專利名稱：一種鴨疫里氏桿菌雙價滅活疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鴨疫里氏桿菌雙價滅活疫苗及其制備方法，屬于 獸用生物制劑制備與禽病防治技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
鴨疫里氏桿菌(及& ^/^//" tf/mrt》"/i:^r, RA)病是目前對養(yǎng)鴨業(yè)危 害最嚴(yán)重的傳染病之一，臨床上常引起雛鴨的纖維素性心包炎、肝周 炎、氣囊炎、干酪性輸卵管炎、結(jié)膜炎、關(guān)節(jié)炎等，發(fā)病率和病死率 均很高，該病的致病菌即鴨疫里氏桿菌，此菌的部分菌株對部分抗菌 藥物敏感，但難于清除，尤其是鴨疫里氏桿菌侵入氣囊后，藥物難以 到達(dá)。當(dāng)前，由于不合理的用藥方案，鴨疫里氏桿菌耐藥現(xiàn)象普遍存 在，耐藥率高且廣泛，同時造成了一定的藥物殘留等問題。
防制該病的重要手段是接種鴨疫里氏桿菌疫苗，但當(dāng)前國內(nèi)尚沒 有針對該病的商品化疫苗可用。且鴨疫里氏桿菌血清型眾多，國際上 報道多達(dá)21種，型間交叉保護(hù)力較差，因此給此病的防治帶來了較 大的困難。中國最主要流行血清型是I和II等血清型，因此，研究 鴨疫里氏桿菌血清I型和血清II型雙價滅活疫苗具有重大現(xiàn)實意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種鴨疫里氏桿菌雙價滅活疫苗,此疫苗 可有效用于預(yù)防鴨傳染性漿膜炎。
本發(fā)明的另一 目的在于提供該疫苗的制備方法。
本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的
本發(fā)明提供一種鴨疫里氏桿菌雙價滅活疫苗,該疫苗抗原為鴨疫 里氏桿菌血清I型和血清II型菌株。
其中，上述菌株來源于福建省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所。
3該疫苗中血清I型和血清II型菌株的比例是1:1-1:1.5。 本發(fā)明還提供了該鴨疫里氏桿菌雙價滅活疫苗的制備方法，主要 包括如下步驟
(1) 生產(chǎn)用菌種的制備
一級種子繁殖將凍干菌種分別用LB培養(yǎng)基溶解，接種于含胎 牛血清的胰蛋白胨大豆瓊脂斜面，C02培養(yǎng)箱37'C培養(yǎng)24h形成特 征單菌落，作為一級種子，挑取特征單菌落再接種于LB液體培養(yǎng)基 純培養(yǎng)作為二級種子；
(2) 制苗用菌液的制備按培養(yǎng)基體積的3%~5%分別加入生 產(chǎn)用菌種進(jìn)行純培養(yǎng)，分別收集菌液、進(jìn)行計數(shù)、滅活和濃縮，使其 菌數(shù)達(dá)到5.6xl01GCFU/mL以上；
(3) 配苗
油相制備取注射用白油94份、司本-80 6份、硬脂酸鋁2份， 配油相時先取少量注射用白油與硬脂酸鋁混合，加熱溶化，再與全量 司本-80及注射用白油混合均勻，116'C滅菌30分鐘備用；水相制備 將制苗菌液用2mM NaOH調(diào)pH值至6.8~7.2,將菌液與吐溫-80按 96:4的比例混勻，充分振搖，使吐溫-80完全溶解；乳化取油相1.2 份放于膠體磨內(nèi)，開動電機慢速轉(zhuǎn)動攪拌，同時徐徐加入水相l(xiāng)份， 加完后再以10000r / min攪拌4~5分鐘，在終止攪拌前加入1%硫柳 汞溶液，使硫柳汞終濃度為0.005%。
其中，制備過程中，滅活采用常規(guī)滅活劑即可，濃縮可采用其它 方法，但本發(fā)明優(yōu)選采用過中空纖維柱法。
本發(fā)明中兩種抗原的含量均不低于lX101()CFU/mL，其免疫保 護(hù)期可達(dá)兩個月以上。
本發(fā)明具有如下優(yōu)越性
本發(fā)明將免疫原性良好的鴨疫里氏桿菌血清I型菌株和血清II 型菌株組合制成了鴨疫里氏桿菌血清I型和血清II型雙價滅活疫苗，該疫苗一次注射，免疫期就長達(dá)70天以上，且對血清i型和n型免
疫保護(hù)效率達(dá)90%以上；該疫苗中兩個菌株抗原間的比例配合恰當(dāng)，
簡化免疫程序的同時，減少了接種動物的應(yīng)激反應(yīng)，節(jié)約了生產(chǎn)和注
射成本；此疫苗用于商業(yè)化生產(chǎn)后，將結(jié)束我國鴨傳染性漿膜炎防治 過度依賴藥物的現(xiàn)實，可為養(yǎng)鴨業(yè)的健康穩(wěn)定發(fā)展提供強大技術(shù)支持 和物質(zhì)保障。
通過下列實施例將更具體的說明本發(fā)明，但是應(yīng)理解所述實施例 僅是為了說明本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
具體實施例方式
實施例l鴨疫里氏桿菌滅活疫苗的制備
1. 生產(chǎn)用種子制備
(l)一級種子的制備將鴨疫里氏桿菌凍干菌種分別用LB培養(yǎng) 基溶解，劃線接種于含2%胎牛血清的胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA) 平板上，置熠燭缸中37'C培養(yǎng)24h。肉眼觀察菌苔表面光滑，挑選 圓形、微突起、奶油狀呈微藍(lán)色半透明的菌落5 10個；
挑選的菌落混勻后接種含2%胎牛血清的TSA斜面，C02培養(yǎng) 箱37'C培養(yǎng)24h取出，肉眼觀察純粹的作為一級種子。 一級種子在 2~8°。保存。
(2) 二級種子繁殖及檢驗取一級種子，用5mL左右的LB洗 下菌苔，接種于LB液體培養(yǎng)基400mL中置37'C振蕩培養(yǎng)24h，純 檢合格后，作為二級種子置2 8'C保存，不超過3天。
2. 制苗用菌液的制備
培養(yǎng)基制備胰蛋白胨酵母肉湯，配方為胰蛋白胨10g，酵 母粉5g， NaC110g，蒸餾水加至1000mL。
(l)菌液培養(yǎng)用培養(yǎng)罐通氣培養(yǎng)，按容積裝入70%培養(yǎng)基及 花生油消泡劑，116'C滅菌40min后按培養(yǎng)基總量的3M接種二級種子 液，以逐漸增大通氣量的方法，37'C培養(yǎng)24小時，I型和II型分別進(jìn)
5行；
(2) 純粹檢驗菌液培養(yǎng)完成后，取樣做純粹檢驗；
(3) 活菌計數(shù)測OD525值，將菌液稀釋到OD525值為l，將稀 釋倍數(shù)乘以5xl(^CFU進(jìn)行活菌計數(shù)，計數(shù)結(jié)果作為配苗時參考；
(4) 滅活按菌液總量的0.3%緩慢加入分析純甲醛溶液，37'〇 恒溫條件下作用48小時，期間振搖數(shù)次，然后取少量接種于含2%胎牛 血清的胰蛋白胨大豆瓊脂，應(yīng)無菌生長。
3.配苗
(1) 油相制備注射用白油94份、司本-80 6份、硬脂酸 鋁2份，配油相時先取少量注射用白油與硬脂酸鋁混合，加熱溶化， 再與全量司本-80及注射用白油混合均勻，116'C滅菌30分鐘，備用；
(2) 水相制備菌液滅活檢驗合格后，根據(jù)菌數(shù)的計數(shù)結(jié)果， 用無菌生理鹽水將其稀釋成配苗菌液，并使其活菌數(shù)達(dá)到 5.6xl0WCFU以上，用2mM NaOH調(diào)pH值至6.8 7.2,將兩菌液以l:l 混合，再將混合菌液與吐溫-80按96:4的比例混勻，將菌液與吐溫-80 按96:4的比例混勻，充分振搖，使吐溫-80完全溶解；
(3) 取油相1.2份放于膠體磨內(nèi)，慢速轉(zhuǎn)動攪拌，同時加入水 相1份，再以10000r / min攪拌4巧分鐘，在終止攪拌前加入1%硫柳汞 溶液，使其最終濃度為0.005%。
實施例2鴨疫里氏桿菌滅活疫苗的制備
1. 生產(chǎn)用種子制備，同實施例l;
2. 制苗用菌液的制備
培養(yǎng)基制備同實施例l; (1)菌液培養(yǎng)用培養(yǎng)罐通氣培養(yǎng)，按容積裝入70%培養(yǎng)基及 花生油消泡劑，116""C滅菌40miii后按培養(yǎng)基總量的5M接種二級種子 液，以逐漸增大通氣量的方法，37'C培養(yǎng)22小時，I型和II型分別進(jìn) 行；
6(2) 純粹檢驗菌液培養(yǎng)完成后，取樣做純粹檢驗；
(3) 活菌計數(shù)測OD525值，將菌液稀釋到OD525值為l，將稀 釋倍數(shù)乘以5xl(^CFU進(jìn)行活菌計數(shù)，計數(shù)結(jié)果作為配苗時參考；
(4) 滅活按菌液總量的0.5。/。加入分析純甲醛溶液，37'C恒溫 條件下作用48小時，期間振搖數(shù)次，然后取少量接種于含2%胎牛血清 的胰蛋白胨大豆瓊脂，應(yīng)無菌生長。
3.配苗
(1) 油相制備注射用白油94份、司本-80 6份、硬脂酸 鋁2份，配油相時先取少量注射用白油與硬脂酸鋁混合，加熱溶化， 再與全量司本-80及注射用白油混合均勻，116'C滅菌30分鐘，備用；
(2) 水相制備菌液滅活檢驗合格后，根據(jù)菌數(shù)的計數(shù)結(jié)果， 用無菌生理鹽水將其稀釋成配苗菌液，并使其活菌數(shù)達(dá)到 5.6xlO"CFU以上，用2mM NaOH調(diào)pH值至6.8 7.2,將兩菌液以1:1.5 混合，再將混合菌液與吐溫-80按96: 4的比例混勻，充分振搖，使吐 溫-80完全溶解；
(3) 取油相1.2份放于膠體磨內(nèi)，慢速轉(zhuǎn)動攪拌，同時徐徐加 入水相l(xiāng)份，加完后再以10000r/min攪拌4^分鐘，在終止攪拌前加 入1%硫柳汞溶液，使其最終濃度為0.0(|5%。
實施例3鴨疫里氏桿菌滅活疫苗效力檢驗 (1)攻毒保護(hù)試驗 用5 10日齡健康番鴨10羽，各頸部背側(cè)皮下注射疫苗0.51111， 15 天后連同條件相同的對照健康番鴨10羽，各腿部肌肉注射I型和II型 的混合液0.5mL，含菌量分別為5億和20億。觀察10天，記錄試驗結(jié) 果。
其中，臨床癥狀判定標(biāo)準(zhǔn)
±有輕微臨床反應(yīng)，減食、排白色糞便1 2天，內(nèi)臟無肉眼可 見病變。+臨床減食3天以上或停食1天以上，排黃白色糞便3天以上， 剖檢見心臟或肝臟有輕度纖維素滲出性炎癥。
++臨床同(+)，可見明顯心包積液及纖維素滲出性炎癥。 +++臨床同(+)，有嚴(yán)重心包膜炎，并與肝或胸膜發(fā)生粘連。 ++++試驗鴨死亡，其他同(+++)。
結(jié)果對照鴨10羽全部發(fā)病，最后全部死亡，剖檢發(fā)現(xiàn)均具有典 型病變(反應(yīng)在++以上)；免疫番鴨保護(hù)9羽，僅一羽對在觀察期內(nèi) 出現(xiàn)"+"以上臨床反應(yīng)，觀察結(jié)束時進(jìn)行剖檢，內(nèi)臟無纖維素滲出 性炎癥。
(2)抗體監(jiān)測
用5~10日齡健康番鴨30羽，15羽頸部背側(cè)皮下注射疫苗0.51111， 15羽作空白對照。免疫后14日、28日、42日和56日和70日分別從實驗 組和對照組各隨機抽取10羽，采集鴨血制備血清，以間接ELISA檢測 免疫鴨和對照鴨的血清I型鴨疫里氏桿菌抗體效價，具體步驟如下 (一)配制以下試劑
1、 包被液pH9.6 0.051VI的碳酸鹽緩沖液
碳酸鈉1.59§ ，碳酸氫鈉2.93g，溶解至1000ml，于4'C保存， 不超過l個月；
2、 磷酸緩沖液(PBS)， 0.01M，PH7.4
氯化鈉8g,磷酸二氫鈉0.2g,含12分子結(jié)晶水的磷酸氫二鈉 2.9g,氯化鉀0.2g，加水至1000mL，用lNNaOH或1NHCL調(diào)整 PH至7.2， 4'C保存;
3、 洗滌液(PBST):含0.05%吐溫一20的PBS液；
4、 封閉液以PBS配制的0，5。/。牛血清白蛋白；
5、 抗體稀釋液以PBST配制的0.1。/。牛血清白蛋白；
6、 底物溶液取0.1M檸檬酸液24.30亳升，0.2M磷酸氫二鈉 溶液25.70毫升，加雙蒸水50毫升配成底物緩沖液；取四甲基聯(lián)苯
8胺(TMB) 10mg溶于5mL無水乙醇中，臨用前取0.5mL加底物緩 沖液液lOmL，再加0.75%H2O232jil; 7、終止液2MH2S04。 (二)以間接ELISA方法進(jìn)行血清I型鴨疫里氏桿菌抗體效價檢測。
1、 制備抗原
將血清I型鴨疫里氏桿菌接種到胰酶大豆瓊脂平板上，置37aC 蠟燭缸內(nèi)培養(yǎng)24小時。用滅菌生理鹽水將細(xì)菌從平板洗下，5000rprn 離心10分鐘，去上清，加生理鹽水洗滌直至上清液完全透明，然后 將沉淀的細(xì)菌懸浮于少量包被液中，將細(xì)菌懸液用超聲波裂解器充分 裂解，后再2000rpm離心30分鐘除去大的細(xì)菌碎片。測定蛋白含量， 將制備好的抗原分裝，-2(TC保存?zhèn)溆谩?br> 2、 包被抗原
以包被液將抗原稀釋后包被酶標(biāo)板，每孔200微升，4'C濕盒中 放置20小時，其中，包被抗原使用濃度為1.68ng/mL，然后以PBST 洗3次。3、 封閉
每孔加200微升封閉液，37-C水浴l小時進(jìn)行封閉，再以PBST 洗板3次。
4、 加待檢血清
將待檢血清以抗體稀釋液先稀釋100倍，然后再將其倍比稀釋液 作為一抗，每孔加200微升，37'C水浴1小時，以PBST洗板3次。
5、 加酶標(biāo)二抗
每孔加200微升酶標(biāo)二抗，37'C水浴1小時；以PBST洗3次，
6、 反應(yīng)顯色，讀OD415值
每孔加150微升底物，37'C水浴15分鐘，注意應(yīng)避光放置；每 孔加50微升終止液，拭干酶標(biāo)板背面的水珠，置酶標(biāo)儀中讀取OD415 值。同時以鴨陰性血清為陰性對照，以強陽性血清為陽性對照，以抗
體稀釋液代替待檢血清為空白對照，所有OD415值必須減去空白對 照的OD415值。 7、結(jié)果判定
將OD415值大于規(guī)定吸收值的待檢血清的最高稀釋度定為每份 待檢測血清的效價，以20份陰性血清100倍稀釋時的OD415平均值 為規(guī)定吸收值，本試驗中規(guī)定吸收值為0.145。
免疫后14日、28日、42日、56日和70日抗體效價如圖l所示: 如圖所示，可以看到，鴨只免疫后14日抗體效價迅速上升至 1/420，免疫后？^日抗體效價高達(dá)1/960，之后緩慢下降，直到免疫 后70日時，抗體效價還高達(dá)1/520，高于免疫后14日抗體效價。


圖1是本發(fā)明的鴨疫里氏桿菌雙價滅活疫苗血清I型鴨疫里氏桿 菌抗體效價圖。
10
權(quán)利要求
1、一種鴨疫里氏桿菌雙價滅活疫苗，其特征在于疫苗抗原為鴨疫里氏桿菌血清I型和血清II型菌株。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的鴨疫里氏桿菌雙價滅活疫苗，其特征 在于疫苗中血清I型和血清II型菌株的比例是1:1 1:1.5;
3、 如權(quán)利要求l、 2任一項所述的鴨疫里氏桿菌雙價滅活疫苗的 制備方法，其特征在于主要包括如下步驟(1) 生產(chǎn)用菌種的制備一級種子繁殖將凍干菌種分別用LB培養(yǎng)基溶解，接種于含胎 牛血清的胰蛋白胨大豆瓊脂斜面，C02培養(yǎng)箱37。C培養(yǎng)24h形成特 征單菌落，作為一級種子，挑取特征單菌落再接種于LB液體培養(yǎng)基 純培養(yǎng)作為二級種子；(2) 制苗用菌液的制備按培養(yǎng)基體積的3%~5%分別加入生 產(chǎn)用菌種進(jìn)行純培養(yǎng)，分別收集菌液、進(jìn)行計數(shù)、滅活和濃縮，使其 菌數(shù)達(dá)到5.6xl01DCFU/mL以上；(3) 配苗油相制備取注射用白油94份、司本-80 6份、硬脂酸鋁2份， 配油相時先取少量注射用白油與硬脂酸鋁混合，加熱溶化，再與全量 司本-80及注射用白油混合均勻，116'C滅菌30分鐘備用；水相制備 將制苗菌液用2mM NaOH調(diào)pH值至6.8 7.2,將菌液與吐溫-80按 96:4的比例混勻，充分振搖，使吐溫-80完全溶解；乳化取油相1.2 份放于膠體磨內(nèi)，開動龜機慢速轉(zhuǎn)動攪拌，同時徐徐加入水相l(xiāng)份， 加完后再以10000r / min攪拌4~5分鐘，在終止攪拌前加入1%硫柳 汞溶液，使硫柳汞終濃度為0.005%。
4、 如權(quán)利要求3所述的鴨疫里氏桿菌雙價滅活疫苗的制備方法， 其特征在于濃縮采用過中空纖維柱法。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鴨疫里氏桿菌雙價滅活疫苗及其制備方法，屬于獸用生物制劑制備與禽病防治技術(shù)領(lǐng)域。該疫苗的抗原為鴨疫里氏桿菌血清I型和血清II型菌株，兩個菌株抗原間的比例配合恰當(dāng)。該疫苗一次注射，免疫期就長達(dá)70天以上，且對血清I型和II型免疫保護(hù)效率達(dá)90％以上；該疫苗在簡化免疫程序的同時，減少了接種動物的應(yīng)激反應(yīng)，節(jié)約了生產(chǎn)和注射成本。此疫苗用于商業(yè)化生產(chǎn)后，將結(jié)束我國鴨傳染性漿膜炎防治過度依賴藥物的現(xiàn)實，可為養(yǎng)鴨業(yè)的健康穩(wěn)定發(fā)展提供強大技術(shù)支持和物質(zhì)保障。
文檔編號A61K39/116GK101507816SQ200910077900
公開日2009年8月19日 申請日期2009年2月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月3日
發(fā)明者張淵魁, 趙亞榮, 趙建增, 陳義鋒 申請人:福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司;北京大北農(nóng)科技集團股份有限公司