專(zhuān)利名稱(chēng)：：人羧肽酶A抑制因子Latexin的單克隆抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及人羧肽酶A抑制因子Latexin的單克隆抗體，同時(shí)涉及所述單克隆抗體的制備方法以及產(chǎn)生所述單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，還涉及含有所述單克隆抗體的試劑盒、所述單克隆抗體在檢測(cè)Latexin基因及其編碼蛋白的水平中的應(yīng)用、以及所述單克隆抗體在制備具有檢測(cè)或輔助診斷腫瘤作用的組合物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：癌基因和抑癌基因的研究使人們逐步認(rèn)識(shí)癌變的分子過(guò)程，推動(dòng)了細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)理論知識(shí)的積累，同時(shí)為腫瘤防治提供分子靶點(diǎn)。羧肽酶A具有蛋白水解和蛋白保護(hù)雙重功能，可提高彈性蛋白結(jié)合蛋白(EBP)的穩(wěn)定性，而EBP是成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、白細(xì)胞以及多種腫瘤細(xì)胞(包括黑色素瘤、肺癌、乳腺癌等)膜表面受體的構(gòu)成成分，介導(dǎo)了細(xì)胞與細(xì)胞基質(zhì)間的相互作用，在組織血管形成、白細(xì)胞浸潤(rùn)以及腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用(1、PshezhetskyAV,AshmarinaM.Lysosomalmultienzymecomplex:biochemistry,genetics,andmolecularpathophysiology./Vog.7Vwc/e/cj"'dMo/,所o/.2001;69:81-114.)。己有研究顯示人惡性黑色素瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移瘤組織內(nèi)的羧肽酶A活性明顯高于原發(fā)灶瘤組織內(nèi)的酶活性，提示羧肽酶A與惡性黑色素瘤的細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(2、KozlowskiL,WojtukiewiczMZ,OstrowskaH.CathepsinAactivityinprimaryandmetastatichumanmelanocytictumors,yirc//.Dermato/.2000Feb-Mar;292(2-3):68-71.)，早期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也提示羧肽酶A的蛋白水解活性與胰腺癌的腫瘤發(fā)生相關(guān)(3、RabanalR,FondevilaD，VargasA,RamisA,BadiolaJ,FerrerL.Immunocytochemicaldetectionofamylase,carboxypeptidaseA,carcinoembryonicantigenandalpha1-antitrypsinincarcinomasoftheexocrinepancreasofthedog.K".5W.1992Mar;52(2):217-223.)。Latexin基因及其編碼的Latexin蛋白是羧肽酶A抑制因子。Latexin蛋白最早是由ArimatsuY.等應(yīng)用單克隆抗體PC3.1從大鼠腦組織中分離到的蛋白分子，隨后的研究顯示Latexin蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)大腦皮層V和皮層VI的特異神經(jīng)元細(xì)胞群中表達(dá)，在外周神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)則僅限于小直徑的初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元細(xì)胞(4、ArimatsuY,MiyamotoM,NihonmatsuI,HirataK，UrataniY,HatanakaY,Takiguchi陽(yáng)HayashiK.Earlyregionalspecificationforamolecularneuronalphenotypeintheratneocortex.尸roc.jVaZ/.爿cat/.5W.SA1992Octl;89(19):8879-8883.;5、ArimatsuY.Latexin:amolecularmarkerforregionalspecificationintheneocortex.jVewmsr/.ie義1994Aug;20(2》131-135.;6、ArimatsuY,IshidaM,Takiguchi-HayashiK，UrataniY.Cerebralcorticalspecificationbyearlypotentialrestrictionofprogenitorcellsandlaterphenotypecontrolofpostmitoticneurons.Dev—1999Feb;126(4):629-638.;7、MiyasakaN，HatanakaY,JinM，ArimatsuY.Genomicorganizationandregulatoryelementsoftheratlatexingene,whichisexpressedinacelltype-specificmannerinbothcentralandperipheralnervoussystems.5ra/"她/.Sra!、1999May21;69(1):62-72.)。已有的少數(shù)關(guān)于Latexin基因的功能研究主要是在大鼠中進(jìn)行，大鼠Latexin蛋白是羧肽酶A的抑制劑，可在體外抑制羧肽酶Al、A2的蛋白水解活性(8、No畫(huà)ntE,MartresMP,SchwartzJC，GrosC.Purification,cDNAcloning,functionalexpression,andcharacterizationofa26-kDaendogenousmammaliancarboxypeptidaseinhibitor.Prac.Ato/.^cad5W.USA1995Dec19;92(26):12225-12229.)，大鼠Latexin蛋白可能通過(guò)控制蛋白酶的活性參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞的功能(9、BaiWZ，IshidaM，ArimatsuY.ChemicallydefinedfeedbackconnectionsfrominfragranularlayersofsensoryassociationcorticesintheratjVew簡(jiǎn)dewce.2004;123(l》257-267.)。近來(lái)有研究顯示大鼠Latexin蛋白與類(lèi)固醇/甲狀腺激素受體超家族成員Nuirl核受體在大腦皮層V、Via以及新皮層側(cè)區(qū)的白質(zhì)中共表達(dá)(10、ArimatsuY，IshidaM,KanekoT,IchinoseS，OmoriA.Organizationanddevelopmentofcorticocorticalassociativeneuronsexpressingtheorphannuclearrec印torNurrl.J.Cow;.Wewra/.2003Nov10;466(2):180-196.)，也有研究發(fā)現(xiàn)在大鼠造骨細(xì)胞的高分化階段檢測(cè)到Latexin基因的高表達(dá)(11、BalintE,LapointeD，DrissiH,vanderMeijdenC,YoungDW,vanWijnenAJ，SteinJL,SteinGS，LianJB.Phenotypediscoverybygeneexpressionprofiling:mappingofbiologicalprocesseslinkedtoBMP-2-mediatedosteoblastdifferentiation.O;〃說(shuō)oc/zew.2003May15;89(2):401-426.)，但都沒(méi)有關(guān)于Latexin蛋白的進(jìn)一步功能提示，關(guān)于Latexin蛋白與腫瘤相關(guān)性的研究更未見(jiàn)報(bào)道。人羧肽酶A抑制因子一一Latexin基因是在人胃粘膜上皮細(xì)胞多步癌變過(guò)程中克隆到的基因。Latexin基因來(lái)源于GES-1與MC細(xì)胞系(GES-1細(xì)胞系是人胎兒胃粘膜上皮細(xì)胞經(jīng)SV40轉(zhuǎn)化而成的永生化細(xì)胞系，GES-1細(xì)胞再經(jīng)化學(xué)致癌劑MNNG處理轉(zhuǎn)4化成為具有惡性表型的MC細(xì)胞系)的差異顯示分析，在GES-1細(xì)胞中高表達(dá)(12、柯楊，寧濤，王冰，路桂榮，馮莉雅，李吉友，呂有勇，鄂征.人胃粘膜上皮細(xì)胞系GES-1的建立及其生物學(xué)特性.中舉,蘑染志1994;16(1):7-10.;13、蘇秀蘭，柯楊，王冰，寧乾馮莉雅，路桂榮，舍英.MNNG誘導(dǎo)人胃粘膜上皮細(xì)胞系GES-1及正常胃粘膜標(biāo)本原癌基因的激活.^舉##染盧1995;17:42-43.;14、柯楊，徐國(guó)威，KoichiHagiwara,張建明，寧濤，王冰，蘇秀蘭，馮莉雅，路桂榮，呂有勇，CurtisC.Harris.化學(xué)致癌作用靶基因的分離與測(cè)序.^房W學(xué).1996;26(1):85-91.)。Latexin基因(登錄號(hào)NM—020169)的cDNA全長(zhǎng)1144bp，其序列如SEQIDNo.1所示，具有669bp的開(kāi)放閱讀框架(ORF)，編碼222個(gè)氨基酸(編碼的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，本發(fā)明中稱(chēng)為L(zhǎng)atexin蛋白)，與大鼠Latexin基因編碼的氨基酸序列存在84%的同源性，而且兩者均具有相同的11個(gè)氨基酸殘基(，LWHPQYGTKVK刑)的羧肽酶A作用結(jié)構(gòu)域(15、HiraiwaM.CathepsinA/protectiveprotein:anunusuallysosomalmultifunctionalprotein.Ce//iWo/.Zz/e5W.1999;56(ll-12):894-907.)，提示Latexin蛋白也可能通過(guò)抑制羧肽酶A的活性參與腫瘤細(xì)胞多種生物學(xué)過(guò)程的調(diào)控。臨床上研究表明，腫瘤相關(guān)的分子標(biāo)志對(duì)腫瘤的診斷和治療起著重要的作用。但是，由于腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性和發(fā)生機(jī)制的復(fù)雜性，目前已知的分子標(biāo)志只能解決部分患者的早期診斷和治療指標(biāo)的問(wèn)題，因此尋找新的腫瘤標(biāo)志分子，將為臨床早發(fā)現(xiàn)早診斷和早治療提供更多更可靠的靶分子，是腫瘤研究的重要內(nèi)容。目前臨床上迫切需要高度的抗原結(jié)合特異性的單克隆抗體，以有助于Latexin的功能檢測(cè)，從而適于腫瘤的臨床診斷、預(yù)后判斷，并指導(dǎo)臨床治療。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供人羧肽酶A抑制因子Latexin的單克隆抗體，該單克隆抗體對(duì)SEQIDNo.2所示蛋白有特異性。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供產(chǎn)生所述單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供制備所述單克隆抗體的方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供所述單克隆抗體在檢測(cè)Latexin基因及其編碼蛋白的水平中的應(yīng)用，優(yōu)選所述水平為在細(xì)胞內(nèi)的分布水平。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種檢測(cè)試劑盒，該試劑盒含有所述的單克隆抗體、和用于與單克隆抗體結(jié)合的標(biāo)記物。5本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供所述單克隆抗體在制備具有檢測(cè)和/或輔助診斷腫瘤作用的組合物中的應(yīng)用。本案發(fā)明人已利用差異顯示法在人胃粘膜上皮細(xì)胞多步癌變過(guò)程中克隆到人羧肽酶A抑制因子——Latexin基因，人Latexin的序列如SEQIDNo.1所示。為了進(jìn)一步研究Latexin，本發(fā)明應(yīng)用雜交瘤技術(shù)制備了人羧肽酶A抑制因子Latexin的單克隆抗體。首先，本發(fā)明的一個(gè)方面是提供了一種對(duì)SEQIDNo.2所示蛋白有特異性的單克隆抗體。本發(fā)明中所述的"抗體的特異性"是指單克隆抗體對(duì)相應(yīng)抗原或近似抗原物質(zhì)的識(shí)別能力。特異性高，抗原的識(shí)別能力就強(qiáng)。本發(fā)明中SEQIDNo.2所示蛋白可以是由SEQIDNo.1第216至884位核苷酸編碼產(chǎn)生。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的單克隆抗體對(duì)GST(谷胱苷肽轉(zhuǎn)移酶)-Latexin融合蛋白有特異性，對(duì)谷胱苷肽轉(zhuǎn)移酶沒(méi)有特異性。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，所述的單克隆抗體是由保藏號(hào)為CGMCCNo.2336的細(xì)胞株分泌產(chǎn)生。抗體類(lèi)型屬于IgGl。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了產(chǎn)生所述單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。按照《國(guó)際承認(rèn)用于專(zhuān)利程序的微生物保存布達(dá)佩斯條約》的規(guī)定，一種產(chǎn)生本發(fā)明單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株已保藏在國(guó)際保藏單位之一一一中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCenter,CGMCC，地址中國(guó)北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼100101)，保藏日期2008年1月10日，保藏編號(hào)CGMCCNo.2336，分類(lèi)命名小鼠雜交瘤細(xì)胞(Mowse/3^〃'(i蘭(3)。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了一種制備所述單克隆抗體的方法。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，是將本發(fā)明如SEQIDNo.2所示蛋白與已知的標(biāo)簽形成重組蛋白作為抗原，以制備獲得本發(fā)明的單克隆抗體。所述的標(biāo)簽選自，但不限于，組氨酸標(biāo)簽(His標(biāo)簽)、谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽(GST標(biāo)簽)、HA標(biāo)簽、HSV標(biāo)簽、Myc標(biāo)簽和VSV-G-標(biāo)簽。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，采用GST與如SIQIDNo.2所示蛋白形成的重組蛋白。制備本發(fā)明的單克隆抗體所用的抗原可以按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)固相合成方法合成。例如本發(fā)明如SEQIDNo.2所示蛋白可以按StewardandYoung(Steward,J.M.禾口Young,J.D.,SolidPhasePeptideSynthesis,2ndEd.，PierceChemicalCompany，Rockford,111.,(1984))描述的方法用AppliedBiosystem合成儀或Pioneer肽合成儀按固相化學(xué)技術(shù)合成。優(yōu)選本發(fā)明的抗原通過(guò)基因工程的方法獲得，利用在原核生物中表達(dá)含有編碼本發(fā)明的抗原的多核苷酸序列。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知適用于表達(dá)本發(fā)明的抗原的載體?？筛鶕?jù)所選用的適當(dāng)啟動(dòng)子和待表達(dá)的結(jié)構(gòu)基因序列來(lái)選擇適當(dāng)?shù)妮d體。可使用任何適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞表達(dá)本發(fā)明的抗原。可提到的適當(dāng)宿主的例子包括原核細(xì)胞如大腸桿菌、芽孢桿菌、鏈霉菌等。轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的方法是本領(lǐng)域已知的，包括，但不限于，病毒感染、氯化鈣轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、電穿孔法或微粒轟擊法等。為了活化啟動(dòng)子、選擇轉(zhuǎn)化體或擴(kuò)增所需的基因，可以在適當(dāng)修飾的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)被轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。培養(yǎng)中所使用的溫度、pH值等培養(yǎng)條件一般都是由所選用的表達(dá)特定蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞決定的，并且這些條件都是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。為了大量獲得重組蛋白，可以采用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，并利用誘導(dǎo)物誘導(dǎo)基因的表達(dá)。實(shí)質(zhì)上，"誘導(dǎo)物"可以是任何能誘導(dǎo)宿主中基因表達(dá)的物質(zhì)，可以化學(xué)物質(zhì)或環(huán)境刺激，如，暴露于特定波長(zhǎng)的光下。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，采用的誘導(dǎo)物為IPTG(異丙基-e-D-硫代半乳糖苷)。在本發(fā)明的一具體實(shí)施例中，應(yīng)用SMARTRACEcDNA擴(kuò)增試劑盒(amplificationkit)，經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄及特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增以及質(zhì)粒水平上的核苷酸序列重組得到了Latexin基因讀碼框的全長(zhǎng)序列；并通過(guò)BamHI和SalI酶切、連接等步驟將包含Latexin基因全部開(kāi)放讀碼框的669bp核苷酸序列克隆到原核表達(dá)載體pGEX-4T-3(購(gòu)自Promega)中，構(gòu)建成pGEX-4T-3-Latexin的原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，在IPTG的誘導(dǎo)下，分子量約50kD的pGEX-Latexin融合蛋白以包涵體形式存在。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，以GST-Latexin融合蛋白作為抗原免疫小鼠，取小鼠的脾細(xì)胞作為能夠產(chǎn)生抗體的漿細(xì)胞(免疫細(xì)胞)，與同系動(dòng)物的骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。篩選能夠產(chǎn)生目的抗體的雜交瘤細(xì)胞，進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，并建立雜交細(xì)胞株。上述方法僅是示例性的，例如可以用同樣的方法免疫其他哺乳動(dòng)物，將其脾細(xì)胞作為免疫細(xì)胞。還可以選擇適宜的骨髓瘤細(xì)胞用于融合，例如用來(lái)自大鼠、小鼠或倉(cāng)鼠的骨髓瘤細(xì)胞。免疫細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合可以按照常規(guī)方法進(jìn)行(Milsteinetal.,MechodsEnzymol.,1981,73,3-46)。更具體地說(shuō)，免疫細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞可以按照1:51:10的比例混合在培養(yǎng)基中充分混合，在融合促進(jìn)劑的作用下進(jìn)行細(xì)胞融合，例如將預(yù)熱至37。C的PEG(平均分子量1,000-6,000)溶液以30%60%(W/V)的比例加入培養(yǎng)基。7可以作為融合促進(jìn)劑的物質(zhì)還有仙臺(tái)病毒(HVJ)，此外，還可以根據(jù)需要適當(dāng)加入佐劑(如二甲基亞砜)以增強(qiáng)融合效果。用于融合的培養(yǎng)基包括RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基以及其他可用于此類(lèi)培養(yǎng)的培養(yǎng)基，還可以根據(jù)需要補(bǔ)加新生小牛血清等物質(zhì)。可以用普通的選擇培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞，例如用含有次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶核苷的HAT培養(yǎng)基。在HAT培養(yǎng)基中持續(xù)培養(yǎng)足夠的時(shí)間，以使雜交瘤以外的細(xì)胞(非融合細(xì)胞)死亡，一般為幾天至幾周。然后篩選產(chǎn)生目的抗體的雜交瘤細(xì)胞并進(jìn)行單克隆化。得到的產(chǎn)生本發(fā)明單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，可以在普通培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)或者在液氮長(zhǎng)時(shí)間保存。從雜交瘤細(xì)胞收集本發(fā)明的單克隆抗體時(shí)，可以從雜交瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)上清液中獲得抗體，或者將雜交瘤細(xì)胞注入適宜的哺乳動(dòng)物并從動(dòng)物腹水中獲取抗體。前一種方法適于獲得高純度的抗體，后一種方法適于大量獲取抗體。通過(guò)上述方法獲得的抗體，可以用常規(guī)方法純化，例如鹽析、凝膠過(guò)濾、親合色譜等方法。在本發(fā)明的一具體實(shí)施方案中，所述制備單克隆抗體的方法包括用GST-Latexin融合蛋白免疫小鼠，取小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選出能夠分泌對(duì)SEQIDNo.2所示蛋白有反應(yīng)性、對(duì)谷胱苷肽轉(zhuǎn)移酶沒(méi)有反應(yīng)性的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，從雜交瘤細(xì)胞上清液中或從注射雜交瘤細(xì)胞后的動(dòng)物腹水中獲取單克隆抗體。在該方案中，具體是用純化的GST-Latexin融合蛋白常規(guī)免疫Balb/c小鼠，血清效價(jià)達(dá)10—5時(shí)，將免疫小鼠脾細(xì)胞與SP20骨髓瘤細(xì)胞融合。HAT選擇培養(yǎng)第10天，雜交瘤細(xì)胞融合率約為60%。融合后第13天進(jìn)行第一次ELISA雙篩、亞克隆，此后重復(fù)進(jìn)行ELISA雙篩及亞克隆34次，直至每個(gè)單克隆孔均為GST-Latexin強(qiáng)陽(yáng)性而GST陰性為止。該方案中篩選出了四株雜交瘤細(xì)胞株，其中命名為1G11的雜交瘤細(xì)胞株即為前述保藏編號(hào)為CGMCCNo.2336的雜交瘤細(xì)胞株，該雜交瘤細(xì)胞株能穩(wěn)定分泌抗Latexin的單克隆抗體，體外連續(xù)培養(yǎng)2個(gè)月以上及液氮凍存4個(gè)月后，仍能穩(wěn)定分泌單克隆抗體。將該株雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，能誘導(dǎo)Balb/c小鼠產(chǎn)生抗人Latexin的腹水，腹水產(chǎn)量在310ml之間，其效價(jià)達(dá)10—6。雜交瘤細(xì)胞株1G11所分泌產(chǎn)生的單克隆抗體(本發(fā)明中命名為單克隆抗體1G11)，具有高度的抗原結(jié)合特異性。在本發(fā)明的一具體實(shí)施方案(實(shí)施例三)中，為分析Latexin單克隆抗體的特異性，本發(fā)明用純化的GST及GST-Latexin融合蛋白包被96孔板，ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，包被純化的GST-Latexin融合蛋白的孔1G11為強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，包被GST蛋白的孔均為陰性。8本發(fā)明還提供了本發(fā)明的單克隆抗體的用途。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了所述單克隆抗體在檢測(cè)Latexin基因及其編碼蛋白的水平中的應(yīng)用，優(yōu)選所述水平為在細(xì)胞內(nèi)的分布水平。本發(fā)明的單克隆抗體特異性強(qiáng)、純度高、效價(jià)高，并可同時(shí)應(yīng)用于ELISA方法，WesternBlot雜交，免疫組織化學(xué)和細(xì)胞免疫化學(xué)方法檢測(cè)Latexin基因編碼蛋白的細(xì)胞核漿表達(dá)水平。本發(fā)明的另一個(gè)方面還提供了所述單克隆抗體在制備檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種檢測(cè)試劑盒，該試劑盒含有本發(fā)明的單克隆抗體、和用于與單克隆抗體結(jié)合的標(biāo)記物。本發(fā)明的單克隆抗體可以用任何已知的方法與作為檢測(cè)信號(hào)的標(biāo)記物結(jié)合，標(biāo)記物可以是放射性同位素、熒光化合物、生物素和酶等物質(zhì)。本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒還可進(jìn)一步包含用于檢測(cè)的試劑和/或緩沖液。本發(fā)明應(yīng)用所述的單克隆抗體，就人Latexin基因在人類(lèi)細(xì)胞及組織中的亞細(xì)胞定位及功能，特別是與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系進(jìn)行了研究，研究實(shí)驗(yàn)主要包括本發(fā)明利用所述的單克隆抗體，應(yīng)用免疫組織化學(xué)及WesternBlot技術(shù)，將Latexin蛋白定位于胞漿區(qū)(參見(jiàn)實(shí)施例四)。本發(fā)明還應(yīng)用免疫組織化學(xué)及WesternBlot技術(shù)檢測(cè)了Latexin蛋白在多種腫瘤細(xì)胞系及組織中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)Latexin基因在永生化細(xì)胞系GES-l中表達(dá)水平較高，而在十幾種腫瘤細(xì)胞系中表達(dá)水平較低或不表達(dá)；人Latexin蛋白在胃癌和食管癌組織的檢出率均顯著低于其對(duì)應(yīng)的遠(yuǎn)端正常組織；賁門(mén)癌各個(gè)病理分期的檢測(cè)結(jié)果顯示從高分化至低分化的組織中Latexin蛋白表達(dá)量遞減(參見(jiàn)實(shí)施例五)。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果有力提示Latexin基因的表達(dá)水平與胃癌、食管癌等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展呈負(fù)相關(guān)，是一個(gè)新的候選抑癌基因。由于本發(fā)明的單克隆抗體具有高度的抗原結(jié)合特異性，利用本發(fā)明的單克隆抗體檢測(cè)Latexin蛋白在多種腫瘤細(xì)胞系及組織中的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)Latexin基因在永生化細(xì)胞系GES-l中表達(dá)水平較高，而在十幾種腫瘤細(xì)胞系中表達(dá)水平較低或不表達(dá)。因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面還提供了本發(fā)明的單克隆抗體在制備具有檢測(cè)和/或輔助診斷腫瘤作用的組合物中的應(yīng)用。本發(fā)明中已檢測(cè)的腫瘤具體包括胃癌、食管癌和賁門(mén)癌。本發(fā)明通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)本發(fā)明的單克隆抗體，尤其是1G11，具有以下兩個(gè)顯著的特點(diǎn)(一)高度的抗原結(jié)合特異性，主要的實(shí)驗(yàn)證據(jù)包括1.免疫裸鼠應(yīng)用GST-Latexin融合蛋白，而獲得的單克隆抗體1G11經(jīng)ELISA法檢測(cè)(參見(jiàn)實(shí)施例三)證實(shí)，1G11為強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，而包被GST蛋白的孔均為陰性；2.應(yīng)用WesternBlot方法對(duì)永生化和腫瘤細(xì)胞系以及11種4月齡胎兒組織中Latexin蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)(參見(jiàn)實(shí)施例四)，結(jié)果顯示Latexin主要分布在細(xì)胞漿，雜交帶行單一，對(duì)應(yīng)分子量大小與Latexin蛋白的分子大小一致；應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)四種細(xì)胞系(參見(jiàn)實(shí)施例四)的結(jié)果顯示，Latexin蛋白主要分布在細(xì)胞漿中；3.應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)胃癌、食管癌及其遠(yuǎn)端的正常組織以及賁門(mén)癌中Latexin蛋白的表達(dá)(參見(jiàn)實(shí)施例五)，結(jié)果顯示Latexin蛋白主要在腺體細(xì)胞的胞漿中表達(dá)。(二)由于本發(fā)明的單克隆抗體與Latexin高度特異性結(jié)合，而針對(duì)抗原Latexin蛋白發(fā)揮抑癌作用，因此，本發(fā)明的單克隆抗體可廣泛應(yīng)用于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、放射免疫分析、WesternBlot、免疫組化等技術(shù)。主要的實(shí)驗(yàn)證據(jù)包括1.應(yīng)用單克隆抗體1G11進(jìn)行的消化道腫瘤(包括胃癌、食管癌和賁門(mén)癌及遠(yuǎn)端的正常對(duì)照組織)的免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，Latexin蛋白在腫瘤組織中的表達(dá)水平明顯低于其正常對(duì)照組織(參見(jiàn)實(shí)施例五)；2.應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN構(gòu)建Latexin基因的反義cDNA序列的重組體(pLXSN-LatexinAntisense)，轉(zhuǎn)染Latexin蛋白基礎(chǔ)表達(dá)水平較高的人胃粘膜腺癌細(xì)胞系BGC823并篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。進(jìn)一步的克隆形成率實(shí)驗(yàn)分析顯示轉(zhuǎn)染反義Latexin基因的BGC823細(xì)胞生長(zhǎng)速度加快，克隆形成能力明顯增強(qiáng)(參見(jiàn)實(shí)施例六)；3.BGC823細(xì)胞裸鼠致瘤性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pLXSN-LatexinAntisense的BGC823細(xì)胞裸鼠致瘤能力顯著降低，高度支持Latexin基因具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的功能(參見(jiàn)實(shí)施例六)。所以，本發(fā)明所制備的Latexin單克隆抗體IGII為進(jìn)一步深入研究Latexin基因的功能及其與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)性的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，有利于深入探討Latexin基因的功能及其抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的分子機(jī)制，并有利于開(kāi)展Latexin基因與腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移等細(xì)胞生物學(xué)行為的相關(guān)性研究。圖1顯示應(yīng)用內(nèi)切酶EcoRI鑒定pcDNA3-Latexin重組質(zhì)粒；其中，M:DNAladdermix。圖2為pcDNA3-Latexin重組質(zhì)粒測(cè)序圖。圖3為pGEX-4T-3-Latexin表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖。圖4顯示GST-Latexin融合蛋白的表達(dá)與純化結(jié)果；其中，M:低分子量蛋白marker;1:IPTG誘導(dǎo)前轉(zhuǎn)化pGEX-4T-3-Latexin質(zhì)粒的BL21細(xì)菌總蛋白；2:IPTG誘導(dǎo)1小時(shí)后轉(zhuǎn)化pGEX-4T-3-Latexin質(zhì)粒的BL21細(xì)菌總蛋白；3:IPTG誘導(dǎo)4小時(shí)后轉(zhuǎn)化pGEX-4T-3-Latexin質(zhì)粒的BL21細(xì)菌總蛋白；4:應(yīng)用GlutathioneSepharose4B純化的GST-Latexin融合蛋白。圖5顯示ELISA法檢測(cè)單克隆抗體的特異性結(jié)果；其中，系列1:GST-Latexin;系歹'J2:GST。圖6A顯示W(wǎng)esternBlot方法檢測(cè)抗Latexin蛋白的單克隆抗體1G11的特異性。圖6B顯示W(wǎng)esternBlot方法檢測(cè)Latexin蛋白在細(xì)胞系中的核漿表達(dá)情況；其中，GES-1:人胃粘膜永生化細(xì)胞；MC、N87禾I3MGC803均為人胃癌細(xì)胞系；C:細(xì)胞漿蛋白；N:細(xì)胞核蛋白。所用一抗為1G11單克隆抗體，以1:500稀釋。圖6C顯示11種人4月齡胎兒組織中Latexin蛋白在的表達(dá)情況；其中，1:BGC823做陽(yáng)性對(duì)照；2:腦；3:心；4:肺；5:胃；6:肝；7:睥；8:小腸；9:結(jié)腸；10:腎；11:骨骼??；12:皮膚；所用一抗為1G11單克隆抗體，以1:500稀釋。圖7顯示免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)Latexin蛋白在細(xì)胞系核漿分布情況；其中，A:胃癌細(xì)胞系BGC823;B:胃粘膜永生化細(xì)胞系GES-1;C:胃癌細(xì)胞系MC;D:胃癌細(xì)胞系N87。所用一抗為1G11單克隆抗體，以1:100稀釋?zhuān)珼AB顯色后再經(jīng)10%蘇木素復(fù)染(200X)。圖8為免疫組織化學(xué)方法顯示Latexin蛋白在腫瘤組織及其遠(yuǎn)端正常組織中的表達(dá)情況；其中，A:胃癌；B:正常胃組織；C:食管癌；D:正常食管組織；E:賁門(mén)癌；F:正常賁門(mén)組織。所用一抗為1G11單克隆抗體，以1:100稀釋(200X)。圖9A和圖9B顯示轉(zhuǎn)染反義Latexin基因?qū)ξ赴┘?xì)胞系BGC823克隆形成能力的影響；圖9A中，1:BGC823;2:BGC823-pLXSN;3:BGC823-Anti-Latexin;圖9B中，pLXSN:胃癌細(xì)胞系BGC823轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN;Anti-Latexin:BGC823細(xì)胞轉(zhuǎn)染pLXSN-反義LatexincDNA序列。圖10A和圖10B顯示Latexin基因表達(dá)水平對(duì)BGC823細(xì)胞裸鼠致瘤性的影響；圖10B中，1和2組織蛋白取自轉(zhuǎn)染pLXSN空載的BGC823細(xì)胞接種裸鼠組，3和4組織蛋白取自轉(zhuǎn)染pLXSN-Latexin反義的BGC823細(xì)胞接種裸鼠組。用于專(zhuān)利程序的微生物保存保藏日期2008年1月10日；保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC);保藏編號(hào)CGMCCNo.2336;分類(lèi)命名小鼠雜交瘤細(xì)胞(Afoz^/7y6rWowa)。具體實(shí)施例方式為了更清楚地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面通過(guò)具體實(shí)施例并配合附圖進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不因此而受到任何限制。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠(chǎng)商所建議的條件；實(shí)施例中所用到的各種常用化學(xué)試劑，除標(biāo)注外，均購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司。實(shí)施例一.Latexin基因全長(zhǎng)讀碼區(qū)序列的獲得及鑒定一.RACE法擴(kuò)增Latexin5'末端1.細(xì)胞總RNA的制備使用Invitrogene公司的產(chǎn)品TrizolLSReagent(Cat.No.10296-010)，按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)操作。2.用SMARTRACEcDNA擴(kuò)增試劑盒(購(gòu)自Clontech公司)獲得Latexin5'末端片段2.1cDNA第一條鏈的合成lOmMPolyOligo*(dT)lpl細(xì)胞總RNA3W(1昭)SMARTIIAOligo**(10mM)lpl丄70°C5min，冰浴2min丄5x第一條鏈合成液2plDTT(20mM)1^1dNTPC10mM)lplPowerScript逆轉(zhuǎn)錄酶lpl丄42°C1.5小時(shí)丄終止反應(yīng)時(shí)向反應(yīng)管內(nèi)加入100mlTricine-EDTA緩沖液，72°C，加熱7min。2.2PCR擴(kuò)增LatexincDNA片段根據(jù)Latexin3'端片段設(shè)計(jì)特異3'PCR引物，其中具有Latexin片段單一的Sspl切點(diǎn)，位置在5'端447bp處。12PCR反應(yīng)體系(50nl)10xAdvantage2PCR緩沖液(Buffer)5|al50xdNTPmixl^il5'PCR引物IIA***(10pM)l^il3'Latexin特異引物""(10pM)lpl50xAdvantage2聚合酶混合(PolymeraseMix)1^1cDNA產(chǎn)物lpl去離子水4(^1PCR反應(yīng)程序95。C預(yù)變性3min，95'C變性15秒，55'C復(fù)性30秒，72。C延長(zhǎng)2min，共30個(gè)循環(huán)。(注*5，_TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3，(SEQIDNo.3);**5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3'(SEQIDNo.4);5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'(SEQIDNo.5);****5，-CTGGAATATTTTGTGCTTCTAGC-3，(SEQIDNo.6);上述引物除試劑盒提供外，其余均為北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成)二.pcDNA3-Latexin基因讀碼區(qū)全長(zhǎng)序列重組質(zhì)粒的獲得1.將PCR擴(kuò)增片段連接到TA載體(購(gòu)自Promega)中，獲得TA/Latexin重組質(zhì)粒，測(cè)序鑒定。2.用內(nèi)切酶EcoRI(本發(fā)明具體實(shí)施例中所用內(nèi)切酶均購(gòu)自NEBENGLANDBioLabs公司)禾卩SspI從TA-Latexin中獲得Latexin5'末端470bp片段。3.內(nèi)切酶SspI和Xbal從pcDNA3-Latexin3'中獲得Latexin3'末端528bp片段。4.用EcoRI和XbaI對(duì)pcDNA3進(jìn)行雙酶切獲得pcDNA3線(xiàn)形載體。5.將Latexin5'EcoRI-SstI片段、Latexin3'SspI-XbaI片段和用SstI-EcoRI將pcDNA3線(xiàn)性化載體(購(gòu)自Invitrogen公司)用T4連接酶(購(gòu)自Promega)4'C連接過(guò)夜，構(gòu)建成可用EcoRI單一酶切即可釋放包括Latexin基因全部開(kāi)放閱讀框架(ORF)的669bp核苷酸序列在內(nèi)的pcDNA3-Latexin重組質(zhì)粒。6.測(cè)序鑒定。三.結(jié)果應(yīng)用內(nèi)切酶EcoRI鑒定pcDNA3-Latexin重組質(zhì)粒的結(jié)果見(jiàn)圖1;陽(yáng)性克隆進(jìn)一步測(cè)序鑒定，測(cè)序準(zhǔn)確結(jié)果見(jiàn)圖2?？梢源_定，本實(shí)施例中應(yīng)用SMARTRACEcDNA擴(kuò)增試劑盒，經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄及特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到了Latexin基因讀碼框的全長(zhǎng)序13列。將Latexin基因讀碼框的全長(zhǎng)序列進(jìn)一步構(gòu)建入pGEX-4T-3載體中，重組質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖3。實(shí)施例二.Latexin原核表達(dá)載體pGEX/Latexin的構(gòu)建、原核表達(dá)及抗原的純化一.Latexin原核表達(dá)載體pGEX/Latexin的構(gòu)建將pcDNA3-Latexin經(jīng)EcoRI酶切，回收并純化切出756bp的片段(LatexincDNA194887(SEQIDNo.1所示第194至887位)，此外包含一小段來(lái)自pcDNA3載體的序列)，將其克隆入pGEX-4T-3(購(gòu)自Promega)中，構(gòu)建成pGEX-4T-3-Latexin的原核表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)化BL21表達(dá)菌，鋪LBAmP+盤(pán)，挑克隆，小提質(zhì)粒，酶切鑒定，全自動(dòng)測(cè)序，鑒別插入片段和閱讀框架，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-Latexin融合蛋白。二.GST-Latexin重組蛋白的誘導(dǎo)、表達(dá)及純化1.無(wú)菌吸取經(jīng)上述鑒定后的pGEX-4T-3-Latexin陽(yáng)性菌5ml，接種于400mlLBAmp+培養(yǎng)液中，37。C200300g震蕩培養(yǎng)23h，至0D6(X)=1左右；2.細(xì)菌加IPTG(Promega)至終濃度為lmM，繼續(xù)培養(yǎng)，在4h后收集細(xì)菌；3.臺(tái)式離心機(jī)離心(400ml分裝成100ml、4管)4000g/min離心5min，棄上清，沉淀重懸于20ml用冰預(yù)冷過(guò)的lxPBS，混勻，此步后兩管并作一管，即每管有200ml細(xì)菌；4.于4°C4000g離心5min，棄上清；5.沉淀加細(xì)菌裂解液10ml(50pl/ml)，冰浴20min;6.超聲18Hz，約15秒x3次，每次中間間歇10秒，至細(xì)胞清亮，菌液不粘，并避免氣泡；7.加TritonX-100(Promega)至終濃度1%，冰浴1030min;(此步驟有助于融合蛋白溶解)8.15000g離心20min，收集上清；9.細(xì)菌的裂解上清中加200^1的經(jīng)PBS漂洗過(guò)的50%slurryofGlutathioneSepharose4B(谷胱苷肽瓊脂糖凝膠4B)，室溫下混合15min;10.于4°C500g離心10min，棄上清；11.收集吸附后的珠子，用lml的lmMPMSF(購(gòu)自SIGMA)/PBS或PBS洗珠子并轉(zhuǎn)移至1.5ml的離心管，于4'C500g離心10min，棄上清；12.重復(fù)第11步3次，每次混勻5min;13.力P100nl谷胱苷肽洗脫緩沖液(GlutathionElutionBuffer)，室溫下孵育10min;14.于室溫下500g離心5min，吸上清；15.重復(fù)13、14步2次；16.上清可用來(lái)定量lOD28。=0.5mg/ml，依次取1^1上清+9pl去離子水+10jal2xSDS-PAGE上樣緩沖液(buffer)，5^1去離子水+10pl2><SDS-PAGE上樣緩沖液，10pl上清+10nl2xSDS-PAGE上樣緩沖液，混勻，在沸水中煮35min;17.行10。/。SDS-PAGE膠電泳，考馬斯亮蘭染液染l10h，脫色液脫色30min10h，觀(guān)察重組蛋白的表達(dá)情況。三，結(jié)果將pGEX-4T-3-Latexin的原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化BL21細(xì)菌，在IPTG誘導(dǎo)下，能穩(wěn)定表達(dá)GST-Latexin融合蛋白，表達(dá)的融合蛋白的分子量約50kD，與推算值相符。該融合蛋白以包涵體形式存在。經(jīng)堿變性法提取包涵體，又經(jīng)SDS-PAGE、GlutathioneSepharose4B柱子純化，獲得了電泳純的GST-Latexin融合蛋白(請(qǐng)參見(jiàn)圖4，其中，M:低分子量蛋白marker;1:IPTG誘導(dǎo)前轉(zhuǎn)化pGEX-4T-3-Latexin質(zhì)粒的BL21細(xì)菌總蛋白；2:IPTG誘導(dǎo)1小時(shí)后轉(zhuǎn)化pGEX-4T-3-Latexin質(zhì)粒的BL21細(xì)菌總蛋白；3:IPTG誘導(dǎo)4小時(shí)后轉(zhuǎn)化pGEX-4T-3-Latexin質(zhì)粒的BL21細(xì)菌總蛋白；4:應(yīng)用GlutathioneSepharose4B純化的GST-Latexin融合蛋白；圖中箭頭所示即為GST-Latexin融合蛋白)。實(shí)施例三.人羧肽酶A抑制因子Latexin的單克隆抗體的制備、純化、鑒定1.動(dòng)物雌性，68W齡Balb/c小鼠4只(購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所)，1820g/只。2.抗原GST-Latexin融合蛋白由原核表達(dá)，SDS-PAGE膠純化，純度達(dá)電泳級(jí)，50嗎/只/次。3.免疫程序及途徑初次免疫Latexin抗原與等體積完全弗氏佐劑充分混勻，形成油包水，于鼠背部皮內(nèi)多點(diǎn)注射。四周后第一次加強(qiáng)免疫，Latexin抗原與不完全弗氏佐劑等體積混勻，背部皮內(nèi)多點(diǎn)注射。之后每隔一個(gè)月加強(qiáng)免疫一次并于加強(qiáng)后第10天取尾血2^1，用ELISA法測(cè)抗體效價(jià)。待抗體效價(jià)達(dá)10—5或10—6時(shí)，尾靜脈加強(qiáng)免疫(不加佐劑)，于三天后取脾，進(jìn)行細(xì)胞融合。4.細(xì)胞融合4.1飼養(yǎng)細(xì)胞的制備取兩只正常昆明小鼠，常規(guī)無(wú)菌取腹腔飼養(yǎng)細(xì)胞，加入含HAT選擇培養(yǎng)基中。4.2脾細(xì)胞的制備取免疫的Balb/c小鼠，無(wú)菌取脾，置于盛有無(wú)血清1640培養(yǎng)基的平皿中，過(guò)鋼絲網(wǎng)(200目)，收集過(guò)網(wǎng)后的脾細(xì)胞于試管中，靜置數(shù)min;吸出上層細(xì)胞放入50ml無(wú)菌試管中。4.3骨髓瘤SP2/0細(xì)胞的準(zhǔn)備取三瓶SP20細(xì)胞，棄培養(yǎng)液，加無(wú)血清1640培養(yǎng)基吹起，與上述分離的脾細(xì)胞混勻，1000g離心5min，棄上清，用無(wú)菌濾紙條吸凈培養(yǎng)基，輕輕彈起細(xì)胞。4.4融合于37'C水浴中，將50%PEG慢慢加入細(xì)胞中，邊加邊輕輕攪拌，lml50%PEG于lmin內(nèi)加完，繼續(xù)攪拌30秒，靜置30秒，于兩分鐘內(nèi)輕輕加入4.5ml無(wú)血清1640培養(yǎng)基，1000g離心5min，棄上清，輕輕打散沉淀細(xì)胞，少量HAT培養(yǎng)基懸浮后加到已配好的含腹腔飼養(yǎng)細(xì)胞的HAT培養(yǎng)基中，用尖吸管滴加在96孔板中(3滴/孔)，37°C，5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5.陽(yáng)性克隆篩選及亞克隆融合后10天進(jìn)行全換液，再過(guò)3天后進(jìn)行第一次ELISA雙篩，篩選到僅GST-Latexin包板陽(yáng)性而GST包板陰性的孔進(jìn)行亞克隆，710天進(jìn)行ELISA雙篩，對(duì)Latexin陽(yáng)性、GST陰性孔進(jìn)行第二次亞克隆，如此亞克隆35次，直至檢測(cè)所有孔均為L(zhǎng)atexin陽(yáng)性而GST陰性為止。選出四株單抗，分別為命名為1G11、1G7、1F9、1D6。擴(kuò)大培養(yǎng)、建株、凍存并制備腹水。其中，在選出的四株單抗中，命名為1G11的單抗能穩(wěn)定分泌抗Latexin的雜交瘤細(xì)胞株，體外連續(xù)培養(yǎng)2個(gè)月以上及液氮凍存4個(gè)月后，仍能穩(wěn)定分泌單克隆抗體，抗體類(lèi)型屬于IgGl。將1G11雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)能誘導(dǎo)Balb/c小鼠產(chǎn)生抗人Latexin的腹水，腹水產(chǎn)量在310ml之間，其效價(jià)達(dá)10—6。6.單克隆抗體的純化6.1小鼠雜交瘤腹水的制備及收集選取2022gBalb/c雌性小鼠，腹腔注射降殖烷(2,6,10,14-Tetramethylpen陽(yáng)tradecaneJANSSENCHIMICA)，0.5ml/只。一周后，腹腔注射雜交瘤細(xì)胞2xl0"只小鼠，710天后待小鼠腹部明顯膨脹后，收集腹水。將收集的腹水12000g離心30秒，去除底部沉淀和上層油脂，收集中段液體，-2(TC儲(chǔ)存待用。6.2雜交瘤上清的濃縮取待測(cè)雜交瘤上清至少15ml，加等量飽和硫酸胺(50%)，充分混勻，4"C放置過(guò)夜，次日10000g離心10min，沉淀用500^1去離子水溶解，4'C存放待用。6.3單克隆抗體的純化(高鹽-Pro.ASepharose4B柱純化)將收集的腹水以33%硫酸銨沉淀過(guò)夜，次日10000g離心4min，沉淀溶于去離子水中，對(duì)PBS透析。6.4高鹽結(jié)合緩沖液平衡柱子以高鹽結(jié)合緩沖液l:l稀釋待純化樣品，然后上樣(必要時(shí)可重復(fù)上樣)。用23個(gè)柱床體積的BandingBuffer流洗柱子直至流出液體OD值O.01。用pH2.6、0.1M的檸檬酸鈉緩沖液洗脫，用Eppendorf管收集洗脫液，1.5ml/管，紫外分光光度計(jì)測(cè)每管的OD280值，將峰值所在管的液體合并，再測(cè)OD280值，并推算所純化的單克隆抗體含量。用5MTris(pH8.8)調(diào)pH至7，PBS透析過(guò)夜。行SDS-PAGE電泳鑒定其純度，分裝、-7(TC儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?.單克隆抗體的儲(chǔ)存7.1純化的單克隆抗體透析至PBS中，以110mg/ml-70匸儲(chǔ)存；低濃度時(shí)，加1%BSA及0.02%疊氮鈉，-70°〇儲(chǔ)存。7.2雜交瘤上清力n1/20體積的lMTris(pH8.0)，并加0.02%疊氮鈉，-20。C保存，可保存數(shù)年；4'C可穩(wěn)定存放6個(gè)月。8.單克隆抗體的鑒定8.1酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)抗體特異性8.1.1ELISA包被液稀釋純化的GST-Latexin抗原至濃度為5嗎/ml，包被96孔板50pl/孔，4。C過(guò)夜；8.1.2用0.05%Tween20-PBS洗2遍，3%脫脂奶粉(PBS配制)封閉200^1/孔，室溫12小時(shí)或4'C過(guò)夜；8.1.30.05。/。Tween20-PBS洗2遍，加入不同稀釋度的抗血清(l(T3、l(T4、10-5、l(T6，用上述純化的GST-Latexin融合蛋白常規(guī)免疫昆明小鼠，經(jīng)三次加強(qiáng)免疫后，效價(jià)達(dá)10—5，取血得抗GST-Latexin融合蛋白的抗血清)和正常鼠血清(10—3)，50^1/孔，室溫1小時(shí)；8.1.40.05%Tween20-PBS洗5遍，加羊抗鼠HRP(1:1000,購(gòu)自中杉金橋公司)50pl/L,室溫1小時(shí)；8.1.5PBS洗5遍，力POPD顯色液lOOpl/孔，避光顯色，顯色后加終止液50^1/孔，觀(guān)察結(jié)果并用ELISAReader測(cè)OD492。ELISA實(shí)驗(yàn)方法同上，檢測(cè)的一抗分別為命名為1G11、1G7、1F9、1D6的四種單克隆抗體。ELISA檢測(cè)抗體特異性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果請(qǐng)參見(jiàn)圖5所示，圖中系列1表示GST-Latexin，系列2表示GST，可以看出，在4株單克隆抗體中包被純化的GST-Latexin融合蛋白的孔1D6呈弱陽(yáng)性反應(yīng)，1F9和1D7呈陽(yáng)性、1G11為強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，包被GST蛋白的孔均為陰性。表明本發(fā)明的命名為"1G11"的抗體具有高度的抗原結(jié)合特異性。因此除特別注明外，后續(xù)實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)中所用的單克隆抗體均采用命名為"1G11"的抗體。8.2WesternBlot檢測(cè)單克隆抗體的特異性吸去BGC823及Hela細(xì)胞培養(yǎng)基，加lmlPBS至培養(yǎng)瓶中，用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮至一1.5mlEP管中，離心棄上清，重懸沉淀于RIPA(購(gòu)自上海博彩生物科技有限公司)，冰上放置10min，4°C14000g離心30min，移上清至新EP管中(-70。C保存)。用Bradford比色法對(duì)蛋白定量。取BGC823、Hela細(xì)胞總蛋白、GST蛋白、GST-Latexin融合蛋白及BSA各30嗎行12%SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜(美國(guó)AmershamBiosciences公司)。5%脫脂奶粉封閉4匸過(guò)夜或37°C1小時(shí)，加Latexin單克隆抗體4。C過(guò)夜。0.5%Tween20-PBS充分洗滌后在加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體。按ECL(Westernblottingdetectionreagents,購(gòu)自美國(guó)AmershamBiosciences公司)說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行化學(xué)發(fā)光、X光片曝光、洗片。WesternBlot檢測(cè)單克隆抗體的特異性的結(jié)果顯示制備的單克隆抗體1G11在4種細(xì)胞系總蛋白的約30kD處及GST-Latexin融合蛋白在約48kD處出現(xiàn)了一條特異的帶(Latexin蛋白預(yù)計(jì)大小為29kD左右)，而在GST蛋白處卻沒(méi)有任何條帶出現(xiàn)。說(shuō)明1G11為L(zhǎng)atexin特異性結(jié)合抗體(參見(jiàn)圖6A、圖6B)。實(shí)施例四.應(yīng)用WesternBlot方法和免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)Latexin蛋白在永生化和腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)本實(shí)施例中，應(yīng)用WestemBlot方法，采用本發(fā)明的命名為"1G11"的單克隆抗體，對(duì)永生化和腫瘤細(xì)胞系以及11種4月齡胎兒組織中Latexin表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。本實(shí)施例中還應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞系中Latexin蛋白在細(xì)胞系核漿分布情況。具體方法可參照以下操作(其中，應(yīng)用SP-9000/9001/9002HistostainTM-PlusKits免疫組化染色試劑盒，購(gòu)自中杉金橋公司代理的美國(guó)ZYMED公司)石蠟切片常規(guī)脫蠟至水(二甲苯I60min—二甲苯II60min—二甲苯III60min—100%乙醇I3min—100。/。乙醇n3min—95%乙醇3min—75%乙醇3min—蒸餾水沖洗，lxPBS再洗一次)；1%H202阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶室溫10min;抗原微波修復(fù)切片放入修復(fù)液中92'C98'C至少維持lOmin后室溫冷卻2030min;lxPBS洗3次每次5min，10%正常18羊血清37。C封閉4'C過(guò)夜；吸去羊血清(勿洗)，加入一抗(1:100)4。C過(guò)夜；^PBS洗3次，每次5min，加入生物素標(biāo)記的羊抗鼠二抗，37'C作用30min至1小時(shí)；lxPBS洗3次，每次5min，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的三抗鏈霉卵白素(HRP-Strepavidin)，37°C作用30min至1小時(shí)；lxPBS洗3次，每次5min，DAB避光顯色510min，鏡下觀(guān)察有信號(hào)時(shí)可用自來(lái)水沖洗終止反應(yīng)，10%蘇木精復(fù)染(自來(lái)水沖洗)，1%鹽酸-酒精分色(可滴片并直接泡在lxPBS里然后用水沖)；逐級(jí)酒精脫水、二甲苯透明(75%乙醇3min—95%乙醇3min—100%乙醇I3min—100%乙醇II3min—二甲苯I3min—二甲苯113min;中性樹(shù)膠加蓋玻片封片。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)以細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒狀著染判斷為陽(yáng)性，細(xì)胞胞漿內(nèi)無(wú)棕黃色顆粒著染為陰性。應(yīng)用WesternBlot方法檢測(cè)Latexin蛋白在永生化和腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)結(jié)果請(qǐng)參見(jiàn)圖6B、圖6C所示。其中，圖6B顯示的為WesternBlot方法檢測(cè)Latexin蛋白在細(xì)胞系中的核漿表達(dá)情況，圖中GES-1為人胃粘膜永生化細(xì)胞，MC、N87和MGC803均為人胃癌細(xì)胞系，C為細(xì)胞漿蛋白，N為細(xì)胞核蛋白；所用一抗為1G11單克隆抗體(以l:500稀釋)。圖6C顯示ll種人4月齡胎兒組織中Latexin蛋白在的表達(dá)情況，其中，用BGC823做陽(yáng)性對(duì)照，所用一抗為1G11單克隆抗體(以1:500稀釋)。檢測(cè)結(jié)果顯示Latexin主要分布在細(xì)胞漿，雜交帶行單一，對(duì)應(yīng)分子量大小與Latexin蛋白的分子大小一致。免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)Latexin蛋白在細(xì)胞系核漿分布情況的結(jié)果請(qǐng)參見(jiàn)圖7;其中，圖片A為胃癌細(xì)胞系BGC823，圖片B為胃粘膜永生化細(xì)胞系GES-1，圖片C為胃癌細(xì)胞系MC，圖片D為胃癌細(xì)胞系N87。所用一抗為1G11單克隆抗體(以1:100稀釋)，DAB顯色后再經(jīng)10%蘇木素復(fù)染(200X)。檢測(cè)結(jié)果表明Latexin在細(xì)胞內(nèi)主要分布在細(xì)胞漿。實(shí)施例五.免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)Latexin蛋白在腫瘤組織中的表達(dá)本實(shí)施例應(yīng)用本發(fā)明的單克隆抗體采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)了胃癌、食管癌及其遠(yuǎn)端的正常組織以及賁門(mén)癌中Latexin蛋白的表達(dá)，檢測(cè)結(jié)果請(qǐng)參見(jiàn)圖8和表1。圖8中，圖片A為胃癌，圖片B為正常胃組織，圖片C為食管癌，圖片D為正常食管組織，圖片E為賁門(mén)癌，圖片F(xiàn)為正常賁門(mén)組織；所用一抗為1G11單克隆抗體，以1:100稀釋(200X)。從圖8中可以看出Latexin蛋白在腫瘤組織中的表達(dá)水平明顯低于其正常對(duì)照組織。19表1.免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)Latexin在各種腫瘤組織及遠(yuǎn)端正常組織中的表達(dá)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>從表1中的數(shù)據(jù)可以看出胃癌陽(yáng)性率為14.63%(6/41)，而遠(yuǎn)端的正常組織為72.09%(31/43)，比較胃癌組織與正常組織的Latexin蛋白的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)端正常組織的表達(dá)顯著高于胃癌組織；食管癌陽(yáng)性率為14.81%(8/54);而賁門(mén)癌的不同分化程度腺癌的Latexin蛋白表達(dá)情況為高-中分化腺癌陽(yáng)性率為66.67%(6/9)、中分化腺癌為50%(7/14)、中低分化腺癌為42.86%(6/14)、低分化腺癌為37.50%(12/32)。對(duì)以上數(shù)據(jù)進(jìn)行分析表明，隨著分化程度的降低Latexin的表達(dá)量呈遞減的趨勢(shì)。實(shí)施例六，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN建立Latexin基因的反義RNA體系，研究Latexin蛋白表達(dá)水平對(duì)腫瘤細(xì)胞惡性程度的影響(一)應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN構(gòu)建Latexin基因的反義cDNA序列的重組體，轉(zhuǎn)染Latexin蛋白基礎(chǔ)表達(dá)水平較高的人胃粘膜腺癌細(xì)胞系BGC823并篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系；進(jìn)一步的克隆形成率實(shí)驗(yàn)分析顯示轉(zhuǎn)染反義Latexin基因的BGC823細(xì)胞生長(zhǎng)速度加快，克隆形成能力明顯增強(qiáng)(結(jié)果見(jiàn)圖9A和圖9B，圖9A中，1:BGC823;2:BGC823-pLXSN;3:BGC823-Anti-Latexin;圖9B中，pLXSN:胃癌細(xì)胞系BGC823轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN;Anti-Latexin:BGC823細(xì)胞轉(zhuǎn)染pLXSN-反義LatexincDNA序列)。(二)檢測(cè)Latexin基因表達(dá)水平對(duì)BGC823細(xì)胞裸鼠致瘤性的影響分別應(yīng)用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pLXSN空載和pLXSN-Latexin反義(Antisense)的BGC823細(xì)胞接種B/C裸鼠各IO只(接種細(xì)胞數(shù)100萬(wàn)/只)致瘤，4周后將瘤體剝離稱(chēng)重(稱(chēng)重量結(jié)果參見(jiàn)圖10A和表2，表2中的裸鼠編號(hào)與圖10A中瘤體從左至右的位置相對(duì)應(yīng))，并進(jìn)行WesternBlot檢測(cè)Latexin蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果見(jiàn)圖IOB(圖10B中，1和2組織蛋白取自轉(zhuǎn)染pLXSN空載的BGC823細(xì)胞接種裸鼠組，3和4組織蛋白取自轉(zhuǎn)染pLXSN-Latexin反義(Antisense)的BGC823細(xì)胞接種裸鼠組)。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>T檢驗(yàn)結(jié)果P0.05，兩組數(shù)據(jù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Latexin蛋白的表達(dá)水平降低，腫瘤生長(zhǎng)速度顯著增加，高度支持Latexin基因具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的功能。序列表<110>北京市腫瘤防治研究所<120>人羧肽酶A抑制因子Latexin的單克隆抗體及其應(yīng)用〈130〉GAI08C翻88C<160>6<170>Patentlnversion3.3<210〉1<211>1144<212>薩<213〉人類(lèi)(Homosapiens)<220><221>CDS<222>(216)..(884)<400>1agaagcagtcagcccagggctctcggatgcagggagcctgggcccaaacagcagcttccg60gagtcggaaggagctgaggaagaagacagactgaaggagcttgcgacttttccgcctcgg120caaccggacccagcagcaagcaggacgggcggcgctctgctactggtcccgttaagccag180agtagcccaagccctgaagtcactgctcatccggaatggaaateccgccgacc233MetGlulieProProThr15aactacccagcctecagggcggccttggtggcacagaactacateaac281AsnTyrProAlaSerArgAlaAlaLeuValAlaGinAsnTyrlieAsn101520taccagcaggggaccccgcacagggtgtttgaggtgcagaaggtcaaa329TyrGinGinGlyThrProHisArgValPheGluValGinLysValLys253035caagccageatggaggatattccaggaagaggacata_agtatcgcctt377GinAlaSerMetGluAsplieProGlyArgGlyHisLysTyrArgLeu404550aaatttgetgttgaagaaattatacaaaaacaagttaaggtgaactgc425LysPheAlaValGluGlulielieGinLysGinValLysValAsnCys55606570acagetgaagtactttaccctteaacgggacaagaaactgcaccagaa473ThrAlaGluValLeuTyrProSerThrGlyGinGluThrAlaProGlu758085gtcaacttcacatttgaaggagaaactgg已a(bǔ)agaatccagatgaagaa521ValAsnPheThrPheGluGlyGluThrGlyLysAsnProAspGluGlu9095100gacaacacattttotcaaagacttaagtecatgaaggaaccgetagaa569AspAsnThrPheTyrGinArgLeuLysSerMetLysGluProLeuGlu105110115gcacaaaatattccagacaattttgga犯tgtatctccsgaastgacg617AlaGinAsnlieProAspAsnPheGlyAsnValSerProGluMetThr120125130etcgttetacatttagcctgggttgcctgtggttatataatatggcaa665LeuValLeuHisLeuAlaTrpValAlaCysGlyTyrlielieTrpGin135140145150aattctactgaagacacatggtataaaatggtaaaaattcaaactgtc713AsnSerThrGluAspThrTrpTyrLysMetValLyslieGinThrVal155160165aagcaagtgcaaagaaatgatgactttattgaattagactacaccatt761LysGinValGinArgAsnAspAspPhelieGluLeuAspTyrThrlie170175180etacttcataatatagcatctcaggagattattccctggcaaatgcaa809LeuLeuHisAsnlieAlaSerGinGlulielieProTrpGinMetGin185190195gttetctggcatccacaatacggcactaaagtaaaacataatagecgt857ValLeuTrpHisProGinTyrGlyThrLysValLysHisAsnSerArg200205210ctgccagaagtactggaataaacaaaaaccctsacactgga904LeuProLysGluValGinLeuGlu215220tgtctattgatgtgtatgccaatttcactggcatctagct964aataatcccaaagtgtcactgtcttgattacagtatagaactttatagag1024aaagtatcactacataaaaatgtctttaaatggtatgtat1084atccaaaataaaaagcttca1144〈210〉2<211>222〈212〉PRT〈213〉人類(lèi)(Homosapiens)〈400〉2MetGlulieProProThrAsnTyrProAlaSerArgAlaAlaLeuVal15101523AlaGinGluValGlyHis50GinVal65GinGluLysAsnMetLysValSer130GlyTyr145ValLysAsnTyrlie20GinLysVal35LysTyrArgLysValAsnThrAlaPro85ProAspGlu100GluProLeu115ProGluMetlielieTrplieGinThr165GluLeuAspTyrThr180lieProTrpGinMet195ValLysHisAsnSerArgLeu210215AsnTyrGinGinGlyThrProHisArgValPhe2530LysGinAlaSerMetGluAsplieProGlyArg4045LeuLysPheAlaValGluGlulielieGinLys5560CysThrAlaGluValLeuTyrProSerThrGly707580GluValAsnPheThrPheGluGlyGluThrGly9095GluAspAsnThrPheTyrGinArgLeuLysSer105110GluAlaGinAsnlieProAspAsnPheGlyAsn120125ThrLeuValLeuHisLeuAlaTrpValAlaCys135140GinAsnSerThrGluAspThrTrpTyrLysMet150155160ValLysGinValGinArgAsnAspAspPhelie170175lieLeuLeuHisAsnlieAlaSerGinGlulie185190GinValLeuTrpHisProGinTyrGlyThrLys200205ProLysGluValGinLeuGlu220<210>3<211>20<212>DNA〈213>人工序列(Artificial)〈220>〈223>引物<400〉3tttttttuttututttt<210>4<211>302024〈212〉賺<213>人工序列(Artificial)<220>〈223〉引物〈400>4aagcagtggtatcaacgcagagtacgcggg30〈210〉5〈211>23<212>DNA〈213〉人工序列(Artificial)〈220〉〈223>引物〈400〉5aagcagtggtatcaacgcagagt23〈210>6<211>23<212>廳〈213〉人工序列(Artificial)<220〉<223>引物〈400〉6ctggaatattttgtgcttctage232權(quán)利要求1.一種對(duì)SEQIDNo.2所示蛋白有特異性的單克隆抗體。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，該抗體對(duì)GST-Latexin融合蛋白有特異性，對(duì)谷胱苷肽轉(zhuǎn)移酶沒(méi)有特異性。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，該抗體由保藏號(hào)為CGMCCNo.2336的細(xì)胞株分泌產(chǎn)生。4.產(chǎn)生權(quán)利要求1所述的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的雜交瘤細(xì)胞株，該細(xì)胞株的保藏號(hào)為CGMCCNo.2336。6.—種制備權(quán)利要求1所述的單克隆抗體的方法，該方法包括用GST-Latexin融合蛋白免疫小鼠，取小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選出能夠分泌對(duì)SEQIDNo.2所示蛋白有反應(yīng)性、對(duì)谷胱苷肽轉(zhuǎn)移酶沒(méi)有反應(yīng)性的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，從雜交瘤細(xì)胞上清液中或從注射雜交瘤細(xì)胞后的動(dòng)物腹水中獲取單克隆抗體。7.權(quán)利要求1所述的單克隆抗體在檢測(cè)Latexin基因及其編碼蛋白的水平中的應(yīng)用，優(yōu)選所述水平為在細(xì)胞內(nèi)的分布水平。8.—種檢測(cè)試劑盒，該試劑盒含有權(quán)利要求1所述的單克隆抗體、和用于與單克隆抗體結(jié)合的標(biāo)記物。9.權(quán)利要求1所述的單克隆抗體在制備具有檢測(cè)和/或輔助診斷腫瘤作用的組合物中的應(yīng)用。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其中所述腫瘤為胃癌、食管癌、或賁門(mén)癌。全文摘要本發(fā)明涉及一種人羧肽酶A抑制因子Latexin的單克隆抗體，同時(shí)涉及該單克隆抗體的制備方法以及產(chǎn)生該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。本發(fā)明還涉及含有所述單克隆抗體的試劑盒、所述單克隆抗體在檢測(cè)Latexin基因及其編碼蛋白的水平中的應(yīng)用、以及所述單克隆抗體在制備具有檢測(cè)和/或輔助診斷腫瘤作用的組合物中的應(yīng)用。文檔編號(hào)C07K16/18GK101497664SQ20081005702公開(kāi)日2009年8月5日申請(qǐng)日期2008年1月29日優(yōu)先權(quán)日2008年1月29日發(fā)明者丁慧榮,濤寧,巴桑卓瑪,勇李,楊柯,陸哲明,魏浩然申請(qǐng)人:北京市腫瘤防治研究所