一種從草魚中提取純化胰蛋白酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及酶學(xué)、及其分離或純化方法技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及一種從胰臟中提 取及純化胰蛋白酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 胰蛋白酶（trypsin，EC3. 4. 21. 4)為絲氨酸蛋白酶類的一種。在脊椎動物體內(nèi)作 為消化酶而起作用。該酶在胰臟是作為酶的前體-胰蛋白酶原而被合成的。隨胰液分泌到 小腸中，受腸激酶，或胰蛋白酶的作用成為活化胰蛋白酶。胰蛋白酶是肽鏈內(nèi)切酶，它能把 多肽鏈中賴氨酸（Lys)和精氨酸（Arg)殘基中的羧基側(cè)切斷，酶切作用專一性強(qiáng)。它不僅 起消化酶的作用，而且還能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前體，起 到活化作用。是特異性最強(qiáng)的蛋白酶，在決定蛋白質(zhì)的氨基酸排列中，它成為不可缺少的工 具。
[0003] 在多種魚類肝胰臟和幽門垂中，胰蛋白酶以酶原形式分泌，進(jìn)入消化道后在腸激 酶和Ca2+的作用下，去除激活肽后成為有活性的胰蛋白酶。草魚為中國主要淡水魚類養(yǎng)殖 對象，分布于中國各大水系，肉味美，營養(yǎng)豐富且易養(yǎng)殖，是一種很好的經(jīng)濟(jì)動物。有研究報 道草魚的胰臟蛋白酶活性較高，對其內(nèi)臟蛋白酶的相關(guān)研究可以為草魚內(nèi)臟的合理利用提 供理論基礎(chǔ)，同時胰蛋白酶的制備提供了一種新的材料來源。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供了一種從草魚中提取純化胰蛋白酶的方法。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：將草魚胰臟經(jīng)粗提液的制備、硫酸銨分級鹽析、 DEAE-Sephacel陰離子交換層析和Sephacryl-200凝膠過濾層析得到胰蛋白酶純品，包括 如下步驟： (1)粗提液的制備：取清洗干凈的草魚胰臟，加入pH 7. 0~9· 0的含0· 01~0· lmol/L NaCl、0.001~0. 005 mol/L CaCl2 的0.02111〇1/1 Tris-HCl 緩沖液，高速勻質(zhì)機(jī)（10~20sec/ 次)搗碎20~30次；12000~15000rpm，4°C離心15~20分鐘，收集上清作為胰蛋白酶粗提液。
[0006] (2)硫酸銨分級沉淀： ?::向粗提液加固體硫酸銨至1〇%~30%飽和度，靜置l~2h，12000~15000rpm，4Γ離心 15~20分鐘； Π :向上清液中繼續(xù)添加硫酸銨至加硫酸銨至60%~70%飽和度；靜置l~2h， 12000~15000rpm, 4Γ離心 15~20 分鐘； IlI :沉淀用上述同樣的Tris-HCl緩沖液溶解后進(jìn)行透析15~20h，期間更換3~5次透 析液，每次透析液用量為樣品體積的15~20倍；透析后12000~15000rpm，4°C離心15~20分 鐘；上清液用3~5層紗布過濾后得層析用酶液。
[0007] (3) DEAE-S印hacel 陰離子交換層析：用 pH 7. 0~9· 0 的含 0· 01~0· lmol/L NaCl、 0· 001~0· 005 mol/L CaC12 的 0· 02mol/L Tris-HCl 緩沖液平衡 DEAE-S印hacel 層析柱； 將酶液上樣于層析柱后，先用同樣的Tris-HCl緩沖液沖洗掉未結(jié)合的蛋白，再換用pH 7· 0~9· O的含0· 05~0· 5mol/L NaCl 0· 02mol/L Tris-HCl緩沖液洗脫，紫外檢測，收集酶活 性部分，超濾濃縮。
[0008] (4) S印hacryl-200 凝膠過濾層析：用含 pH 7. 0~9· 0 的含 0· 1~0· 3mol/L NaCl 的 0. 02mol/L Tris-HCl緩沖液平衡S印harcyl S-200凝膠柱，將上述濃縮液上樣于該柱，用同 樣的含NaCl的Tris-HCl緩沖液洗脫，紫外檢測儀檢測并記錄洗脫酶活性峰，洗脫液經(jīng)4°C 透析過夜，冷凍干燥得胰蛋白酶純品。
【具體實(shí)施方式】
[0009] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。 實(shí)施例
[0010] 所述的利用將草魚胰臟經(jīng)粗提液的制備、硫酸銨分級鹽析、DEAE-Sephacel陰離子 交換層析和Sephacryl-200凝膠過濾層析得到胰蛋白酶純品，包括如下步驟： (1)粗提液的制備：取清洗干凈的草魚胰臟，加入pH 7. 8的含0· 05mol/L NaCl、0. 002 mol/L CaCl2 的0.02111〇1/1 Tris-HCl 緩沖液，高速勻質(zhì)機(jī) 20sec/次搗碎 25 次；13000,4°C 離心15分鐘，收集上清作為胰蛋白酶粗提液。
[0011] (2)硫酸銨分級沉淀： ?::向粗提液加固體硫酸銨至20%飽和度，靜置I. 5h，13000rpm，4Γ離心15分鐘； :向上清液中繼續(xù)添加硫酸銨至加硫酸銨至70%飽和度；靜置I. 5h，13000rpm，4Γ 咼心15分鐘； :沉淀用上述同樣的TriS-HCl緩沖液溶解后進(jìn)行透析16h，期間更換5次透析液， 每次透析液用量為樣品體積的20倍；透析后13000, 4°C離心15分鐘；上清液用4層紗布過 濾后得層析用酶液。
[0012] (3)DEAE-S印hacel陰離子交換層析：加入pH7·8的含0·05mol/LNaCl、0·002 mol/L CaCl2的0.02111〇1/1 Tris-HCl緩沖液平衡DEAE-S印hacel層析柱；將酶液上樣于層 析柱后，先用同樣的Tris-HCl緩沖液沖洗掉未結(jié)合的蛋白，再換用pH 7. 8的含0. 2mol/L NaCl 0.02mol/L Tris-HCl緩沖液洗脫，紫外檢測，收集酶活性部分，超濾濃縮。
[0013] (4)S印hacryl-200 凝膠過濾層析：用含 pH 7. 8 的含 0· 25mol/L NaCl 的 0· 02mol/ L Tris-HCl緩沖液平衡S印harcyl S-200凝膠柱，將上述濃縮液上樣于該柱，用同樣的含 NaCl的Tris-HCl緩沖液洗脫，紫外檢測儀檢測并記錄洗脫酶活性峰，洗脫液經(jīng)4°C透析過 夜，冷凍干燥得胰蛋白酶純品。
[0014] 以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非是對本發(fā)明作其它形式的限制，任 何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等 效實(shí)施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對以上實(shí)施例所 作的任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種從草魚中提取純化胰蛋白酶的方法，其特征在于：將草魚胰臟經(jīng)粗提液的制 備、硫酸銨分級鹽析、DEAE-Sephacel陰離子交換層析和Sephacryl-200凝膠過濾層析得到 膜蛋白酶純品。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取純化胰蛋白酶的方法，其特征在于，該方法包括如下步 驟： (1) 粗提液的制備：取清洗干凈的草魚胰臟，加入Tris-HCl緩沖液，高速勻質(zhì)機(jī)搗碎， 離心，收集上清作為胰蛋白酶粗提液； (2) 硫酸銨分級沉淀： I::向粗提液加固體硫酸銨至較低飽和度，靜置，離心，取上清； 盡：向上清液中繼續(xù)添加硫酸銨至較高飽和度，靜置，離心收集沉淀； 議：沉淀用上述同樣的Tris-HCl緩沖液溶解后進(jìn)行透析，透析后的樣品離心，過濾得 上清液； (3)DEAE-Sephacel陰離子交換層析：用Tris-HCl緩沖液平衡DEAE-Sephacel層析柱； 將酶液上樣于層析柱后，先用同樣的Tris-HCl緩沖液沖洗掉未結(jié)合的蛋白，再換用含一定 濃度NaCl的Tris-HCl洗脫液洗脫，紫外檢測，收集酶活性部分，超濾濃縮； (4) Sephacryl-200凝膠過濾層析：用含NaCl的Tris-HCl緩沖液平衡Sepharcyl S-200凝膠柱，將上述濃縮液上樣于該柱，用同樣的含NaCl的Tris-HCl緩沖液洗脫，紫外檢 測儀檢測并記錄洗脫酶活性峰，超濾后冷凍干燥，即得成品。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：步驟（1)中所述的緩沖液是pH7. 0~9. 0 的含 0· 01~0.lmol/LNaCl、0. 001~0· 005mol/LCaC12 的 0· 02mol/LTris-HCl緩沖液。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：步驟（1)中高速勻質(zhì)機(jī)運(yùn)行頻率為 10~20sec/ 次，搗碎 20~30 次；離心機(jī)轉(zhuǎn)速 12000~15000rpm, 4°C離心 15~20 分鐘。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：步驟步驟（2)I中，加硫酸銨至10%~30% 飽和度，靜置l~2h, 12000~15000rpm, 4°C離心 15~20 分鐘。6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：步驟（2)11中，加硫酸銨至60%~70%飽和 度；靜置l~2h, 12000~15000rpm, 4°C離心 15~20 分鐘。7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：步驟（2)III中，透析時間為15~20h，期間 更換3~5次透析液，每次透析液用量為樣品體積的15~20倍；透析后12000~15000rpm，4°C 離心15~20分鐘；上清液用3~5層紗布過濾后得層析用酶液。8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：步驟（3)中，平衡液是pH7. 0~9. 0的含 0· 01~0·lmol/LNaCl、0. 001~0· 005mol/LCaC12 的 0· 02mol/LTris-HCl緩沖液；洗脫液 為pH7· 0~9· 0 的含 0· 05~0· 5mol/LNaCl0· 02mol/LTris-HCl緩沖液；活性部分用YM-10 超濾膜進(jìn)行超濾濃縮。9. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：步驟（4)中，平衡液是pH7. 0~9. 0的含 0. 1~0. 3mol/LNaCl的0. 02mol/LTris-HCl緩沖液；洗脫液經(jīng)4°C透析過夜，冷凍干燥得胰 蛋白酶純品。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從草魚中提取純化胰蛋白酶的方法。本發(fā)明通過粗提液的制備、硫酸銨分級鹽析、DEAE-Sephacel陰離子交換層析和Sephacryl-200凝膠過濾層析等提取純化得到胰蛋白酶。該發(fā)明為胰蛋白酶的制備提供了一種新的材料來源，同時為草魚內(nèi)臟的合理回收及應(yīng)用提供了理論依據(jù)。
【IPC分類】C12N9/76
【公開號】CN105385674
【申請?zhí)枴緾N201510826574
【發(fā)明人】劉乃山, 于曉娜, 劉翠珍
【申請人】青島康原藥業(yè)有限公司
【公開日】2016年3月9日
【申請日】2015年11月25日