鴨疫里默氏菌OmpA/MotB截短重組蛋白、其抗體及制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鴨疫里默氏菌OmpA/MotB截短重組 蛋白、其抗體及制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 鴨疫里默氏菌（Riemerella anatipestifer，RA)所致鴨疫里默氏菌病 (Riemerella anatipestifer infection)是家鴨、火雞和多種其它鳥類的一種接觸傳染性 疾病，也稱為新鴨?。?New duck syndrome)、鴨敗血癥（Duck septicaemia)、鴨疫綜合癥 (Anatipestfer syndrome)、鴨疫敗血癥（Anatipestifer septicaemia)、鴨疫巴氏桿菌病 (Pasteurella anatipestifer infection)和鴨傳染性衆(zhòng)膜炎（Infectious serositis) 〇 它是鴨的一種常見的細(xì)菌性傳染病，主要侵害2- 8周齡雛鴨，以纖維素性心包炎、肝周炎、 氣囊炎為主要的病理特征。
[0003] 引起鴨疫里默氏菌病的病原為鴨疫里默氏菌（Riemerella anatipestifer，RA)。 此菌為革蘭氏陰性小桿菌，無芽胞，菌體無菌毛或鞭毛，不能運(yùn)動(dòng)，有莢膜，瑞氏染色呈兩極 濃染。純培養(yǎng)菌涂片，美藍(lán)染色，可見菌體多為桿狀，常單個(gè)存在，少數(shù)成雙排列，偶見個(gè)別 菌體呈長絲狀排列。RA的血清型多而復(fù)雜，血清型超過21個(gè)，且各血清型之間缺乏有效的 交叉免疫保護(hù)，這給RA的疫苗防治帶來一定困難。比較有效的方法是針對(duì)當(dāng)?shù)刂饕餍醒?清型，選取相應(yīng)菌株研制疫苗，以達(dá)到更有效的預(yù)防效果。
[0004] 細(xì)菌外膜蛋白（OMP)是革蘭氏陰性菌特有的，是存在于外膜之中及與外膜有關(guān)的 所有蛋白的總稱。外膜在細(xì)菌胞漿膜（內(nèi)膜）和肽聚糖層的外側(cè)，包圍整個(gè)細(xì)菌，是革蘭氏 陰性菌細(xì)胞壁成分中所特有的結(jié)構(gòu)。外膜蛋白由6個(gè)家族組成：包括OmpA蛋白、OmpX蛋白、 水解磷脂酶A、普通膜孔蛋白（OmpF，PhoE)、底物特異性膜孔蛋白（LamB，ScrY)以及金屬依 賴性鐵運(yùn)輸?shù)鞍譌huA和F印A蛋白，共有20余種，但多數(shù)功能尚不清楚。外膜蛋白A (Outer Membrane Protein A，0mpA)是革蘭氏陰性菌的主要外膜蛋白，OmpA與細(xì)菌的生物膜形成有 關(guān)，可維持外I旲的完整，缺少OmpA的細(xì)菌，細(xì)胞I旲不穩(wěn)定。OmpA是一種跨I旲蛋白，有研宄表 明，該蛋白除了具有維持外膜結(jié)構(gòu)的作用外，其重要作用是在細(xì)菌感染早期與細(xì)胞基質(zhì)相 互作用，定植于宿主細(xì)胞，從而達(dá)到吸附作用。據(jù)報(bào)道，OmpA是RA的一種毒力因子，具有致 病作用，因此，在鴨疫里默氏菌病的診斷和疫苗研制上可能具有重要價(jià)值。此外，OmpA基因 核酸序列高度保守，有著良好的免疫原性，能夠激發(fā)機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫，并可通過 遺傳工程技術(shù)得到大量表達(dá)。對(duì)于異種血清型，OmpA可起到免疫交叉保護(hù)的作用，是一種 潛在的共同保護(hù)性抗原，它是被公認(rèn)的RA高保護(hù)性抗原。再者，OmpA有助于RA逃逸機(jī)體 的免疫防御。
[0005] Thrombospondin是指凝血酶敏感蛋白，又稱血小板反應(yīng)蛋白。其基因家族分為 兩個(gè)亞科，亞科A和亞科B。亞群A的蛋白質(zhì)包括TSP-I和TSP-2,被組裝成三聚體，包含 有1、2、3型重復(fù)；亞群B的蛋白質(zhì)，是指TSP-3、TSP-4與C0MP(TSP-5)，它們的特征是包 括獨(dú)特的N端區(qū)域，缺乏原骨膠原同源區(qū)域和1型重復(fù)，含有四個(gè)版本的2型重復(fù)，被組 裝成五聚化物。3型重復(fù)（Thrombospondin type 3repeats)的作用在于細(xì)胞黏附（cell attachment)、傳播（spreading)和抑制蛋白酶（protease inhibition)。Thrombospondin type 3repeat: OmpA/MotB可能涉及病原體同宿主細(xì)胞之間的相互作用，與病原體吸附宿主 細(xì)胞有關(guān)，是OmpA家族的其他成員。MotB是細(xì)菌的一種鞭毛馬達(dá)蛋白，與細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)有關(guān)。 但是鴨疫里默氏菌沒有鞭毛，可以推測(cè)MotB與OmpA可能具有同源性，存在相似功能。有文 獻(xiàn)指出，OmpA相關(guān)蛋白與MotB蛋白C端的保守序列在革蘭氏陰性菌與陽性菌中有一個(gè)共同 的功能：可能與肽聚糖相互作用有關(guān)（The C-terminal sequence conservation between OmpA-related outer membrane proteins and MotB suggests a common function in both gram-positive and gram-negative bacteria, possibly in the interaction of these domains with peptidoglycan, Molecular microbiology, 1994, 12(2):333)〇
[0006] 由于國內(nèi)外關(guān)于鴨疫里默氏菌凝血酶敏感III型重復(fù)蛋白（Thrombospondin type 3repeats) :0mpA/MotB基因及其蛋白的研宄未見報(bào)道，因此，對(duì)Thrombospondin type 3 repeats :0mpA/MotB基因及其蛋白的研宄有助于為RA的防控開辟新的思路。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種鴨疫里默氏菌OmpA/MotB截短重組蛋白， 其具有與天然OmpA/MotB蛋白相似的免疫反應(yīng)活性，能夠與RA抗體特異性結(jié)合；本發(fā)明同 時(shí)還提供了上述重組蛋白的抗體及制備方法和應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明通過下述技術(shù)方案達(dá)到所述目的：
[0009] 1、鴨疫里默氏菌OmpA/MotB截短重組蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0010] 2、鴨疫里默氏菌OmpA/MotB截短重組蛋白的編碼基因。
[0011] 優(yōu)選的，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0012] 3、含有上述編碼基因的重組表達(dá)載體。
[0013] 優(yōu)選的，是將核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示的OmpA/MotB截短重組蛋白編碼基 因克隆入原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32 (a)+中而得到。
[0014] 4、上述重組表達(dá)載體的工程菌。
[0015] 優(yōu)選的，是將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)中而得到；所述重組表達(dá)載 體為將核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示的OmpA/MotB截短重組蛋白編碼基因克隆入原核表 達(dá)質(zhì)粒pET-32 (a) +中而得到。
[0016] 5、上述工程菌制備鴨疫里默氏菌OmpA/MotB截短重組蛋白的方法，包括如下步 驟：
[0017] 取工程菌接種于含Amp的LB培養(yǎng)基中，以150-200r/min、37°C培養(yǎng)12h或至OD 6tltlmi為0. 6,然后按體積比為1:100的比例加入到含Amp的LB培養(yǎng)液中37°C繼續(xù)培養(yǎng)至OD6tltol達(dá)0. 6后，于I. 2mmol/L IPTG、37°C條件下誘導(dǎo)12h ;收集菌液，離心，菌體沉淀用1/10菌液 體積的20mmol/L、pH 8. 0的Tris-HCl懸浮，冰水浴超聲裂解菌體，而后12000r/min離心 l〇min，沉淀用1/50原菌液體積的8mol/L尿素溶液溶解，8000r/min離心10min，取溶解液， 采用Ni-NTA親和層析進(jìn)行純化，將收集的純化蛋白液進(jìn)行梯度透析、超濾及濃縮即得。
[0018] 6、鴨疫里默氏菌OmpA/MotB截短重組蛋白為抗原免疫動(dòng)物得到的多克隆抗體。
[0019] 7、鴨疫里默氏菌OmpA/MotB截短重組蛋白在制備鴨疫里默氏菌基因工程亞單位 疫苗或抗體檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。
[0020] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明選取RA OmpA/MotB基因的主要抗原表位蛋白區(qū) 域，利用原核表達(dá)系統(tǒng)成功制得了截短OmpA/MotB重組蛋白。該重組蛋白具有與天然OmpA/ MotB蛋白相似的免疫反應(yīng)活性，能夠與RA抗體特異性結(jié)合，而與鴨沙門氏菌陽性血清、鴨 大腸桿菌陽性血清、鴨腫頭敗血癥病毒陽性血清、禽流感病毒（H5)陽性血清、鴨瘟病毒陽 性血清、鴨肝炎病毒陽性血清等不產(chǎn)生交叉反應(yīng)，可作為檢測(cè)RA全菌抗體的檢測(cè)抗原應(yīng) 用，且由于該重組蛋白非全細(xì)菌，應(yīng)用其進(jìn)行檢測(cè)時(shí)無散毒危險(xiǎn)；此外，該重組蛋白的制備 方法簡單，適于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，能夠?qū)崿F(xiàn)產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)化，利于不同實(shí)驗(yàn)室之間的結(jié)果比 較。
【附圖說明】
[0021] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：
[0022] 圖I OmpA/MotB基因主要抗原表位區(qū)PCR產(chǎn)物電泳。M泳道：DL5000 Marker，1泳 道：OmpA/MotB基因主要抗原表位區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0023] 圖2 OmpA/MotB主要抗原表位區(qū)重組質(zhì)粒構(gòu)建及其PCR與酶切鑒定。圖中A圖 為pMD19-T/0mpA/MotB主要抗原表位區(qū)質(zhì)粒PCR鑒定，M泳道：DL5000 Marker，1泳道： PCR產(chǎn)物；圖中B圖為pMD19-T/0mpA/MotB主要抗原表位區(qū)質(zhì)粒酶切鑒定，M泳道：DL15000 Marker，1泳道：BamH I/Xho I雙酶切條帶；圖中C圖為pET-32 (a)+/OmpA/MotB主要抗原表 位區(qū)質(zhì)粒的PCR鑒定，M泳道：DL2000 Marker，1泳道：PCR產(chǎn)物；圖中D圖為pET-32 (a)+/ OmpA/MotB主要抗原表位區(qū)質(zhì)粒的酶切鑒定，M泳道：DL15000 Marker ; 1泳道：BamH I/Xho I雙酶切條帶。
[0024] 圖3 OmpA/MotB主要抗原表位區(qū)蛋白的表達(dá)分析及表達(dá)條件的優(yōu)化。M泳道為低 分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品。圖中A圖為重組蛋白表達(dá)形式的分析，泳道1為pET-32