專利名稱：鼠疫耶爾森氏菌天然f1抗原的提取、純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，具體涉及從鼠疫耶爾森氏菌的培養(yǎng)物中提取、純化天然F1 抗原的方法。
技術(shù)背景鼠疫是由鼠疫耶爾森氏菌引起的烈性傳染病。人類鼠疫按發(fā)病形式分為三種:腺 鼠疫、肺鼠疫和敗血癥鼠疫。近年來，世界鼠疫疫情呈上升趨勢(shì)，2000年世界衛(wèi)生組 織將鼠疫列為重新抬頭的傳染病(WHO: h咖an plague in 1998 and 1999.『ee^y 印j'ofe則'o7o^'caJ record 2000， 75:338-343.)。另夕卜，鼠疫耶爾森氏菌又是一種標(biāo)準(zhǔn)的生物戰(zhàn)劑和生物恐怖劑，美國已將鼠疫耶爾森氏菌列為恐怖分子最有可能使 用的6個(gè)生物劑之一。鼠疫滅活疫苗僅對(duì)腺鼠疫具有一定的保護(hù)作用，而且保護(hù)時(shí)間短，因此這類疫苗 不適合于大規(guī)模的預(yù)防接種。美軍曾在越戰(zhàn)中使用的USP滅活疫苗于1999年停止生產(chǎn)。 EV76疫苗株是最好的減毒活疫苗，能提供早期的保護(hù)作用，但減毒活疫苗不如滅活疫 苗有效，而且有時(shí)副作用嚴(yán)重，同樣，減毒活疫苗對(duì)肺鼠疫也無保護(hù)作用(Russell P， Eley SM, Hibbs SE, Manchee RJ, Stagg AJ， Titball RW: A comparison of Plague vaccine, USP and EV76 vaccine induced protection against Yersinia pestis in a murine model. Kacci"e 1995, 13 (16) : 1551-1556.)。亞單位疫苗能夠克服傳統(tǒng)疫 苗的許多缺陷，不含有感染性組分，無致病性，而且對(duì)腺鼠疫和肺鼠疫均具有一定的 免疫保護(hù)作用。因此，目前鼠疫疫苗的研究多集中在亞單位疫苗。鼠疫耶爾森氏菌的 主要保護(hù)性抗原是F1 (莢膜抗原)(Andrews GP, Heath DG' Anderson GW， Jr., Welkos SL， Friedlander AM: Fraction 1 capsular antigen (Fl) purification from Yersinia pestis C092 and from an Escherichia coli recombinant strain and efficacy against lethal plague challenge. i> /e" /鵬肌1996， 64(6) :2180-2187.) 和LcrV (V-抗原)(Anderson GW， Jr. ， Leary SE, Williamson ED， Titball RW， Welkos SL， Worsham PL， Friedlander AM: Recombinant V antigen protects mice against pneumonic and bubonic plague caused by Fl-capsule-positive and -negative strains of Yersinia pestis. iw/ect /腳""1996, 64(11) :4580-4585.) 。 Fl抗原 由鼠疫耶爾森氏菌pMTl質(zhì)粒上的Fl操縱子編碼，以多聚體的形式在細(xì)胞表面形成莢膜，F(xiàn)l抗體通過阻斷Fl蛋白的抗吞噬作用從而具有免疫保護(hù)作用(Dii Y, Rosqvist R， Forsberg A: Role of fraction 1 antigen of Yersinia pestis in inhibition of phagocytosis, // /"ecf Zt做ot 2002, 70(3) : 1453-1460.) 。 V抗原是一種多功能蛋白， 與鼠疫耶爾森氏菌的抗吞噬能力有關(guān),具有免疫保護(hù)和免疫抑制作用(Pettersson J, Holrastrom A, Hill J， Leary S, Frithz-Lindsten E, von Euler-Matell A， Carlsson E, Titball R, Forsberg A, Wolf-Watz H: The V-antigen of Yersinia is surface exposed before target cell contact肌d involved in virulence protein translocation. #W必'croZ^'oi 1999， 32 (5) :961-976.)。雖然基于Fl抗原與V抗原 的新型疫苗對(duì)腺鼠疫和肺鼠疫均有效，但Fl抗原不能代表鼠疫耶爾森氏菌的全部毒力 (Titball RW， Williamson ED: Yersinia pestis (plague) vaccines, f邵erf Qoi" A'o/ 7Xer 2004， 4(6) :965-973.)。最近，研究人員發(fā)現(xiàn)在云南感染東方型鼠疫耶爾 森氏菌的病人血清中檢測(cè)不到V抗原的抗體，提示某些鼠疫菌株的V抗原不具有免疫保 護(hù)作用(Li B， Jiang L， Song Q， Yang丄Chen Z， Guo Z, Zhou D， Du Z, Song Y， Wang J Protein microarray for profiling antibody responses to Yersiniapestis live vaccine, /"/ecf 2005, 73(6) :3734-3739.)。因此，目前鼠疫疫苗的研究多采用F1和V抗原聯(lián)合應(yīng)用的方案。Fl是鼠疫特異的保護(hù)性抗原，是制備 鼠疫疫苗的重要成分，也是中國生物制品規(guī)程中規(guī)定的檢測(cè)鼠疫的特異性抗原?，F(xiàn)有提取F1抗原的方法國內(nèi)提取F1抗原的步驟主要包括首先，用-4(TC丙酮 處理菌體，然后用乳缽將菌體研磨成菌粉，再用甲苯飽和的氯化鈉溶液浸提，最后用 飽和硫酸銨沉淀。此法雖能提取出F1蛋白，但不能純化出純度較高的F1抗原(蛋白電 泳可見明顯的雜蛋白條帶)，而且在提取過程中蛋白與有機(jī)溶劑接觸易引起蛋白活性 降低，同時(shí)有毒溶劑對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重(中國生物制品標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)中國生物制品規(guī) 程，2000年版，化學(xué)工業(yè)出版社)。國外提取F1抗原仍然用冷丙酮處理菌體，用甲苯 飽和的氯化鈉溶液浸提，飽和硫酸銨沉淀，最后凝膠過濾。此法提取的蛋白純度較高， 但仍然使用了有機(jī)溶劑，無法避免有機(jī)溶劑對(duì)蛋白的影響和對(duì)環(huán)境的污染(Andrews GP, Heath DG， Anderson GW， Jr.， Welkos SL， Friedlander AM: Fraction 1 capsular antigen (Fl) purification from Yersinia pestis C092 and from an Escherichia coli recombinant strain and efficacy against lethal plague challenge. // /ect /鵬w3 1996， 64(6) :2180-2187.)。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種從鼠疫耶爾森氏菌的培養(yǎng)物中提取、純化天然Fl抗原 的方法。本發(fā)明所提供的鼠疫耶爾森氏菌天然F1抗原的提取、純化方法，是先從鼠疫耶 爾森氏菌培養(yǎng)物中分離培養(yǎng)上清和菌體沉淀，再利用飽和硫酸銨沉淀從培養(yǎng)上清中以 及利用玻璃珠從菌體沉淀中分別提取出多部分鼠疫耶爾森氏菌天然Fl抗原粗蛋白， 再將各部分鼠疫耶爾森氏菌天然Fl抗原粗蛋白各自通過飽和硫酸銨沉淀、凝膠過濾 得到多部分純化的鼠疫耶爾森氏菌天然F1抗原。具體來講，上述鼠疫耶爾森氏菌天然F1抗原的提取、純化方法，可包括以下獲取第一部分至第四部分任意一種鼠疫耶爾森氏菌天然Fl目標(biāo)抗原的必要步驟1) 鼠疫耶爾森氏菌的培養(yǎng)將鼠疫耶爾森氏菌接種到添加質(zhì)量/體積(W/V)百分濃度為0. 1-0. 3%木糖的心腦浸液培養(yǎng)基中，在35-40。C下培養(yǎng)12-96h;2) 對(duì)步驟l)得到的鼠疫耶爾森氏菌培養(yǎng)物進(jìn)行離心，分離出上清和菌體沉淀；3) 鼠疫耶爾森氏菌天然F1抗原粗蛋白的提取將步驟2)分離出的上清用30-50 X(W/V)飽和硫酸銨沉淀，鹽析，再離心，分離出上清和沉淀，棄掉上清，得到A部 分粗蛋白；將步驟2)分離出的菌體沉淀用PBS緩沖液重懸后，加入玻璃珠，在35-40 °C、 100-400rpm下振搖12-24h，再離心，分離出用于提取B部分和C部分粗蛋白的 上清和用于提取D部分粗蛋白的菌體沉淀；將用于提取B部分和C部分粗蛋白的上清 用30-50%飽和硫酸銨沉淀，鹽析，再離心，棄掉上清，將沉淀用0. 005-0. 015M的 PB緩沖液重新溶解后，再用20-30%飽和硫酸銨沉淀，鹽析，離心，分離出含B部分 粗蛋白的上清和含C部分粗蛋白的沉淀；將用于提取D部分粗蛋白的菌體沉淀重懸于 0. 005-0. 015M的PBS緩沖液中，超聲，離心，棄掉沉淀，將上清用30-50%飽和硫酸 銨沉淀，鹽析，再離心，分離出上清和沉淀，棄掉上清，得到D部分粗蛋白；4) 將步驟3)獲得的A部分粗蛋白溶于0. 005-0. 015M的PBS緩沖液中后，用20-30 %飽和硫酸銨沉淀，鹽析，離心，棄掉沉淀，將上清再用1-10%飽和硫酸銨沉淀，鹽 析，離心，棄掉上清，將沉淀溶于0. 005-0. 015M的PBS緩沖液中，過S印hacryl S-200HR 凝膠柱，洗脫液為pH 7.5-8.5、 0.005-0.015M的Tris-HCl緩沖液，透析，得到第一部分天然F1抗原純化蛋白。5) 將步驟3)獲得的含B部分粗蛋白的上清用1-10%飽和硫酸銨沉淀，鹽析， 離心，棄掉上清，將沉淀重新溶于0. 005-0. 015M的PB緩沖液中，過S印hacryl S-200HR 凝膠柱，洗脫液為pH 7.5-8.5、 0. 005-0. 015M的Tris-HC1緩沖液，透析，得到第二 部分天然F1抗原純化蛋白；6) 將步驟3)獲得的含C部分粗蛋白的沉淀溶于O. 005-0. 015M的PB緩沖液中， 再用20-30%飽和硫酸銨沉淀，鹽析，離心，棄掉沉淀，將上清用1-10%飽和硫酸銨 沉淀，離心，棄掉上清，將沉淀重新溶于0.005-0.015M的PB緩沖液中，過S印hacrylS-200HR凝膠柱，洗脫液為pH 7. 5-8. 5、 0. 005-0. 015M的Tris-HCl緩沖液，透析， 得到第三部分天然Fl抗原純化蛋白；7)將步驟3)獲得的D部分粗蛋白溶于0. 005-0. 015M的PB緩沖液中，用20-30 %飽和硫酸銨沉淀，鹽析，離心，棄掉沉淀，將上清用1-10%飽和硫酸銨沉淀，鹽析， 離心，棄掉上清，將沉淀重新溶于0. 005-0. 015M的PB緩沖液中，過S印hacryl S-200服 凝膠柱，洗脫液為pH 7.5-8.5、 0. 005-0. 015M的Tris-HCl緩沖液，透析，得到第四 部分天然F1抗原純化蛋白；第一至第四部分天然F1抗原純化蛋白(成分相同)中的一種或它們之間任意幾 種組合的混合產(chǎn)物(混合比例任意)構(gòu)成所要的鼠疫耶爾森氏菌天然F1目標(biāo)抗原。在上述鼠疫耶爾森氏菌天然F1抗原的提取、純化方法中，步驟l)所用的鼠疫耶 爾森氏菌可為任意可產(chǎn)生F1抗原的鼠疫耶爾森氏菌菌株，如鼠疫耶爾森氏菌EV76疫 苗株、EV40疫苗株、Tjiwidej株、A1122株、M23、 P175或Otten等，優(yōu)選為鼠疫耶 爾森氏菌EV76疫苗株。步驟l)中所述心腦浸液培養(yǎng)基中木糖的質(zhì)量/體積百分濃度優(yōu)選為0.2%;鼠 疫耶爾森氏菌的培養(yǎng)溫度優(yōu)選為37°C，培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選為72h。此外，為提供菌體的生長(zhǎng)速率，步驟l)中在鼠疫耶爾森氏菌的培養(yǎng)過程中可對(duì) 其進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，振蕩速率可為100-400rpm。步驟3)中的超聲條件為5秒間5秒，時(shí)間為30min。步驟3)至步驟7)中30-50%飽和硫酸銨均優(yōu)選為40%飽和硫酸銨，20-30%飽 和硫酸銨均優(yōu)選為25%飽和硫酸銨，1-100%飽和硫酸銨均優(yōu)選為5%飽和硫酸銨； 鹽析條件均為；在3-5。C下鹽析5-20h，優(yōu)選為在4"C下鹽析12h;所述PB緩沖液 的濃度均優(yōu)選為0. OIM， PBS緩沖液的濃度均優(yōu)選為0. 01M;步驟2)至步驟7)中的離心條件均為在4000-12000rpm下離心20-40min。 步驟4)至步驟7)中S印hacryl S-200HR凝膠柱的洗脫液均優(yōu)選為pH 8. 0、 0. 01M 的Tris-HC1緩沖液；所用的透析液為0. 005-0. 015M的PBS緩沖液，優(yōu)選為0. 01M的 PBS緩沖液。步驟4)至步驟7)中得到的四部分天然F1抗原純化蛋白均為本發(fā)明所要得到的 鼠疫耶爾森氏菌天然F1抗原。用上述方法得到的鼠疫耶爾森氏菌天然Fl抗原也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。第一至第四部分天然Fl抗原純化蛋白中的一種或它們之間任意幾種組合的混合 產(chǎn)物均構(gòu)成所要的鼠疫耶爾森氏菌天然F1目標(biāo)抗原。本發(fā)明提供了一種鼠疫耶爾森氏菌天然F1抗原的提取、純化方法。該方法采用玻璃珠替代有機(jī)溶劑處理，飽和硫酸銨沉淀和分子篩過濾相結(jié)合的方案，成功地從鼠 疫耶爾森氏菌的培養(yǎng)物中提取、純化出高純度的天然F1抗原。此法不僅簡(jiǎn)單有效， 而且還避免了純化過程中有機(jī)溶劑對(duì)蛋白活性的影響和對(duì)環(huán)境的污染。經(jīng)免疫學(xué)檢 測(cè)和動(dòng)物保護(hù)實(shí)驗(yàn)證明，用本發(fā)明方法獲得的天然Fl抗原具有較高的免疫保護(hù)作用和檢測(cè)靈敏度，如以相同濃度的本發(fā)明天然F1抗原和經(jīng)表達(dá)獲得的重組F1抗 原(rFl)，分別對(duì)同一小鼠腹水樣本進(jìn)行F1單克隆抗體檢測(cè)，結(jié)果顯示，天然F1 抗原檢測(cè)的抗體滴度明顯高于重組rFl抗原的檢測(cè)結(jié)果，表明若將本發(fā)明的天然Fl 抗原應(yīng)用于鼠疫亞單位疫苗的研制及鼠疫的檢測(cè)診斷，將具有更好的免疫保護(hù)作用和 更高的敏感性。本發(fā)明將在鼠疫亞單位疫苗的研制及鼠疫的檢測(cè)診斷(如免疫檢測(cè)等) 中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。


圖1為鼠疫耶爾森氏菌天然Fl抗原提取、純化過程的流程圖 圖2為提取、純化后的鼠疫耶爾森氏菌天然F1抗原的15% SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見《分子克 隆實(shí)驗(yàn)指南》(J.薩姆布魯克D.W.拉塞爾著，黃培堂等譯，第三版，2002，科學(xué)出 版社)。所述百分比濃度如無特別說明均為質(zhì)量/體積(W/V)百分比濃度或體積/體積(V/V) 百分比濃度。所用弓I物合成工作由上海英駿公司完成。實(shí)施例l、鼠疫耶爾森氏菌EV76疫苗株天然F1抗原提取、純化及其免疫學(xué)檢測(cè) 和免疫保護(hù)作用評(píng)價(jià)一、鼠疫耶爾森氏菌EV76疫苗株天然F1抗原提取、純化以鼠疫耶爾森氏菌EV76疫苗株為例，用本發(fā)明的方法從鼠疫耶爾森氏菌EV76疫 苗株中提取、純化天然F1抗原，具體過程如圖l所示，包括以下步驟.-1、鼠疫耶爾森氏菌EV76疫苗株的培養(yǎng)將鼠疫耶爾森氏菌EV76疫苗株(購自蘭州生物制品研究所)接種到5raL添加 0.2%(W/V， 0. 1-0.3%均可)木糖的心腦浸液培養(yǎng)基(購自BD公司，將37g培養(yǎng)基溶 于1L純水中)中，在37。C (35-4(TC均可)下培養(yǎng)24h，然后取300Ml菌液，再接種 到2L添加0. 2% (0. 1-0. 3%均可)木糖的心腦浸液培養(yǎng)基中，在37°C (35-4(TC均可)、 150rpm (100-400rpm均可)下振蕩培養(yǎng)72h。2、 鼠疫耶爾森氏菌培養(yǎng)物的處理對(duì)步驟l得到的鼠疫耶爾森氏菌培養(yǎng)物進(jìn)行離心(4000rpm， 30min)，分離出上 清和菌體沉淀。3、 鼠疫耶爾森氏菌天然F1抗原粗蛋白的提取將步驟2分離出的上清用40X(W/V， 30-50%均可)飽和硫酸銨沉淀，置4。C冰箱 中鹽析12h，再離心(8000rpm， 30min)，分離出上清和沉淀，棄掉上清，得到A部分 粗蛋白；將步驟2分離出的菌體沉淀用200mL PBS緩沖液(0. 01M)重懸后，置于三 角瓶中，加入高壓滅菌后的玻璃珠，在37。C (35-4(TC均可)、400rpm (100-400rpm 均可)下振搖18h (12-24h均可)，再離心(12000rpm， 30rain)，分離出用于提取B 部分和C部分粗蛋白的上清和用于提取D部分粗蛋白的菌體沉淀；將用于提取B部分 和C部分粗蛋白的上清用40% (30-50%均可)飽和硫酸銨沉淀，置4T:冰箱中鹽析12h， 再離心，棄掉上清，將沉淀用200mL PB緩沖液(0. 01M)重新溶解后，再用25% (20-30 %均可)飽和硫酸銨沉淀，置4i:冰箱中鹽析12h，離心(8000rpm， 30min)，分離出 含B部分粗蛋白的上清和含C部分粗蛋白的沉淀；將用于提取D部分粗蛋白的菌體沉 淀重懸于20mL PBS緩沖液(0. 01M)中，超聲(5秒間5秒，30min)，離心(12000rpm， 30min)，棄掉沉淀，將上清用0.01M的PB緩沖液稀釋至200mL后，用40% (30-50 %均可)飽和硫酸銨沉淀，置fC冰箱中鹽析12h,再離心(8000rpm, 30min)，分離 出上清和沉淀，棄掉上清，得到D部分粗蛋白。4、 第一部分天然F1抗原純化蛋白的獲得將步驟3獲得的A部分粗蛋白溶于200mL PBS緩沖液(O. OIM)中后，用25%(20-30 %均可)飽和硫酸銨沉淀，置4。C冰箱中鹽析12h,離心(8000rpm， 30min)，棄掉 沉淀，將上清再用5% (卜10%均可)飽和硫酸銨沉淀，置4r冰箱中鹽析12h，離心 (8000rpm， 30min)，棄掉上清，將沉淀溶于15mL(10-20mL均可)PBS緩沖液(O. 01M) 中，過S印hacryl S-200HR凝膠柱(購自Amershara Biosciences公司)，以pH 8. 0、 0.01M (pH7. 5-8. 5、 0. 005-0. 015M均可)的Tris-HC1緩沖液為洗脫液洗柱，控制流 速為1-2mL/min，收集蛋白溶液，將蛋白溶液裝透析袋，置于2000mL PBS透析液(O. 01M) 中透析12h，每4h換一次液。將得到的純化蛋白進(jìn)行15% SDS-PAGE檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果 如圖2所示(泳道M為低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker,分子量范圍為14. 4-97. 4 kDa，泳 道A為第一部分天然F1抗原純化蛋白)，結(jié)果得到了純度較高(98%)的17 kDa的第一部分天然F1抗原蛋白。5、 第二部分天然Fl抗原純化蛋白的獲得將步驟3獲得的含B部分粗蛋白的上清用5X (1-10%均可)飽和硫酸銨沉淀，置4。C冰箱中鹽析12h，離心(8000rpm， 30min)，棄掉上清，將沉淀重新溶于15raL (10-20mL均可)PB緩沖液(0. 01M)中，過S印hacryl S-200HR凝膠柱，以pH8.0、 0.01M (pH7. 5-8. 5、 0. 005-0. 015M均可)的Tris-HC1緩沖液為洗脫液洗柱，控制流 速為1-2mL/min，收集蛋白溶液，將蛋白溶液裝透析袋，置于2000mL PBS透析液(O. 01M) 中透析12h，每4h換一次液。將得到的純化蛋白進(jìn)行15% SDS-PAGE檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果 如圖2所示(泳道M為低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker,分子量范圍為14. 4-97. 4 kDa，泳 道B為第二部分天然F1抗原純化蛋白)，結(jié)果得到了純度較高(98%)的17 kDa的 第二部分天然F1抗原蛋白。6、 第三部分天然F1抗原純化蛋白的獲得將步驟3獲得的含C部分粗蛋白的沉淀溶于200mL PB緩沖液(0. 01M)中，再用 25% (20-30%均可)飽和硫酸銨沉淀，置4。C冰箱中鹽析12h，離心(8000rpm， 30min)， 棄掉沉淀，將上清用5% (1-10%均可)飽和硫酸銨沉淀，置4i:冰箱中鹽析12h，離 心(8000rpm, 30min)，棄掉上清，將沉淀重新溶于15mL (10-20mL均可)PB緩沖液(0.01M)中，過S印hacryl S-200服凝膠柱，以pH 8.0、 0. 01M (pH 7.5-8.5、 0. 005-0. 015M均可)的Tris-HCl緩沖液為洗脫液洗柱，控制流速為1-2mL/min，收 集蛋白溶液，將蛋白溶液裝透析袋，置于2000mL PBS透析液(0. 01M)中透析12h， 每4h換一次液。將得到的純化蛋白進(jìn)行15% SDS-PAGE檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖2所示(泳道M為低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker,分子量范圍為14. 4-97. 4 kDa，泳道C為第三 部分天然F1抗原純化蛋白)，結(jié)果得到了純度較高(98%)的17 kDa的第三部分天然F1抗原蛋白。7、 第四部分天然F1抗原純化蛋白的獲得將步驟3獲得的D部分粗蛋白溶于200mLPB緩沖液(0.01M)中，用25% (20-30 %均可)飽和硫酸銨沉淀，置4'C冰箱中鹽析12h，離心(8000rptn， 30min)，棄掉 沉淀，將上清用5% (1-10%均可)飽和硫酸銨沉淀，置4匸冰箱中鹽析12h，離心 (8000rpm， 30rain)，棄掉上清，將沉淀重新溶于15mL( 10-20mL均可)PB緩沖液(O. 01M) 中，過S印hacryl S-200HR凝膠柱，以pH 8.0、 0. 01M (pH 7.5-8.5、 0. 005-0. 015M 均可)的Tris-HCl緩沖液為洗脫液洗柱，控制流速為1-2mL/min，收集蛋白溶液，將 蛋白溶液裝透析袋，置于2000mL PBS透析液(0.01M)中透析12h，每4h換一次液。 將得到的純化蛋白進(jìn)行15% SDS-PAGE檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖2所示(泳道M為低分子 量標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker,分子量范圍為14. 4-97. 4 kDa，泳道D為第四部分天然Fl抗原 純化蛋白)，結(jié)果得到了純度較高(98%)的17 kDa的第四部分天然Fl抗原蛋白。 步驟4至步驟7中得到的四部分天然Fl抗原純化蛋白的成分相同，它們之中任一部分或是任意幾部分的以任意比例的混合物均為本發(fā)明所要得到的鼠疫耶爾森氏 菌天然F1抗原。二、鼠疫耶爾森氏菌EV76疫苗株天然Fl抗原的免疫學(xué)檢測(cè)和免疫保護(hù)作用評(píng)價(jià) 1、鼠疫耶爾森氏菌EV76疫苗株天然Fl抗原的免疫學(xué)檢測(cè)1) 重組F1抗原(rFl)的制備根據(jù)鼠疫耶爾森氏菌C092株的基因組序列(GenBank登錄號(hào)AL590842)設(shè)計(jì)一 對(duì)引物，引物序列如下Pl (上游引物)5， 一CGGGATCCATGAAAAAAATCAGTTCC — 3'P2 (下游引物)5， 一GCCCAAGCTTTTATTGGTTAGATACGGTTAC — 3'以鼠疫耶爾森氏菌EV76疫苗株的基因組DNA為模板，在引物Pl和P2的引導(dǎo)下 PCR擴(kuò)增重組F1抗原(rFl)基因，反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5X瓊脂糖 凝膠電泳檢測(cè)，回收并純化約980bp的目的片段，并將其克隆入載體pET32a (Novagen 公司)多克隆位點(diǎn)的i^歷WI和歷'/^III酶切位點(diǎn)之間，得到rFl基因的重組表達(dá)載 體，命名為pET-32a/rFl，將pET-32a/rFl轉(zhuǎn)化大腸桿菌cWi) BL21感受態(tài)細(xì)胞， 篩選陽性重組子，以pET32a空載體轉(zhuǎn)化菌為對(duì)照，在37t:下培養(yǎng)至0De。。值為0. 6-0. 8 時(shí)，添加O. 5mM IPTG，在相同條件下誘導(dǎo)4-5小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，對(duì)將pET-32a/rFl 轉(zhuǎn)化菌的表達(dá)蛋白進(jìn)行Western-blot鑒定，以兔抗鼠疫耶爾森氏菌EV76疫苗株免疫 血清作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗，結(jié)果顯示pET-32a/rFl轉(zhuǎn)化菌表達(dá) 蛋白與兔抗鼠疫耶爾森氏菌EV76疫苗株免疫血清反應(yīng)后在36kDa處有一特異的反應(yīng) 條帶，而pET32a空載體轉(zhuǎn)化菌卻沒有相應(yīng)的條帶出現(xiàn)，表明pET-32a/rFl轉(zhuǎn)化菌表 達(dá)蛋白具有較高的抗原性，純化，得到重組F1抗原。2) 小鼠腹水中鼠疫耶爾森氏菌F1蛋白單克隆抗體的獲得將步驟一提取的本發(fā)明天然F1抗原(四個(gè)部分天然F1抗原的混合)免疫6-8周 齡雌性BALB/C小鼠3次(每次間隔2周)，免疫劑量為每次25-504g，第3次免疫后 9天采血測(cè)其效價(jià)，融合前3天加強(qiáng)免疫一次。取加強(qiáng)免疫后第3天的小鼠脾細(xì)胞與 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的骨髓瘤細(xì)胞SP2/0按5-10:1的比例混合，逐滴加入0. 8-0. 9raL預(yù)熱的 融合劑(50% PEG1500， Sigma公司)，邊加邊攪動(dòng)，然后加入無血清培養(yǎng)基(購自 GIBC0公司)終止融合。接著以800rpm離心5min，棄上清液，將細(xì)胞重懸浮于HAT 培養(yǎng)基(購自GIBC0公司)中，至細(xì)胞濃度為1-2X107mL，再接種于含有飼養(yǎng)細(xì)胞 的96孔培養(yǎng)板中，每孔O. lmL。將該96孔培養(yǎng)板置37°C、 5% 0)2孵箱中培養(yǎng)，培 養(yǎng)8-12天，克隆可長(zhǎng)至孔底面積的1/3-1/2，此時(shí)可取培養(yǎng)液上清，用ELISA法檢測(cè) 有無抗體產(chǎn)生。取出抗體陽性孔內(nèi)的雜交瘤細(xì)胞，用有限稀釋法，將細(xì)胞分配到另一96孔培養(yǎng)板內(nèi)，這時(shí)可換用HT培養(yǎng)基(購自GIBCO公司)繼續(xù)培養(yǎng)。兩周左右檢測(cè)，對(duì)仍產(chǎn) 生抗體者再進(jìn)行克隆化(用有限稀釋法)，如此進(jìn)行3-5次，以保證確是由單克隆細(xì) 胞分泌的單克隆抗體。在此過程中，對(duì)分泌抗體的陽性孔細(xì)胞要及時(shí)擴(kuò)大培養(yǎng)，凍存。對(duì)產(chǎn)生抗體的細(xì)胞克隆， 一方面檢査其染色體數(shù)；另一方面，取其培養(yǎng)上清，檢 測(cè)抗體的免疫球蛋白類別、亞類和特異性。將鑒定正確的雜交瘤細(xì)胞注入BALB/C小鼠 腹腔內(nèi)(預(yù)先注射過石蠟油)，7-IO天后收集腹水(Prior幾,Titball RW: Monoclonal antibodies against Yersinia pestis lipopolysaccharide detect bacteria cultured at 28°Cor37°C. Molecular and Cellular Probes 2002， 16: 251-256)， 得到含鼠疫耶爾森氏菌Fl蛋白單克隆抗體的小鼠腹水。3)用鼠疫耶爾森氏菌EV76疫苗株天然Fl抗原測(cè)定鼠疫耶爾森氏菌Fl蛋白單克 隆抗體的效價(jià)由于被鼠疫感染的人及動(dòng)物可產(chǎn)生強(qiáng)烈的針對(duì)F1抗原的體液免疫，因此對(duì)Fl抗體 的檢測(cè)是鼠疫血清學(xué)檢測(cè)的基礎(chǔ)。用步驟一獲得的鼠疫耶爾森氏菌EV76疫苗株天然F1 抗原(四個(gè)部分天然F1抗原混合)和步驟l)獲得的重組F1抗原(rFl)進(jìn)行間接ELISA 試驗(yàn)(具體步驟可參見Goodin J L， Nellis D F, Powell B S et al: Purification and protective efficacy of raonoraeric and modified Yersinia pestis capsular Fl-V antigen fusion proteins for vaccination against plague. Protein Expression and Purification 2007,53: 63 - 79.)，檢測(cè)步驟2)獲得的小鼠腹水 中鼠疫耶爾森氏菌F1蛋白單克隆抗體的效價(jià)，檢測(cè)方法為用F1抗原(100ul/孔， 500ng/mL)包被酶標(biāo)板，分別加不同稀釋度(1:800、 1:1600、 1:3200、 1:6400、 1:12800、 1:25600、 1:51200、 1:102400)的含鼠疫耶爾森氏菌F1蛋白單克隆抗體的小鼠腹水， 孵育后洗滌(以除去未結(jié)合的雜蛋白質(zhì))，然后加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG 二抗(購自Sigma公司)，孵育后洗滌，加底物孵育30分鐘后，終止酶促反應(yīng)，用光 電比色測(cè)定抗體效價(jià)。檢測(cè)結(jié)果如表l所示，以相同蛋白濃度的本發(fā)明天然F1抗原和 重組rFl抗原分別對(duì)同一小鼠腹水樣本進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)，結(jié)果天然F1抗原檢測(cè)的敏 感性明顯高于重組rFl抗原，可用于鼠疫檢測(cè)的血清學(xué)分析。表1用Fl抗原測(cè)定小鼠腹水中Fl蛋白單克隆抗體的滴度抗原Fl抗體最高滴度(3次結(jié)果)重組Fl抗原 天然Fl抗原1:51200 1:3200 1:12800 1:102400 1:25600 1:1024002、鼠疫耶爾森氏菌EV76疫苗株天然Fl抗原的免疫保護(hù)效力測(cè)定 用下述實(shí)驗(yàn)檢測(cè)步驟一獲得的鼠疫耶爾森氏菌EV76疫苗株天然Fl抗原(四個(gè)部 分天然F1抗原混合)的免疫保護(hù)效力，檢測(cè)方法為將24只6-8周雌性BALB/c小 鼠(購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)隨機(jī)分成3組，2個(gè)劑量組(分別注射 Fl (10網(wǎng))+ 50pL鋁佐劑和Fl (20ng)+ 50pL鋁佐劑)和1個(gè)對(duì)照組(注射等量鋁佐劑)， 每組8只小鼠。在第一次肌肉注射免疫后的第21天加強(qiáng)免疫一次。第一次免疫后第8 周用100000cfu鼠疫耶爾森氏菌141強(qiáng)毒株皮下注射攻毒，觀察14天。結(jié)果如表2 所示，對(duì)照組8只小鼠全部死亡，而兩個(gè)天然F1劑量組的小鼠全部存活，而且健康 狀況良好，表明用本發(fā)明方法提取、純化的天然F1蛋白具有良好的免疫保護(hù)作用， 可用于制備鼠疫亞單位疫苗。表2天然Fl抗原免疫保護(hù)效果的檢測(cè)結(jié)果疫 苗攻毒劑量(cfu)小鼠總數(shù)(只)存活數(shù)(只)存活率(％)Fl(10叫)+鋁佐劑1000088100Fl(20ug)+鋁佐劑1000088100等量鋁佐劑10000800此外，用上述相同的方法分別用第一至第四部分鼠疫耶爾森氏菌天然F1抗原 分別測(cè)定小鼠腹水中F1蛋白單克隆抗體的滴度(蛋白濃度相同)及其免疫保護(hù)效果(免 疫劑量相同)，結(jié)果第一至第四部分鼠疫耶爾森氏菌天然F1抗原的敏感性相同，均 明顯高于重組rFl抗原，可用于鼠疫檢測(cè)的血清學(xué)分析；而且，四部分鼠疫耶爾森氏 菌天然F1抗原的免疫保護(hù)作用也相同。上述檢測(cè)結(jié)果證明，用本發(fā)明方法提取的四 部分鼠疫耶爾森氏菌天然F1抗原不僅成分相同，且免疫保護(hù)效果相同，因而這四部分 天然F1抗原既可單獨(dú)使用，也可按任意比例混合使用。實(shí)施例2、鼠疫耶爾森氏菌A1122株天然F1抗原提取、純化及其免疫學(xué)檢測(cè)和 免疫保護(hù)作用評(píng)價(jià)一、鼠疫耶爾森氏菌A1122株天然F1抗原提取、純化用本發(fā)明的方法從鼠疫耶爾森氏菌A1122株中提取、純化天然F1抗原，具體過 程如圖1所示，包括以下步驟1、鼠疫耶爾森氏菌A1122株的培養(yǎng)將鼠疫耶爾森氏菌A1122株(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所菌種庫提供) 接種到5mL添加0. 1% (W/V， 0.卜O. 3%均可)木糖的心腦浸液培養(yǎng)基(購自BD公司，37g溶于1L純水中)中，在35。C (35-40。C均可)、250rpra下培養(yǎng)12h，然后取300W 菌液，再接種到2L添加0.3% (0.1-0. 3%均可)木糖的心腦浸液培養(yǎng)基中，在40。C (35-40。C均可)、100rpm (100-400rpm均可)下振蕩培養(yǎng)72h。2、 鼠疫耶爾森氏菌培養(yǎng)物的處理對(duì)步驟l得到的鼠疫耶爾森氏菌培養(yǎng)物進(jìn)行離心(4000rpm， 40min)，分離出上 清和菌體沉淀。3、 鼠疫耶爾森氏菌天然Fl抗原粗蛋白的提取將步驟2分離出的上清用30%(W/V， 30-50%均可)飽和硫酸銨沉淀，在3。C下鹽 析20h，再離心(8000rpm， 40min)，分離出上清和沉淀，棄掉上清，得到A部分粗蛋 白；將步驟2分離出的菌體沉淀用200mL PBS緩沖液(0. 015M)重懸后，置于三角瓶 中，加入高壓滅菌后的玻璃珠，在35。C (35-4(TC均可)、300rpm (100-400rpm均可) 下振搖24h (12-24h均可)，再離心(12000rpm， 20min)，分離出用于提取B部分 和C部分粗蛋白的上清和用于提取D部分粗蛋白的菌體沉淀；將用于提取B部分和C 部分粗蛋白的上清用50% (30-50%均可)飽和硫酸銨沉淀，在5"C下鹽析10h，再離心， 棄掉上清，將沉淀用200raL PB緩沖液(0.015M)重新溶解后，再用20% (20-30%均 可)飽和硫酸銨沉淀，置4。C冰箱中鹽析12h，離心(8000rpm， 35min)，分離出含B 部分粗蛋白的上清和含C部分粗蛋白的沉淀；將用于提取D部分粗蛋白的菌體沉淀重 懸于20mLPBS緩沖液(0.015M)中，超聲(5秒間5秒，30min)，離心(12000rpm， 30min)，棄掉沉淀，將上清用0. 005M的PB緩沖液稀釋至200mL后，用45% (30-50 %均可)飽和硫酸銨沉淀，置4。C冰箱中鹽析12h，再離心(8000rpm， 25min)，分離 出上清和沉淀，棄掉上清，得到D部分粗蛋白。4、 第一部分天然Fl抗原純化蛋白的獲得將步驟3獲得的A部分粗蛋白溶于200mL PBS緩沖液(O. 005M)中后，用25%(20-30 %均可)飽和硫酸銨沉淀，置4。C冰箱中鹽析15h，離心(8000rpm， 35min)，棄掉 沉淀，將上清再用10% (1-10%均可)飽和硫酸銨沉淀，置4i:冰箱中鹽析5h，離心(8000rpm， 25min)，棄掉上清，將沉淀溶于15mL( 10-20mL均可)PBS緩沖液(O. 005M) 中，過S印hacryl S-200HR凝膠柱(購自Amersham Biosciences公司)，以pH 8. 5、 0. 015M (pH 7. 5-8. 5、 0. 005-0. 015M均可)的Tris-HCl緩沖液為洗脫液洗柱，控制 流速為l-2mL/min，收集蛋白溶液，將蛋白溶液裝透析袋，置于2000mL PBS透析液(0. 015M)中透析12h，每4h換一次液。將得到的純化蛋白進(jìn)行15% SDS-PAGE檢測(cè)， 結(jié)果得到了純度較高(97%)的17kDa的第一部分天然Fl抗原蛋白。5、 第二部分天然Fl抗原純化蛋白的獲得將步驟3獲得的含B部分粗蛋白的上清用1% (1-10%均可)飽和硫酸銨沉淀， 在5。C下鹽析12h，離心(8000rpm， 30min),棄掉上清，將沉淀重新溶于15mL(10-20raL 均可)PB緩沖液(0. 015M)中，過S印hacryl S-200服凝膠柱，以pH 7.5、 0. 005M (pH 7.5-8.5、 0.005-0.015M均可)的Tris-HC1緩沖液為洗脫液洗柱，控制流速為 l-2mL/fflin，收集蛋白溶液，將蛋白溶液裝透析袋，置于2000mLPBS透析液(0.005M) 中透析16h，每4h換一次液。將得到的純化蛋白進(jìn)行15% SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果得到 了純度較高(97%)的17kDa的第二部分天然Fl抗原蛋白。6、 第三部分天然F1抗原純化蛋白的獲得將步驟3獲得的含C部分粗蛋白的沉淀溶于200mL PB緩沖液(0. 015M)中，再 用30% (20-30%均可)飽和硫酸銨沉淀，置4。C冰箱中鹽析18h，離心(8000rpm， 30min)，棄掉沉淀，將上清用5% (1-10%均可)飽和硫酸銨沉淀，置4"C冰箱中鹽 析8h，離心(8000rpm，30min)，棄掉上清，將沉淀重新溶于15mL (10-20mL均可)PB 緩沖液(0. 01M)中，過S印hacryl S-200HR凝膠柱，以pH8. 0、 0. 01M (pH 7. 5-8. 5、 0. 005-0. 015M均可)的Tris-HCl緩沖液為洗脫液洗柱，控制流速為1-2mL/min，收 集蛋白溶液，將蛋白溶液裝透析袋，置于2000mL PBS透析液(0. 01M)中透析12h， 每4h換一次液。將得到的純化蛋白進(jìn)行15% SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果得到了純度較高 (97%)的17kDa的第三部分天然Fl抗原蛋白。7、 第四部分天然F1抗原純化蛋白的獲得將步驟3獲得的D部分粗蛋白溶于200mL PB緩沖液(0. 005M)中，用25% (20-30 %均可)飽和硫酸銨沉淀，置4t:冰箱中鹽析12h，離心(8000rpffl， 30min)，棄掉 沉淀，將上清用8% (1-10%均可)飽和硫酸銨沉淀，在3"C下鹽析10h，離心 (8000rpm，30min)，棄掉上清，將沉淀重新溶于15mL (10-20mL均可)PB緩沖液 (0.005M)中，過S印hacryl S-200服凝膠柱，以pH 8.0、 0. 01M (pH 7.5-8.5、 0.005-0.015M均可)的Tris-HC1緩沖液為洗脫液洗柱，控制流速為1-2raL/rain，收 集蛋白溶液，將蛋白溶液裝透析袋，置于2000mL PBS透析液(0. 005M)中透析20h， 每4h換一次液。將得到的純化蛋白進(jìn)行15% SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果得到了純度較高 (97%)的17kDa的第四部分天然Fl抗原蛋白。步驟4)至步驟7)中得到的四部分天然F1抗原純化蛋白(成分相同)或是任意幾 部分的混合物(混合比例任意)均為本發(fā)明所要得到的鼠疫耶爾森氏菌天然F1抗原。 二、鼠疫耶爾森氏菌A1122株天然F1抗原的免疫學(xué)檢測(cè)和免疫保護(hù)作用評(píng)價(jià) 1、用鼠疫耶爾森氏菌A1122株天然F1抗原測(cè)定鼠疫耶爾森氏菌F1蛋白單克隆 抗體的效價(jià)用鼠疫耶爾森氏菌A1122株天然F1抗原(四個(gè)部分天然F1抗原混合)測(cè)定鼠疫耶 爾森氏菌F1蛋白單克隆抗體的效價(jià)，檢測(cè)方法與實(shí)施例l相同。檢測(cè)結(jié)果如表3所示， 以相同蛋白濃度的本發(fā)明鼠疫耶爾森氏菌A1122株天然Fl抗原和重組rFl抗原分別對(duì) 同一小鼠腹水樣本進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)，結(jié)果鼠疫耶爾森氏菌A1122株天然F1抗原檢 測(cè)的敏感性明顯高于重組rFl抗原，可用于鼠疫檢測(cè)的血清學(xué)分析。 表3用鼠疫耶爾森氏菌A1122株天然Fl抗原測(cè)定小鼠腹水中Fl蛋白單克隆抗體的滴度抗原Fl抗體最高滴度(3次結(jié)果)重組Fl抗原 天然Fl抗原1:25600 1:3200 1:12800 1:51200 1:25600 1:256002、鼠疫耶爾森氏菌A1122株天然Fl抗原的免疫保護(hù)效力測(cè)定 用下述實(shí)驗(yàn)檢測(cè)步驟一獲得的鼠疫耶爾森氏菌A1122株天然F1抗原(四個(gè)部分 天然F1抗原混合)的免疫保護(hù)效力，檢測(cè)方法與實(shí)施例l相同。結(jié)果如表4所示， 對(duì)照組10只小鼠全部死亡，而兩個(gè)天然F1劑量組的小鼠全部存活，而且健康狀況良 好，表明用本發(fā)明方法提取、純化的鼠疫耶爾森氏菌A1122株天然F1蛋白具有良好 的免疫保護(hù)作用，可用于制備鼠疫亞單位疫苗。表4鼠疫耶爾森氏菌A1122株天然Fl抗原免疫保護(hù)效果的檢測(cè)結(jié)果疫 苗攻毒劑量(cfu)小鼠總數(shù)(只)存活數(shù)(只)存活率(％)Fl(10嗎)+鋁佐劑100001010100Fl(20ug)+鋁佐劑100001010100等量鋁佐劑100001000此外，用上述相同的方法分別用第一至第四部分鼠疫耶爾森氏菌天然F1抗原 測(cè)定小鼠腹水中F1蛋白單克隆抗體的滴度(蛋白濃度相同)及其免疫保護(hù)效果(免 疫劑量相同)，結(jié)果第一至第四部分鼠疫耶爾森氏菌天然F1抗原的敏感性相同，均 明顯高于重組rFl抗原，可用于鼠疫檢測(cè)的血清學(xué)分析；而且，四部分鼠疫耶爾森氏 菌天然F1抗原的免疫保護(hù)作用也相同。上述檢測(cè)結(jié)果證明，用本發(fā)明方法提取的 四部分鼠疫耶爾森氏菌天然F1抗原不僅成分相同，且免疫保護(hù)效果相同，因而這四 部分天然F1抗原既可單獨(dú)使用，也可按任意比例混合使用。
權(quán)利要求
1、鼠疫耶爾森氏菌天然F1抗原的提取、純化方法，是先從鼠疫耶爾森氏菌培養(yǎng)物中分離培養(yǎng)上清和菌體沉淀，再利用飽和硫酸銨沉淀從培養(yǎng)上清中以及利用玻璃珠從菌體沉淀中分別提取出多部分鼠疫耶爾森氏菌天然F1抗原粗蛋白，再將各部分鼠疫耶爾森氏菌天然F1抗原粗蛋白各自通過飽和硫酸銨沉淀、凝膠過濾得到多部分純化的鼠疫耶爾森氏菌天然F1抗原。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取、純化方法，其特征在于所述鼠疫耶爾森氏菌 天然F1抗原的提取、純化方法，包括以下獲取第一部分至第四部分任意一種鼠疫耶 爾森氏菌天然F1目標(biāo)抗原的必要步驟 1) 鼠疫耶爾森氏菌的培養(yǎng)將鼠疫耶爾森氏菌接種到添加質(zhì)量/體積百分濃度 為0. 1-0. 3%木糖的心腦浸液培養(yǎng)基中，在35-4(TC下培養(yǎng)12-96h; 2) 對(duì)步驟1)得到的鼠疫耶爾森氏菌培養(yǎng)物進(jìn)行離心，分離出培養(yǎng)上清和菌體沉淀； 3) 鼠疫耶爾森氏菌天然Fl抗原粗蛋白的提取將步驟2)分離出的上清用30-50 %飽和硫酸銨沉淀，鹽析，再離心，分離出上清和沉淀，棄掉上清，得到A部分粗蛋 白；將步驟2)分離出的菌體沉淀用PBS緩沖液重懸后，加入玻璃珠，在35-4(TC、 100-400rpm下振搖12-24h，再離心，分離出用于提取B部分和C部分粗蛋白的上清 和用于提取D部分粗蛋白的菌體沉淀；將用于提取B部分和C部分粗蛋白的上清用 30-50%飽和硫酸銨沉淀，鹽析，再離心，棄掉上清，將沉淀用0. 005-0. 015M的PB 緩沖液重新溶解后，再用20-30%飽和硫酸銨沉淀，鹽析，離心，分離出含B部分粗 蛋白的上清和含C部分粗蛋白的沉淀；將用于提取D部分粗蛋白的菌體沉淀重懸于 0.005-0.015M的PBS緩沖液中，超聲，離心，棄掉沉淀，將上清用30-50%飽和硫酸 銨沉淀，鹽析，再離心，分離出上清和沉淀，棄掉上清，得到D部分粗蛋白； 4) 將步驟3)獲得的A部分粗蛋白溶于0. 005-0. 015M的PBS緩沖液中后，用20-30 %飽和硫酸銨沉淀，鹽析，離心，棄掉沉淀，將上清再用1-10%飽和硫酸銨沉淀，鹽 析，離心，棄掉上清，將沉淀溶于0. 005-0. 015M的PBS緩沖液中，過S印hacryl S-200HR 凝膠柱，洗脫液為pH 7.5-8.5、 0.005-0.015M的Tris-HCl緩沖液，透析，得到第一 部分天然F1抗原純化蛋白。 5) 將步驟3)獲得的含B部分粗蛋白的上清用1-10%飽和硫酸銨沉淀，鹽析， 離心，棄掉上清，將沉淀重新溶于0. 005-0. 015M的PB緩沖液中，過S印hacryl S-200服 凝膠柱，洗脫液為pH 7.5-8.5、 0. 005-0.015M的Tris-HCl緩沖液，透析，得到第二部分天然Fl抗原純化蛋白；6) 將步驟3)獲得的含C部分粗蛋白的沉淀溶于0.005-0.015M的PB緩沖液中， 再用20-30%飽和硫酸銨沉淀，鹽析，離心，棄掉沉淀，將上清用1-10%飽和硫酸銨 沉淀，離心，棄掉上清，將沉淀重新溶于O. 005-0. 015M的PB緩沖液中，過S印hacryl S-200服凝膠柱，洗脫液為pH 7.5-8.5、 0. 005-0. 015M的Tris-HCl緩沖液，透析， 得到第三部分天然Fl抗原純化蛋白；7) 將步驟3)獲得的D部分粗蛋白溶于0. 005-0. 015M的PB緩沖液中，用20-30 %飽和硫酸銨沉淀，鹽析，離心，棄掉沉淀，將上清用1-10%飽和硫酸銨沉淀，鹽析， 離心，棄掉上清，將沉淀重新溶于0. 005-0. 015M的PB緩沖液中，過S印hacryl S-200HR 凝膠柱，洗脫液為pH 7.5-8.5、 0.005-0.015M的Tris-HCl緩沖液，透析，得到第四 部分天然F1抗原純化蛋白；第一至第四部分天然Fl抗原純化蛋白中的一種或它們之間任意幾種組合的混合 產(chǎn)物構(gòu)成所要的鼠疫耶爾森氏菌天然F1目標(biāo)抗原。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的提取、純化方法，其特征在于所述步驟l)中的鼠疫 耶爾森氏菌為鼠疫耶爾森氏菌EV76疫苗株、A1122株、EV40疫苗株、Tjiwidej株、 M23、 P175或0tten。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的提取、純化方法，其特征在于所述心腦浸液培養(yǎng)基 中木糖的質(zhì)量/體積百分濃度為0.2%;鼠疫耶爾森氏菌的培養(yǎng)溫度為37X:，培養(yǎng)時(shí) 間為72h。
5、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的提取、純化方法，其特征在于所述步驟l)中在鼠疫 耶爾森氏菌的培養(yǎng)過程中對(duì)其進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，振蕩速率為100-400rpm;所述步驟3) 中的超聲條件為5秒間5秒，時(shí)間為30min。
6、 根據(jù)權(quán)利要求2-5任一項(xiàng)所述的提取、純化方法，其特征在于所述步驟3) 至步驟7)中30-50%飽和硫酸銨均為40%飽和硫酸銨，20-30%飽和硫酸銨均為25 %飽和硫酸銨，1-100%飽和硫酸銨均為5%飽和硫酸銨；鹽析條件均為；在3-5"C下 鹽析5-20h;所述PB緩沖液的濃度均為0.01M， PBS緩沖液的濃度均為0. OIM。
7、 根據(jù)權(quán)利要求2-5任一項(xiàng)所述的提取、純化方法，其特征在于所述步驟2) 至步驟7)中的離心條件均為在4000-12000rpm下離心20-40min。
8、 根據(jù)權(quán)利要求2-5任一項(xiàng)所述的提取、純化方法，其特征在于所述步驟4) 至步驟7)中S印hacryl S-200HR凝膠柱的洗脫液均為pH 8. 0、 0. 01M的Tris-HCl緩 沖液；所用的透析液為0. 005-0. 015M的PBS緩沖液。
9、 用權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述提取、純化方法得到的鼠疫耶爾森氏菌天然F1抗原。
10、權(quán)利要求9所述鼠疫耶爾森氏菌天然Fl抗原在鼠疫亞單位疫苗的制備及鼠 疫的免疫檢測(cè)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了鼠疫耶爾森氏菌天然F1抗原的一種提取、純化方法。該方法采用玻璃珠處理和飽和硫酸銨沉淀與分子篩過濾相結(jié)合的方案，成功地從鼠疫耶爾森氏菌的培養(yǎng)物中提取、純化出高純度的天然F1抗原。經(jīng)免疫學(xué)檢測(cè)和動(dòng)物保護(hù)實(shí)驗(yàn)證明，用本發(fā)明方法獲得的天然F1抗原具有較高的免疫保護(hù)作用和檢測(cè)靈敏度，如以相同濃度的本發(fā)明天然F1抗原和經(jīng)表達(dá)獲得的重組F1抗原(rF1)，分別對(duì)同一小鼠腹水樣本進(jìn)行F1單克隆抗體檢測(cè)，結(jié)果顯示，天然F1抗原檢測(cè)的抗體滴度明顯高于重組rF1抗原的檢測(cè)結(jié)果。本發(fā)明將在鼠疫亞單位疫苗的研制及鼠疫的檢測(cè)診斷(如免疫學(xué)檢測(cè)等)中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號(hào)C07K14/195GK101220086SQ20081005569
公開日2008年7月16日 申請(qǐng)日期2008年1月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月7日
發(fā)明者吳本傳, 崔百忠, 朱紫雯, 楊永海, 楊瑞馥, 棠 王, 虎 王, 王效義, 王祖隕, 祁芝珍, 郭兆彪 申請(qǐng)人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所