利用大腸桿菌純化和提高切割蛋白酶活性的方法
【專利說明】利用大腸桿菌純化和提高切割蛋白酶活性的方法
[0001] 本發(fā)明涉及蛋白酶重組純化技術(shù)應用領(lǐng)域，特別是一種利用大腸桿菌純化和提高 切割蛋白酶活性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，在蛋白切割方面普遍采用PPase或者thrombin兩種酶，然而這兩種酶都是 單重標簽，其選擇性和實用性比較單一；為了克服上述缺點，技術(shù)人員重組了切割蛋白酶， 這種切割蛋白酶具有雙重標簽，其選擇性和實用性較強，但是在重組、表達和純化方法上還 是不成熟，存在著生產(chǎn)效率低、生產(chǎn)周期長的缺點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是為了解決上述問題，設(shè)計了一種利用大腸桿菌純化和提高切割蛋 白酶活性的方法。
[0004] 實現(xiàn)上述目的本發(fā)明的技術(shù)方案為，一種利用大腸桿菌純化和提高切割蛋白酶活 性的方法，該方法包括如下步驟： (1 )、分子克隆，選擇pET-28a(+)為目標蛋白的載體，并且在His標簽前段加入GST融 合蛋白，以EcoRI和NotI為限制性酶切位點設(shè)計引物進行PCR實驗擴增目的基因： 上游引物：TTGGATCCCATATGGGCCCGAGCCTTGACTTTG下游引物：AGTGCGGCCGCTTATTGTTCACTAGCAAAGTAAC 取一定量的上述PCR體系將擴增目的基因，利用瓊脂糖凝膠電泳取鑒定PCR產(chǎn)物，如果 出現(xiàn)500bp的條帶則可以證明PCR得到了目標產(chǎn)物，可以進行下一步的膠回收和雙酶切實 驗； (2) 、融合蛋白，將膠回收后的PCR擴增產(chǎn)物與已連入GST蛋白序列的pET-28a空載體 分別進行雙酶切反應，然后將雙酶切得到的具有粘性末端的PCR產(chǎn)物和線性pET-28a載體 利用T4連接酶進行過夜連接，再將得到的的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中進行質(zhì)粒的擴 增，提取DH5α中的重組質(zhì)粒備用； (3) 、蛋白表達，在重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E.coliROSETTA菌株中后，進行小量蛋白的試表達， 可選取重組蛋白5mLDotblot進行試表達。，試表達成功后對轉(zhuǎn)化入E.coliROSETTA菌株 中的重組質(zhì)粒進行大量表達得到切割蛋白酶； (4) 、蛋白純化，將大量表達后的切割蛋白酶進行IMAC和肝素陽離子交換層析實驗對 其進行純化； (5) 、酶活測定，經(jīng)過步驟（4)的純化后，得到得到20°C，常壓條件下適宜的切割蛋白 酶，切割蛋白酶的酶活緩沖液為10mMMES，PH6. 7,酶活緩沖液的蛋白體系終濃度15μΜ，底 物體系終濃度為〇. 〇4mM。
[0005] 所述步驟（1)中一定量的上述PCR體系將擴增目的基因的具體量為過50μL。
[0006] 所述步驟（2)中在DH5a中提出重組質(zhì)粒后，還要通過雙酶切驗證，確定之前的鏈 接反應是否正確。
[0007] 所述步驟（5)中通過酶活緩沖液最終得到的FRET酶活體系見下表：
[0008] 所述K"為測定初速度與濃度的非線性擬合曲線。
[0009] 利用本發(fā)明的技術(shù)方案制作的切割蛋白酶，與PPase或者thrombin相比，其優(yōu)勢 在于具有雙重標簽，這便使其在蛋白切割方面有了更多的選擇性和實用性；并且切割蛋白 酶在大腸桿菌中進行純化表達，1L菌液可拿到20mg左右的蛋白，相較其他蛋白酶，具有效 率高，周期短的優(yōu)勢。
【附圖說明】
[0010] 圖1是本發(fā)明所述證明PCR得到了目標產(chǎn)物的示意圖； 圖2是本發(fā)明所述證明擴增后重組質(zhì)粒的示意圖； 圖3是本發(fā)明所述重組質(zhì)粒雙酶切鑒定的示意圖； 圖中，泳道1為37°C，酶切15min的狀態(tài)；Μ為maker; 圖4是本發(fā)明所述小量蛋白（5mLDotblot)試表達的示意圖； 圖中，1，37°C表達30min;2,37°C表達2h;3,菌株用IPTG誘導前；4,陰性對照，菌株轉(zhuǎn) 入空載pET-28a(+)質(zhì)粒； 圖5是本發(fā)明所述FPLC以及蛋白純化結(jié)果蛋白膠圖； 圖6是本發(fā)明所述K"曲線示意圖； 圖7是本發(fā)明所述證明切割蛋白酶具有GST和HIS雙重標簽的曲線圖； 圖8是本發(fā)明所述切割蛋白酶在底物選擇上的對比圖； 圖9是本發(fā)明所述切割蛋白酶與同類產(chǎn)品在切割效果上的對比圖（圓點代表本產(chǎn)品、 方框代表PPase酶、三角代表TEV酶）； 圖10本發(fā)明所述的切割蛋白酶在不同酶活體系中的活性對比圖。
【具體實施方式】
[0011] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明進行具體描述，一種利用大腸桿菌純化和提高切割蛋白酶 活性的方法，該方法包括如下步驟： (1 )、分子克隆，選擇pET-28a(+)為目標蛋白的載體，并且在His標簽前段加入GST融 合蛋白，以EcoRI和NotI為限制性酶切位點設(shè)計引物進行PCR實驗擴增目的基因： 上游引物：TTGGATCCCATATGGGCCCGAGCCTTGACTTTG 下游引物：AGTGCGGCCGCTTATTGTTCACTAGCAAAGTAAC 取一定量的上述PCR體系將擴增目的基因，利用瓊脂糖凝膠電泳取鑒定PCR產(chǎn)物，如果 出現(xiàn)500bp的條帶則可以證明PCR得到了目標產(chǎn)物，如圖1所示，可以進行下一步的膠回收 和雙酶切實驗； (2) 、融合蛋白，將膠回收后的PCR擴增產(chǎn)物與已連入GST蛋白序列的pET-28a空載體 分別進行雙酶切反應，如圖3所示，然后將雙酶切得到的具有粘性末端的PCR產(chǎn)物和線性 pET_28a載體利用T4連接酶進行過夜連接，再將得到的的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α中 進行質(zhì)粒的擴增，提取DH5 α中的重組質(zhì)粒備用，如圖2所示； (3) 、蛋白表達，在重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E.coliROSETTA菌株中后，進行小量蛋白的試表達， 如圖4所示，可選取重組蛋白5mLDotblot進行試表達。，試表達成功后對轉(zhuǎn)化入E.coli ROSETTA菌株中的重組質(zhì)粒進行大量表達得到切割蛋白酶； (4) 、蛋白純化，將大量表達后的切割蛋白酶進行IMAC和肝素陽離子交換層析實驗對 其進行純化，如圖5所示； (5) 、酶活測定，經(jīng)過步驟（4)的純化后，得到得到20°C，常壓條件下適宜的切割蛋白 酶，切割蛋白酶的酶活緩沖液為10mMMES，PH6. 7,酶活緩沖液的蛋白體系終濃度15μΜ，底 物體系終濃度為〇. 〇4mM。
[0012] 所述步驟（1)中一定量的上述PCR體系將擴增目的基因的具體量為過50μL。
[0013] 所述步驟（2)中在DH5a中提出重組質(zhì)粒后，還要通過雙酶切驗證，確定之前的鏈 接反應是否正確。
[0014] 所述步驟（5)中通過酶活緩沖液最終得到的FRET酶活體系見下表：
[0015] 所述K"為測定初速度與濃度的非線性擬合曲線，如圖6所示。
[0016] 切割蛋白酶是一種由人類腸道病毒的3C蛋白酶、GST和組氨酸便簽組成的融合蛋 白，本發(fā)明所述的切割蛋白酶是通過大腸桿菌來重組和表達的，其具有效率高、周期短的特 點，且這種蛋白酶可特異識別短肽Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln/Gly-Pro中的Gin和Gly殘 基而進行切割，底物的識別和切割不僅依賴于融合蛋白的一級結(jié)構(gòu)還依賴于融合蛋白的二 級和三級結(jié)構(gòu)。它可以特異性的將帶有GST標簽和HIS標簽等一系列等載體表達出的帶有 酶底物識別多肽序列融合蛋白的GST標簽和His標簽進行分離。
[0017] 其中3C蛋白酶由一條長183個氨基酸的多肽鏈折疊而成，其折疊后形成了兩個對 稱的由6個β折疊結(jié)構(gòu)組成的桶裝結(jié)構(gòu)域，一個淺而長的底物結(jié)合溝位于兩個結(jié)構(gòu)域之 間。3C蛋白酶的酶切功能區(qū)是由催化三聯(lián)體Cysl47、His40和Glu71組成的拓撲立體結(jié)構(gòu) 構(gòu)成，催化三體中Cysl47作為底物羰結(jié)合位點，是酶切的執(zhí)行者。
[0018] 本發(fā)明所述的切割蛋白酶帶有GST和HIS雙重標簽，這就為其的純化方法提供了 多重選擇，使用更為靈活多變，如圖7所示。本發(fā)明所述的切割蛋白酶在底物的選擇上有其 針對性，有圖8可知，雖然對于不同的底物本發(fā)明所述的切割蛋白酶均有活性，但是通過對 t匕，其對于特定底物具有選擇性。如圖9所示，本發(fā)明所述的切割蛋白酶的酶切效果明顯比 同類產(chǎn)品好。如圖10所示，切割蛋白酶在不同的酶活體系中均具有活性，這為其切割不同 的蛋白，提供了可能、 上述技術(shù)方案僅體現(xiàn)了本發(fā)明技術(shù)方案的優(yōu)選技術(shù)方案，本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對其 中某些部分所可能做出的一些變動均體現(xiàn)了本發(fā)明的原理，屬于本發(fā)明的保護范圍之 內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種利用大腸桿菌純化和提高切割蛋白酶活性的方法，其特征在于，該方法包括如 下步驟： (1 )、分子克隆，選擇pET-28a (+)為目標蛋白的載體，并且在His標簽前段加入GST融 合蛋白，以EcoR I和Not I為限制性酶切位點設(shè)計引物進行PCR實驗擴增目的基因： 上游引物：TTGGATCCCATATGGGCCCGAGCCTTGACTTTG 下游引物：AGTGCGGCCGCTTATTGTTCACTAGCAAAGTAAC 取一定量的上述PCR體系將擴增目的基因，利用瓊脂糖凝膠電泳取鑒定PCR產(chǎn)物，如果 出現(xiàn)500bp的條帶則可以證明PCR得到了目標產(chǎn)物，可以進行下一步的膠回收和雙酶切實 驗； (2) 、融合蛋白，將膠回收后的PCR擴增產(chǎn)物與已連入GST蛋白序列的pET-28a空載體 分別進行雙酶切反應，然后將雙酶切得到的具有粘性末端的PCR產(chǎn)物和線性pET-28a載體 利用T4連接酶進行過夜連接，再將得到的的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α中進行質(zhì)粒的擴 增，提取DH5 α中的重組質(zhì)粒備用； (3) 、蛋白表達，在重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E.coli ROSETTA菌株中后，進行小量蛋白的試表 達，試表達成功后對轉(zhuǎn)化入E. coli ROSETTA菌株中的重組質(zhì)粒進行大量表達得到切割蛋白 酶； (4) 、蛋白純化，將大量表達后的切割蛋白酶進行IMAC和肝素陽離子交換層析實驗對 其進行純化； (5) 、酶活測定，經(jīng)過步驟（4)的純化后，得到得到20°C，常壓條件下適宜的切割蛋白 酶，切割蛋白酶的酶活緩沖液為10mM MES，PH6. 7,酶活緩沖液的蛋白體系終濃度15μΜ，底 物體系終濃度為〇. 〇4mM。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用大腸桿菌純化和提高切割蛋白酶活性的方法，其特征在 于，所述步驟（1)中一定量的上述PCR體系將擴增目的基因的具體量為過50 μ L。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用大腸桿菌純化和提高切割蛋白酶活性的方法，其特征在 于，所述步驟（2)中在DH5a中提出重組質(zhì)粒后，還要通過雙酶切驗證，確定之前的鏈接反應 是否正確。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用大腸桿菌純化和提高切割蛋白酶活性的方法，其特征在 于，所述步驟（5)中通過酶活緩沖液最終得到的FRET酶活體系見下表：〇5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用大腸桿菌純化和提高切割蛋白酶活性的方法，其特征在 于，所述K"為測定初速度與濃度的非線性擬合曲線。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用大腸桿菌純化和提高切割蛋白酶活性的方法，該方法利用大腸桿菌通過分子克隆、融合蛋白、蛋白表達、蛋白純化和酶活測定五個步驟重組表達切割蛋白酶。本發(fā)明的有益效果是，酶切效率高，重組周期短。
【IPC分類】C12N9/50, C12N15/70
【公開號】CN105463004
【申請?zhí)枴緾N201410442218
【發(fā)明人】朱丹, 曹林
【申請人】天津舒伯格文科技有限公司
【公開日】2016年4月6日
【申請日】2014年9月2日