粉的方法成功解決了上述技術(shù)缺陷，發(fā)明人對丙酮抽提方法進(jìn)行了廣泛研究。
為了克服現(xiàn)有技術(shù)中羧肽酶B制劑不穩(wěn)定的缺陷，發(fā)明人進(jìn)行了廣泛研究。
基于上述研究，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之一是提供一種羧肽酶B的制備方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的羧肽酶B得率低的技術(shù)缺陷。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之二是提供一種穩(wěn)定的羧肽酶B組合物以克服現(xiàn)有技術(shù)中羧肽酶B穩(wěn)定性差的技術(shù)缺陷。
為解決上述羧肽酶B制備方法中存在的技術(shù)問題，發(fā)明人采取的技術(shù)方案是用丙酮抽提胰臟羧肽酶B，制備包含羧肽酶B的丙酮粉。然后采用疏水層析、離子交換層析純化羧肽酶B，本發(fā)明的技術(shù)路線如圖1。
其中，丙酮粉的制備方法是將胰臟用1～5倍量丙酮處理2～3次，制成丙酮粉。胰臟是新鮮的胰臟或者凍胰臟，胰臟用機(jī)械方法粉碎。優(yōu)選地，選用凍胰臟用機(jī)械方法粉碎后，加1～5倍量預(yù)冷的丙酮處理2～3次。更優(yōu)選地，凍胰臟機(jī)械粉碎后自溶16～24hr，加1～5倍量預(yù)冷的丙酮處理2～3次。每次用丙酮處理后收集濾渣，收集濾渣的方法在本領(lǐng)域是已知的，例如離心收集濾渣或者過濾收集濾渣。最后收集的濾渣干燥后即得丙酮粉。濾渣干燥的方法在本領(lǐng)域是已知的，如自然風(fēng)干等。
優(yōu)選地，制備包含羧肽酶B的丙酮粉的方法是將凍胰臟機(jī)械粉碎，用1～5倍量的預(yù)冷丙酮處理2～3次，收集最后濾渣后用1～5倍量丙酮/乙醚混合液(體積比1∶1)處理，收集濾渣干燥后獲得丙酮粉。更優(yōu)選地，上述濾渣再用1～5倍量乙醚處理，收集濾渣干燥獲得丙酮粉。
上述所說的“1～5倍量”的含義是每g胰臟1～5ml丙酮或其它溶液，在下文中如沒有特別說明，凡提到“倍量”均為該含義。
在本發(fā)明羧肽酶B的制備方法中，丙酮粉加水?dāng)嚢韬螅肨ris-HCl緩沖液或者氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.0-8.0，攪拌抽提1～4hr，抽提液過濾或離心，每升清液中加入180～220g硫酸銨鹽析。該鹽析技術(shù)在本領(lǐng)域是公知的。鹽析液過濾或離心，清液經(jīng)疏水層析和離子交換層析獲得純化的羧肽酶B。疏水層析介質(zhì)可以選用本領(lǐng)域常用的苯基、C8或C4基瓊脂糖凝膠，如Butyl Sepharose 4Fast Flow、Octyl Sepharose 4 Fast Flow和Phenyl Sepharose 6 Fast Flow等(GE Healthcare，Amersham Biosciences)或者FractogelEMD Phenyl(北京金歐亞科技發(fā)展有限公司)，按照廠家提供的說明書自己裝柱，或者選用預(yù)裝柱如HiLoadTMPhenyl Sepharose HP Columns或HiPrepTM或HiTrapTM等，疏水層析的操作按照廠家提供的說明書進(jìn)行。疏水介質(zhì)的平衡緩沖液為含有1.5M硫酸銨的20-50mmol/LTris-HCl、pH7.0-8.5，優(yōu)選地pH7.0-8.0，最優(yōu)選地pH8.0。洗脫緩沖液為20-50mmol/LTris-HCl、pH7.0-8.5，優(yōu)選地pH7.0-8.0，最優(yōu)選地pH8.0。操作流速10cm-18cm/hr，優(yōu)選地操作流速12-16cm/hr。紫外檢測A280nm吸收值。峰值洗脫液進(jìn)一步用離子交換層析純化。離子交換介質(zhì)選用本領(lǐng)域常用的陰離子交換介質(zhì)，如DEAE Sepharose Fast Flow、Q Sepharose FastFlow(GE Healthcare，Amersham Biosciences)或者FractogelEMD TMAE、FractogelEMD DEAE(北京金歐亞科技發(fā)展有限公司)等，按照廠家提供的說明書或者本領(lǐng)域公知的技術(shù)自己裝柱或者選用廠家預(yù)裝柱如HiLoadTMQSepharose等。離子交換介質(zhì)的平衡緩沖液為20-50mMTris-HCl，pH7.0-8.5，優(yōu)選地pH7.0-8.0，特別優(yōu)選地pH7.5；洗脫緩沖液為20-50mMTris-HCl，pH7.0-8.5，優(yōu)選地pH7.0-8.0，特別優(yōu)選地pH7.5，氯化鈉線性梯度0-0.1M/(5-10柱體積)，操作流速16cm-26cm/hr，優(yōu)選地18cm-24cm/hr。
為了解決上述羧肽酶B不穩(wěn)定的技術(shù)問題，發(fā)明人所采取的技術(shù)方案是在純化的羧肽酶B中加入甘露醇，冷凍干燥獲得穩(wěn)定的羧肽酶B組合物。
本發(fā)明提供的穩(wěn)定的羧肽酶B組合物包括羧肽酶B，還含有3-5％(重量體積比，g/100ml)的甘露醇。
本發(fā)明的穩(wěn)定的羧肽酶B組合物的制備方法，通過制備丙酮粉、硫酸銨鹽析、疏水層析、離子交換層析后的純化羧肽酶B溶液中加入3-5％(重量體積比，g/100ml)的甘露醇，混勻，冷凍干燥即得。優(yōu)選地離子交換層析后的純化羧肽酶B溶液經(jīng)過濃縮，然后再加入3-5％(重量體積比，g/100ml)的甘露醇，混勻，冷凍干燥即得。
本發(fā)明通過制備丙酮粉抽提羧肽酶B具有顯著的技術(shù)效果。丙酮可以有效破碎細(xì)胞膜，加速目標(biāo)產(chǎn)物的釋放，而且丙酮可以脫去胰臟組織中的脂肪，便于后續(xù)的抽提。制備的丙酮粉具有蛋白活性，可以長時間保存，便于控制。同時該丙酮粉還可以用于提取其它胰酶。
本發(fā)明制備羧肽酶B的方法，羧肽酶B的得率達(dá)60U/g胰臟以上，得率提高了20％以上，羧肽酶B的比活性大于200U/mg，SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)純度與羧肽酶B對照品(SIGMA)在同一位置有單一條帶。另外本發(fā)明的制備羧肽酶B的方法大大縮短了生產(chǎn)周期，降低了生產(chǎn)成本，而且單元操作簡便，易于控制。應(yīng)當(dāng)說明的是在上下文中“得率”一詞的含義理解為每單位原料(動物胰臟)經(jīng)過本發(fā)明的方法純化后獲得的羧肽酶B的活性(U)。
本發(fā)明的羧肽酶B組合物，其羧肽酶B的穩(wěn)定性大大提高，活性穩(wěn)定性保持兩年以上，而現(xiàn)有技術(shù)中羧肽酶B加鹽凍存僅為2月。


附圖1系制備羧肽酶B的工藝路線。
附圖2系羧肽酶B疏水層析洗脫曲線。
附圖3系羧肽酶B離子交換層析洗脫曲線，——為A280nm，——為羧肽酶B活性曲線。
附圖4系羧肽酶B的穩(wěn)定性曲線。
以下結(jié)合具體實(shí)施方式
詳細(xì)說明本發(fā)明，但是所有具體實(shí)施方式
均應(yīng)理解為說明性的，僅為闡明本發(fā)明的內(nèi)容，不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一 丙酮粉的制備選用豬凍胰臟1kg，刨切成厚約2mm左右的薄片，室溫自溶16-24小時。自溶后，加預(yù)冷丙酮處理兩遍，每遍加3倍量丙酮(V/W)，攪拌，離心收集濾渣，濾渣自然風(fēng)干即為包含羧肽酶B的丙酮粉。
實(shí)施例二 丙酮粉的制備選用新鮮豬胰臟1kg，用絞肉機(jī)絞碎，加入預(yù)冷的丙酮處理三遍，每遍用5倍量丙酮(v/w)，不斷攪拌，離心收集濾渣，濾渣自然風(fēng)干后即為含有羧肽酶B的丙酮粉。
實(shí)施例三 丙酮粉的制備選用豬凍胰臟1kg，刨切成厚約2mm左右的薄片，室溫自溶16-24小時。自溶后，加預(yù)冷丙酮處理兩遍，每遍加3倍量丙酮(V/W)，攪拌，離心收集濾渣，再用2倍量丙酮∶乙醚(1∶1)混合液處理，不斷攪拌，離心收集濾渣，濾渣自然風(fēng)干即為包含羧肽酶B的丙酮粉。
實(shí)施例四 丙酮粉的制備選用豬凍胰臟1kg，如實(shí)施例三一樣操作，經(jīng)丙酮乙醚混合液處理后的濾渣，再用2倍量乙醚攪拌抽濾一遍，離心收集濾渣，攤平，自然晾干即得丙酮粉。
實(shí)施例五 羧肽酶B的純化取實(shí)施例一的丙酮粉加十倍量水，攪拌半小時后，用1mol/L氫氧化鈉調(diào)pH至8.0，繼續(xù)攪拌抽提1.5小時。抽提液用一層紗布過濾后，清液量體積，按1.5mol/L加入硫酸銨，放置1.5小時。鹽析液過濾后上疏水層析柱，疏水層析介質(zhì)用平衡緩沖液平衡，穿透峰棄去，待A280nm下至基線后，用洗脫緩沖液洗脫，檢測A280nm吸光度值，收集洗脫峰。疏水層析條件如下層析柱11×20cm(介質(zhì)床層高度)疏水介質(zhì)Octyl Sepharose 4 Fast Flow流速12cm/hr平衡緩沖液20mmol/LTris-HCl，pH8.0，含1.5mol/L硫酸銨洗脫緩沖液20mmol/LTris-HCl，pH8.0洗脫曲線見附圖2。收集大洗脫峰(第一洗脫峰)洗脫液，即為含有羧肽酶B的洗脫液。疏水層析目的洗脫液上預(yù)先用平衡緩沖液平衡的陰離子交換層析柱，上樣完畢用平衡緩沖液平衡，穿透峰棄去，待A280nm下至基線后，開始梯度洗脫，收集含有羧肽酶B的洗脫峰。離子交換層析條件如下層析柱8×20cm(介質(zhì)床層高度)離子交換介質(zhì)DEAE Sepharose Fast Flow流速18cm/hr平衡緩沖液20mmol/LTris-HCl，pH8.0洗脫緩沖液20mmol/LTris-HCl，pH8.0線性梯度0～0.1MNaCl/5倍柱體積洗脫曲線如附圖3，第三個洗脫峰即為羧肽酶B洗脫峰。
羧肽酶B的純度檢測采用SDS-PAGE法〖張龍翔，張庭芳等SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)的相對分子量，生化實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)，北京高等教育出版社，1989年版100-106〗，與對照品羧肽酶B(SIGMA)在同一位置，均為單一條帶。
羧肽酶B的濃度測定采用雙縮脲法〖張龍翔，張庭芳等雙縮脲法，生化實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)，北京高等教育出版社，1989年版136-138〗。
羧肽酶B的活力測定采用紫外吸收法，參照Wolff法〖J.E.Folk，Gladner，KarlA.Piez，et alCarboxypeptidases B.J.Biol.Chem.，Vol.235，No.3，August 1960〗測定。底物為HIPPURYL-L-ARG。測定濃度為10-3mol/L，緩沖液為0.025MTris-HCl，pH7.5(含0.1MNaCl)，反應(yīng)溫度為25℃。反應(yīng)體系2.9ml加入酶液100μl后，立即搖勻校正零點(diǎn)并記時。在254nm測其吸收度增值，每隔30s讀數(shù)一次，5min內(nèi)吸收度的增值應(yīng)呈線性，否則酶液應(yīng)稀釋后再測。
結(jié)果羧肽酶B的純度為單一條帶，比活大于200U/mg，羧肽酶B的收率65U/g胰臟。
實(shí)施例六 羧肽酶B的純化取實(shí)施例三的丙酮粉，如實(shí)施例五操作，疏水層析和離子交換層析pH控制為7.5，疏水層析線性流速16cm/hr，離子交換層析線性流速24cm/hr。結(jié)果羧肽酶B的SDS-PAGE純度呈單一條帶，羧肽酶B的比活大于200U/mg，羧肽酶B的收率64U/g胰臟。
實(shí)施例七 羧肽酶B的純化取實(shí)施例四的丙酮粉，如實(shí)施例五操作，所有緩沖液的濃度為50mmol/L。結(jié)果羧肽酶B的SDS-PAGE純度呈單一條帶，羧肽酶B的比活大于200U/mg，羧肽酶B的收率60U/g胰臟以上。
實(shí)施例八 羧肽酶B組合物實(shí)施例五的純化羧肽酶B，超濾濃縮后加入3％(重量體積比，g/100ml)的甘露醇，混勻，冷凍干燥即得羧肽酶B組合物。
實(shí)施例九 羧肽酶B組合物實(shí)施例六和七的純化羧肽酶B，超濾濃縮后加入5％(重量體積比，g/100ml)的甘露醇，混勻，冷凍干燥即得羧肽酶B組合物。
實(shí)施例十 羧肽酶B的穩(wěn)定性實(shí)施例八和九的羧肽酶B組合物，-20℃保存，定期取樣，用SDS-PAGE測定其純度、用雙縮脲法測定其濃度，用紫外吸收法測定其活性，結(jié)果活性保持兩年，附圖4。
權(quán)利要求
1.一種羧肽酶B的制備方法，包括鹽析、疏水層析和陰離子交換層析步驟，其特征在于還包括用丙酮抽提胰臟制備丙酮粉的步驟，即將胰臟用1～5倍量丙酮處理2～3次，制成丙酮粉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的羧肽酶B的制備方法，其特征在于將凍胰臟機(jī)械粉碎后自溶16～24hr，加1～5倍量預(yù)冷的丙酮處理2～3次，收集濾渣，再用1～5倍量丙酮/乙醚混合液(體積比1∶1)處理，收集濾渣干燥后獲得丙酮粉。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的羧肽酶B的制備方法，其特征在于用丙酮/乙醚混合液處理后再用1～5倍量乙醚處理，收集濾渣干燥獲得丙酮粉。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的羧肽酶B的制備方法，其特征在于(a)丙酮粉加水?dāng)嚢?，調(diào)節(jié)pH至7.0-8.0，抽提1-4hr；(b)清液經(jīng)疏水層析，條件為疏水層析介質(zhì)是苯基、C8或C4基瓊脂糖凝膠，平衡緩沖液是20-50mmol/LTris-HCl、pH7.0-8.0、含1.5M硫酸銨，洗脫緩沖液是20-50mmol/LTris-HCl、pH7.0-8.0，流速12-16cm/hr，檢測A280nm收集大吸收峰；和(c)用陰離子交換層析純化，條件是介質(zhì)為DEAE或者Q陰離子交換介質(zhì)，平衡緩沖液是20-50mmol/LTris-HCl、pH7.0-8.0，洗脫緩沖液是20-50mmol/LTris-HCl、pH7.0-8.0，NaCl線性梯度0-0.1M/(5-10倍柱體積)、流速16cm-26cm/hr檢測A280nm收集羧肽酶B吸收峰。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的羧肽酶B的制備方法，其特征在于疏水層析介質(zhì)為OctylSepharose 4 Fast Flow，緩沖液pH8.0；陰離子交換層析介質(zhì)為DEAE SepharoseFast Flow，緩沖液pH7.5，線性流速18-24cm/hr。
6.穩(wěn)定的羧肽酶B組合物，包括羧肽酶B，其特征在于還包括3-5％(重量體積比，g/100ml)的甘露醇。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的羧肽酶B組合物的制造方法，其特征在于根據(jù)權(quán)利要求4純化羧肽酶B，收集含有羧肽酶B的洗脫液，然后加入3-5％(重量體積比，g/100ml)的甘露醇，冷凍干燥即得穩(wěn)定的羧肽酶B組合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的羧肽酶B組合物的制造方法，其特征在于根據(jù)權(quán)利要求5純化羧肽酶B，收集含有羧肽酶B的洗脫液，然后加入3-5％(重量體積比，g/100ml)的甘露醇，冷凍干燥即得穩(wěn)定的羧肽酶B組合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的羧肽酶B組合物的制造方法，其特征在于含有羧肽酶B的洗脫液經(jīng)過超濾濃縮，然后加入3-5％(重量體積比，g/100ml)的甘露醇，冷凍干燥即得。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的羧肽酶B組合物的制造方法，其特征在于含有羧肽酶B的洗脫液經(jīng)過超濾濃縮，然后加入3-5％(重量體積比，g/100ml)的甘露醇，冷凍干燥即得。
全文摘要
本發(fā)明一種羧肽酶B的制備方法及其組合物涉及酶學(xué)、含有酶的組合物及分離或純化方法技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種羧肽酶B的制備方法及其組合物以解決現(xiàn)有技術(shù)中羧肽酶B制備方法得率低及羧肽酶B不穩(wěn)定的缺陷。公開了一種制備羧肽酶B的方法，包括鹽析、疏水層析和陰離子交換層析的步驟，其特征在于用1～5倍量丙酮處理2～3次，制成丙酮粉；并公開了一種含有3－5％(重量體積比，g/100ml)甘露醇的羧肽酶B組合物。該發(fā)明羧肽酶B的得率達(dá)60U/g胰臟以上，收率提高了20％以上，羧肽酶B的比活性大于200U/mg，羧肽酶B穩(wěn)定性2年。
文檔編號C12N9/48GK1948471SQ20051003039
公開日2007年4月18日 申請日期2005年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月11日
發(fā)明者李顯林, 楊煒, 王偉剛, 曹雪梅, 溫傳彬 申請人:江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司, 上海復(fù)星醫(yī)藥(集團(tuán))股份有限公司