由雙孢蘑菇罐頭加工廢水中提取純化的活性多糖及其提取純化工藝以及應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及由雙孢蘑菇罐頭加工廢水中提取純化的活性多糖及其提取純化工藝 以及應用。
【背景技術】
[0002] 雙孢蘑菇性平、味甘，能補脾益氣，潤燥化痰，有滋補作用，消食，清神，平肝陽，主 治消化不良，高血壓，雙孢蘑菇肉質肥厚，味道鮮美，而且熱能低，具有很高的醫(yī)療保健 作用，被聯(lián)合國糧農(nóng)組織譽為21世紀的健康食品，雙孢蘑菇子實體中含有豐富的氨基酸、 礦質元素、多糖、核甘酸、粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、灰分及其超氧化物歧化酶（S0D)。
[0003] 雙孢蘑菇具有降低血液中的總膽固醇、超低密度脂蛋白、中密度脂蛋白、低密度脂 蛋白膽固醇；雙孢蘑菇能夠促進⑶40、⑶80、⑶86、主要組織相容性復合體、IL-12的表達、 T細胞增殖、增高胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)等免疫活性；抑制乳癌細胞MCF-7aro等癌細胞的生長 具有抗腫瘤活性；能顯著地抑制大腸桿菌390、大腸桿菌739、產(chǎn)氣腸桿菌、銅綠假單胞菌、 肺炎克雷伯菌等細菌的生長；具有除去大#示所廣生口腔惡臭的治療口臭功效；可顯者抑制 正常小鼠的胃排空、對新斯的明負荷小鼠引起的胃排空亢進有顯著的拮抗作用，具有改善 胃腸道功能等活性，雙孢蘑菇有這么多的功效，源于其含有豐富的營養(yǎng)成分和活性物質，具 有相當大的開發(fā)潛力
[0004] 雙孢蘑菇作為世界上人工栽培最廣泛、產(chǎn)量最高、消費量最大的食用菌，其貿(mào)易以 罐頭為主，在雙孢蘑菇罐頭加工過程中清洗、預煮、灌裝、注液等工藝產(chǎn)生大量工業(yè)廢水，這 些廢水中往往含有大量的雙孢蘑菇子實體中可溶性物質，然而諸多罐頭工廠著眼于眼前利 益，對雙孢蘑菇罐藏預煮液沒有做任何處理，直接排入環(huán)境，這不僅給環(huán)境、生態(tài)、經(jīng)濟協(xié)調 發(fā)展造成很大的壓力，而且浪費了這些廢水中隱藏的有益成分，因此，有必要設計出一種能 夠將雙孢蘑菇罐頭加工過程中產(chǎn)生的廢水中有益物質提取出來，將這些有益物質利用起 來，防止資源的浪費，造福人類。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供具有良好生物活性的由雙孢蘑菇罐頭加工廢水中提取純 化的活性多糖及其提取純化工藝以及應用。
[0006] 本發(fā)明的目的通過如下技術方案實現(xiàn)：一種由雙孢蘑菇罐頭加工廢水中提取純化 的活性多糖AbaplOOl，其特征在于：它的單糖組成為阿拉伯糖、木糖、甘露糖以及葡萄糖， 且阿拉伯糖、木糖、甘露糖以及葡萄糖的摩爾比為〇. 4:0. 02:0. 4:73. 6。
[0007] -種由雙孢蘑菇罐頭加工廢水中提取純化的活性多糖Abap100 2,其特征在于：它 的單糖組成為阿拉伯糖、木糖、甘露糖以及葡萄糖，且阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖的摩 爾比為 1. 3:0. 14:0. 2:76. 73。
[0008] -種活性多糖的提取純化工藝，其特征在于：它包括以下工藝步驟：
[0009] (1)材料預處理：收集蘑菇罐頭加工過程中產(chǎn)生的工業(yè)廢水，然后對該工業(yè)廢水 進行旋轉蒸發(fā)濃縮，濃縮至溶液折光率達到35~55%，得到蘑菇預煮濃縮液；量取單位 體積的蘑菇預煮濃縮液，在蘑菇預煮濃縮液中加入等體積的去離子水進行混合，混合后 在65-75°C水浴條件下將蘑菇預煮濃縮液中析出的晶體完全溶解（因為折光率高于35% 就會出現(xiàn)晶體析出，所以需要在65-75Γ水浴條件下將晶體溶解），溶解之后離心機離心， 離心機的轉速控制在11500-12500rpm之間，離心溫度為15_25°C，離心時間為10_20min， 離心之后取上清液，上清液用90-150KDa的超濾膜超濾，將超濾得到的截留液，按體積比 為1:3. 5-1:2. 5的比例加入乙醇，在室溫下醇沉過夜，醇沉得到的沉淀用50~100ml去 離子水溶解，并于65-75Γ減壓蒸餾除去乙醇，再次離心機離心，離心機的轉速控制在 11500-12500rpm之間，離心溫度為15-25°C，離心時間為10_20min，收集上清液，即得到不 小于lOOKDa的粗多糖Abcp，采用苯酚-硫酸法測Abcp的多糖含量（測Abcp的多糖含量， 是為了解粗多糖Abcp含量的多少，方便進行下一步實驗），3. 5-5°C保存?zhèn)溆茫?br>[0010] (2)離子交換柱層析：
[0011] a. DEAE-52預處理：將DEAE-52進行酸、堿預處理；
[0012] b.經(jīng)柱層析得粗多糖AbaplOO ;
[0013] (3) AbaplOO 的 Sephadex G-200 凝膠柱層析：
[0014] a. Sephadex G-200 預處理；
[0015] b.經(jīng)柱層析得活性多糖。
[0016] 步驟（2)中DEAE-52預處理的具體過程為：在DEAE-52中加入蒸餾水，浸泡過夜后 抽濾，先用〇· 45-0. 55mol/L的NaOH-NaCl堿洗，用蒸餾水洗至中性；用0· 45-0. 55mol/L的 HC1酸洗，用蒸餾水洗至中性；用0. 45-0. 55mol/L的NaOH-NaCl浸泡，最后用蒸餾水洗至中 性即可。
[0017] 步驟（2)的b工藝具體為：將預處理后的DEAE-52進行沸水浴脫氣，脫氣時間為 10-20min，脫氣之后冷卻裝柱，用0. 015-0. 025mol/L、pH為7. 1-7. 3的Tris-HCl緩沖液洗 至分層明顯，之后注入DEAE-S印hadex-A50,將層析柱連接到組合紫外檢測儀和HW-2000色 譜工作站，定時為5~20min/管，用0. 015-0. 025mol/L，pH為7. 1-7. 3Tris-HCl緩沖液洗 平衡后上Abcp，待Abcp進入DEAE-52的界面時，開始平衡洗脫，先用0· 015-0. 025mol/L，pH 為7. 1-7. 3的Tris-HCl緩沖液洗脫平衡，收集主峰A的洗脫液；
[0018] 當收集完主峰A的洗脫液之后，層析柱繼續(xù)用0. 1~0. 5mol/L連續(xù)梯度溶度的 NaCl溶液進行洗脫，控制流速為0. 15-0. 25mL/min，進行部分收集，每5~20min收集1管， 每管的量是2~10mL，采用苯酚-硫酸法測偶數(shù)管多糖濃度，根據(jù)所測得數(shù)據(jù)，繪制成多糖 含量分布圖，再根據(jù)多糖含量分布圖與洗脫譜圖收集主峰B的洗脫液，合并主峰B的洗脫 液，主峰B的洗脫液經(jīng)4. 5-5. 5KDa超濾膜超濾脫鹽，超濾得到的截留液進行離心機離心，離 心機的轉速控制在11500_12500rpm之間，離心溫度為15-25°C，離心時間為10_20min，收集 上清液，即得酸性粗多糖AbaplOO ;
[0019] 步驟（3)中所述Sephadex G-200預處理的具體工藝為：將Sephadex G-200干膠 浸泡在蒸餾水中，不斷攪拌，放置于室溫下膨脹45-50h，并除去表面的碎片和沉降緩慢的細 小顆粒，之后利用真空干燥器除盡凝膠液中的空氣。
[0020] 步驟（3)的b工藝具體為：將預處理后的Sephadex G-200填入層析柱中，將層析 柱連接到組合紫外檢測儀和HW-2000色譜工作站，用去離子水洗平衡，平衡后使液面降至 填料界面時上樣品AbaplOO,待樣品完全進入填料界面時用0. 015-0. 025mol/L的NaCl溶液 洗脫，控制流速為0. 15-0. 250mL/min，分部收集，每5~20min收集1管，每管的量是2~ 10mL，用苯酚-硫酸法測各管多糖濃度，根據(jù)所測得數(shù)據(jù)，繪制成多糖含量分布圖，根據(jù)多 糖含量分布圖與洗脫譜圖，收集主峰E的洗脫液，合并主峰E的洗脫液，對主峰E的洗脫液 用4. 5-5. 5KDa超濾膜進行超濾到9-1 lmL，進行冷凍真空干燥后，得多糖純品Abap 1001。
[0021] 步驟（3)的b工藝具體為：將預處理后的Sephadex G-200填入層析柱中，將層析 柱連接到組合紫外檢測儀和HW-2000色譜工作站，用去離子水洗平衡，平衡后使液面降至 填料界面時上樣品AbaplOO,待樣品完全進入填料界面時用0. 015-0. 025mol/L的NaCl溶液 洗脫，控制流速為0. 15-0. 250mL/min，分部收集，每5~20min收集1管，每管的量是2~ 10mL，用苯酚-硫酸法測各管多糖濃度，根據(jù)所測得數(shù)據(jù)，繪制成多糖含量分布圖，根據(jù)多 糖含量分布圖與洗脫譜圖，收集主峰F的洗脫液，合并主峰F的洗脫液，對主峰F的洗脫液 用4. 5-5. 5KDa超濾膜進行超濾到9-llmL，進行冷凍真空干燥后，得多糖純品Abap100 2。
[0022] 步驟（2)的b步驟中：所選用的層析柱為2. 6cmX50cm層析柱，DEAE-52填料填的 高度為柱高的2/5_3/5,填入DEAE-Sephadex_A50的高度為8-llcm，Abcp的上樣量為5-10 毫升。
[0023] 步驟（3)的b步驟中：所選用的層析柱為2. 6cmX 50cm層析柱，Sephadex G-200 填入的高度為35-45cm，AbaplOO的上樣量為5-10毫升。
[0024] 以上所述的NaCl溶液為以NaCl作溶質，0· 015-0. 025mol/L，pH為7. 1-7. 3的 Tris-HCl緩沖液作溶劑配得的溶液。
[0025] 所述的活性多糖AbaplOOl的應用，其特征在于：在制備治療急性肝損傷藥物以及 抗腫瘤藥物中的應用。
[0026] 所述的活性多糖Abap100 2的應用，其特征在于：在制備治療急性肝損傷藥物以及 抗腫瘤藥物中的應用。
[0027] 較之現(xiàn)有技術而言，本發(fā)明的優(yōu)點在于：1)本發(fā)明提取純化的活性多糖 AbaplOOl、活性多糖Abap100 2對急性肝損傷具有良好的保護活性可以作為潛在的急性肝 損傷治療藥物或者可以用于制備治療急性肝損傷的藥物；2)本發(fā)明提取純化的活性多糖 AbaplOOl、活性多糖Abap100 2具有良好的抗腫瘤活性，它們可以作為潛在的抗腫瘤藥物或 者可以用于制備抗腫瘤藥物；3)本發(fā)明將廢棄的雙孢蘑菇罐頭加工過程中產(chǎn)生的工業(yè)廢 水作為原料，提取純化出能夠為人們所用的活性多糖，這不僅將廢水變廢為寶，減少了廢水 的排放量，降低了對環(huán)境的污染程度，而且為人們帶來了具有良好生物活性的活性多糖；4) 本發(fā)明的提取純化工藝簡單易實施，且得到高純度的活性多糖。
【附圖說明】
[0028] 圖1是本發(fā)明多糖Abnp 1001的單糖組分分析圖。
[0029] 圖2是本發(fā)明多糖Abnp 1002的單糖組分分析圖。
[0030] 圖3是本發(fā)明多糖AbaplOOl的單糖組分分析圖。
[0031] 圖4是本發(fā)明多糖Abap 1002的單糖組分分析圖。
[0032] 圖5是本發(fā)明實施例1粗多糖Abcp的洗脫曲線及多糖含量分布圖。
[0033] 圖6是本發(fā)明實施例1中性粗多糖Ab