腦鈉肽免疫層析定量檢測試紙條的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實用新型屬于免疫檢測領(lǐng)域，具體涉及一種高靈敏度腦鈉肽免疫層析定量檢測試紙條。
【背景技術(shù)】
[0002]1988年日本學(xué)者Tetsuji Sudoh首次從豬腦內(nèi)分離得到一種具有強(qiáng)力的利鈉、利尿、擴(kuò)血管和降壓作用的多肽，命名為腦鈉肽(brain natriuretic peptide，BNP)。以后的研究表明，不只是BNP這一種多肽，而是有一組多肽在生物進(jìn)化的過程中逐漸發(fā)展產(chǎn)生(在人類和脊椎動物至少包括ANP、BNP、CNP、DNP、VNP和Urodilatin)，稱為利鈉肽(NP)家族。其功能是維持循環(huán)系統(tǒng)的容量、滲透壓和壓力調(diào)節(jié)的穩(wěn)態(tài)。目前用于臨床檢測的包括BNP和氨基末端腦鈉肽前體(NT-proBNP)兩種。在心肌細(xì)胞受刺激后，產(chǎn)生初始基因產(chǎn)物前BNP前體(pre-proBNP)，該肽的一個26氨基信號肽被立即去除，形成含108個氨基酸的的BNP前體(proBNP)，后者在內(nèi)切酶的作用下裂解為含有76個氨基酸、無生物活性的NT-proBNP和含有32個氨基酸、有活性的BNP。兩者有相同的生物學(xué)來源，但生物學(xué)效應(yīng)和臨床意義不完全相同。BNP和NT-proBNP檢測在本世紀(jì)初先后進(jìn)入我國，十年來已經(jīng)為各級醫(yī)院和醫(yī)師廣泛用于臨床實踐，成為心血管病尤其是心力衰竭診斷十分有用的生物標(biāo)志物。我國2007年《慢性心力衰竭診斷治療指南》也推薦將BNP和NT-proBNP用于慢性心衰的診斷和預(yù)后判斷。
[0003]腦鈉肽(BNP)主要來源是心室。在正常狀態(tài)下，BNP在顆粒中儲存很少，機(jī)械性刺激是心室產(chǎn)生及分泌BNP的主要原因。當(dāng)各種心肌損傷引起心輸出量下降時，反饋性的興奮神經(jīng)、體液機(jī)制，從而使血管收縮、水鈉潴留、心臟前后負(fù)荷增加，心肌張力升高，心肌細(xì)胞受到牽拉，使心室肌細(xì)胞BNP合成與分泌增加，血漿BNP濃度升高?？梢援a(chǎn)生抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)、抑制交感神經(jīng)活動、減少水鈉潴留、舒張血管等作用，對心臟有保護(hù)作用。因而血漿BNP水平的異常變化即可以顯示心臟功能的變化。
[0004]30年間，BNP在心臟疾病領(lǐng)域有了很大的轉(zhuǎn)變，從最初的研究熱點(diǎn)到確定為HF的診斷標(biāo)記物。截止到目前，已經(jīng)確定了 BNP對于HF的診斷作用，評估預(yù)后的功能也開始應(yīng)用，而鈉尿肽的篩查功能和預(yù)測HF等級方面還需要進(jìn)一步確定。
[0005]BNP的測定方法較多，產(chǎn)品多樣，定量檢測的有:放射免疫法(RIA)，高靈敏度的免疫放射法(IRMA)，酶免疫法(EIA)，微粒子酶免疫法(MEIA)，免疫熒光法(FIA)等。
[0006]1.EIA及RIA法測定BNP時，血漿標(biāo)本均須經(jīng)過抽提濃縮10倍以上，需要I毫升以上血漿標(biāo)本，并且反應(yīng)時間長達(dá)18-24小時，不適于常規(guī)操作。且RIA法有放射性污染問題，有一定局限性。IRMA法準(zhǔn)確敏感，但亦較為費(fèi)時費(fèi)力，須經(jīng)過溫育過夜的實驗步驟，自動化程度不高，也存在放射性1125對環(huán)境及操作人員的損害。
[0007]2.MEIA采用BNP特異的單克隆抗體和二步夾心分析技術(shù)測定血漿BNP水平。樣品中的BNP被包被在乳膠微粒子顆粒上的抗-BNP抗體捕獲，微粒子在纖維網(wǎng)上進(jìn)行清洗分離，結(jié)合在纖維網(wǎng)上的BNP再與堿性磷酸酶標(biāo)記的另一株單抗結(jié)合。通過對熒光底物磷酸-4-甲基傘型酮催化反應(yīng)所發(fā)出的熒光信號進(jìn)行檢測，和已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)物熒光信號強(qiáng)度進(jìn)行比較，可得到待測樣品中BNP濃度。
[0008]各種市售BNP測定試劑盒由于使用的抗原標(biāo)準(zhǔn)品，單抗來源以及抗體所針對的BNP抗原決定簇不同，這些檢測方法在靈敏度、特異性等方面存在差異。由于不同實驗室對同一份樣品的測定值不一致，對判斷測定值的臨床意義造成了困難。因此，首先應(yīng)針對各種測定方法建立相應(yīng)的正常人及各種病理狀態(tài)下的測定參考值范圍。就目前的現(xiàn)狀而言，BNP檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)化還有很長的路要走。
[0009]生物素-親和素系統(tǒng)(b1tinavidin system，BAS)，是一種新型生物反應(yīng)放大系統(tǒng)。隨著各種生物素衍生物的問世，BAS很快被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域。將該系統(tǒng)應(yīng)用于免疫組化，酶聯(lián)免疫，熒光免疫，放射免疫等檢測技術(shù)中，可顯著地提高以上技術(shù)方法的敏感性、特異性和穩(wěn)定性，使方法更簡便，有助于臨床快速診斷，并利于進(jìn)行大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查，成為研究免疫反應(yīng)的有力工具。由于BAS檢測系統(tǒng)經(jīng)濟(jì)快速，又無放射物質(zhì)污染，不需復(fù)雜儀器，充分顯示了此系統(tǒng)的巨大潛力和應(yīng)用的可能性。
[0010]生物素-親和素系統(tǒng)檢測原理:BAS是在常規(guī)ELISA原理的基礎(chǔ)上，結(jié)合生物素與親和素間的高度放大作用，而建立的一種檢測系統(tǒng)。親和素是卵白蛋白中提取的一種堿性糖蛋白，分子量為68kDa，由4個亞單位組成，對生物素有非常高的親和力(結(jié)合常數(shù)高達(dá)115M1K生物素很易與蛋白質(zhì)(如抗體等)以共價鍵結(jié)合。這樣，結(jié)合了酶的親和素分子與結(jié)合有特異性抗體的生物素分子產(chǎn)生反應(yīng)，既起到了多級放大作用，又由于酶在遇到相應(yīng)底物時的催化作用而呈色，達(dá)到檢測未知抗原(或抗體)分子的目的。鏈霉親和素是與親和素有相似生物學(xué)特性的一種蛋白質(zhì)，鏈霉親和素與親和素一樣分子中每條肽鏈都能結(jié)合一個生物素，因幾乎所有用于標(biāo)記的物質(zhì)均可以同親和素或鏈霉親合素結(jié)合。利用生物素-親和素系統(tǒng)研制腦鈉肽檢測快速診斷試劑尚無報道。
【實用新型內(nèi)容】
[0011]本實用新型的目的，在于提供一種腦鈉肽免疫層析定量檢測試紙條，其基于雙抗體夾心法、熒光免疫側(cè)向?qū)游龊蜕锼?鏈霉親和素放大系統(tǒng)，提供高靈敏度腦鈉肽免疫層析定量檢測試紙條。使用本實用新型時，提高了檢測靈敏度和檢測穩(wěn)定性，降低了非特異性結(jié)合，檢測時間不大于10分鐘，大大提高了診斷效率。
[0012]本實用新型解決其技術(shù)問題的解決方案是:腦鈉肽免疫層析定量檢測試紙條，其包括底板，所述底板上依次設(shè)有樣品墊、熒光標(biāo)記物結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，所述吸水墊和熒光標(biāo)記物結(jié)合墊分別交疊壓在硝酸纖維素膜的兩端后在硝酸纖維素膜的表面形成檢測區(qū)，所述樣品墊交疊壓在熒光標(biāo)記物結(jié)合墊上，所述熒光標(biāo)記物結(jié)合墊上固定有生物素標(biāo)記的腦鈉肽單克隆抗體和鏈霉親和素標(biāo)記的熒光蛋白；所述檢測區(qū)內(nèi)的硝酸纖維素膜上固定有識別腦鈉肽另外一個表位的單克隆抗體構(gòu)成的檢測線和羊抗鼠IgG多克隆抗體構(gòu)成的質(zhì)控線。
[0013]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述熒光標(biāo)記物結(jié)合墊包括層疊的第一熒光標(biāo)記物結(jié)合墊和第二熒光標(biāo)記物結(jié)合墊，所述第一熒光標(biāo)記物結(jié)合墊的一端墊在樣品墊的下方，所述第二熒光標(biāo)記物結(jié)合墊交疊壓在硝酸纖維素膜的一端。
[0014]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述第一熒光標(biāo)記物結(jié)合墊中插入樣品墊下方的一端設(shè)有定位條，所述樣品墊的下端面設(shè)有能容納定位條的定位槽。
[0015]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，還包括卡殼，所述底板、樣品墊、熒光標(biāo)記物結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊均置于卡殼內(nèi)，所述卡殼殼面上對應(yīng)于硝酸纖維膜的位置設(shè)有觀察窗，卡殼殼面上對應(yīng)于樣品墊的位置設(shè)有加樣孔。
[0016]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述觀察窗為長方形孔。
[0017]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述熒光蛋白可以是綠色熒光蛋白、藻膽蛋白中的一種。
[0018]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述樣品墊為經(jīng)表面活性劑緩沖液浸泡處理后干燥的玻璃纖維構(gòu)件。
[0019]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述底板為聚苯乙烯構(gòu)件或者聚乙烯構(gòu)件。
[0020]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述卡殼包括塑料上殼和塑料下殼，所述塑料上殼扣合塑料下殼上后形成卡殼。
[0021]本實用新型與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0022](I)本實用新型將熒光蛋白作為標(biāo)記物，此標(biāo)記物穩(wěn)定性良好，有利于提高檢測穩(wěn)定性。
[0023](2)本實用新型通過利用“鏈霉親和素-生物素放大系統(tǒng)”，提高檢測靈敏度，降低非特異性結(jié)合，有利于提高試劑盒性能。
[0024](3)利用本實用新型進(jìn)行腦鈉肽的檢測時間不大于10分鐘，檢測線性范圍為5.0-5000.0pg/mL，極大地提高了檢測效率。
[0025](4)本實用新型可通過熒光免疫分析儀對結(jié)果進(jìn)行判讀，可實現(xiàn)自動化，減少主觀因素的影響，提供便利、快速、可靠的診斷結(jié)果。
[0026](5)本實用新型卡殼設(shè)有樣品進(jìn)入的加樣孔和供觀測結(jié)果的觀察窗，根據(jù)分析儀器判定結(jié)果，準(zhǔn)確可靠。