一種胃泌素釋放肽前體熒光免疫層析檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種胃泌素釋放肽前體熒光免疫層析檢測(cè)試 劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 肺癌是世界上發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤之一。肺癌分為非小細(xì)胞肺癌 (NSCLC)和小細(xì)胞肺癌（SCLC)，后者占肺癌患者總數(shù)的15%-20%<^ΟΧ是一種快速生長(zhǎng)的惡 性腫瘤，患者在就診時(shí)多數(shù)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)局部淋巴結(jié)或者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，早期診斷能夠提高生存率。 腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)是肺癌的一項(xiàng)重要輔助檢測(cè)方法，理想的腫瘤標(biāo)志物應(yīng)具有較高的靈敏度 和特異性，不但有助于腫瘤的早期診斷、病理類型的判斷和癌癥分期，而且能夠評(píng)估治療效 果和預(yù)后并指導(dǎo)個(gè)體化治療。目前常用的肺癌相關(guān)腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原(CEA)、細(xì)胞角蛋白 19的可溶性片段(CYFRA21 -1)、鱗狀細(xì)胞癌抗原（SCCA)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)對(duì)早 期肺癌診斷敏感性和特異性都不高，不適合作為早期肺癌篩查。大量研究顯示，腫瘤標(biāo)志物 胃泌素釋放肽前體(proGRP)有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。
[0003] 人胃泌素釋放肽前體(proGRP)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種針對(duì)SCLC的腫瘤標(biāo)志物，它 不僅可用于SCLC的早期診斷，還有助于判斷療效及早期發(fā)現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)。胃泌素釋放肽前體 在人血清中的臨界值為50pg/ml，對(duì)SCLC早期診斷的特異性為100%，檢測(cè)靈敏度為75%左右， 其診斷SCLC的特異性可達(dá)95%以上，因此胃泌素釋放肽前體是小細(xì)胞肺癌輔助診斷的良好 指標(biāo)。
[0004] 胃泌素釋放肽前體檢測(cè)方法主要有雙抗夾心法(ELISA)、免疫發(fā)光法、放射免疫分 析法。其中，ELI SA法定量準(zhǔn)確性差、操作時(shí)間長(zhǎng)、自動(dòng)化程度低，多用于定性檢測(cè);放射免疫 分析法靈敏度可達(dá)到4pg/ml，能檢測(cè)正常人血清胃泌素釋放肽前體，比雙抗夾心法靈敏，缺 點(diǎn)是所需時(shí)間較長(zhǎng)，檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定，重復(fù)性比ELISA差，且存在放射性污染危險(xiǎn);免疫發(fā)光 法方法特異性強(qiáng)，敏感性高，但需要昂貴的儀器設(shè)備和經(jīng)驗(yàn)豐富的操作人員，一般多在特定 醫(yī)療機(jī)構(gòu)使用。因此開發(fā)靈敏度更高、快捷方便的胃泌素釋放肽前體產(chǎn)品，仍是臨床診斷產(chǎn) 品研究領(lǐng)域亟需解決的重要問題。
[0005]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種胃泌素釋放肽前體定量熒光免疫層析檢測(cè)試劑盒;其由 試紙卡和熒光免疫層析分析儀組成。
[0007] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述試紙卡是在PVC板上順次相互搭接經(jīng)過處理的 樣品墊、吸附有稀土熒光微球標(biāo)記抗體的結(jié)合墊、包被有檢測(cè)線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜 和吸水墊，組裝后形成試紙，然后切割成4mm寬的試紙條，將試紙條裝入塑料卡內(nèi)形成試紙 卡。
[0008] 在本發(fā)明進(jìn)一步實(shí)施方案中，所述稀土熒光微球摻雜有鑭系元素，包括銪(EU)、釤 (Sm)、鉺(Er)和/或釹(Nd)等鑭系元素的任意一種或幾種。所述稀土熒光微球的直徑為60-200nm，進(jìn)一步優(yōu)選地，所選用的稀土焚光微球的直徑是100-120nm。
[0009]在本發(fā)明中，所述稀土熒光微球含有稀土絡(luò)合物，在基態(tài)下穩(wěn)定，在350-400nm的 激發(fā)光源作用下，能夠發(fā)射出波長(zhǎng)范圍在550-600nm的熒光。
[0010]所述熒光免疫層析分析儀是一種光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)，用于對(duì)檢測(cè)結(jié)果的定量判定，對(duì) 胃泌素釋放肽前體的檢測(cè)范圍為〇-5ng/mL。
[0011] 在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，所述吸附熒光微球標(biāo)記的抗體的結(jié)合墊通過以下方 法制備： A、稀土熒光微球的醛基化： 取5mg稀土熒光微球，用50mM，pH9.5的碳酸鹽緩沖液，采用離心法洗滌3遍，離心速度為 12000rpm，時(shí)間為10分鐘，最后重懸于200μ1的上述碳酸鹽緩沖液中。加入400μ1醛基化的葡 聚糖，混勻，室溫下暗反應(yīng)4小時(shí)。采用同樣的離心法洗滌和重懸到200μ1的上述碳酸鹽緩沖 液中，置于4 C備用。
[0012] Β、稀土熒光微球標(biāo)記的胃泌素釋放肽前體單克隆抗體的制備： 將2mg胃泌素釋放肽前體單克隆抗體用上述碳酸鹽緩沖液于4°C透析過夜，然后與上述 醛基化的稀土熒光微球混合，4°C反應(yīng)過夜。然后，加入硼氫化鈉至終濃度10mM，4°C反應(yīng)4小 時(shí);再加入等體積的封閉液（l〇〇mM三羥甲基氨基甲烷緩沖液，pH8.0，含0.5%BSA，0.1%蔗糖 和0.1 %PVP)，4 °C封閉過夜;然后用1 OOmM三羥甲基氨基甲烷緩沖液，pH8.0的緩沖液采用離 心法洗滌3遍，重懸于200μ1的100mM三羥甲基氨基甲烷緩沖液中（含1.0%NaCl，0.3%BSA， 0.2%乙二醇），4 °C避光保存?zhèn)溆谩?br>[0013] C、吸附熒光微球標(biāo)記的抗體的結(jié)合墊的制備： 將玻璃纖維膜浸泡于250mM三羥甲基氨基甲烷緩沖液中（含1.2% Triton X-100，2.5% 85八，？!18.0)，4°(：浸泡4小時(shí)，然后取出37°(：烘箱烘干4小時(shí)，備用。將玻璃纖維膜在則〇-DotXYZ3050三維噴點(diǎn)平臺(tái)上，用Bio-Jet Quanti300非接觸式微定量噴頭將稀土熒光微球 標(biāo)記的胃泌素釋放肽前體單克隆抗體噴到玻璃纖維膜，37°C烘干4小時(shí)，備用。
[0014] 在本發(fā)明又一個(gè)實(shí)施方案中，所述包被有檢測(cè)線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜的制備 方法如下： 用包被稀釋液將胃泌素釋放肽前體單克隆抗體和羊抗小鼠 IgG抗體調(diào)整濃度到5mg/ ml，膜液量為2yl/cm，將它們分別作為檢測(cè)線和質(zhì)控線平行噴灑于硝酸纖維素膜上進(jìn)行包 被，檢測(cè)線和質(zhì)控線間隔為5mm，然后置于烘箱中，37°C烘干4小時(shí)。所述包被稀釋液為100mM 三羥甲基氨基甲烷緩沖液，PH8.0。
[0015] 在本發(fā)明又一個(gè)實(shí)施方案中，所述樣品墊的制備方法如下： 將玻璃纖維膜浸泡于0.25M Tris緩沖液(pH7.5)，1.2%Triton X-100,2.5% BSA的處理 液中，于4°C浸泡4個(gè)小時(shí)，然后置于烘箱中，37°C烘干4小時(shí)。
[0016] 在本發(fā)明中，所述試紙卡的組裝過程如下：在PVC板上依次粘貼經(jīng)過處理的樣品 墊、吸附有稀土熒光微球標(biāo)記的抗體的結(jié)合墊、包被有檢測(cè)線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜和 吸水墊，組裝后得到試紙大板，按照要求切割成4_寬，將試紙裝入塑料卡內(nèi)形成試紙卡。
[0017] 所述試劑盒，檢測(cè)方法為：1)將檢測(cè)試劑及樣本平衡至室溫，取出試紙卡，平放； 2)精確吸取100μ1血清樣本，樣本為全血時(shí)吸取150μ1樣本，加入到樣本孔中，15-30分鐘 內(nèi)用熒光免疫層析分析儀定量判定結(jié)果;3)設(shè)置好儀器相關(guān)參數(shù)后將試紙卡放入倉(cāng)內(nèi)進(jìn)行 檢測(cè)，儀器將顯示出樣品濃度的定量測(cè)定結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面將詳細(xì)說明本發(fā)明。需要指出的是，以下說明僅僅是對(duì)本發(fā)明要求保護(hù)的技 術(shù)方案的舉例說明，并非對(duì)這些技術(shù)方案的任何限制。本發(fā)明的保護(hù)范圍以所附權(quán)利要求 書記載的內(nèi)容為準(zhǔn)。
[0019] 實(shí)施例1胃泌素釋放肽前體定量熒光免疫層析檢測(cè)試劑盒的制備 1)吸附熒光微球標(biāo)記的抗體的結(jié)合墊的制備： A、稀土熒光微球的醛基化： 取5mg稀土熒光微球(直徑100nm)，用50mM，pH9.5的碳酸鹽緩沖液，采用離心法洗滌3 遍，離心速度為12000rpm，時(shí)間為10分鐘，最后重懸于200μ1的上述碳酸鹽緩沖液中。加入 400μ1醛基化的葡聚糖，混勻，室溫下暗反應(yīng)4小時(shí)。采用同樣的離心法洗滌和重懸到200μ1 的上述碳酸鹽緩沖液中，置于4°C備用。
[0020] B、稀土熒光微球標(biāo)記的胃泌素釋放肽前體單克隆抗體的制備： 將2mg胃泌素釋放肽前體單克隆抗體用上述碳酸鹽緩沖液于4°C透析過夜，然后與上述 醛基化的稀土熒光微球混合，4°C反應(yīng)過夜。然后，加入硼氫化鈉至終濃度10mM，4°C反應(yīng)4小 時(shí);再加入等體積的封閉液（l〇〇mM三羥甲基氨基甲烷緩沖液，pH8.0，含0.5%BSA，0.1%蔗糖 和0.1 %PVP)，4 °C封閉過夜;然后用1 OOmM三羥甲基氨基甲烷緩沖液，pH8.0的緩沖液采用離 心法洗滌3遍，重懸于200μ1的100mM三羥甲基氨基甲烷緩沖液中（含1.0%NaCl，0.3%BSA， 0.2%乙二醇），4 °C避光保存?zhèn)溆谩?br>[0021 ] C、吸附熒光微球標(biāo)記的抗體的結(jié)合墊的制備： 將玻璃纖維膜浸泡于250mM三羥甲基氨基甲烷緩沖液中（含1.2% Triton X-100，2