檢測樂果的時間分辨熒光免疫試劑盒及其檢測方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物檢測領域，具體的說，涉及一種檢測樂果的時間分辨熒光免疫分析試劑盒及其檢測方法。
【背景技術】
[0002]樂果是內(nèi)吸性有機磷殺蟲、殺螨劑。殺蟲范圍廣，對害蟲和螨類有強烈的觸殺和一定的胃毒作用。在昆蟲體內(nèi)能氧化成活性更高的氧樂果，其作用機制是抑制昆蟲體內(nèi)的乙酰膽堿脂酶，阻礙神經(jīng)傳導而導致死亡，具有致癌性、致突變型和致畸性，因此安全問題受到高度重視。
[0003]樂果殘留分析一般使用氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)及氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(GC/MS)，這些方法靈敏、準確，可以同時測定多種藥物，但需要昂貴的儀器，樣品前處理復雜、繁瑣費時、檢測成本較高，而且需專業(yè)人員操作，很難滿足對樣品進行現(xiàn)場、批量、快速檢測的需要。因此，開發(fā)一種簡單快速、適用于農(nóng)藥殘留現(xiàn)場監(jiān)控的分析方法具有重要的現(xiàn)實意義。
[0004]而時間分辨熒光免疫分析法(TR-FIA)由于其特異性強、靈敏度高、操作簡單、廉價，且特別適于大批量樣品的檢測等優(yōu)點而越來越被人們所重視和采用。目前還沒有針對樂果檢測的時間熒光免疫分析法的專利和文獻報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為解決以上技術問題，本發(fā)明的目的在于提供一種蔬菜水果中樂果殘留的檢測時間分辨熒光免疫分析試劑盒。
[0006]本發(fā)明的目的之二在于提供一種快速簡便地檢測蔬菜水果中樂果的時間分辨熒光免疫分析試劑盒的檢測方法，用于定量或定性地檢測蔬菜水果中樂果殘留量。
[0007]本發(fā)明目的之一是這樣實現(xiàn)的:檢測樂果的時間分辨熒光免疫分析試劑盒，其關鍵在于由多孔包被板、緩沖液、樂果標準品溶液、抗樂果的抗體凍干品、銪標記的兔抗鼠抗體、洗滌液和增強液體所組成。
[0008]本發(fā)明目的之二是這樣實現(xiàn)的:檢測樂果的時間分辨熒光免疫分析試劑盒的檢測方法，包括免疫原、包被原和單克隆抗體的制備以及樣品前處理及檢測，其關鍵在于:
(1)免疫原的制備:將半抗原樂果與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)，得到免疫原(樂果-BSA)；
(2)包被原的制備:將半抗原樂果與卵血清白蛋白(OVA)偶聯(lián)，得到包被原(樂果-OVA)；
(3)單克隆抗體的制備:
a.用步驟(I)的免疫原(樂果-BSA)免疫小鼠，通過雜交瘤技術，得到分泌抗樂果的單克隆抗體的雜交瘤細胞株；
b.以體內(nèi)誘生腹水法大量制備抗體，使用ProteinG柱進行純化，獲得抗樂果的單克隆抗體IgG ；
c.用步驟(2)的包被原包被96孔包被板；
(4)樣品的前處理及檢測:
取包被有包被原(樂果-OVA)的多孔包被板，加入50 μ?的樂果到各自的微孔中，加50μ?以緩沖液稀釋的抗樂果抗體，250C?37°C振蕩0.5~1小時，洗滌液洗3次，加以緩沖液稀釋的100 μ? Eu3+ -兔抗鼠抗體，25°C?37°C振蕩0.5~1小時，洗滌液洗6次，加200 μ?增強液振蕩5分鐘后測量熒光強度cps，根據(jù)標準曲線計算樣品中的樂果含量。
[0009]上述的固相載體是多孔包被板，采用96孔的多孔包被板作為固相載體。
[0010]本發(fā)明主要采用時間分辨熒光免疫分析方法來檢測樂果。采用時間分辨熒光免疫分析法的技術主要有兩個方面:第一，特異性單克隆抗體制備，用偶聯(lián)的免疫原免疫小鼠，通過雜交瘤技術，得到分泌抗樂果的單克隆抗體的雜交瘤細胞株；以體內(nèi)誘生腹水法大量制備抗體，使用Protein G柱進行純化,獲得抗樂果的單克隆抗體IgG。第二, Eu3+標記抗體的制備。
[0011]本發(fā)明測定方法:測定的基礎是標記免疫反應。包被有樂果-OVA的多孔包被板，加入測試樣品到各自的微孔中，再加入抗樂果抗體，振蕩反應，游離的樂果與微孔板上的樂果-OVA競爭抗樂果抗體，洗滌液洗滌，沒有連接的樂果抗體在洗滌步驟中被除去。加入Eu3+-兔抗鼠抗體，進行標記免疫反應，再用洗滌液洗滌，反應后沒有連接的Eu3+-兔抗鼠抗體在洗滌步驟中被除去。加增強液振蕩后，在紫外燈的激發(fā)下發(fā)射很強的熒光，用時間分辨熒光儀測定其熒光強度cps，熒光強度與樣品中的濃度成反比，對照標準曲線即可確定樣品中樂果的量。
[0012]本發(fā)明檢測方法不需要昂貴的儀器，樣品前處理簡單、能現(xiàn)場操作檢測，應用廣泛，該方法靈敏、準確、快速，操作簡便、特異性強，適用于大批樣品的快速檢測。
【附圖說明】
[0013]圖1為本發(fā)明的樂果標準品與抗體的TR-FIA標準抑制曲線圖。
【具體實施方式】
實施例
[0014]1、免疫原與包被原制備
本發(fā)明免疫原(樂果-BSA)的合成:準確稱取樂果324mg溶解在2mL N, N- 二甲基甲酰胺中，攪拌下逐滴加入Y-氨基丁酸溶液，攪拌反應3小時，調(diào)節(jié)反應液pH 10左右。離心除掉沉淀物。將上述反應逐滴加入BSA溶液中(320mg BSA溶解于5mL生理鹽水)，再加入N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) 23mg, N, N- 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC) 45.4mg，4°C反應過夜，離心除去沉淀，取上清液用磷酸緩沖液(PBS)透析3天，每6小時更換透析液，將所得產(chǎn)物低壓凍干，于_20°C保存?zhèn)溆茫?br> 包被原(樂果-0VA)的合成:在上述反應中，將BSA換成OVA后，得到反應偶聯(lián)物樂果-0VA，該偶聯(lián)物作為TR-FIA檢測時作為包被原使用。
[0015]2、單克隆抗體制備 2.1動物免疫
用步驟I制備的免疫原分別免疫6周齡雌性Balb/c小鼠，每只小鼠的免疫劑量為100μδ/0.2mL。首次免疫，用無菌0.0lmol/L pH7.4 PBS溶解免疫原(樂果-BSA)，再與等量弗氏完全佐劑混合，完全乳化，勁背部皮下分2?3點注射；加強免疫，用0.0lmol/L pH7.4PBS溶解免疫原與等量弗氏完全佐劑混合，充分乳化，小鼠腹腔注射。每次間隔14?21天，第3次免疫后7?10天開始對免疫小鼠尾靜脈采血，收集血清,用ELISA檢測小鼠血清效價。末次免疫后間隔4周以上，在細胞融合前3?4天，腹腔注射樂果-BSA抗原100μδ/0.2mL/只，注射后每天注意觀察，保證融合前小鼠狀態(tài)良好。
[0016]2.2單克隆抗體制備
分離免疫小鼠的脾細胞，并進行勻漿制備免疫脾細胞。取I只免疫的Balb/c小鼠，從眼眶放血分離血清作為陰性血清，處死。小鼠用75%酒精浸泡5min，進行整體消毒。將小鼠四肢固定，然后用鑷子夾住小鼠下腹部皮膚，剪開一小口，再用鑷子撕開皮膚，露出腹膜，換一套鑷子和剪刀，在腹部中央腹膜上用剪刀剪開一小口。換一套鑷子和剪刀，用剪刀剪開腹膜，露出脾臟，再換一套器械用鑷子夾住脾臟，用剪刀將脾臟外膜剪破，然后放入事先滅菌的勻漿器中。加適量基礎培養(yǎng)基(RPM1-1640)于勻漿器中，進行研磨，擠壓出脾細胞，取出勻漿器的勻漿棒，再補加適量基礎培養(yǎng)基(RPM1-1640)，靜置2min，將上層細胞液吸取后，放入腹腔巨噬細胞離心管中，重復上述操作I次。1200r/min離心lOmin，除去上清。將18個免疫脾細胞與I?2X107個SP2/0骨髓瘤細胞按照1:10或1:5的比例加入離心管中，進行混勻，然后于1500r/min水平離心lOmin，棄去上清。將離心管倒扣在滅菌的吸水紙上，把管中液體吸干。用手指或桌面輕輕敲擊管底，讓沉淀的細胞松動，再把離心管置于37°C水浴鍋中。在Imin內(nèi)緩慢將50% PEG 0.8mL滴入離心管中，邊加邊輕輕用吸管尖攪拌沉淀細胞。再繼續(xù)攪拌30s后，靜置lmin，然后慢慢加入事先進行37°C預溫的40mL基礎培養(yǎng)基(RPM1-1640)ο加基礎培養(yǎng)基方法為:第Imin內(nèi)逐滴滴入ImL,第2min內(nèi)逐滴滴入2mL，第3min內(nèi)逐滴滴入3mL,第4min內(nèi)逐滴滴入4mL,在每次加培養(yǎng)基時需緩慢加入,并輕輕地攪拌培養(yǎng)基，最后將剩余的RPM1-1640培養(yǎng)基慢慢加入。1000r/min離心5min，除去上清。然后用HAT培養(yǎng)基懸浮混合的細胞，再加入飼養(yǎng)脾細胞。根據(jù)需要補加適量的HAT培養(yǎng)基，混合均勻，再將含有飼養(yǎng)細胞的細胞融合液滴加到96孔細胞培養(yǎng)板上，滴加量約為150?/孔。將培養(yǎng)板置于37 °C、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中，進行培養(yǎng)。用建立的間接ELISA篩選陽性細胞克隆。選擇強陽性集落生長的孔，用有限稀釋法進行克隆。并對其他陽性孔，進行24孔擴大培養(yǎng)，用間接ELISA和間接競爭ELISA對擴大培養(yǎng)孔的上清液進行檢測，對間接ELISA和間接競爭ELISA均為陽性孔的細胞進行液氮冷凍保存。通過融合檢測，并進行3次亞克隆后獲得雜交瘤細胞株。雜交瘤細胞株經(jīng)過多次傳代、凍存、復蘇，雜交瘤細胞分泌抗體穩(wěn)定。進行雜交瘤細胞染色體的計數(shù)，將每株雜交瘤細胞隨機選擇20個細胞，進行細胞染色體條數(shù)的計數(shù)，再計算細胞染色體條數(shù)的平均值。小鼠脾細胞染色體數(shù)為40條，SP2/0細胞的染色體數(shù)目平均數(shù)為62~68條，而本試驗獲得的20株雜交瘤細胞染色體數(shù)目都在92~103條之間，平均為96.8條。本雜交瘤細胞染色體數(shù)目高于兩親本細胞的染色體數(shù)目，說明是兩種細胞的雜交產(chǎn)物。取細胞株細胞分泌的培養(yǎng)上清液，進行1:10稀釋后，用夾心ELISA方法測定抗體亞型，該細胞株分泌的抗體亞型為IgGl。采用辛酸-硫酸銨法對小鼠腹水進行純化。該單克隆抗體可用于制備時間分辨熒光檢測試劑盒。
[0017]2.3單克隆抗體的純化
采用辛酸-硫酸銨法對小鼠腹水進行純化:取小鼠腹水10mL，加入等體積的巴比妥緩沖液，適量的二氧化硅混合，室溫振蕩30min。室溫靜置15min后，取上清于潔凈離心管中，4°C, 1800r/min離心20min ;取上清液18mL,加入36mL 0.06mol/L醋酸鈉緩沖液,用HCl調(diào)pH值至4.5，充分攪拌下在30min內(nèi)緩慢加入辛酸297 μ? ;繼續(xù)攪拌lOmin，然后轉(zhuǎn)入4°C冰箱靜置2h，4°C，15000r/min離心30min，上清液經(jīng)0.45Pm濾膜過濾后體積為50mL ;加入5mL 0.lmol/L的磷酸緩沖液，用NaOH調(diào)pH值至7.6，攪拌下緩緩加入硫酸銨至終濃度為0.277g/mL ;4°C冰箱靜置 2h 后，4°C, 12000r/min 離心 30min,棄上清；沉淀用 5mL 0.lmol/L的磷酸緩沖液重懸，裝入透析袋，用5000mL 0.0lmol/L pH7.2 PBS緩沖液充分透析后，再用2000 mL蒸懼水透