基于核酸適配體(aptamer)的膠體金(AuNPs)層析試紙條檢測四環(huán)素(TET)，屬于分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

四環(huán)素類抗生素作為一種廣譜抗生素被廣泛地用來控制細(xì)菌感染，在動物疾病的治療中發(fā)揮著舉足輕重的作用。其中，四環(huán)素因高效性、廣譜性和低成本性等特點(diǎn)，已成為應(yīng)用最為普遍的一類抗生素。四環(huán)素不僅作為藥物廣泛地應(yīng)用于人類與動物疾病的預(yù)防與治療，同時也作為飼料添加劑被大量地使用，用于提高飼料利用效率和促進(jìn)動物生長。

然而，四環(huán)素化學(xué)性質(zhì)相對穩(wěn)定，且具有一定的持久性，造成了其在環(huán)境中的殘留，大量研究證實(shí)了四環(huán)素廣泛存在于土壤和生態(tài)水中。不僅如此，在動物飼料中過度和不適當(dāng)?shù)奶砑訒斐伤沫h(huán)素或其降解產(chǎn)物高水平的殘留與累積在動物源性食品中，如牛奶、肉類、魚類和雞蛋。

當(dāng)人們攝入帶有四環(huán)素殘留的這些食物，可能會造成牙齒發(fā)黃，機(jī)體耐藥性增強(qiáng)、過敏反應(yīng)、胃腸道紊亂以及肝損傷，嚴(yán)重威脅人體健康。

因此，為保障人體健康，許多國際組織規(guī)定了四環(huán)素在食品中的最大殘留限量(MRL)，如美國食品藥品管理局、歐盟和聯(lián)合國食品法典委員會限定牛奶中四環(huán)素的MRL分別為900nM、225nM和100μg/Kg。而我國農(nóng)業(yè)部允許四環(huán)素在牛奶中的MRL為100ng/mL。

目前，四環(huán)素的常用檢測方法是色譜分析方法，如毛細(xì)管電泳法、高效液相色譜法、液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法等，這些方法大多需要漫長而復(fù)雜的分析過程、昂貴的儀器以及專業(yè)人員的操作，并不適合于現(xiàn)場快速檢測。另一種常用的檢測方法是酶聯(lián)免疫吸附法，雖然其檢測靈敏度較高，但是選擇性差，且費(fèi)用較為昂貴。因此有必要研發(fā)出既有較好選擇性和靈敏度，又簡便、經(jīng)濟(jì)、易于操作，更適于現(xiàn)場快速檢測的四環(huán)素檢測方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種基于核酸適配體的膠體金層析試紙條檢測四環(huán)素的方法，以快速、簡單、靈敏地檢測四環(huán)素的殘留量。

技術(shù)問題：基于核酸適配體的膠體金試紙條檢測四環(huán)素基于以下原理：

基于aptamer的試紙條設(shè)計方法的原理是基于DNA探針1(測試線)及目標(biāo)TET與aptamer結(jié)合的競爭反應(yīng)。如果檢測液中存在TET，將與aptamer-AuNPS探針結(jié)合，減少了與DNA探針1雜交的aptamer-AuNPS，使檢測線上紅色的顏色強(qiáng)度變?nèi)?。換句話說，溶液中的目標(biāo)TET越多，測試線的強(qiáng)度較弱；無論目標(biāo)TET的在檢測溶液中是否存在，aptamer-AuNPs探針一定會在控制線與DNA探針2雜交，以確保檢測的效度。評估此方法的靈敏度是根據(jù)試紙條的視覺檢測限，即最小目標(biāo)濃度在測試線上的顏色與不用靶分析的陰性對照條帶的測試線有顯著不同的顏色。

本發(fā)明的技術(shù)方案：

包括以下步驟：適于標(biāo)記aptamer的膠體金納米粒子的合成；膠體金與核酸適配體的組裝與偶聯(lián)；鏈霉親和素和DNA鏈的組裝；樣品墊與金標(biāo)墊的前處理；NC膜劃線；試紙條的組裝；四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品的檢測；選擇性和特異性實(shí)驗；實(shí)際樣品的檢測。

(1)適于標(biāo)記aptamer的膠體金納米粒子的合成

①樣品制備

對于所有制樣的玻璃器皿徹底用王水(鹽酸/HNO₃，體積比3:1)清洗然后烘干備用。100mL的0.01％氯金酸溶液徹底煮沸，并在不斷攪拌下迅速加入2.5mL的1％的檸檬酸三鈉溶液。將溶液再煮沸10min時，溶液的顏色在1min內(nèi)從藍(lán)色變?yōu)榫萍t色。目測所制備的膠體金溶液，顏色呈鮮亮的酒紅色，分布均 勻，無明顯顆粒沉淀物或漂浮物。在室溫攪拌下冷卻后，將溶液貯存于4℃黑暗中做進(jìn)一步研究。所制備AuNPs的尺寸分布是由紫外分光光度計檢測吸光度確認(rèn)。

②參數(shù)

紫外分光光度計型號為UV-2550；光譜值范圍為400nm到800nm；掃描速度為60nm/分鐘；帶寬為100nm；數(shù)據(jù)間隔為1nm。將測得的OD值利用Origin軟件進(jìn)行處理并作出OD色譜圖。

(2)aptamer-膠體金的組裝與偶聯(lián)

AuNPs-aptamer探針的制備是基于硫醇-金鍵的形成。AuNPs溶液在8000r/min離心15min，并分散到膠體金復(fù)溶液中形成特定的濃度。30μL硫醇改性aptamer溶液(10μM)加入到5備濃縮后的1mLAuNPs溶液中并在室溫下反應(yīng)12小時。然后，加入300μL20mM的NaCl溶液到2ml混勻后室溫反應(yīng)8小時。再加入1ml80mMNaCl，混勻后室溫靜置反應(yīng)8h。該混合物通過離心在4℃，13000r/min純化20min，棄去上清液，用偶聯(lián)物復(fù)溶液溶解至1mL，4℃保存待用。探針偶聯(lián)的結(jié)果通過紫外可見分光光度計進(jìn)一步掃描確認(rèn)。(3)建立核酸適配體的膠體金試紙條檢測四環(huán)素

DNA1/2都用鏈霉親和素修飾；樣品墊用前處理液浸泡、金標(biāo)墊用特制處理液浸泡后鋪設(shè)金標(biāo)適配子、DNA1/2劃線于NC膜的檢測線與控制線位置；上述三者37℃烘干后拼貼到試紙條底板上并切割成小條，與卡殼組裝成型；配制四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液500μg/mL滴至樣品墊部位，在遷移過程中控制線出現(xiàn)明顯紅色，檢測線顏色變淺或消失，說明有四環(huán)素檢出。

(4)選擇性測定

選擇實(shí)際樣品中易出現(xiàn)殘留的與四環(huán)素結(jié)構(gòu)相似的抗生素進(jìn)行了選擇性實(shí)驗，分別為洛美沙星、恩諾沙星、土霉素和氯霉素；首先，分別配制等濃度四環(huán)素、土霉素、氯霉素、洛美沙星、恩諾沙星的標(biāo)準(zhǔn)溶液；其次，將上述10μg/mL抗生素溶液各吸取50μL分別滴入試紙條的加樣孔中，樣液完全擴(kuò)散至吸水板上，反應(yīng)大約15min；結(jié)果顯示只有加入四環(huán)素的體系中出現(xiàn)檢測線顏色明顯變淺，即該基于核酸適配體的膠體金層析試紙條對于實(shí)際樣品中四環(huán)素的檢測具有較好的選擇性。

(5)實(shí)際樣品檢測：選擇牛奶作為實(shí)際樣品進(jìn)行檢測。

吸取4mL的牛奶加入到15mL的離心管中，加入6mL的三重蒸餾水進(jìn)行稀釋后加入2mL 10％的三氯乙酸和2mL氯仿，渦旋混合1min后，在溫度為20℃的條件下超聲15min；然后，將上述溶液以13000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心10min，吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一個15mL的離心管中，再以10000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心10min，吸取上清液備用。分析中，將提取的上清液稀釋20倍，等分為5份，加入不同濃度的四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定。根據(jù)檢測線顏色深淺，牛奶中四環(huán)素的視覺檢出限為1.0×10^-3μg/mL。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明建立了一種新型、高效的檢測技術(shù)，適于對四環(huán)素的進(jìn)行現(xiàn)場篩查和快速檢測，對預(yù)防和控制食品安全事件具有一定的意義。

附圖說明

圖1適于標(biāo)記核酸適配體的膠體金的紫外可見吸收光譜圖

圖2不同稀釋倍數(shù)的金標(biāo)適配子偶聯(lián)物紫外可見光譜對比圖

具體實(shí)施方式

(1)適于標(biāo)記aptamer的膠體金納米粒子的合成

材料/試劑：氯金酸(HAuCl₄·3H₂O)(阿拉丁)、檸檬酸三鈉，均購買于生工生物工程股份有限公司(中國上海)。

方法：AuNPs的制備是根據(jù)稍作修改的經(jīng)典Frens方法。首先，對于所有制樣的玻璃器皿徹底用王水(鹽酸/HNO3，體積比3:1)清洗然后烘干備用。100mL的0.01％氯金酸溶液徹底煮沸，并在不斷攪拌下迅速加入1.8毫升的1％的檸檬酸三鈉溶液。將溶液再煮沸5min時，溶液的顏色在1min內(nèi)從藍(lán)色變?yōu)榫萍t色。目測所制備的膠體金溶液，顏色呈鮮亮的酒紅色，分布均勻，無明顯顆粒沉淀物或漂浮物。在室溫和攪拌下冷卻后，將溶液貯存于4℃黑暗中做進(jìn)一步研究。所制備AuNPs的尺寸分布是由紫外分光光度計檢測吸光度確認(rèn)。

結(jié)果：膠體金溶液在400～800nm波長范圍內(nèi)有一單吸收峰，最大吸收波長520nm，根據(jù)最大吸收波長(Y)與膠體金顆粒粒徑(X)之間的回歸方程：Y＝0.4271X+514.56(R＝0.974,P<0.01)可知本次制備的膠體金粒徑大約為13nm。并且最大吸收峰峰寬較小，說明金粒子分布較均勻。

(2)AuNPs-aptamer探針的制備

材料/試劑：四環(huán)素核酸適配體、磷酸三氯乙基酯(TCEP)購買于生工生物工程股份有限公司(中國上海)

方法：①取TET適配子干粉，開蓋前離心(5000rpm,5min)。緩慢加入適量適配子溶解液使終溶度為100μM，水平搖床上搖晃10min使充分溶解。取最低穩(wěn)定量的100μM適配子溶液，加入等體積的5mg/mLTCEP溶液，充分混合，4℃反應(yīng)2h；

②取5mL膠體金溶液，用0.1mol/L K2CO3溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液pH值；

③將上述3所得溶液高速離心(13000rpm)15min；

④棄上清，濃縮膠體金至1mL，加蒸餾水至1.7mL；

⑤混合1和4兩種溶液，手動振搖1min后，室溫避光靜置12h；

⑥加入300μL20mMNaCl溶液至2mL，振搖1min，繼續(xù)靜置8h

⑦將上述溶液分至2管，各加入500μL 80mM NaCl溶液，振搖1min，室溫繼續(xù)靜置8h；

偶聯(lián)物稀釋不同濃度，用紫外分光光度計測定吸收光譜。

純化：將結(jié)合好的金標(biāo)適配子溶液于4℃、13000rpm冷凍高速離心20min，棄去上清液，將管底的暗紅色膠狀物合并；加入事先配制好的金標(biāo)適配子偶聯(lián)物復(fù)溶液重懸至1mL。4℃保存待用。

結(jié)果：結(jié)果表明，此法制得的金標(biāo)適配子偶聯(lián)狀況較好。

(3)檢測線和質(zhì)控線的制備

材料/試劑：鏈霉親和素、測試線的DNA探針1、控制線的DNA探針2購買于生工生物工程股份有限公司(中國上海)。

方法：取Probe1(DNA1)干粉，開蓋前離心(5000rpm，5min)后加入工作液使終濃度為100μM，再稀釋成25μM，Probe2(DNA2)配制成15μM；取40μL Probe1/2溶液分別與40μL鏈霉親和素溶液在4℃下反應(yīng)2h，再加入20μL 0.01mol/LPBS緩沖液；取劃膜套裝，將上述制備好的檢測線/控制線溶液加入劃線筆中，均勻劃線于NC膜上，不要有間斷；檢測線和質(zhì)控線分別劃線成功后，將NC膜于37℃烘箱烘烤30min后放入密封袋中保存待用。

結(jié)果：成功將兩條探針鏈固定在NC膜上。

(4)試紙條的組裝

材料/試劑：快速檢測部件套裝、手動劃膜套裝購買于杰一生物技術(shù)有限公司(中國上海)；PBS、Tris、PEG20000、蔗糖、卵白蛋白OVA、氯化鎂(MgCl₂)、Na2HPO₄、磷酸氫二鉀(KH₂PO₄)、硫酸鎂(MgSO₄)均購買于生工生物工程股份有限公司(中國上海)

方法：4％蔗糖、1％OVA、0.25％Tween20的0.01mol/L PBS配制金標(biāo)墊預(yù)處理液；2％蔗糖、0.25％Tween20、pH 7.4的0.01mol/LPBS為樣品墊預(yù)處理液；將兩種耗材裁剪為1cm×4cm的條分別浸泡于兩種預(yù)處理液后37℃烘干；用金標(biāo)適配子溶液浸潤金標(biāo)墊，再次烘干呈干脆狀。將處理后的NC膜、吸水板、金標(biāo)墊、樣品墊分別層疊2mm粘貼于底板上，裝于卡套內(nèi)。

結(jié)果：制成四環(huán)素的基于核酸適配體的膠體金快速檢測卡

(5)方法的選擇性測定

材料/試劑：四環(huán)素核酸適配體、四環(huán)素、土霉素和氯霉素均購買于生工生物工程股份有限公司(中國上海)；洛美沙星、恩諾沙星均購買于美國西格瑪奧德里奇公司(美國圣路易斯)。

方法：選擇實(shí)際樣品中易出現(xiàn)殘留的與四環(huán)素結(jié)構(gòu)相似的抗生素進(jìn)行了選擇性實(shí)驗，分別為洛美沙星、恩諾沙星、土霉素和氯霉素。首先，分別將四環(huán)素、土霉素、氯霉素、洛美沙星、恩諾沙星的標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋到500μg/mL；其次，將上述10μg/mL抗生素溶液各吸取50μL分別滴入試紙條的加樣孔中，樣液完全擴(kuò)散至吸水板上，反應(yīng)大約15min。

結(jié)果：結(jié)果顯示只有加入四環(huán)素的體系中出現(xiàn)檢測線顏色明顯變淺，即該基于核酸適配體的膠體金層 析試紙條對于實(shí)際樣品中四環(huán)素的檢測具有較好的選擇性。

(6)實(shí)際樣品檢測：選擇牛奶作為實(shí)際樣品進(jìn)行檢測

材料/試劑：四環(huán)素核酸適配體、四環(huán)素均購買于生工生物工程股份有限公司(中國上海)；牛奶購買于當(dāng)?shù)剞r(nóng)場。

方法：吸取4mL的牛奶加入到15mL的離心管中，加入6mL的三重蒸餾水進(jìn)行稀釋后加入2mL 10％的三氯乙酸和2mL氯仿，渦旋混合1min后，在溫度為20℃的條件下超聲15min；然后，將上述溶液以13000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心10min，吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一個15mL的離心管中，再以10000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心10min，吸取上清液備用。分析中，將提取的上清液稀釋20倍，等分為5份，如權(quán)利要求5所述的方法，加入不同濃度的四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定。

結(jié)果：根據(jù)檢測線顏色深淺，肉眼可檢出牛奶中四環(huán)素的濃度為1.0×10^-3μg/mL。

SEQUENCE LISTING

<110> 吉林大學(xué)

<120>基于核酸適配體的膠體金層析試紙條檢測四環(huán)素

<160> 3

<210> 1

<211>54

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 1

gggtgggtgg gtgggtgggt cgctggtgac ccacccaaaa aaaaaaaaaa aaaa 54

<210>2

<211>54

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 2

cccacccacc cacccaccca gcgaccactg ggtggg 36

<210>3

<211> 54

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 2

tttttttttt tttttttt 18