專利名稱：檢驗(yàn)鼠疫菌的熒光免疫染色試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動(dòng)物鼠疫疫情監(jiān)測與鼠疫診斷技術(shù)領(lǐng)域，尤其是能通過熒光顯微鏡檢 查識(shí)別鼠疫菌，是一種檢驗(yàn)鼠疫菌的熒光免疫染色試劑盒。
背景技術(shù)：
鼠疫是由鼠疫桿菌引起的一種自然疫源性烈性傳染病，是我國《傳染病防治法》規(guī) 定的甲類傳染病，嚙齒類是鼠疫的主要宿主動(dòng)物和傳染源，可自然感染鼠疫動(dòng)物近200種。 我國已發(fā)現(xiàn)12個(gè)類型的鼠疫疫源地，分布于19個(gè)省區(qū)，面積130多萬km2。20世紀(jì)90年代 以來，一些靜息多年的鼠疫自然疫源地動(dòng)物間鼠疫持續(xù)處于活躍狀態(tài)，人間鼠疫時(shí)有發(fā)生， 遠(yuǎn)距離高速度傳播的危險(xiǎn)性增加。監(jiān)測動(dòng)物間鼠疫的流行狀況，是預(yù)防控制人間鼠疫的重 要工作內(nèi)容。實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)結(jié)果是制定實(shí)施鼠疫控制措施的重要依據(jù)，鼠疫傳播速度快，防控鼠 疫應(yīng)急反應(yīng)需要快速的檢測鼠疫技術(shù)。分離培養(yǎng)鼠疫菌最快要24小時(shí)才能出結(jié)果；膠體金 紙上色譜法、反相間接血凝試驗(yàn)等檢測鼠疫菌及其抗原的免疫學(xué)方法，可在3小時(shí)內(nèi)出結(jié) 果，最小檢出量在IO5個(gè)菌體/ml，敏感性較低。顯微鏡檢查鼠疫菌，美蘭染色為兩端濃染，革 蘭氏染色為革蘭氏陰性桿菌，顯微鏡檢查美蘭染色、革蘭氏染色的標(biāo)本速度快，但鼠疫菌和 腸桿菌科的細(xì)菌沒有明顯差異，沒有鑒別意義。根據(jù)應(yīng)急反應(yīng)的需要，檢查鼠疫菌的準(zhǔn)確、 穩(wěn)定、快速、簡便的檢驗(yàn)鼠疫菌的方法的研究倍受關(guān)注。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種檢查動(dòng)物鼠疫菌的熒光免疫染色試劑盒，克服了現(xiàn)有動(dòng)物鼠疫 監(jiān)測與診斷技術(shù)中存在的問題。本發(fā)明是通過應(yīng)用熒光免疫染色法顯示鼠疫菌夾膜中的Fl 抗原，檢查各種動(dòng)物血液、器官、臟器組織中的鼠疫菌，經(jīng)多次改進(jìn)，現(xiàn)已制成具體有效的檢 查鼠疫菌的熒光免疫染色試劑盒，可準(zhǔn)確、穩(wěn)定、快速、簡便鑒定鼠疫菌，供鼠疫監(jiān)測和診斷 使用。本發(fā)明的技術(shù)方案是通過以下措施來實(shí)現(xiàn)的一種檢驗(yàn)鼠疫菌的熒光免疫染色 試劑盒，其包括凍干熒光素標(biāo)記抗體1支，熒光抗體保存液2ml X 1支，固定液20ml X 1瓶， 10 X稀釋液20ml X 1瓶，鼠疫菌陽性對照2ml X 1支，鼠疫菌陰性對照2ml X 1支，抑制用鼠 疫Fl抗體5ml X 1支，1 %硫柳汞2ml X 1支；所述螢光素標(biāo)記抗體為異硫氰酸熒光素標(biāo)記鼠 疫Fl抗體即FITC-FlAb。對上述本發(fā)明的技術(shù)方案可進(jìn)一步進(jìn)行如下的選擇或/和優(yōu)化 上述異硫氰酸熒光素標(biāo)記鼠疫Fl抗體按下述方法得到
(1)抗鼠疫Fl抗原血清，用硫酸銨沉淀法提取鼠疫Fl抗體；
(2)含鼠疫Fl抗體20mg的生理鹽水溶液27ml，加含異硫氰酸熒光素即FITC2mg的 0. 5mol/LpH9. 5碳酸鹽緩沖液3ml，混勻；室溫持續(xù)攪拌2小時(shí)；(3)邊搖邊緩慢加入飽和硫酸銨水溶液30ml，4°C放置1小時(shí)，4000X g離心10分鐘，棄 上清；沉淀用生理鹽水5ml溶解，邊搖邊緩慢加入飽和硫酸銨水溶液5ml，4°C放置1小時(shí)， 4000Xg離心10分鐘，棄上清，再用50%飽和度硫酸銨洗滌沉淀2次，洗除游離異硫氰酸熒 光素即FITC，沉淀用生理鹽水5ml溶解，即為FITC-FlAb溶液；
(4)將FITC-FlAb溶液裝入透析袋，用0.01mol/LpH7. 2磷酸鹽緩沖液即PBS在4°C溫 度下透析，每6-8小時(shí)換0. 01mol/LpH7. 2PBS液1次；將FITC-FlAb溶液移入試管；
(5)測定FITC-FlAb適用濃度，用濃度按容量/容量含50%新生小牛血清的0.Olmol/ LpH7. 2PBS稀釋，分裝，凍干，-20°C保存；
在上述方法中溶液濃度除注明外均為重量/容量。本發(fā)明的有益效果被測物經(jīng)過氧乙醇固定，使檢測過程安全；突出特點(diǎn)是實(shí)驗(yàn) 條件簡單，用熒光顯微鏡觀察染色結(jié)果，全程60分鐘，最小檢出量為500個(gè)鼠疫菌體/ml ； 抑制試驗(yàn)可提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性；為動(dòng)物鼠疫監(jiān)測和診斷提供了準(zhǔn)確、快速、簡便的檢驗(yàn) 器具。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明不受下述實(shí)施例的限制，可依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案和實(shí)際情況來確定具體 的實(shí)施方式。下述實(shí)施例中，無特別說明均為常規(guī)方法；溶液濃度除注明外均為重量/容量。實(shí)施例1 檢查動(dòng)物鼠疫菌的熒光免疫染色試劑盒制備
一、檢查動(dòng)物鼠疫菌的熒光免疫染色試劑盒的組成
1.異硫氰酸熒光素標(biāo)記鼠疫Fl抗體(FITC-FlAb)凍干 1支
2.熒光抗體保存液2ml 1支
3.固定液20ml 1瓶
4.10 X稀釋液20ml 1瓶
5.鼠疫菌陽性對照(凍干劑)2ml 1支
6.鼠疫菌陰性對照(凍干劑)2ml 1支
7.抑制用鼠疫Fl抗體(凍干劑)5ml 1支 8.1%硫柳汞 2ml 1支
二、試劑盒各組分的制備方法
1.制備異硫氰酸熒光素標(biāo)記鼠疫Fl抗體(FITC-FlAb)
(1)抗鼠疫Fl抗原血清，用硫酸銨沉淀法提取鼠疫Fl抗體；
(2)含鼠疫Fl抗體20mg的生理鹽水溶液27ml，加含異硫氰酸熒光素(以下簡稱 FITC) 2mg的0. 5mol/LpH9. 5碳酸鹽緩沖液3ml，混勻；室溫持續(xù)攪拌2小時(shí)；
(3)邊搖邊緩慢加入飽和硫酸銨水溶液30ml，4°C放置lh，4000Xg離心10分鐘，棄 上清；沉淀用生理鹽水5ml溶解，邊搖邊緩慢加入飽和硫酸銨水溶液5ml，4°C放置1小時(shí)， 4000 Xg離心10分鐘，棄上清，再用50%飽和度硫酸銨洗滌沉淀2次，洗除游離FITC，沉淀 用生理鹽水5ml溶解，即為FITC-FlAb溶液；
(4)將FITC-FlAb溶液裝入透析袋，用0.01mol/LpH7. 2磷酸鹽緩沖液即PBS，4°C透析， 每6-8h換液1次；將FITC-FlAb溶液移入試管；(5)測定FITC-FlAb適用濃度，用含50% (容量/容量)新生小牛血清0. Olmol/ LpH7. 2PBS稀釋，分裝，凍干，-20°C保存。2.熒光抗體保存液0. lmol/LpH7. 2磷酸鹽緩沖液與等量丙三醇混合，分裝，每支 2ml。3.固定液75%(容量/容量)乙醇100ml，30%(容量/容量)H2O2 5ml，分裝，每支 20ml。4. IOX稀釋液制備0. lmol/LpH7. 2磷酸鹽緩沖液90ml，吐溫-205ml，新生小牛血 清IOml，硫柳汞0. 2g，混合溶解分裝，每支20ml。5.鼠疫菌陽性對照制備鼠疫菌EV株用0. 01mol/LpH7. 2PBS配制成5% (濕菌重 量/容量)菌液Iml，與含3 % H2O2的95 %酒精5ml混勻，20_37°C室溫放置30分鐘，4000 X g 離心10分鐘，收集菌體，用含30%新生小牛血清0. 01mol/LpH7. 2PBS50ml制成混懸液，分裝 每支0. 1ml，凍干。6.鼠疫菌陰性對照制備菌株為大腸桿菌，制備方法與鼠疫菌陽性對照相同。7.抑制用鼠疫Fl抗體0. 01mol/LpH7. 2PBS30ml，加硫柳汞0. Ig,新生小牛血清 10ml，加滴度為1 8000的鼠疫Fl抗體10ml，混勻，分裝，每支0. 2ml，凍干。8. 硫柳汞硫柳汞lg，NaCl lg，加蒸餾水至100ml，分裝，每支2ml。上述制備好的各種試劑定量分裝，裝入檢查動(dòng)物鼠疫菌的熒光免疫染色的試劑
品.ο實(shí)施例2 檢查動(dòng)物鼠疫菌的熒光免疫染色的試劑盒的應(yīng)用方法 一、檢查動(dòng)物鼠疫菌的熒光免疫染色的器材與試劑配制
1.稀釋液10X稀釋液用0. 85%NaCl溶液稀釋10倍。2. FITC-FlAb貯存液每支FITC-Fl抗體(凍干劑)加熒光抗體保存液2ml溶解，混 勻，-20°C保存，有效期6個(gè)月。FITC-FlAb應(yīng)用液FITC_FlAb貯存液用稀釋液10倍稀釋，4°C保存10天。3.鼠疫菌陽性對照每支鼠疫菌陽性對照(凍干劑)用稀釋液2ml溶解混勻。4.鼠疫菌陰性對照每支鼠疫菌陰性對照(凍干劑)用稀釋液2ml溶解混勻。5.抑制用鼠疫Fl抗體用稀釋液5ml溶解混勻。二、標(biāo)本準(zhǔn)備
1.印片用剪刀剪切待檢標(biāo)本，剪切面在吸水紙上輕按吸去過多血液，再將剪切面在 玻片上印片，同步制陽性、陰性對照涂片，自然干燥，火焰固定。2.涂片沾取待檢菌液，涂片，同步制陽性、陰性對照涂片，自然干燥，火焰固定。3.富集細(xì)菌標(biāo)本涂片新鮮、腐敗或干枯的臟器、肌肉組織塊，放入乳缽內(nèi)剪碎， 研磨成糊狀，按組織塊重量的2倍加含殺菌劑的生理鹽水，繼續(xù)研磨制成混懸液。骨頭用 紗布包裹骨頭，用剪刀或骨鉗剪斷骨頭的兩端，采取紅色骨髓；如骨髓干枯，可剪斷骨頭的 一端，用注射器注入少量含殺菌劑的生理鹽水，浸泡30分鐘，反復(fù)吹吸數(shù)次后吸出，或?qū)⒘?一端打開，直接沖入試管內(nèi)；也可用紗布包裹骨頭，砸碎骨頭紅髓豐富的部位，在2倍容量 的含消毒劑的生理鹽水中浸泡30分鐘，反復(fù)沖洗，收集混懸液?；鞈乙?、心血混懸液500 X g 離心3分鐘或靜置15分鐘，棄組織塊和細(xì)胞沉淀，吸取上清液，4000 Xg離心5分鐘，沉淀 用少量生理鹽水混懸，按常規(guī)法涂片，同步制陽性、陰性對照涂片，自然干燥，火焰固定。
三、檢查鼠疫菌的熒光免疫染色
1.待檢標(biāo)本的涂片或印片2張與陽性對照、陰性對照同步進(jìn)行。2.用火焰固定，滴加固定液覆蓋標(biāo)本或浸泡于固定液中5分鐘，標(biāo)本面的背面流 水沖洗1分鐘。3.熒光免疫染色(1)抑制試驗(yàn)標(biāo)本片，用Fl抗體應(yīng)用液覆蓋待檢標(biāo)本5分鐘，流 水沖洗標(biāo)本面的背面1分鐘；
(2)熒光免疫染色片和抑制試驗(yàn)標(biāo)本片，用FITC-FlAb應(yīng)用液覆蓋玻片上的標(biāo)本，置濕 盒內(nèi)28-37°C染色20分鐘，流水沖洗標(biāo)本面的背面1分鐘。4.觀察記錄結(jié)果
熒光顯微鏡油鏡1000X鏡檢，有鼠疫Fl抗原的鼠疫菌菌體呈明亮的黃綠色； 陽性、陰性對照染色結(jié)果必須與已知陽性、陰性相符，抑制試驗(yàn)與陰性相同； 按鏡檢染色清晰的菌體量分級未看到(_)，平均每視野有1-5個(gè)(+ )，每視野5個(gè)以上 (++),每視野50個(gè)以上(+++ )，滿視野密布(++++ )。
權(quán)利要求
一種檢驗(yàn)鼠疫菌的熒光免疫染色試劑盒，其特征在于包括凍干熒光素標(biāo)記抗體1支，熒光抗體保存液2ml×1支，固定液20ml×1瓶，10×稀釋液20ml×1瓶，鼠疫菌陽性對照2ml×1支，鼠疫菌陰性對照2ml×1支，抑制用鼠疫F1抗體5ml×1支，1％硫柳汞 2ml×1支；所述螢光素標(biāo)記抗體為異硫氰酸熒光素標(biāo)記鼠疫F1抗體即FITC-F1Ab。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢驗(yàn)鼠疫菌的熒光免疫染色試劑盒，其特征在于異硫氰酸熒 光素標(biāo)記鼠疫F1抗體按下述方法得到(1)抗鼠疫F1抗原血清，用硫酸銨沉淀法提取鼠疫F1抗體；(2)含鼠疫F1抗體20mg的生理鹽水溶液27ml，加含異硫氰酸熒光素即FITC2mg的 0. 5mol/LpH9. 5碳酸鹽緩沖液3ml，混勻；室溫持續(xù)攪拌2小時(shí)；(3)邊搖邊緩慢加入飽和硫酸銨水溶液30ml，4°C放置1小時(shí)，4000Xg離心10分鐘， 棄上清；沉淀用生理鹽水5ml溶解，邊搖邊緩慢加入飽和硫酸銨水溶液5ml，4°C放置1小 時(shí)，4000Xg離心10分鐘，棄上清，沉淀再用50%飽和度硫酸銨洗滌沉淀2次，洗除游離的 FITC，沉淀用生理鹽水5ml溶解，即為FITC-FlAb溶液；(4)將FITC-FlAb溶液裝入透析袋，用0.01mol/LpH7. 2磷酸鹽緩沖液即PBS在4°C溫 度下透析，每6至8小時(shí)換0. 01mol/LpH7. 2PBS液1次；將FITC-FlAb溶液移入試管；(5)測定FITC-FlAb適用濃度，用濃度按容量/容量含50%新生小牛血清0.Olmol/ LpH7. 2PBS稀釋，分裝，凍干，-20°C保存；在上述方法中溶液濃度除注明外均為重量/容量。
全文摘要
本發(fā)明涉及動(dòng)物鼠疫疫情監(jiān)測與鼠疫診斷技術(shù)領(lǐng)域，是一種檢驗(yàn)鼠疫菌的熒光免疫染色試劑盒，其包括熒光素標(biāo)記抗體1支，熒光抗體保存液2ml×1支，固定液20ml×1瓶，10×稀釋液20ml×1瓶，鼠疫菌陽性對照2ml×1支，鼠疫菌陰性對照2ml×1支，抑制用鼠疫F1抗體5ml×1支，1％硫柳汞5ml×1支；所述螢光素標(biāo)記抗體為異硫氰酸熒光素標(biāo)記鼠疫F1抗體。本發(fā)明的有益效果被測物經(jīng)過氧乙醇固定，使檢測過程安全；用熒光顯微鏡觀察染色結(jié)果，程序簡單，全程60分鐘，最小檢出量為500個(gè)鼠疫菌體/ml；抑制試驗(yàn)可提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性；為動(dòng)物鼠疫監(jiān)測和診斷提供了準(zhǔn)確、穩(wěn)定、快速、簡便的檢驗(yàn)器具。
文檔編號G01N33/533GK101839916SQ20101020199
公開日2010年9月22日 申請日期2010年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月17日
發(fā)明者丁雄杰, 唐建國, 徐兵, 熱娜.吐爾地, 蔣衛(wèi), 雷剛 申請人:新疆維吾爾自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心