專利名稱：鴨疫里默氏菌血清1型、2型、4型三價油乳劑滅活疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鴨疫里默氏菌三價油乳劑滅活的制備方法及其在預(yù)防由鴨疫里默氏菌引起的各種病癥中的應(yīng)用。2.背景技術(shù)鴨疫里默氏菌(Rimerella-anatipestifer，RA)是鴨傳染性漿膜炎病的病原體，它侵入機(jī)體可引起以纖維素性多發(fā)性漿膜炎、腦膜炎為特征的全身性疾病。鴨疫里默氏菌是一種非溶血性，非運(yùn)動性、革蘭氏陰性細(xì)小桿菌。隨著世界養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展，該病已成為全球范圍內(nèi)影響?zhàn)B鴨業(yè)的一種重要細(xì)菌性疾病。在鴨群的養(yǎng)殖中，做好平時的預(yù)防工作尤為重要。至今，我國幾乎所有養(yǎng)鴨地區(qū)都報道了本病的發(fā)生。近年來由于養(yǎng)鴨數(shù)量增大，鴨疫里默氏菌病的發(fā)生呈上升趨勢。研究表明各地區(qū)都有RA優(yōu)勢血清型的存在，而針對優(yōu)勢血清型研制疫苗是一種有效的防治手段。 大量研究證實了免疫商品疫苗成功的案例，目前使用的疫苗主要是滅活的單價及二價滅活疫苗，通過接種這些疫苗可以有效控制該疫病的發(fā)生。但是，RA血清型眾多且沒有交叉保護(hù)作用，而目前在RA感染的鴨場中血清型大多呈多樣化分布這都直接影響了疫苗效果的發(fā)揮。血清型復(fù)雜多變，在不同時期，不同地區(qū)流行的血清型存在著差異，加強(qiáng)血清型的監(jiān)測工作并研制有效的多價苗是目前解決該病的關(guān)鍵。所以，研制一種多價血清型且含有獨特菌株的商品疫苗是非常關(guān)鍵的。3.發(fā)明內(nèi)容現(xiàn)有的鴨疫里默氏菌滅活苗多為單價及二價滅活苗，分別針對血清 1型、血清2型。本發(fā)明提供一種三價的滅活疫苗，同時預(yù)防當(dāng)前我國鴨疫里默氏菌流行菌株的主要血清型即血清1型、2型和4型引起的疾病。4.技術(shù)方案本發(fā)明的技術(shù)方案是，將鴨疫里默氏菌血清1、2、4型分離株分別進(jìn)行培養(yǎng)，滅活后加入吐溫-80制成油乳劑的水相；利用馬可52輕質(zhì)石蠟油及司本-80、硬脂酸鋁制成油相。將水相和油相等體積混合后乳化，從而得到鴨疫里默氏菌三價滅活疫苗。其具體制備方法如下1)細(xì)菌的培養(yǎng)將鴨疫里默氏菌血清1型、2型和4型三株種子菌分別接種于TSA 固體培養(yǎng)基，37°C恒溫箱中培養(yǎng)，24h后挑取單個菌落，接入含小牛血清的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、180r/min條件下振蕩培養(yǎng)12-1 后再將此菌液按3 %的比例加入新配制的LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行大量增殖。37°C、180r/min振蕩培養(yǎng)24h后，收集菌液，用分光光度計測定細(xì)菌總菌含量。2)細(xì)菌的滅活按TSB液體培養(yǎng)基總體積加入0. 3%甲醛滅活，于37°C振蕩滅活 ll-13h。3)油乳劑水相的制備三個血清型的菌種滅活后，將各個血清型的菌液濃度均調(diào)至lX101(lCFU/ml，按1 1 1的體積比混合，按總體積4%加入滅菌吐溫-80，邊加邊攪拌。4)油相制備取馬可52輕質(zhì)石蠟油93份，加入硬脂酸鋁1份并攪拌直到透明為止，隨后加入6份司本-80，充分混勻，121°C高壓蒸汽滅菌30min，冷卻至室溫備用。5)油乳劑滅活苗的制備將制備好的油相和水相等體積混合，邊加邊攪拌，至完全溶解，并于均質(zhì)機(jī)中進(jìn)行乳化。本三價油乳劑滅活苗的保存條件為2 8。C。
本發(fā)明的優(yōu)點是可以預(yù)防由鴨疫里默氏菌血清1、2、4型菌株引起的疾病，對于同血清型菌株的免疫保護(hù)達(dá)到83%。相對于目前的商品疫苗來講，可以單針免疫較多的血清型，使用方便，并提高了對其他血清型交叉保護(hù)的可能性。
具體實施例方式結(jié)合實施對本發(fā)明做進(jìn)一步描述和論證。實施例1已制備好的鴨疫里默氏菌血清1型、2型、4型三價油乳劑滅活疫苗，3日齡櫻桃谷鴨70只，滅菌生理鹽水，規(guī)格為Iml注射器，疫苗菌株。實驗步驟1,70只3日齡櫻桃谷鴨分為注射疫苗組30只，攻毒組30只，空白對照組10只。2、疫苗組雛鴨每只頸部皮下注射疫苗0.5ml，空白對照組注射等量滅菌生理鹽水。3、全部雛鴨均置于相同條件下飼養(yǎng)，14d后，進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗。4、先將每個疫苗菌株擴(kuò)繁ll_13h，然后將濃度均調(diào)至2X 109CFU/ml。做攻毒保護(hù)試驗時，將注射疫苗組雛鴨分為3組，每組10只，分別頸部皮下注射SWS1、SWS2、SWS4菌株菌液，每只雛鴨注射菌液1ml。攻毒組也分為三組，每組10只，攻毒組的攻毒方式同疫苗注射組。攻毒后，注意觀察雛鴨的臨床癥狀，并記錄死亡時間和死亡率。實驗結(jié)果攻毒對照組在72h內(nèi)，死亡率均在70%以上，而疫苗免疫組的攻毒保護(hù)率均在80%左右。實施例2已制備好的鴨疫里默氏菌三價滅活苗，3日齡櫻桃谷雛鴨20只，滅菌生理鹽水， Iml注射器實驗步驟1、將3日齡櫻桃谷雛鴨分為兩組，一組為注射疫苗組，另一組為注射生理鹽水的空白對照組。2、注射疫苗組的雛鴨每只注射疫苗0.5ml，對照組注射等量生理鹽水。所有雛鴨均置于相同條件下飼養(yǎng)。3、注射后^d內(nèi)觀察雛鴨的精神及采食等情況。實驗結(jié)果28d內(nèi)，雛鴨沒有出現(xiàn)精神萎靡，采食量降低等不良狀況。表明該疫苗對于雛鴨具有較高的安全件。
權(quán)利要求
1.鴨疫里默氏菌血清1型、2型、4型三價油乳劑滅活疫苗，其特征是由我國當(dāng)前鴨疫里默氏菌主要流行血清型1、2、4型的分離株經(jīng)滅活后按比例混合制成三價油乳劑滅活疫苗。 所含佐劑的成份有礦物油、表面活性劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三價油乳劑滅活疫苗所用的分離株為鴨疫里默氏菌血清1、 2、4型，菌株編號為SWS1、SWS2、SWS3，均為臨床分離株。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三價油乳劑滅活疫苗，其中所述抗原的制備方法為，將鴨疫里默氏菌血清1、2、4型分離株接種于5%新生小牛血清的LB肉湯，37°C、180r/min振蕩培養(yǎng)Mh，加入終濃度為0.3%的甲醛滅活ll_13h，最后將三種菌株的培養(yǎng)物濃度均濃縮至 lX1010CFU/mlo
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三價油乳劑滅活疫苗，其中所述礦物油為馬可52輕質(zhì)石蠟油。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三價油乳劑滅活疫苗，其中所述表面活性劑為司本-80、吐溫-80、硬脂酸鋁。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三價油乳劑滅活疫苗，其中所述的油乳劑滅活苗的制備方法，該方法包括以下步驟1)細(xì)菌的培養(yǎng)將鴨疫里默氏菌血清1型、2型和4型三株種子菌分別接種于TSA固體培養(yǎng)基，37°C恒溫箱中培養(yǎng)，24h后挑取單個菌落，接入含小牛血清的LB液體培養(yǎng)基中， 37°CU80r/min條件下振蕩培養(yǎng)12-1 后再將此菌液按3%的比例加入新配制的LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行大量增殖。37°C、180r/min振蕩培養(yǎng)24h后，收集菌液，用分光光度計測定細(xì)菌濃度。2)細(xì)菌的滅活按LB液體培養(yǎng)基總體積0.3%緩慢加入甲醛，于37°C振蕩滅活 ll-13h。3)油乳劑水相的制備三個血清型的菌種滅活后，將各個血清型的菌液濃度均調(diào)至 lX101(lCFU/ml，然后將調(diào)整濃度后的菌液按1 1 1的體積比混合，按總體積的4%緩慢加入滅菌吐溫-80并攪拌均勻。4)油相制備取馬可52輕質(zhì)石蠟油93份，加入硬脂酸鋁1份，邊加邊攪拌，直到透明為止，再加入6份司本-80，充分混勻，121°C高壓蒸汽滅菌30min，冷卻至室溫備用。5)油乳劑滅活苗的制備將制備好的油相和水相等體積混合，于均質(zhì)機(jī)中乳化。
全文摘要
鴨疫里默氏菌血清1型、2型、4型三價滅活油乳劑疫苗。它是應(yīng)用我國鴨疫里默氏菌三個主要的流行血清型的分離株作為抗原，通過LB肉湯培養(yǎng)擴(kuò)繁18h后，經(jīng)過0.3％甲醛滅活11-13h，三個血清型的抗原以1∶1∶1的比例混合，然后加入與抗原總體積相等的油相，再經(jīng)乳化制備而成。用于預(yù)防由當(dāng)前流行的鴨疫里默氏菌主要血清型菌株引起的鴨的纖維素性多發(fā)漿膜炎和腦膜炎。
文檔編號A61K39/116GK102309753SQ20101021887
公開日2012年1月11日 申請日期2010年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月7日
發(fā)明者岳華, 湯承, 田令 申請人:西南民族大學(xué)