人附睪分泌蛋白4時間分辨熒光免疫分析方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種人附睪分泌蛋白4時間分辨熒光免疫分析方法及試劑盒，其選用抗人附睪分泌蛋白4單克隆抗體H00010406-M01作為包被抗體，用緩沖液稀釋至1～10mg/L作為包被液；選用鑭系元素離子標(biāo)記的抗人附睪分泌蛋白4抗體PAB18601作為標(biāo)記抗體，用反應(yīng)緩沖液以體積比為1：25～100稀釋；在包被抗體的反應(yīng)板上，每孔依次加入體積比為1:3～8的人附睪分泌蛋白4標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品、以及稀釋的標(biāo)記抗體，采用平衡法進(jìn)行熒光檢測。本發(fā)明還提供了相應(yīng)的試劑盒。本發(fā)明具有較高的靈敏度、特異度及穩(wěn)定性；且分析系統(tǒng)高度自動化，可提高臨床檢驗(yàn)結(jié)果的速度，又可大幅度降低人為誤差和增加檢出結(jié)果的可靠性。
【專利說明】人附睪分泌蛋白4時間分辨熒光免疫分析方法及試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及人附睪分泌蛋白4的分析檢測技術(shù)，特別涉及一種人附睪分泌蛋白4時間分辨熒光免疫分析方法及試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002]人附睪分泌蛋白4(HE4)是一個新的高特異性盆腔腫瘤標(biāo)志物，1991年由Kirchhoff首先發(fā)現(xiàn)，1999年Schummer應(yīng)用cDNA列傳雜交技術(shù)揭示了 HE4基因與卵巢癌(ovarian cancer, OC)的關(guān)系,2003年Hellstrom等通過免疫鼠制備的單克隆抗體建立ELISA方法，檢測了 37例OC患者的血清，首次肯定了 HE4作為OC的血清標(biāo)志物的臨床價值。近年來國內(nèi)外學(xué)者的系列研究表明，HE4在卵巢漿液性癌、卵巢上皮性癌、卵巢透明細(xì)胞癌及子宮內(nèi)膜癌均有不同程度的高表達(dá)，而在卵巢黏液性癌及正常卵巢組織中不表達(dá)，提示該分子可能是一個卵巢癌相關(guān)基因。此外，它在肺癌、胰腺癌、移行細(xì)胞癌、胃腸癌、乳腺癌等也有一定程度的表達(dá)。
[0003]卵巢癌是婦科惡性腫瘤中死亡率高居第一位的腫瘤。HE4作為一個新的血清標(biāo)志物，在OC的早期診斷、盆腔腫塊的鑒別診斷及復(fù)發(fā)監(jiān)測等方面均有較好的臨床應(yīng)用價值。目前，臨床上測定血清中HE4的主要方法有化學(xué)發(fā)光免疫分析法(CMIA)和酶免疫測試法(EIA)法等。這些方法均采用進(jìn)口產(chǎn)品，價格昂貴。
[0004]而時間分辨突光免疫分析(time-resolved fluoroimmunoassay, TRFIA)利用具有獨(dú)特?zé)晒馓匦缘蔫|系元素，如銪(Eu)、鋱(Te)、釤(Sm)、鏑(Dy)等及其螯合物為示蹤劑，代替酶、同位素、熒光物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等標(biāo)記抗體、抗原、源素、多肽、蛋白質(zhì)、核酸探針及生物細(xì)胞，待反應(yīng)體系完成后，用時間分辨熒光免疫分析檢測儀測定反應(yīng)物中的熒光強(qiáng)度，定量分析待測物質(zhì)的含量。由于鑭系兀素突光時間極長，為傳統(tǒng)突光的103?106倍。激發(fā)光與發(fā)射光之間的stokes位移大,可達(dá)290nm,而普通突光素的stokes位移僅28nm,采用波長分辨和時間延遲的方法，可大大提高檢測靈敏度和特異性，目前已應(yīng)用于臨床微量物質(zhì)，如乙肝病毒標(biāo)記、PSA、AFP等癌胚抗原的定量測定。
[0005]建立一種靈敏穩(wěn)定廉價的免疫測定方法非常有助于臨床應(yīng)用，為此我們利用時間分辨突光免疫分析技術(shù)(Time-resolved fluoroimmunoassay, TrFIA)的高靈敏度寬線性和好的穩(wěn)定性，選用針對HE4抗原不同位點(diǎn)的兩株單抗，用夾心法建立了 HE4-TrFIA。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題即是克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種靈敏度和特異性高、且穩(wěn)定性佳的人附睪分泌蛋白4時間分辨熒光免疫分析方法。
[0007]為此，本發(fā)明首先進(jìn)行了抗HE4抗體的免疫活性測定與篩選。即用現(xiàn)有的ELISA法進(jìn)行測定，HE4純化抗原包被，HRP標(biāo)記羊抗鼠二抗作為檢測抗體，OPD作為顯色劑，分別檢測兩株抗體的免疫活性，結(jié)果示H00010406-M01和PAB18601兩株抗體皆可與抗原HE4反應(yīng)；并用常用的棋盤法，對兩株抗體H00010406-M01和PAB18601分別交叉包被與標(biāo)記，反應(yīng)后取熒光值高且本底低的配對抗體，結(jié)果如表I所示:
[0008]表1.H00010406-M01 和 PAB18601 交叉配對試驗(yàn)
[0009]
抗體H00010406-M01 ( fekl)PAB18601 (,Wid')
H00010406-M01 C 被)一A: 2460/F: 324500
PAB18601 (包被)A: 2231/F: 121333—
[0010]注:A為“O”標(biāo)準(zhǔn)品，F(xiàn)為“500pmol/L”標(biāo)準(zhǔn)品。
[0011]TRFIA結(jié)果顯示，用H00010406-M01作包被抗體，PAB18601作為標(biāo)記抗體效果較好。
[0012]因此，本發(fā)明一種人附睪分泌蛋白4時間分辨熒光免疫分析方法的技術(shù)方案為:其包括下列步驟:①固相抗體制備:將抗人附睪分泌蛋白4單克隆抗體H00010406-M01用緩沖液稀釋至I?10mg/L作為包被液，包被反應(yīng)板，并用封閉液封閉；
[0013]②鑭系元素離子標(biāo)記抗體制備:選用抗人附睪分泌蛋白4抗體PAB18601用常規(guī)方法進(jìn)行鑭系元素離子標(biāo)記；
[0014]③測定方法:在步驟①制得的具有固相抗體的反應(yīng)板上，每孔依次加入人附睪分泌蛋白4標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品，以及用反應(yīng)緩沖液以體積比為1:25?100稀釋的步驟②制得的標(biāo)記抗體，采用平衡法進(jìn)行熒光檢測；其中人附睪分泌蛋白4標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品、與稀釋的標(biāo)記抗體之間用量的體積比為1:3?8。
[0015]為取得靈敏度和特異性高、且穩(wěn)定性佳的更佳效果，本發(fā)明用上述棋盤法將不同稀釋濃度的包被抗體與標(biāo)記抗體進(jìn)行交叉反應(yīng)，以篩選較佳配對的包被抗體與標(biāo)記抗體的稀釋濃度；且摸索人附睪分泌蛋白4標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品、與稀釋的標(biāo)記抗體之間的用量比。其中，如包被液中單克隆抗體的濃度太低，如<lmg/L，則靈敏度不高，反之，濃度太高，不僅影響結(jié)果還增加成本；而標(biāo)記抗體用反應(yīng)緩沖液稀釋比例，以及人附睪分泌蛋白4標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品、與稀釋的標(biāo)記抗體之間用量的體積比例太大太小也有類似結(jié)果。
[0016]在本發(fā)明一最佳實(shí)施例中，步驟①的包被液中單克隆抗體的濃度為5mg/L，步驟③中標(biāo)記抗體用反應(yīng)緩沖液以體積比為1:50稀釋，該人附睪分泌蛋白4標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品、與稀釋的標(biāo)記抗體之間用量的體積比為50:150。
[0017]其中步驟①中的緩沖液選用常規(guī)的包被稀釋液，即50mmol/L、pH9.6的Na2CO3-NaHCO3緩沖液；封閉液選擇牛血清白蛋白(BSA)，本發(fā)明選用含3g/L牛血清白蛋白的上述緩沖液。
[0018]步驟②中的鑭系元素離子選用相對常用的Eu3+，其標(biāo)記常規(guī)方法可參照標(biāo)記試劑盒說明書。
[0019]而步驟③中的反應(yīng)緩沖液為內(nèi)含8mmol/L NaCl、0.1%BSA、50 μ mol/L DTPA,
0.lml/L Tween-80 和 0.l%NaN3, ρΗ7.8 的 50mmol/L Tris-HCl 緩沖液。
[0020]按常規(guī)，步驟③的平衡法包括在加完所用試劑和樣品后，將反應(yīng)板25°C振蕩孵育2小時后，用洗滌液洗滌6次。如為Eu3+標(biāo)記，再加增強(qiáng)液200 μ 1，25°C振蕩反應(yīng)5分鐘，進(jìn)行熒光檢測。較佳地，上述步驟③在時間分辨熒光免疫分析儀器上自動完成，本發(fā)明選用Auto DELFIA1235型全自動TRFIA檢測儀。
[0021]本發(fā)明要解決的另一問題是提供一種相應(yīng)的人附睪分泌蛋白4時間分辨熒光免疫分析試劑盒。
[0022]本發(fā)明的試劑盒包括稀釋包被抗體的緩沖液、封閉液、稀釋標(biāo)記抗體的反應(yīng)緩沖液、洗滌液，以及作為包被抗體的抗人附睪分泌蛋白4單克隆抗體H00010406-M01、鑭系元素尚子標(biāo)記的抗人附辜分泌蛋白4抗體PAB18601、和人附辜分泌蛋白4標(biāo)準(zhǔn)品。
[0023]人附睪分泌蛋白4 標(biāo)準(zhǔn)品為用含 0.2%BSA、0.l%NaN3, 50mmol/L、pH7.8 的 Tris-Hcl緩沖液將重組人HE4蛋白配制成0、2.5、25、250、500、2000pmol/L的系列標(biāo)準(zhǔn)液，可以予以每瓶Iml分裝凍干，-20°C干燥保存；其中，該重組人HE4蛋白為市售產(chǎn)品。
[0024]當(dāng)然，所述鑭系元素離子標(biāo)記的抗人附睪分泌蛋白4抗體PAB18601由抗人附睪分泌蛋白4抗體PAB18601參照鑭系元素離子標(biāo)記試劑盒說明書制得，故在本發(fā)明試劑盒中可包括抗體PAB18601和鑭系元素離子標(biāo)記試劑盒,在需要時進(jìn)行標(biāo)記。
[0025]所述鑭系元素離子選用常用的Eu3+，同時還需專用的Eu3+發(fā)光增強(qiáng)液。當(dāng)然，如使用Te等，則可免用增強(qiáng)液。
[0026]同樣，按照常規(guī)，該稀釋包被抗體的緩沖液選用50mmol/L、pH9.6的Na2CO3-NaHCO3緩沖液；封閉液為含3g/L牛血清白蛋白的上述緩沖液；該稀釋標(biāo)記抗體的反應(yīng)緩沖液為內(nèi)含 8mmol/L NaCl.0.1%BSA、50 μ mol/L DTPA、0.lml/L Tween-80 和 0.l%NaN3, pH7.8 的50mmol/L Tris-HCl 緩沖液；洗滌液為 0.2ml/L Tween-80 和 0.2%NaN3,內(nèi)含 14.5mmol/LNaCl的緩沖溶液。
[0027]本發(fā)明方法適于測量血清HE4的含量，Eu3+-PAB18601標(biāo)記抗體經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線比較鑒定，免疫反應(yīng)性基本無損失；10孔重復(fù)6組參考標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的CV均〈10%，批內(nèi)及批間重復(fù)性研究亦證明本方法是可靠的，穩(wěn)定性佳；試劑盒的線性范圍為1.08pmol/L?2000pmol/L,靈敏度為1.08pmol/L，準(zhǔn)確度高，且與CA125和CA153等無交叉反應(yīng)；HE4_TRFIA的分析時間僅為2小時，且分析系統(tǒng)高度自動化，這樣可提高臨床檢驗(yàn)結(jié)果的速度，又可大幅度降低人為誤差和增加檢出結(jié)果的可靠性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1為本發(fā)明HE4-TRFIA試劑盒穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0029]圖2為TRFIA Kit和ELISA Kit檢測結(jié)果比較圖。

【具體實(shí)施方式】
[0030]下面用實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。
[0031]其中，下列實(shí)施例中的抗HE4抗體(克隆號分別為H00010406-M01和PAB18601)及HE4酶聯(lián)試劑盒購自晶美生物公司有限公司；96孔微孔板(8X12)為Iabsystem公司產(chǎn)品；CA199、CA125、CEA、AFP和白蛋白參考標(biāo)準(zhǔn)品購自北京北方生物技術(shù)研究所；Eu3+標(biāo)記盒PE公司產(chǎn)品，PD-10和S印hadex G_50，Amersham產(chǎn)品；增強(qiáng)液購自上海新波生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純；全自動TRFIA檢測儀(Auto DELFIA1235)為Wallac產(chǎn)品。
[0032]實(shí)施例1
[0033]試劑盒中包括:稀釋包被抗體的緩沖液:50mmol/L、pH9.6的Na2CO3-NaHCO3緩沖液；封閉液:含3g/L BSA的上述緩沖液；稀釋標(biāo)記抗體的反應(yīng)緩沖液:pH7.8、50mmol/L的Tris-HCl,內(nèi)含 8mmol/L NaCl.0.1%BSA、50 μ mol/L DTPA、0.lml/L Tween-80 和 0.l%NaN3 ；洗滌液:0.2ml/LTween-80和0.2%NaN3,內(nèi)含14.5mmol/L NaCl的緩沖溶液；以及抗人附睪分泌蛋白4單克隆抗體H00010406-M01、PAB18601 ;Eu3+標(biāo)記試劑盒；和人附睪分泌蛋白4
標(biāo)準(zhǔn)品。
[0034]①固相抗體制備:將包被單克隆抗體H00010406-M01用稀釋包被抗體的緩沖液稀釋至5mg/L的包被液，96孔微孔板各孔加200μ 1，4°C放置過夜；棄去包被液，沖洗三次，加200 μ I封閉，4°C放置過夜；棄去封閉液，真空抽干，板條密封后置_20°C冷凍保存。
[0035]②Eu3+標(biāo)記抗體制備:參照Eu3+標(biāo)記試劑盒說明書操作。具體為:取標(biāo)記抗體PAB186010.4ml,加入Millipore公司的帶有濾膜的離心管中用標(biāo)記緩沖液(pH9.050mmol/L Na2CO3-NaHCO3)洗滌數(shù)次。收集殘留液200 μ I標(biāo)記抗體和0.1mg的Eu3+-N2-[ρ-異氰酸-芐基]-二乙烯三胺四乙酸(Eu3+-DTTA)充分混勻，4°C反應(yīng)24小時。反應(yīng)液用S印hadex G-50柱(lX20cm)層析，A280監(jiān)測收集蛋白峰,合并峰管,定出蛋白含量，同時用PerkinElmer公司Eu3+標(biāo)準(zhǔn)液測定合并峰的Eu3+濃度。所得的標(biāo)記率(Eu3+mol/IgG mol)是7.16，蛋白回收率為87%。
[0036]③測定方法:先在包被有單克隆抗體的96孔微孔板上，每孔依次加入50 μ I ΗΕ4參考標(biāo)準(zhǔn)或待測血清，150 μ I用反應(yīng)緩沖液以體積比1:50稀釋的Eu3+標(biāo)記抗體，25°C振蕩孵育2小時后，洗滌6次。再加增強(qiáng)液200 μ 1，25°C振蕩反應(yīng)5分鐘，熒光檢測。全部過程均在Auto DELFIA1235上自動完成，軟件中的參數(shù)根據(jù)下列實(shí)施例中的條件進(jìn)行相應(yīng)設(shè)置。
[0037]數(shù)據(jù)分析:HE4-TRFIA標(biāo)準(zhǔn)曲線由origin7.5軟件處理,兩組均數(shù)比較用t檢驗(yàn)。
[0038]HE4-TRFIA性能指標(biāo)考核
[0039]1.靈敏度和線性范圍
[0040]以零參考標(biāo)準(zhǔn)品當(dāng)作樣品測量20次，計算其熒光均值及標(biāo)準(zhǔn)差。以該點(diǎn)熒光測定值減減去2倍標(biāo)準(zhǔn)差所得的熒光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算得出的濃度值為其靈敏度，經(jīng)測定本試驗(yàn)靈敏度為1.08pmol/L。將標(biāo)準(zhǔn)品抗原稀釋成不同濃度進(jìn)行測定，測得標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為L 08~2000pmol/L。兩項(xiàng)指標(biāo)都優(yōu)于HE4-ELISA kit。
[0041]2.方法的特異性
[0042]將CA125 (600U/ml)和CA15-3 (1000ng/ml)當(dāng)作樣品稀釋至一定濃度用本方法進(jìn)行測定，結(jié)果分別為1.03pmol/L和0.79pmol/L，交叉反應(yīng)率低，特異性良好。
[0043]3.精密度
[0044]將經(jīng)HE4ELISA精確定量的三份低、中、高血清，采用本試劑方法進(jìn)行測定，各設(shè)10個復(fù)孔。本方法的批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)均小于10% (見表2)，符合試劑盒規(guī)定要求。
[0045]表2批內(nèi)批間變異系數(shù)測定結(jié)果

【權(quán)利要求】
1.一種人附睪分泌蛋白4時間分辨熒光免疫分析方法，其包括下列步驟:①固相抗體制備:將抗人附睪分泌蛋白4單克隆抗體H00010406-M01用緩沖液稀釋至I?10mg/L作為包被液，包被反應(yīng)板，并用封閉液封閉； ②鑭系元素離子標(biāo)記抗體制備:選用抗人附睪分泌蛋白4抗體PAB18601用常規(guī)方法進(jìn)行鑭系元素離子標(biāo)記； ③測定方法:在步驟①制得的具有固相抗體的反應(yīng)板上，每孔依次加入人附睪分泌蛋白4標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品，以及用反應(yīng)緩沖液以體積比為1:25?100稀釋的步驟②制得的標(biāo)記抗體，采用平衡法進(jìn)行熒光檢測；其中人附睪分泌蛋白4標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品，與稀釋的標(biāo)記抗體之間用量的體積比為1:3?8。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟①中包被液中單克隆抗體的濃度為5mg/L，步驟③中標(biāo)記抗體用反應(yīng)緩沖液以體積比為1:50稀釋，所述人附睪分泌蛋白4標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品與稀釋的標(biāo)記抗體之間用量的體積比為1:3。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟①中的緩沖液為50mmol/L、pH9.6的Na2CO3-NaHCO3緩沖液，封閉液為含3g/L牛血清白蛋白的上述緩沖液。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟②中的鑭系元素離子為Eu3+。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟③中的反應(yīng)緩沖液為內(nèi)含8mmol/L NaCl、0.l%BSA、50y mol/L DTPA、0.lml/L Tween-80 和 0.l%NaN3, pH7.8 的 50mmol/LTris-HCl緩沖液；且該步驟③在時間分辨熒光免疫分析儀器上自動完成。
6.一種人附睪分泌蛋白4時間分辨熒光免疫分析試劑盒，其包括稀釋包被抗體的緩沖液、封閉液、稀釋標(biāo)記抗體的反應(yīng)緩沖液、洗滌液，以及作為包被抗體的抗人附睪分泌蛋白4單克隆抗體H00010406-M01、鑭系元素離子標(biāo)記的抗人附睪分泌蛋白4抗體PAB18601、和人附睪分泌蛋白4標(biāo)準(zhǔn)品。
7.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于該人附睪分泌蛋白4標(biāo)準(zhǔn)品為用含.0.2%BSA、0.l%NaN3，50mmol/L、ρΗ7.8 的 Tris-Hcl 緩沖液將重組人 ΗΕ4 蛋白配制成 0,2.5、.25、250、500、2000pmol/L 的系列標(biāo)準(zhǔn)液。
8.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于所述鑭系元素離子標(biāo)記的抗人附睪分泌蛋白4抗體PAB18601由抗人附睪分泌蛋白4抗體PAB18601參照鑭系元素離子標(biāo)記試劑盒說明書制得。
9.如權(quán)利要求6?8任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于所述鑭系元素離子為Eu3+，本發(fā)明試劑盒還包括Eu3+發(fā)光增強(qiáng)液。
10.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于該稀釋包被抗體的緩沖液為50mmol/L、pH9.6的Na2CO3-NaHCO3緩沖液；封閉液為含3g/L牛血清白蛋白的上述緩沖液；該稀釋標(biāo)記抗體的反應(yīng)緩沖液為內(nèi)含 8mmol/L NaCl.0.1%BSA、50 μ mol/L DTPA、0.lml/L Tween-80 和.0.l%NaN3, pH7.8 的 50mmol/L Tris-HCl 緩沖液；洗滌液為 0.2ml/L Tween-80 和 0.2%NaN3,內(nèi)含14.5mmol/L NaCl的緩沖溶液。
【文檔編號】G01N21/64GK104166002SQ201310183063
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2013年5月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月17日
【發(fā)明者】蔡徐山 申請人:上海市嘉定區(qū)婦幼保健院