專利名稱:動(dòng)物細(xì)胞流加培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模、高密度流加培養(yǎng)的方法。
背景技術(shù):
動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)各類生物活性物質(zhì)如單克隆抗體、病毒疫苗、免疫調(diào)節(jié)因子、生長(zhǎng)因子、特定腫瘤抗原以及各種基因重組蛋白質(zhì)藥物。動(dòng)物細(xì)胞同微生物相比具有轉(zhuǎn)錄后修飾的能力,能夠高效地表達(dá)和生產(chǎn)各類高質(zhì)量的蛋白質(zhì)。然而,用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基價(jià)格昂貴,表達(dá)量低造成分離純化的成本較高。因此,提高細(xì)胞密度和產(chǎn)物濃度,降低培養(yǎng)基消耗在工業(yè)應(yīng)用上具有重要意義。
簡(jiǎn)單的批培養(yǎng)(Batch)中,隨著營(yíng)養(yǎng)物的消耗和副產(chǎn)物積累,細(xì)胞停止生長(zhǎng)并開始死亡,產(chǎn)物也停止表達(dá),生產(chǎn)效率很低。為了克服批培養(yǎng)的這些弊端,開發(fā)出了流加培養(yǎng)(Fed-batch),即在培養(yǎng)過程中,根據(jù)細(xì)胞代謝需求,連續(xù)或間歇地向反應(yīng)器內(nèi)加入某一種或幾種特定的限制性底物。流加培養(yǎng)同批培養(yǎng)相比,培養(yǎng)周期延長(zhǎng),能夠最終獲得更高的活細(xì)胞密度和產(chǎn)物濃度(J.B.Griffith,Animal Cell Culture and Production ofBiologicals,pp.401-410,Klumer Academic Publishers,R.Sasaki and K.Ikura(eds),(1991),Robbinson D K,Seamans T C,et al.Optimization of a fed-batch process for production ofa recombinant antibody.Annals NY Academy Sciences,(1994),745185-296.)代表性的范例如,Xie等(Xie LZ and Wang D I C.High cell density and high monoclonal antibodyproduction through medium design and rational control in a bioreactor.Biotechnol.Bioeng,(1996),51725-729.)根據(jù)細(xì)胞組成(蛋白質(zhì)、RNA、DNA、脂、碳水化合物)和產(chǎn)物組成、維生素和ATP需求來設(shè)計(jì)營(yíng)養(yǎng)物濃度和流加速率,當(dāng)葡萄糖和谷氨酰胺在低濃度時(shí),根據(jù)細(xì)胞密度和生長(zhǎng)速率決定流加速率。用這種方法細(xì)胞密度和單抗?jié)舛确謩e提高了2倍和10倍,方瓶中單抗?jié)舛冗_(dá)到0.5g/L,反應(yīng)器中達(dá)到0.9g/L。
Zhou等(Zhou WC,Rehm J & Hu WS.High viable cell concentration fed-batch culturesof Hybridoma through on-line nutrient feeding.Biotechnol Bioeng,(1995),46579-587.)通過在線檢測(cè)OUR,并通過細(xì)胞耗氧和營(yíng)養(yǎng)消耗之間的化學(xué)計(jì)量關(guān)系,動(dòng)態(tài)流加無鹽的完全濃縮培養(yǎng)基進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞流加培養(yǎng),活細(xì)胞密度達(dá)到了1.2×107cells/mL,細(xì)胞代謝從乳酸和氨的高生成、氧的低消耗轉(zhuǎn)化為乳酸和氨的低生成、氧的高消耗。
但是,要達(dá)到優(yōu)化的流加過程,關(guān)鍵是實(shí)現(xiàn)過程中細(xì)胞的優(yōu)化控制,即研究細(xì)胞的代謝規(guī)律并確定優(yōu)化的控制目標(biāo)。顯然,Xie等的方法雖然看似精確,但過于復(fù)雜必然導(dǎo)致研究周期長(zhǎng)和工作量巨大。同時(shí),在動(dòng)物細(xì)胞流加培養(yǎng)過程中,細(xì)胞的代謝規(guī)律和生理狀態(tài)并不是恒定不變的,因此無論是Xie還是Zhou的方法設(shè)計(jì)上都沒有具體考慮過程的反饋和校正,一旦差別存在就將引起過程的不穩(wěn)定,甚至發(fā)散,導(dǎo)致最終的失敗。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題在于公開一種動(dòng)物細(xì)胞流加培養(yǎng)方法,以滿足有關(guān)領(lǐng)域發(fā)展的需要。
本發(fā)明的方法包括如下步驟(a).用于代謝規(guī)律研究的流加培養(yǎng)過程。獲得細(xì)胞在不同生理狀態(tài)下的代謝規(guī)律,建立細(xì)胞的代謝動(dòng)力學(xué)模型;確定流加培養(yǎng)的優(yōu)化控制目標(biāo);根據(jù)細(xì)胞的代謝動(dòng)力學(xué)確定優(yōu)化的流加培養(yǎng)基成分比例。
(b).用于高密度培養(yǎng)的優(yōu)化流加培養(yǎng)過程。根據(jù)設(shè)備的操作參數(shù)和(a)中獲得的優(yōu)化流加培養(yǎng)基成分比例,確定優(yōu)化的培養(yǎng)基組成;根據(jù)細(xì)胞的指數(shù)生長(zhǎng)規(guī)律進(jìn)行指數(shù)的流加培養(yǎng),調(diào)控細(xì)胞生理狀態(tài)處于優(yōu)化的控制目標(biāo);同時(shí),根據(jù)取樣獲得的細(xì)胞密度和培養(yǎng)環(huán)境中氨的濃度,反饋修正流加速率,避免系統(tǒng)的發(fā)散。
實(shí)施上的路線,(a).研究細(xì)胞的代謝規(guī)律和確定優(yōu)化目標(biāo)要研究細(xì)胞處于不同生理狀態(tài)下的代謝規(guī)律,傳統(tǒng)上是采用批培養(yǎng)分析或者所謂的脈沖試驗(yàn)方法。批培養(yǎng)過程中取樣間營(yíng)養(yǎng)物濃度變化很大,呈現(xiàn)出嚴(yán)重的時(shí)變性和不確定性,無法控制培養(yǎng)環(huán)境和狀態(tài),尤其給研究在低營(yíng)養(yǎng)物濃度下細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝規(guī)律帶來很大的困難。脈沖試驗(yàn)方法看似合理,但是細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)環(huán)境的變化有一個(gè)適應(yīng)的過程,突然處于一種新的環(huán)境下并不能馬上呈現(xiàn)出真實(shí)的代謝規(guī)律。
本發(fā)明的方法上可以解決這個(gè)問題,通過合理的設(shè)計(jì)流加培養(yǎng)基和流加速率,可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞在不同培養(yǎng)條件下的長(zhǎng)期擬穩(wěn)態(tài)生長(zhǎng)。同時(shí),由于流加培養(yǎng)周期比連續(xù)恒化培養(yǎng)或灌注培養(yǎng)要短很多,就為快速地獲得細(xì)胞在不同生理狀態(tài)下的代謝規(guī)律并確定優(yōu)化控制目標(biāo),提供了方便。
由于培養(yǎng)基組成很復(fù)雜,并且各種成份間往往存在替代、互補(bǔ)等交互作用,總體優(yōu)化設(shè)計(jì)是非常復(fù)雜的。簡(jiǎn)化處理方法是,考察幾種極端的培養(yǎng)狀態(tài)下的代謝規(guī)律,縮小尋優(yōu)范圍和逐步確定優(yōu)化目標(biāo)。由于乳酸和氨是限制細(xì)胞密度和產(chǎn)物濃度提高的主要副產(chǎn)物,一般的策略是限制培養(yǎng)環(huán)境中的葡萄糖或(和)谷氨酰胺濃度,因此,重點(diǎn)考察細(xì)胞在葡萄糖限制和谷氨酰胺限制狀態(tài)下的代謝規(guī)律。為實(shí)現(xiàn)相應(yīng)狀態(tài)下的擬穩(wěn)態(tài)生長(zhǎng),根據(jù)批培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)起流加培養(yǎng)基和流加速率,根據(jù)基本的動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行合理地假設(shè)和估計(jì),設(shè)計(jì)相應(yīng)的流加過程。
以葡萄糖限制的流加培養(yǎng)設(shè)計(jì)為例根據(jù)批培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,當(dāng)Glucose<0.5mmol/L,Glutamine>0.3mmol/L,并且其它營(yíng)養(yǎng)物不構(gòu)成限制時(shí),可認(rèn)為處于葡萄糖限制培養(yǎng)狀態(tài)。同時(shí),為盡可能排除副產(chǎn)物對(duì)生長(zhǎng)的影響,上述培養(yǎng)狀態(tài)下需Lactate<40mmol/L,Ammonia<6mmol/L。由以往的實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步獲得這種狀態(tài)下qgluc1.3mmol/(109cells·day),qgln0.65mmol/(109cells·day),qNH30.5mmol/(109cells·day),YNH3/gln0.75。實(shí)驗(yàn)采用2L的生物反應(yīng)器,初始培養(yǎng)體積700ml,流加速率選擇為200ml/day,由此可估計(jì)流加過程中稀釋率D0.3~0.1 1/day。起始培養(yǎng)基為Hybri SFM I(本實(shí)驗(yàn)室自己開發(fā)),細(xì)胞密度大于1.0×106mmol/L時(shí)開始流加,此時(shí)氨的濃度約為2.0mmol/L,流加后較長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)細(xì)胞的平均比生成速率在0.5 1/day左右。
最大活細(xì)胞密度(此時(shí),認(rèn)為主要是副產(chǎn)物氨抑制引起細(xì)胞生長(zhǎng)的停止)的估計(jì), 設(shè)計(jì)當(dāng)X3.0×106cells/L時(shí)達(dá)到葡萄糖限制,此時(shí)D0.25 1/day。
流加培養(yǎng)基中葡萄糖濃度的估計(jì),Gluc=qsXD=1.3×30.25=15.6mmol/L,]]>取Gluc=16mmol/L。
流加培養(yǎng)基中谷氨酰胺濃度的估計(jì),Gln≥S+qsXD=0.3+0.65×30.25=8.1mmol/L]]>(避免底物谷氨酰胺限制)Glnin≤S+qsXvmaxD=S+qpYP/S·XvmaxD≈S+PYP/S=0.3+60.75=8.3mmol/L]]>(氨抑制,dPdt≈0]]>)_庢Gln=8.3mmol/L丅其它營(yíng)養(yǎng)物如氨基酸濃度根據(jù)它們同葡萄糖或谷氨酰胺比消耗速率的比例關(guān)系確定。
比較細(xì)胞在不同狀態(tài)下的代謝規(guī)律,確定優(yōu)化的培養(yǎng)目標(biāo)。同時(shí),獲得細(xì)胞的代謝動(dòng)力學(xué)關(guān)系[1].---qs=1VXv[FSin-d(VS)dt],qp=1VXvd(VP)dt]]>[2].CGln=f(qNH3)根據(jù)[1],確定培養(yǎng)基各種營(yíng)養(yǎng)成分的比例。
(b).優(yōu)化的流加培養(yǎng)過程處于特定生理狀態(tài)下的細(xì)胞是呈指數(shù)地?cái)U(kuò)增生長(zhǎng)的,因此以調(diào)控細(xì)胞處于優(yōu)化的目標(biāo)生理狀態(tài)下的流加過程也是指數(shù)流加的過程。但是在培養(yǎng)過程中,細(xì)胞的實(shí)際生理狀態(tài)仍會(huì)不斷發(fā)生變化,因此,在實(shí)際操作上,最好能夠進(jìn)一步地反饋修正流加過程。
指數(shù)流加在實(shí)施上只能用無數(shù)的分階段恒速流加來代替,每一時(shí)間段內(nèi)的流加速率由該階段中理論指數(shù)流加速率對(duì)時(shí)間的平均值確定。在ti到ti+1之間,擬穩(wěn)態(tài)處理(假設(shè)細(xì)胞處于特定的生理狀態(tài),即μ,qs不變),并假設(shè)μiμi-1,qsi≈qsi-1,]]>流加速率由下式確定[3].---Fi=F(ti→i+1)‾=∫titi+1F(t)dt/(ti+1-ti)=biXiVi[exp[μi(ti+1-ti)]-1]ti+1-ti]]>其中μi=dlnXiVidt≈μi-1≈ln(XiVi/Xi-1Vi-1)ti-ti-1]]>bi=1Yx/si·Sin=qsiSinμi≈qsi-1Sinμi-1]]>qsi-1=1(VX‾)iFi-1(Sin-Si-1)≈Fi-1Sin·[lnViXiVi-1Xi-1/(ViXi-Vi-1Xi-1)]]]>若等時(shí)間間隔(ti-ti-1=ti+1-ti)取樣,由以上關(guān)系得流加控制的迭代關(guān)系(Feed-forward algorithm)為 .---Fi=XiViXi-1Vi-1·Fi-1]]>其中,Vi=Vi-1+Fi-1·(ti-ti-1)-(v庢樣)i考慮到流加過程中細(xì)胞實(shí)際的生理狀態(tài)不斷發(fā)生變化,試驗(yàn)階段,盡量縮小取樣間隔和檢測(cè)氨的濃度,根據(jù)[2]中獲得的代謝動(dòng)力學(xué)模型反饋修正流加速率。
更為具體的方法,包括如下步驟將細(xì)胞以活細(xì)胞密度為1.5~2.5×105cells/ml接種在生物反應(yīng)器中,當(dāng)活細(xì)胞密度達(dá)到0.8~1.2×106cells/ml后,開始補(bǔ)加培養(yǎng)基,稀釋率為0.2~0.3day-1。
所說的培養(yǎng)基為葡萄糖限制流加培養(yǎng)基或谷氨酰胺限制流加培養(yǎng)基,葡萄糖限制流加培養(yǎng)基中葡萄糖和谷氨酰胺濃度分別為7.8~17.5mmol/L和6.0~10.0mmol/L;谷氨酰胺限制流加培養(yǎng)基中葡萄糖和谷氨酰胺濃度分別為17.5~30mmol/L和2.5~5.0mmol/L,其它成分如下表所示
培養(yǎng)方法采用文獻(xiàn)(李東曉,張淑香,朱明龍,等.葡萄糖和谷氨酰胺濃度對(duì)雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,華東理工大學(xué)學(xué)報(bào),2003,29(4)359-362.)報(bào)道的方法。控制反應(yīng)器pH=7.2±0.1,溶氧(DO)為50%空氣飽和度,溫度為36.8,攪拌轉(zhuǎn)速120rpm。
葡萄糖限制流加培養(yǎng)在110~140小時(shí)間達(dá)到葡萄糖限制的擬穩(wěn)態(tài),谷氨酰胺限制流加培養(yǎng)在96~144小時(shí)間達(dá)到谷氨酰胺限制的擬穩(wěn)態(tài)。
(b).優(yōu)化的流加培養(yǎng)過程將細(xì)胞以活細(xì)胞密度為1.5~2.5×105cells/ml接種在生物反應(yīng)器中,起始培養(yǎng)基中葡萄糖和谷氨酰胺的濃度分別為7.8mmol/L和2.5mmol/L。當(dāng)活細(xì)胞密度達(dá)到0.8~1.2×106cells/ml后,開始補(bǔ)加培養(yǎng)基。其他條件同上。
優(yōu)化的流加培養(yǎng)基成分如下表所示
本發(fā)明的方法具有以下優(yōu)點(diǎn)1.廣泛適用于多個(gè)細(xì)胞株或細(xì)胞系的培養(yǎng);2.能夠快速地達(dá)到細(xì)胞在不同環(huán)境下的擬穩(wěn)態(tài)培養(yǎng),便于細(xì)胞代謝規(guī)律的研究和代謝動(dòng)力學(xué)模型的建立;3.建立了優(yōu)化的指數(shù)流加培養(yǎng)模型,能夠?qū)崿F(xiàn)以調(diào)控動(dòng)物細(xì)胞生理狀態(tài)為直接目標(biāo)的優(yōu)化流加過程;4.考慮到控制系統(tǒng)的反饋和校正,避免了過程的發(fā)散;5.操作簡(jiǎn)便,適合于指導(dǎo)大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。
圖1為帶反饋的優(yōu)化流加培養(yǎng)控制流程圖。
圖2為HB58雜交瘤細(xì)胞葡萄糖限制下的流加培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)圖。
圖3為HB58雜交瘤細(xì)胞葡萄糖限制下的流加培養(yǎng)細(xì)胞代謝圖。
圖4為HB58雜交瘤細(xì)胞谷氨酰胺限制下的流加培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)圖。
圖5為HB58雜交瘤細(xì)胞谷氨酰胺限制下的流加培養(yǎng)細(xì)胞代謝圖。
圖6為HB58雜交瘤細(xì)胞優(yōu)化流加培養(yǎng)過程細(xì)胞生長(zhǎng)和抗體生成圖。
具體實(shí)施例方式
參見圖1,初始流加速率F0根據(jù)流加點(diǎn)細(xì)胞的比生長(zhǎng)速率(μ0)、活細(xì)胞密度(X0)、培養(yǎng)體積(V0)、控制量谷氨酰胺的濃度(S0)、流加培養(yǎng)基中谷氨酰胺的含量(Sin)和取樣間隔(Δt)等量確定。一般的流加過程中只需等間隔時(shí)間取樣,計(jì)數(shù)細(xì)胞密度(Xv),即可確定下一次的流加速率。另外,為了進(jìn)一步提高整個(gè)過程的穩(wěn)定性,取樣時(shí)同時(shí)測(cè)定氨濃度(CNH3),計(jì)算此時(shí)氨的比生成速率(qNH3),根據(jù)該細(xì)胞的代謝動(dòng)力學(xué)模型(CGlnBioreactor=f(qNH3))可確定此時(shí)培養(yǎng)環(huán)境中谷氨酰胺的濃度(CGlnBioreactor)。根據(jù)控制量谷氨酰胺的控制濃度(CGlnSetpoint),進(jìn)一步獲得修正的流加速率(FiModified)。
根據(jù)試驗(yàn)階段獲得的該細(xì)胞株(系)在優(yōu)化流加過程中的相關(guān)規(guī)律,進(jìn)一步指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)階段,避免實(shí)際應(yīng)用階段過于頻繁的間隔取樣。
符號(hào)說明上述各個(gè)符號(hào)的定義說明如下Gluc——葡萄糖Gln——谷氨酰胺C——底物或產(chǎn)物的濃度D——釋率F——流加速率(Feeding rate,ml/day)P——產(chǎn)物q——底物(產(chǎn)物)的比消耗(生成)速率Sin——流加培養(yǎng)基中的底物t——時(shí)間V——反應(yīng)器體積Xv——活細(xì)胞(Viable cells,106cells/ml)Yx/s——胞對(duì)底物的產(chǎn)率μ——細(xì)胞的比生長(zhǎng)速率實(shí)施例1~2(a).代謝規(guī)律研究用本發(fā)明所述的方法對(duì)HB58雜交瘤細(xì)胞(ATCC)在葡萄糖限制或谷氨酰胺限制培養(yǎng)條件下的生理狀態(tài)進(jìn)行研究。在Biostat B(德國(guó)B.BRAUN公司)2升生物反應(yīng)器中接種,接種密度2.0×105cells/ml。當(dāng)活細(xì)胞0密度達(dá)到1.0×106cells/ml后開始流加培養(yǎng),稀釋率為0.30day-1,培養(yǎng)時(shí)間分別為125小時(shí)和100小時(shí),實(shí)現(xiàn)了葡萄糖限制(見圖2和圖3)和谷氨酰胺限制的擬穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)(圖4和圖5),可以用來研究當(dāng)細(xì)胞處于相應(yīng)狀態(tài)下時(shí)的代謝規(guī)律。整個(gè)培養(yǎng)過程中反應(yīng)器攪拌轉(zhuǎn)速為120rpm,溫度為36.8℃,溶氧為50%空氣飽和度。
葡萄糖限制流加培養(yǎng)基的組分和濃度如下
谷氨酰胺限制流加培養(yǎng)基的組分和濃度如下
圖2中,曲線1代表活細(xì)胞,曲線2代表死細(xì)胞,曲線3代表比生長(zhǎng)速率,曲線4代表稀釋率;圖3中,曲線5代表葡萄糖,曲線6代表乳酸,曲線7代表丙氨酸,曲線8代表谷氨酰胺,曲線9代表氨;圖4中,曲線10代表活細(xì)胞,曲線11代表死細(xì)胞,曲線12代表比生長(zhǎng)速率,曲線13代表稀釋率;圖5中,曲線14代表葡萄糖,曲線15代表乳酸,曲線16代表丙氨酸,曲線17代表谷氨酰胺,曲線18代表氨;實(shí)施例3~4(b).高密度優(yōu)化流加培養(yǎng)將HB58雜交瘤細(xì)胞(ATCC)用本發(fā)明所述的方法進(jìn)行優(yōu)化流加培養(yǎng)。在Biostat B(德國(guó)B.BRAUN公司)2升生物反應(yīng)器中,活細(xì)胞接種密度為2.0×105cells/ml。起始培養(yǎng)基中葡萄糖和谷氨酰胺濃度分別為7.8mmol/L和2.5mmol/L,其它氨基酸濃度為DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基的原始濃度。當(dāng)活細(xì)胞密度達(dá)到1.0×106cells/ml后,開始根據(jù)細(xì)胞需求指數(shù)地補(bǔ)加培養(yǎng)基。流加稀釋率為0.30day-1。
流加培養(yǎng)基中葡萄糖和谷氨酰胺的濃度分別為100mmol/L和33mmol/L,氨基酸為DMEM/F12(1∶1,質(zhì)量比)培養(yǎng)基質(zhì)量的6.5倍。整個(gè)培養(yǎng)過程中反應(yīng)器攪拌轉(zhuǎn)速為120rpm,溫度為36.8℃,溶氧為50%空氣飽和度。
優(yōu)化的流加培養(yǎng)基具體的組分和濃度如下
流加培養(yǎng)過程中最大活細(xì)胞密度達(dá)到5.66×106cells/ml,單抗?jié)舛冗_(dá)到379mg/L(見圖6),與普通培養(yǎng)基批培養(yǎng)的結(jié)果相比,分別提高了2.9倍和3.1倍。在培養(yǎng)過程中,葡萄糖和谷氨酰胺穩(wěn)定維持在較低的濃度,其中葡萄糖濃度在0.5mmol/L以下,谷氨酰胺濃度保持在0.1-0.2mmol/L之間,代謝副產(chǎn)物得到了較好的控制,氨濃度最高為4.4mmol/L。
圖6中,曲線19代表活細(xì)胞,曲線20代表總細(xì)胞,曲線3代表抗體。
權(quán)利要求
1.一種系統(tǒng)的流加培養(yǎng)方法,用于動(dòng)物細(xì)胞的代謝規(guī)律研究和優(yōu)化懸浮培養(yǎng),其特征在于,包括如下步驟(a).根據(jù)批培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)代謝動(dòng)力學(xué)設(shè)計(jì)初始培養(yǎng)基、流加培養(yǎng)基和流加過程,實(shí)現(xiàn)不同的擬穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)環(huán)境,研究細(xì)胞在不同狀態(tài)下的代謝規(guī)律,確定優(yōu)化的控制目標(biāo);建立細(xì)胞的代謝動(dòng)力學(xué)模型;根據(jù)細(xì)胞的代謝動(dòng)力學(xué)確定優(yōu)化的流加培養(yǎng)基成分比例;(b).根據(jù)設(shè)備的操作參數(shù)和(a)中獲得的優(yōu)化的培養(yǎng)基成分比例,確定優(yōu)化的培養(yǎng)基組成。流加過程中調(diào)控細(xì)胞生理狀態(tài)處于優(yōu)化的控制目標(biāo),同時(shí),根據(jù)取樣獲得的細(xì)胞密度和培養(yǎng)環(huán)境中氨的濃度,反饋修正流加速率,避免系統(tǒng)的發(fā)散。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,步驟(a)包括如下步驟將細(xì)胞以活細(xì)胞密度為1.5~2.5×105cells/ml接種在生物反應(yīng)器中,當(dāng)活細(xì)胞密度達(dá)到0.8~1.2×106cells/ml后,開始補(bǔ)加培養(yǎng)基,稀釋率為0.2~0.3day-1;所說的培養(yǎng)基為葡萄糖限制流加培養(yǎng)基或谷氨酰胺限制流加培養(yǎng)基;葡萄糖限制流加培養(yǎng)基中葡萄糖和谷氨酰胺濃度分別為7.8~17.5mmol/L和6.0~10.0mmol/L;谷氨酰胺限制流加培養(yǎng)基中葡萄糖和谷氨酰胺濃度分別為17.5~30mmol/L和2.5~5.0mmol/L,其它成分如下表所示
葡萄糖限制流加培養(yǎng)在110~140小時(shí)間達(dá)到葡萄糖限制的擬穩(wěn)態(tài),谷氨酰胺限制流加培養(yǎng)在96~144小時(shí)間達(dá)到谷氨酰胺限制的擬穩(wěn)態(tài)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,步驟(b)包括如下步驟將細(xì)胞以活細(xì)胞密度為1.5~2.5×105cells/ml接種在生物反應(yīng)器中,起始培養(yǎng)基中葡萄糖和谷氨酰胺的濃度分別為7.8mmol/L和2.5mmol/L,當(dāng)活細(xì)胞密度達(dá)到0.8~1.2×106cells/ml后,開始補(bǔ)加優(yōu)化的流加培養(yǎng)基;優(yōu)化的流加培養(yǎng)基成分如下表所示
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法,其特征在于,所說的動(dòng)物細(xì)胞包括雜交瘤細(xì)胞、CHO、NS0、BHK或293細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法,其特征在于,所采用到的培養(yǎng)基均為無血清培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種動(dòng)物細(xì)胞流加培養(yǎng)方法。首先設(shè)計(jì)不同的流加過程,實(shí)現(xiàn)不同的擬穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)環(huán)境,確定優(yōu)化目標(biāo)和建立代謝動(dòng)力學(xué)模型。根據(jù)代謝動(dòng)力學(xué)模型,進(jìn)行以優(yōu)化調(diào)控細(xì)胞生理狀態(tài)為目標(biāo)的培養(yǎng)過程。同時(shí),等時(shí)間間隔取樣并檢測(cè)氨的濃度,根據(jù)代謝模型估算控制量谷氨酰胺的濃度,反饋修正流加速率,避免系統(tǒng)的發(fā)散。本發(fā)明的方法能夠快速、準(zhǔn)確地對(duì)細(xì)胞株(系)進(jìn)行代謝規(guī)律研究;根據(jù)本發(fā)明中帶反饋修正的優(yōu)化流加模型,能夠?qū)崿F(xiàn)培養(yǎng)基使用效率高、細(xì)胞密度和產(chǎn)物濃度高、穩(wěn)定性和可控性強(qiáng)的細(xì)胞培養(yǎng)過程。根據(jù)本發(fā)明的方法,能夠迅速建立動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模優(yōu)化流加培養(yǎng)過程,對(duì)生物制品的生產(chǎn)具有重要的意義。
文檔編號(hào)C12N5/12GK1772883SQ20051003035
公開日2006年5月17日 申請(qǐng)日期2005年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月10日
發(fā)明者譚文松, 牛紅星, 朱明龍, 周燕, 華平, 顧小華 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)