專利名稱：人類附睪表達精子結(jié)合蛋白hel-178及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)與醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及一種新的人類附睪表達蛋白精子結(jié)合蛋白以下簡稱HEL-178及其編碼基因與應(yīng)用
背景技術(shù)：
本世紀人類的發(fā)展面臨著兩個嚴峻的問題一方面，全球人口在急速膨脹，預(yù)計在2050年將達到90億；另一方面，據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)查，大約15%的夫婦存在著不育問題，發(fā)達國家不育癥的發(fā)病率在最近IO年飚升，歐洲發(fā)達國家可高達30%，其中男性因素約占一半。世界衛(wèi)生組織預(yù)測，隨著環(huán)境污染和性傳播疾病等致病因素的增加，本世紀，不育癥將成為僅次于腫瘤和心腦血管病的第三大疾病。但男性不育并未引起社會和醫(yī)學(xué)界的足夠重視，因此有關(guān)男性生殖健康的研究進展緩慢，明顯落后于其它學(xué)科。缺少分子生物學(xué)層面診斷與治療不育癥的有效方法。由于精子發(fā)育障礙不能自然受精，需要醫(yī)生通過做試管嬰兒獲取后代。利用此種技術(shù)獲取后代，不僅耗費了寶貴的時間與資金，而且存在很多影響健康的潛在因素，失去了正常生育過程中精卵天然結(jié)合、優(yōu)勢選擇遺傳后代的機會。給家庭與社會帶來了沉重的精神和經(jīng)濟負擔。 全世界人口的急劇增長造成了資源耗竭和環(huán)境惡化，成為人類健康與生存的嚴重威脅。當前世界人口已超過60億，據(jù)專家估計，中國資源環(huán)境能支撐的最大人口容量為15-16億。目前可供人類選擇的避孕措施還很有限，離"高效、安全、可逆"的標準還相差較遠。發(fā)展安全有效、先進實用的避孕節(jié)育新技術(shù)、新產(chǎn)品，以滿足不同人群、不同層次的避孕用藥的個性化要求是近年來國內(nèi)外避孕節(jié)育技術(shù)發(fā)展的總趨勢。 附睪是精子成熟的重要器官，睪丸產(chǎn)生的精子需要通過與附睪管腔微環(huán)境相互作用才能獲得運動、受精、防御和維持正常胚胎發(fā)育以及防御等生物學(xué)功能。附睪內(nèi)大約有200余種分泌蛋白與精子相互作用，參與精子成熟過程，但是人們對這些蛋白的功能知之甚少。與精子成熟相關(guān)的附睪蛋白的研究將有助于推動男性生殖醫(yī)學(xué)的研究進展，為男性不育癥的診斷和治療以及開發(fā)新型避孕藥物提供侯選分子靶標，同時有可能對附睪環(huán)節(jié)的男性避孕帶來新的思路和突破。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的是提供一種新的人類附睪表達蛋白精子結(jié)合蛋白HEL-178。
—種人類附睪表達精子結(jié)合蛋白HEL-178，它具有序列表中序列2的氨基酸序列或?qū)⑿蛄?的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)或多肽。 本發(fā)明的人附睪分泌蛋白命名為HEL-178，由491個氨基酸殘基組成。HEL-178蛋白存在有1個N糖基化位點，10個N-十四烷?；稽c和11個磷酸化位點，包括7個酪蛋白激酶II磷酸化位點以及8個蛋白激酶C磷酸化位點，1個cAMP、cGMP依賴性的磷酸化位點.。
本發(fā)明的第二個目的是提供編碼人類附睪表達精子結(jié)合蛋白HEL-178的基因。它是下列核苷酸序列之一序列表中序列1的DNA序歹lj， GenBank注冊號為EU668333 ;
編碼序列表中SEQ ID No. 2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸； 與序列表中序列1限定的DNA序列具有90X以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。 序列表中的SEQID No. l，全長c DNA序列為1949bp，定位于人4號染色體上，編碼491個氨基酸，編碼蛋白為HEL-178,含有信號肽，其開放閱讀框為1476bp，是一個完整的讀碼框。 本發(fā)明的第三方面，提供了采用基因工程技術(shù)制備具有人類附睪表達精子結(jié)合蛋白HEL-178活性多肽的方法，它包括含有上述多核苷酸序列的載體，以及被該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細胞。 本發(fā)明的第四方面，提供了與上述人類附睪表達精子結(jié)合蛋白HEL-178特異性結(jié)
合的抗體，以及由此開發(fā)的用于附睪功能異常所致的不育癥的輔助診斷。 本發(fā)明的第五方面，提供了檢測樣本中是否存在人類附睪表達蛋白HEL-178的方
法，它包括將待測樣品與分泌蛋白的特異性抗體在一定條件下共同作用，觀察是否形成抗
原抗體復(fù)合物，有抗原抗體復(fù)合物形成就提示樣品中存在分泌蛋白。 本發(fā)明的第六方面，提供了本發(fā)明蛋白和其編碼序列的用途。例如本發(fā)明蛋白可
被作為診斷不育癥的分子靶點，或作為有效藥物成分用于治療不育癥，或作為開發(fā)新型避孕藥物的靶分子，或被用于篩選促進人類附睪表達蛋白HEL-178活性的激動劑，或被用于篩選抑制人類附睪表達精子結(jié)合蛋白HEL-178活性的拮抗劑，或被用于肽指紋圖譜鑒定。根據(jù)人類附睪表達蛋白HEL-178的編碼序列或其片段，可設(shè)計引物或探針用于PCR或核酸雜交，或者用于制備基因芯片。本發(fā)明蛋白還可用于藥物組合物，以此作為有效活性成分，用于生產(chǎn)一種對抗病原微生物感染以及腫瘤等疾病的藥物。 本發(fā)明的第七方面，提供了一種藥物組合物，所述組合物包含本發(fā)明所述的蛋白、核苷酸序列、構(gòu)建物或細胞，以及藥學(xué)上可接受的載體。 本發(fā)明的蛋白能夠在附睪內(nèi)特異性表達，定位于精子頭后部區(qū)，因此可能與運動，識別受精有關(guān)。因為它是一種天然的蛋白多肽，可以預(yù)見可能具有較少的副作用，本發(fā)明的其他優(yōu)點可從以下的詳細描述獲知。


圖1. HEL-178蛋白在人精子上的免疫熒光定位 紅色熒光顯示精子核；綠色熒光顯示HEL-178蛋白在精子上的定位； A組陽性對照，A3顯示HEL-75蛋白結(jié)合于整個精子(文章已發(fā)表)； B組陰性對照。 C組HEL_178蛋白定位，C3.顯示HEL-178蛋白結(jié)合在精子頭后部區(qū)。 比例尺5mm。 圖2 HEL-178基因組織表達圖譜 l附睪頭2附睪體3附睪尾4睪丸5心6肝7脾8腎9胃10陰性對照 圖3. HEL-178蛋白在附睪液表達的western blot結(jié)果 M -Marker ;1 :陽性對照，HEL-75蛋白；2 :陰性對照，小鼠血清;3 :HEL_178蛋白
本發(fā)明的蛋白包括了所述蛋白多肽的具有相同或相似性生物活性或功能的變異形式，這些變異形式包括(但并不限于)相對于天然蛋白的氨基酸序列有若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳的1-10個)氨基酸的缺失、插入和取代。另外，所述缺失或插入(增加)也可發(fā)生在C末端和/或N末端(通常有20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi)的氨基酸缺失或增加)，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變氨基酸的功能，提供功能相似氨基酸的保守性置換表是本領(lǐng)域所熟知的。下列5組各自含有能相互保守置換的氨基酸；脂族甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、纈氨酸(V)、亮氨酸(L)、異亮氨酸(I);芳族苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W);
含硫甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C);堿性精氨酸(R)、賴氨酸(K)、組氨酸(H);酸性天冬
氨酸(D)、谷氨酰胺(Q)。另外，該術(shù)語還包括了蛋白的片段或衍生物，條件是該片段或衍生
物保留了所希望的蛋白生物活性。 本發(fā)明的核苷酸序列通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA文庫作為模板，擴增而得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關(guān)序列。 本發(fā)明中，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法將包含編碼本發(fā)明的蛋白的核苷
酸序列插入到載體中，這些方法包括但不限于體外重組DNA技術(shù)，體內(nèi)重組技術(shù)等。 上述載體可用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染適當?shù)脑撕驼婧思毎?，以使其能夠表達所編碼的本
發(fā)明的蛋白，宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞，或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是
高等真核細胞，如昆蟲細胞等?？刹捎玫霓D(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染方法包括但并不限于磷酸鈣共沉淀法、
顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體介導(dǎo)等。 本發(fā)明的蛋白在細胞內(nèi)表達，如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其他特性通過各種方法分離和純化表達產(chǎn)物，這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用常規(guī)的蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、聲波破菌、超離心、分子篩層析、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析和其它各種層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。 本發(fā)明還包括對蛋白或其片段具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，還包括具有免疫活性的抗體片段或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。 本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進行制備。例如重組抗體、純化的基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生，本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備。
發(fā)明人通過研究進一步發(fā)現(xiàn)，該蛋白定位于成熟精子頭后區(qū)域(圖1)， RT-PCR結(jié)果顯示該基因主要在附睪、睪丸、肝、脾組織表達較高(圖2)。發(fā)明人在大腸桿菌中表達了人HEL-178蛋白，用其免疫小鼠，獲得了其多抗血清。發(fā)明人用Western blot在附睪檢測
5到一條49KD左右條帶(圖3)。 本發(fā)明的藥物組合可根據(jù)各種需要制成各種劑型，通?？蓪⑺幬锝M合物制成可注射劑，例如液體溶液或懸浮液；還可制成在注射前適合配入溶液或懸液中、溶液載體的固體形式，脂質(zhì)體也包括在藥學(xué)上可接受的載體的定義中，本發(fā)明的藥物組合物可由醫(yī)師根據(jù)患者種類、年齡、體重和大致疾病狀況、給藥方式等因素確定對病人有益的劑量進行施用，為了提高用藥效果，本發(fā)明的蛋白也可以與其他藥物共同使用。 下面結(jié)合具體實例，進一步闡述本發(fā)明，應(yīng)理解這些實例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，除非另有描述，本發(fā)明的實施將采用分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這些均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的。這些技術(shù)在下面文獻中有完整的描述例如Sambrook《分子克隆實驗指南》第二版(1989);《DNA克隆》第I和第II巻(D. N. Glover編輯，1985);《寡核苷酸合成》(M. J. Gait編輯，1984);《核酸雜交》(B. D. H謙s和S。 J。 Higgins編輯。1984);《蛋白質(zhì)純化；原理和實踐》第2版(Spring-Verlag，N. Y.)，以及《實驗免疫學(xué)手冊》I-IV巻(D.C.Weir和C.C.Blackwell編輯1986)或者，可以按照試劑生產(chǎn)商所提供的說明書進行。
具體實施例方式
實施例l.采用基因工程技術(shù)制備人類附睪表達蛋白HEL-178
基因克隆及序列分析 對本實驗室構(gòu)建的人附睪cDNA文庫進行大規(guī)模測序篩選，獲取表達序列標簽(EST)，利用Unigene數(shù)據(jù)庫進行電子克隆，獲得人HEL-178全長cDNA。使用 Expasy Translate too 1 (http://us. expasy.orghttp://us. expasy.org)，InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/Tools/http://www. ebi. ac. uk/Tools/) 禾口Protein代roteinblast(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BUVST/http://www. ncbi. nlm.nih. gov/BLAST/)等預(yù)測HEL-178肽序列及假定功能。SignalP (http: 〃www. cbs. dtu.dkhttp:〃www. cbs. dtu. dk) ，PSORTII和WoLFPSORT (http: 〃psort. nibb. ac. jp)等軟件分析預(yù)測該蛋白的信號肽及胞內(nèi)定位。ProfileScan(http:〃myhits. isb-sib. ch/cgi-bin/PFSCANhttp:〃myhits. isb-sib. ch/cgi-bin/PFSCAN)預(yù)測N端糖基化和磷酸化位點。
對獲得的人HEL-178全長cDNA，根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測HEL-178編碼區(qū)，設(shè)計一對特異弓l物FOl :5' -TTGGTACCGACGACGACGACAAG AAAAGGATGGTTTCTTGGA-3'， F02 :5'-GCGGCGAATTCTTGCTGTGGGAAGAAG-3'，上下游引物兩端分別引進限制性內(nèi)切酶位點Kpnl和EcoRI。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。以本實驗室構(gòu)建的人附睪cDNA文庫為模板，PCR擴增HEL-178基因片段。PCR反應(yīng)條件94。C預(yù)變性10min， (94。C，40s ;55。C，45s ;70。C，30s)30個循環(huán)，7(TC延伸10min，4。C保存。反應(yīng)結(jié)束后，1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測并分離回收目的片段，插入克隆載體pMD-18T中進行測序鑒定。
重組HEL-178蛋白表達及純化 測序鑒定后HEL-178基因通過Kpnl和EcoRI位點克隆至表達載體pET-32b(+)中，使其與融合標簽閱讀框一致。重組表達載體pET32b(+)-HEL-178轉(zhuǎn)入E. coli BL21 (DE3)感受態(tài)細胞，利用菌落PCR篩選陽性克隆，工程菌株在lmM IPTG，32t:條件下誘導(dǎo)4h后，N端帶有His-tag的重組蛋白通過"兩步鎳親和層析法"對重組HEL-178蛋白進行分離純化。
6簡單地說，"第一步親和層析"用于純化重組Trx-HEL-178融合蛋白。然后融合蛋白用重組腸激酶裂解，釋放融合標簽。最后，運用"第二步親和層析"回收重組HEL-178蛋白。純化后的重組蛋白用Bradford (Bradford 1976)法進行定量，然后用冷凍干燥進行保存。
實施例2.抗HEL-178多克隆抗血清的制備 用重組HEL-178蛋白免疫BALB/C小鼠制備多抗。簡單地說，每只老鼠于第1天注射50iig重組蛋白與等量的完全福氏佐劑(CFA)。然后在第15，30和45天注射25iig重組蛋白和等量的不完全福氏佐劑(IFA)加強免疫。第60天從眼球取血，分離血清后用ELASA和western blot分析抗體的效價和特異性。ELISA分析表明抗體效價達到1 : 10000。Westernblot顯示對重組蛋白和從人附睪液中抽取的天然HEL-178都具有良好的特異性。
實施例3.人HEL-178mRNA組織表達譜研究 為了確定HEL-178的表達模式，采用半定量RT-PCR分析HEL-178基因在人附睪頭、體、尾，睪丸，心，肝，脾，肺，腎，胃等組織中的表達差異。用TRIzol(Tiangen， Beijing,China)抽提總RNA， lug總RNA用20UAMV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega)和0. 3ugoligodT18 (Promega)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后，2ul合成的cDNA利用基因特異引物進行PCR擴增。20ul反應(yīng)體系含有2ul 10XPCR buffer(with MgCl2)，2ul dNTP Mix(10mmol/L) ， lul每個引ul (25umo1/L)，lul Taq DNA聚合酶(2. 5U/ul) ， 2ulcDNA模板以及l(fā)lulddH20。 PCR反應(yīng)的程序為94。C，lOmin ;94。C， lmin ;54。C (對HEL-178)/49°C ( P-actin) 30s ;72。C ， lmin (35循環(huán));72。C延伸7min。 13 -actin的表達作為內(nèi)參。所有PCR擴增產(chǎn)物用1. 5%瓊脂糖電泳分析。RT-PCR結(jié)果顯示該基因主要在附睪、睪丸、肝、脾組織表達較高.
實施例4.人HEL-178蛋白在組織的免疫熒光定位 取人睪丸、附睪組織冰凍切片，進行免疫熒光染色，其中一抗為鼠抗rHEL-178多抗(l : 400)，二抗為FITC-標記羊抗鼠IgG(1 : 200)，細胞核用PI染色。染色后所有的切片用80%甘油封片，然后用共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP2 AOBS)觀察結(jié)果。實驗同時以小鼠免疫前血清替代一抗作為陰性對照。
實施例5.人附睪蛋白提取物與Western blot 將從人附睪液中提取的總蛋白抽提物20ug，用15% SDS-PAGE分離，然后濕轉(zhuǎn)到PVDF膜上進行western blot。鼠抗人HEL-178多抗為一抗(1 : 5000) ， 二抗為HRP-標記羊抗鼠IgG(l : 500)。辣根過氧化酶的活性用增強型HRP-DAB底物顯色試劑盒分析Westernblot顯示抗人HEL-178多抗對重組蛋白和從人附睪液中抽取的天然HEL-178都具有良好的特異性。 實施例6.人HEL-178蛋白在精子的免疫熒光定位 收集精子用PBS洗滌后涂布于1X明膠包被的載玻片上，自然晾干，然后用甲醇固定10分鐘。含有精子的載玻片用3% BSA在室溫下封閉1小時，然后添加鼠抗rhBD32多抗(1 : 200)，4。C過夜。免疫前小鼠血清做陰性對照。用PBST(PBS containing 0.1%Tween-20)洗滌三次，加入對應(yīng)的FITC-標記羊抗鼠IgG二抗(1 : 200)。載玻片用PBST洗滌三次，然后用80%甘油封片。用Olympus BX-52顯微鏡觀察，HEL-178蛋白結(jié)合在精子頭后區(qū)。 實施例7. HEL-178重組蛋白的抗菌活性 運用克隆菌落形成單位(CFU)分析抗菌活性。簡單地說，過夜培養(yǎng)的E.coliXL-lblue生長到對數(shù)期(0D600 = 0. 4-0. 5)后用10mM PBS(pH7. 4)稀釋。大約2X 106CFU/ml細菌在與12. 5 100ug/ml的HEL-178混合，37。C培養(yǎng)。在開始培養(yǎng)后的15， 30， 60 and120min分別在取樣。將樣品用10mM PBS(pH 7.4)做系列稀釋，每個稀釋度取lOOul涂布于LB瓊脂平板，37t:培養(yǎng)過夜至形成單菌落。統(tǒng)計菌落個數(shù)，抗菌活性用細菌存活的百分數(shù)表示，公式為％存活=(蛋白處理后存活克隆數(shù)/未經(jīng)蛋白處理后存活的克隆數(shù))X100。實驗以10mM PBS(pH 7.4)代替蛋白處理細菌作為陰性對照。
實施例8 HEL-178與精子運動性以及體外受精的關(guān)系研究 利用HEL-178多抗封閉正常人精子，然后進行精子運動性和體外受精分析。實驗按照vitro life標準試劑盒提供的方法進行。簡單地說，精子先用SpermRinse-30于37°C 、5%0)2培養(yǎng)1小時獲能。然后按照l : 200加入鼠抗rHEL-178多抗，于37。C、6XC02培養(yǎng)2小時進行封閉。封閉后的精子分成兩部分， 一部分直接利用計算機輔助系統(tǒng)分析精子的運動性。另一部分用G-Fert洗滌2次，并調(diào)整至終濃度為1. 0X 107cells/ml。加入100ug精子樣品于35mm的培養(yǎng)皿中，然后覆蓋石蠟油放入37°C、6% C02和飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)待用。經(jīng)G-MOPS處理后成熟卵母細胞加入預(yù)先準備好的受精滴中，在37°C 、6% C02和飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察受精情況，每日記錄胚胎發(fā)育情況。以上所有實驗同時用免疫前小鼠血清作為陰性對照。
序列表
〈110〉李建遠 〈120〉人類附睪表達精子結(jié)合蛋白HEL-178及其編碼基因與應(yīng)用
〈160>2 〈170>PatentIn version 3. 5
〈210>1
〈211>1949
〈212>DNA 〈213〉人屬人種(homo sapiens)
〈220〉
〈221>CDS
〈222>(26). (1501)
〈400>1 ttgaagatct ctcagttaag tctac
cac 3朋ctt 3朋acc atg 3朋
His Lys Leu Lys Thr Met Lys
10 15
ttt eta gtt aag tec caa ggt
Phe Leu Val Lys Ser Gin Gly
30
agt gec cgt ggt cat cga ccc
atg 3朋agg atg gttMet Lys Arg Met Val1 5cat eta tta ttg etaHis Leu Leu Leu Leu20
gtc朋c gac朋t gagVal Asn Asp Asn Glu35
ctt gac朋g朋g 3g3
tct tgg age ttc 52Ser Trp Ser Phe
eta ttg tgt gtt 100Leu Leu Cys Val25
gag ggt ttc ttc 148Glu Gly Phe Phe40
gaa gag get ccc 196
8
SerAlaArgGlyHisArgProLeuAspLysLysArgGluGluAlaPro455055agectg￡lggcctgccCC3ccgcccate3gtggtggctateggget244SerLeuArgProAlaProProProlieSerGlyGlyGlyTyrArgAla606570cgtCC3gccaaagCElgetgccactc朋朋ggteg朋3gagcc292ArgProAlaLysAlaAlaAlaThrGinLysLysValGluArgLysAla758085cctgatgetggctgtcttC3Cgetg￡lCCC3g￡lCctgggggtgttg340ProAspAlaGlyGlyCysLeuHisAlaAspProAspLeuGlyValLeu9095100105tgtccttgtCElgttgc朋gaggetttgetac朋CElgg朋￡igg388CysProThrGlyCysGinLeuGinGluAlaLeuLeuGinGinGluArg110115120CC3ate3ga朋tElgtgttgatgagtta朋t朋c朋tgtgg朋getgtt436ProlieArgAsnSerValAspGluLeuAsnAsnAsnValGluAlaVal125130135tecCElg3CCtectcttcttectttCElgtacEltgtatttgctgaaag￡lC484SerGinThrSerSerSerSerPheGinTyrMetTyrLeuLeuLysAsp140145150ctgtggc朋朋g￡lggCElgc朋gt￡lgat朋tg朋朋tgt￡lgtc532LeuTrpGinLysArgGinLysGinValLysAspAsnGluAsnValVal155160165朋tgagtactecteag朋ctgg朋朋gC3Cc朋ttatatategatgag580AsnGluTyrSerSerGluLeuGluLysHisGinLeuTyrlieAspGlu170175180185actgtg朋tage朋tateCC3act朋ccttcgtgtgcttcgtteaate628ThrValAsnSerAsnlieProThrAsnLeuArgValLeuArgSerlie190195200ctgg朋朋cctg3gaageatec朋朋gttag朋tctgatgtctea676LeuGluAsnLeuArgSerLyslieGinLysLeuGluSerAspValSer205210215getc朋Eltgg朋tattgtcgc3CCCC3tgcactgtcElgttgc朋tatt724AlaGinMetGluTyrCysArgThrProCysThrValSerCysAsnlie220225230cctgtggtgtctggcg朋tgtgagg朋attate￡lggaaaggt772ProValValSerGlyLysGluCysGluGlulielieArgLysGlyGly235240245g朋tctg朋Eltgtatetcattc朋cctg￡lCElgttctgtcccg820SerGluMet Tyr Leu lie GinPro Asp Ser Ser Val Lys Pro250255260 265tat3gagt￡ltactgt g3C 3tg朋tg朋朋t gg3 gg3 tgg gtg868TyrArgValTyrCys Asp Met Asn ThrGlu Asn Gly Gly Trp Thr Val270275 280attCElg朋ccgtcaa gac ggt agt gttgac ttt ggc agg aaa tgg gat916lieGinAsnArgGin Asp Gly Ser ValAsp Phe Gly Arg Lys Trp Asp285290295CC3tataaaCElggga ttt gga aat gttgC3 3CCgat ggg 33g964ProTyrLysGinGly Phe Gly Asn ValAla Thr Asn Thr Asp Gly Lys300305310朋ttactgtggccte cca ggt g朋tettgg ctt gga朋t gat 333 att1012AsnTyrCysGlyLeu Pro Gly Glu TyrTrp Leu Gly Asn Asp Lys lie315320325ageCElgctt3CC3gg 3tg gg3 CCCg朋ctt ttg ate g朋atg gag1060SerGinLeuThrArg Met Gly Pro ThrGlu Leu Leu lie Glu Met Glu330335340 345g￡lCtgggac朋a gte朋g getcac tet gga gga ttc act gte1108AspTrpLysGlyAsp Lys Val Lys AlaHis Tyr Gly Gly Phe Thr Val350355 360CElg朋tg朋gcc朋c朋a tec cag atetea gtg朋c朋a tec 3ga gga1156GinAsnGluAlaAsn Lys Tyr Gin lieSer Val Asn Lys Tyr Arg Gly365370375gccggt朋tgcc etc atg gat ggagca tct cag ctg atg gga gaa1204ThrAlaGlyAsnAla Leu Met Asp GlyAla Ser Gin Leu Met Gly Glu380385390朋c￡lggacc atg acc att cac aacggc atg ttc ttc age acg tatg￡lC
L252AsnArgThrMetThr lie His Asn GlyMet Phe Phe Ser Thr Tyr Asp3954004053gag￡lC肌t g3C ggC tgg tt3tea gat CCC 3g3 333 C3g tgttct
L300ArgAsp Asn Asp Gly Trp Leu Thr SerAsp Pro Arg Lys Gin Cys Ser410415420 425g肌g￡lC ggt ggt gg￡l tgg tggtat 肌t 3g3 tgt cat gca gcc肌t
L348LysGlu Asp Gly Gly Gly Trp Trp TyrAsn Arg Cys His Ala Ala Asn430435 440CC3肌cggc aga tac tac tgg ggtgga cag tac acc tgg gac atggCEl1396
1444
1492
Pro Asn Gly Arg Tyr Tyr Trp Gly Gly Gin Tyr Thr Trp Asp Met Ala
445 450 455
aag cat ggc aca gat gat ggt gta gta tgg atg aat tgg aag ggg tea
Lys His Gly Thr Asp Asp Gly Val Val Trp Met Asn Trp Lys Gly Ser
460 465 470
tgg tac tea 3tg 3gg 肌g 3tg 3gt atg 肌g ate agg ccc ttc ttc CC3
Trp Tyr Ser Met Arg Lys Met Ser Met Lys lie Arg Pro Phe Phe Pro 475 ■ 485
caa teg tccccaatec gtegattttt gctcttctgt atgtgacaac Gin
CElg
Gin 490
atttttgtec 朋gcagacgt atgattttct ttgacagagt
3卿ggggtC
朋朋gtccac aagatttatt 〈210>2 〈211>491 〈212>PRT
〈213〉人屬人種(homo 〈400>2
Arg
attetgttet tggaattttc tttcatecat tetettcctc teaaactctc gagtgtgact ttttg朋a朋agteteggat 3朋ttecatt朋朋tegcac tttgttttct tcatttctct tgctcaccaa gaagteacaa aagtategtt tggtgttcat aatttcagtt ctegttgatt gcgagaattt tcaaateagg ttttetcctt gtcgtegg朋朋ccatgacg ga朋gg朋朋actgatgttt tttte朋act atetttettt atgteggatc tgtca朋g朋朋cttcca朋 朋tte朋cca gactctgttg c朋t朋朋朋朋朋朋朋
Met 1
His
Lys
Met
Leu Leu
Val Asn Asp 35 Lys
Leu
Pro 65 Thr
Asp 50 lie
Gin
Ser
Lys His Ala Asp
Leu
20
Asn
Lys
Gly
Lys
Pro
Val 5
Leu
sapiens)
Trp Ser Phe
Ser
Leu Leu Cys
Glu Glu Gly
Arg
Gly
Val
85
Asp
Glu
Gly
70
Glu
Leu
Glu
55
Tyr
Phe
40
Ala
Val
25
Phe
His
10
Phe
Lys Leu Lys Leu Val Lys
Ser Ala Arg
Pro Ser Leu
Arg Ala Arg Lys
Ala
Arg Gly Val Leu
Pro 90 Cys
Pro
75
Asp
Arg 60 Ala
Gly
45
Pro
Thr
Ser
30
His
Met
15
Gin
Lys Gly
Arg Pro
Ala Pro Pro
Lys Ala Ala Ala Gly Gly Pro Thr Gly Cys
Cys
95
Gin
Ala
80
Leu
Leu
1541
1601 1661 1721 1781 1841 1901 1949
110193]100105110
0194]GinGluAlaLeuLeuGinGinGluArgProlieArgAsnSerValAsp
0195]115120125
0196]GluLeuAsnAsnAsnValGluAlaValSerGinThrSerSerSerSer
0197]130135140
0198]PheGinTyrMetTyrLeuLeuLysAspLeuTrpGinLysArgGinLys
0199]145150155160
0200]GinValLysAspAsnGluAsnValValAsnGluTyrSerSerGluLeu
0201]165170175
0202]GluLysHisGinLeuTyrlieAspGluThrValAsnSerAsnliePro
0203]180185190
0204]ThrAsnLeuArgValLeuArgSerlieLeuGluAsnLeuArgSerLys
0205]195200205
0206]lieGinLysLeuGluSerAspValSerAlaGinMetGluTyrCysArg
0207]210215220
0208]ThrProCysThrValSerCysAsnlieProValValSerGlyLysGlu
0209]225230235240
0210]CysGluGlulielieArgLysGlyGlyGluThrSerGluMetTyrLeu
0211]245250255
0212]lieGinProAspSerSerValLysProTyrArgValTyrCysAspMet
0213]260265270
0214]AsnThrGluAsnGlyGlyTrpThrVallieGinAsnArgGinAspGly
0215]275280285
0216]SerValAspPheGlyArgLysTrpAspProTyrLysGinGlyPheGly
0217]290295300
0218]AsnValAlaThrAsnThrAspGlyLysAsnTyrCysGlyLeuProGly
0219]305310315320
0220]GluTyrTrpLeuGlyAsnAspLyslieSerGinLeuThrArgMetGly
0221]325330335
0222]ProThrGluLeuLeulieGluMetGluAspTrpLysGlyAspLysVal
0223]340345350
0224]LysAlaHisTyrGlyGlyPheThrValGinAsnGluAlaAsnLysTyr
0225]355360365
0226]GinlieSerValAsnLysTyrArgGlyThrAlaGlyAsnAlaLeuMet
0227]370375380
0228]AspGlyAlaSerGinLeuMetGlyGluAsnArgThrMetThrlieHis
0229]385390395400
0230]AsnGlyMetPhePheSerThrTyrAspArgAspAsnAspGlyTrpLeu
0231]405410415
Thr Ser Asp Pro Arg Lys Gin Cys Ser Lys Glu Asp Gly Gly Gly Trp 420 425 430 Trp Tyr Asn Arg Cys His Ala Ala Asn Pro Asn Gly Arg Tyr Tyr Trp 435 440 445 Gly Gly Gin Tyr Thr Trp Asp Met Ala Lys His Gly Thr Asp Asp Gly 450 455 460 Val Val Trp Met Asn Trp Lys Gly Ser Trp Tyr Ser Met Arg Lys Met 465 470 475 ■ Ser Met Lys lie Arg Pro Phe Phe Pro Gin Gin 485 490
權(quán)利要求
一種人類附睪表達精子結(jié)合蛋白HEL-178，其特征在于，它具有序列表中序列2的氨基酸序列或?qū)⑿蛄?的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的序列2衍生的蛋白質(zhì)和通過化學(xué)方法合成的蛋白質(zhì)。
2. —種人類附睪表達精子結(jié)合蛋白HEL-178的編碼基因，它是下列核苷酸序列之一 序列表中序列1的核苷酸序列；與序列表中序列1限定的DNA序列具有90X以上同源性，且編碼相同功能蛋白的DNA序列。
3. 含有權(quán)利要求2所述基因的真核和原核表達載體。
4. 含有權(quán)利要求2所述基因的細胞系。
5. 針對權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)所制備的各種抗體以及以該抗體為活性成分的試劑。
6. 針對權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)提供的藥物組合物，所述組合物包含本發(fā)明所述的蛋白、核苷酸序列、構(gòu)建物或細胞，以及藥學(xué)上可接受的載體。
7. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的蛋白在不育癥診斷中的應(yīng)用。
8. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的蛋白在不育癥治療中的應(yīng)用。
9. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因在開發(fā)新的避孕藥物中的應(yīng)用。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白在制備新的抗生素中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明公開了一種新的人附睪特異表達精子結(jié)合蛋白HEL-178及其制備和應(yīng)用。公開了本發(fā)明編碼HEL-178蛋白的氨基酸序列，提供攜帶編碼本發(fā)明蛋白的DNA序列的重組表達載體。定位于成熟精子頭后區(qū)域，RT-PCR顯示要在附睪、睪丸、肝、脾表達較高。Western blot在附睪檢測到一條49KD左右條帶。HEL-178蛋白可作為免疫性避孕藥的研發(fā)，以及男性不育癥的臨床診斷與治療的靶蛋白。基于HEL-178蛋白開發(fā)的相應(yīng)基因或蛋白檢測方法，將廣泛用于生殖醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。
文檔編號C07K14/47GK101724063SQ20081030516
公開日2010年6月9日 申請日期2008年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月24日
發(fā)明者李建遠 申請人:李建遠