專利名稱：一種鴨疫里默氏桿菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及一種鴨疫里默氏桿菌及其應(yīng)用，即一株可引起鴨神經(jīng)癥狀和纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎的細(xì)菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鴨傳染性漿膜炎，又稱鴨疫里默氏桿菌病、鴨疫巴氏桿菌病、新鴨病等，是由鴨疫里默氏桿菌(Riemerella Anatipestifer,簡稱RA)引起的鴨、鵝、火雞及其他家禽和野禽的一種急性或慢性接觸性傳染病，主要侵害2 7周齡雛鴨，以神經(jīng)癥狀和纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎為特征。本病于1932年在美國紐約首次發(fā)現(xiàn)，我國鄺榮祿等于1975年首次報(bào)道本病在廣州的存在；郭玉璞等(1982)在北京地區(qū)商品鴨中首次分離出該病原菌；隨后，我國廣東、上海、福建、北京、四川、湖南、江蘇、海南、山東、重慶、湖北等地區(qū)均報(bào)道了發(fā)生該病的情況。迄今為止，國際上報(bào)道鴨疫里默氏桿菌共有21個(gè)血清型。由于缺乏相應(yīng)的參考菌株，在早期研究中，我國關(guān)于RA血清型的報(bào)道不多。早年高福等(1987)對(duì)從北京、廣東和上海等地分離的205個(gè)菌株經(jīng)凝集和瓊擴(kuò)試驗(yàn)鑒定證明均屬血清I型。但近年來發(fā)現(xiàn)其血清型已發(fā)生了巨大變化除了血清2型、6型、10型、11型、13型和14型，汪銘書等(2001)還報(bào)道了血清4型及血清8型鴨疫里默氏桿菌在我國的存在；李文楊等(2002)從福建省103個(gè)肉鴨場(chǎng)116份病料中共分離到細(xì)菌107株，其中鴨疫里默氏菌84株，占78. 5% ；大腸桿菌23株，占21. 5%。在分離鑒定的84株鴨疫里默氏桿菌中，血清2型占60. 7%，I型占25. 0%，其它占14. 3%。韋強(qiáng)等(2003)研究結(jié)果表明，優(yōu)勢(shì)血清型在不同的年份出現(xiàn)不同的變化，2000年鴨疫里默氏桿菌以I型為主，占總分離菌數(shù)的51. 9% ；2001年以后2型占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，占總分離菌數(shù)的89. 5% ；2002年RA2型依舊占53. 3%的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)?？梢娢覈壳傲餍械镍喴呃锬暇溲逍鸵寻l(fā)生了明顯變化，2型已成為主要流行的血清型。當(dāng)前，鴨疫里默氏桿菌對(duì)養(yǎng)殖業(yè)的危害除直接引起動(dòng)物發(fā)病、死亡外，感染過鴨疫里默氏桿菌的鴨因飼料轉(zhuǎn)化率降低、生長發(fā)育遲緩而帶來的間接經(jīng)濟(jì)損失也十分嚴(yán)重，鴨疫里默氏桿菌雖然對(duì)部分抗菌藥物敏感，但難于清除，尤其是該菌侵入氣囊后，藥物難以到達(dá)，由于不合理的用藥方案，鴨疫里默氏桿菌耐藥現(xiàn)象普遍存在，耐藥率高且廣泛，同時(shí)造成一定的藥物殘留等問題。目前防止該病的重要手段是接種鴨疫里默氏桿菌疫苗，但國內(nèi)針對(duì)該病的商品化疫苗非常少。因此，篩選出致病力強(qiáng)、免疫原性好的鴨疫里默氏桿對(duì)于制備疫苗具有重要的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供了一株鴨疫里默氏桿菌及其應(yīng)用，以該菌為抗原制備的疫苗可有效防治以神經(jīng)癥狀、纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎為特征的鴨傳染性漿膜炎，為鴨傳染性漿膜炎的預(yù)防和治療提供了產(chǎn)品和使用方法。本發(fā)明的鴨疫里默氏桿菌(Riemeralla anatipestifer) RA BYT06株已于2012年11月15日保藏于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院中科院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No. 6832。上述的鴨疫里默氏桿菌用于制備鴨疫里默氏桿菌滅活疫苗，所制得的疫苗可以預(yù)防以神經(jīng)癥狀、纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎為特征的鴨傳染性漿膜炎的發(fā)生。本發(fā)明篩選得到的鴨疫里默氏桿菌具有高致病性，用其制備的滅活疫苗，能夠預(yù)防以神經(jīng)癥狀、纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎為特征的鴨傳染性漿膜炎的發(fā)生，具有良好的市場(chǎng)推廣前景。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明對(duì)山東、廣東、福建、廣西等地的疑似鴨疫里默氏桿菌病死鴨進(jìn)行病原分離、鑒定，獲得38株病原為鴨疫里默氏桿菌，對(duì)其進(jìn)行血清型鑒定表明，其中有7株為血清2型；動(dòng)物回歸及毒力試驗(yàn)表明RA BYT06株毒力最強(qiáng)，可致鴨只10/10發(fā)病且其中5只死亡；免疫原性試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)免疫劑量為O. 25mL (抗原含量達(dá)到1. OX 108CFU/mL)時(shí)即可使攻毒保護(hù)達(dá)到9/10。以上結(jié)果表明，篩選得到一株血清2型鴨疫里默氏桿菌，其致病力最 強(qiáng)、免疫原性好、制備的油苗攻毒保護(hù)效果好，確定為生產(chǎn)用菌株，于2012年11月15日保藏于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院中科院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No. 6832。下面對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。一、鴨疫里默氏桿菌的分離及鑒定⑴將從山東、廣東、福建、廣西等地收集的病死鴨進(jìn)行無菌操作，取病死鴨心、血、肝或腦組織劃線接種于胰蛋白胨大豆瓊脂(使用前加5%犢牛血清)平板、鮮血營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，置于含5%C02的37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。其中38株的結(jié)果如下在胰蛋白胨大豆瓊脂平板上，置含5%C02恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，菌落呈圓形奶白色，突起，光滑，邊緣整齊，斜光觀察時(shí)菌落發(fā)綠光，有的培養(yǎng)基亦被襯成綠色，不同菌株綠光深淺程度不同，在鮮血瓊脂上呈圓形，不溶血，有閃光，呈奶油狀菌落，麥康凱瓊脂和普通營養(yǎng)瓊脂上均不生長，38株分離菌分別命名為RA BYTOU RA BYT02至RABYT38。⑵取純培養(yǎng)的細(xì)菌的單個(gè)菌落涂于干凈的載玻片上，然后分別用瑞氏染色法染色和革蘭氏染色，鏡檢，觀察其形態(tài)特征。革蘭氏染色，為革蘭氏陰性細(xì)小桿菌，呈單個(gè)或成對(duì)分布，偶爾呈鏈狀排列，不運(yùn)動(dòng)，無芽胞；瑞氏染色大部分菌體兩極濃染。⑶取純培養(yǎng)物分別進(jìn)行吲哚(靛基質(zhì))試驗(yàn)，甲基紅(M.R.)試驗(yàn)，V-P試驗(yàn)，過氧化氫酶試驗(yàn)，接觸酶試驗(yàn)，尿素酶試驗(yàn)，葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、阿拉伯糖、甘露醇、衛(wèi)矛醇、鼠李糖、果糖發(fā)酵試驗(yàn)。37°C培養(yǎng)，連續(xù)觀察7天。結(jié)果表明其中9株菌部分發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖外，其余菌株均不發(fā)酵糖類，不產(chǎn)生硫化氫，過氧化氫酶試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)均為陽性，V-P試驗(yàn)、甲基紅(M. R.)試驗(yàn)、吲哚(靛基質(zhì))試驗(yàn)均為陰性，符合鴨疫里默氏桿菌的生化反應(yīng)特征。⑷取初步分離保存的各株鴨疫里默氏桿菌純培養(yǎng)物，分別用鴨疫里默氏桿菌定型血清作平板凝集試驗(yàn)，以確定其血清型。結(jié)果顯示,38株細(xì)菌分離株中7株為血清型2型，4株為血清型I型’3株為血清型3型，3株為血清型4型，I株為血清型5型，2株為血清型6型，3株為血清型7型，3株為血清型9型，3株為血清型10型，I株為血清型11型，其中2型為優(yōu)勢(shì)血清型。(5) 7株血清2型鴨疫里默氏桿菌毒力測(cè)定試驗(yàn)分別將分離菌純培養(yǎng)的單個(gè)菌落劃線接種于胰蛋白胨大豆瓊脂(使用前加5%犢牛血清)平板上，37°C培養(yǎng)24h，刮取平板上所有菌落混于滅菌生理鹽水中制成細(xì)菌懸液，以
0.5mL/只劑量肌肉注射19日齡健康易感鴨10只，同時(shí)設(shè)立滅菌生理鹽水注射對(duì)照組10只。攻毒后連續(xù)觀察10天，每日記錄鴨子的精神、食欲、飲水、運(yùn)動(dòng)及死亡情況，并對(duì)死亡鴨進(jìn)行病理剖檢、細(xì)菌分離及鑒定。結(jié)果表明，RA BYT06株所攻毒鴨在攻毒40h后，鴨開始出現(xiàn)精神萎靡，行動(dòng)遲緩或俯臥不起，眼、鼻流分泌物，共濟(jì)失調(diào)等癥狀，其余株部分在90h后出現(xiàn)癥狀，部分未臨床出現(xiàn)癥狀；RA BYT06株攻毒后全部發(fā)病，10天內(nèi)多數(shù)發(fā)病鴨死亡，死亡達(dá)到5/10，剖檢可見典型的心包炎、肝周炎、氣囊炎，RA BYT17.RA BYT2URA BYT24株發(fā)病3/10 7/10，死亡0/10 2/10，因此可確定RA BYT06株毒力最強(qiáng)，詳見表I。取心血涂片和肝組織印片進(jìn)行瑞氏染色后顯微鏡下觀察檢查，RA BYT06株可見兩極濃染的小桿菌，單個(gè)或成對(duì)存在，并能從心血和肝組織在胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基上分離出接種菌，其生化及 培養(yǎng)特征與RA BYT06株株鑒定結(jié)果一致，因此本研究選用RA BYT06株作為疫苗用強(qiáng)毒菌株。并送中科院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)為 CGMCC No. 6832。表1:7株血清型2型鴨疫里默氏桿菌的毒力測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果
前株編號(hào)_攻毐·攻毐H齡汗始發(fā)病時(shí)間發(fā)病數(shù)泣(11/〗0)及死亡數(shù)歟
RA BYT06 0.5mL/只肌注 19 H齡 4龜發(fā)病10只，其屮死亡5只RA BYT17 O.SmL/只肌注 19 H齡 120h 發(fā)_ 3只，其中死亡O只RA BYT21 0.5mL/只肌注請(qǐng)日齡 90h 發(fā) 7只，其中死亡2只RABYT24 0.5mL./只肌注 19 □齡 96h 發(fā)病6只，其中死C 2只RABYT28 0.5mL/只肌注 19 口齡 - 發(fā)病O只，其中死亡O只RA BYT31 0.5mL/只肌注 19 H齡 - 發(fā)病O只，其屮死亡O只RA BYT37 0.5mL/只肌注 19 Π齡 - 發(fā)病O只，+K-中死Γ: O只對(duì)照饑_t理鹽水_19 D齡_-_U 其中死Γ: O K注〃_〃表不未發(fā)病(6)鴨疫里默氏桿菌強(qiáng)毒分離株RA BYT06株的免疫原性測(cè)定將確定的強(qiáng)毒分離株RA BYT06接種胰蛋白胨大豆肉湯(使用前加5%犢牛血清)培養(yǎng)基培養(yǎng)后，以平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，收集菌體，將其濃度稀釋到3. OX 106、3. OX IO7,3. OX IO8,3. OX IO9,3. OX 1010CFU/mL五組，分別按照油水比為2:1的比例做成油佐劑滅活疫苗，使配苗后每毫升抗原液菌數(shù)分別為1. 0X106、1. OXlO'l. 0X108、
1.OX 109、1. OX IOltlCFU,取5日齡健康易感雛鴨60只，10只/組，分別用含有不同濃度抗原的滅活疫苗進(jìn)行頸部皮下注射，O. 25mL/只，10只作為非免疫對(duì)照，接種后14日，每只鴨各肌肉注射O. 5mL(1.0X106CFU/mL)RA BYT06株菌液，觀測(cè)10日，測(cè)定疫苗的免疫保護(hù)效果。結(jié)果如表3所示，當(dāng)抗原含量達(dá)到1. O X 107CFU/mL以上，免疫劑量為O. 25mL時(shí)，保護(hù)8/10，當(dāng)抗原含量達(dá)到1. O X 108CFU/mL以上，免疫劑量為O. 25mL時(shí)，保護(hù)達(dá)到9/10，對(duì)照組10/10發(fā)病且其中5只死亡，結(jié)果表明當(dāng)抗原含量達(dá)到1. O X 108CFU/mL時(shí)，攻毒保護(hù)達(dá)到9/10，免疫原性好；具體結(jié)果見表2。表2 RA BYT06分離株的免疫原性試驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種鴨疫里默氏桿菌，其保藏編號(hào)為CGMCC No. 6832。
2.權(quán)利要求1所述的鴨疫里默氏桿菌在制備疫苗中的應(yīng)用。
3.一種滅活疫苗，所述的滅活疫苗是以權(quán)利要求1所述的鴨疫里默氏桿菌作為抗原制備的。
4.權(quán)利要求3所述的滅活疫苗的制備方法，包括如下步驟取注射用白油94份、6份司本-80混合后，加入2%硬脂酸鋁，加熱熔化至透明，混合均勻，制成油相，取鴨疫里默氏桿菌的菌液96份，加入高壓滅菌的4份吐溫-80，充分溶解混勻；從油相罐內(nèi)將2份油相打到乳化罐內(nèi)，開動(dòng)電機(jī)預(yù)乳化，同時(shí)徐徐加入制備好的鴨疫里默氏桿菌液I份，加完后再以3500r/min乳化40分鐘；在乳化終止前加入1%硫柳汞溶液，使其終濃度為0. 01% ;定量分裝，加蓋密封。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鴨疫里默氏桿菌，保藏號(hào)為CGMCC No.6832。上述的鴨疫里默氏桿菌用于制備鴨疫里默氏桿菌滅活疫苗，所制得的疫苗可以預(yù)防以神經(jīng)癥狀、纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎為特征的鴨傳染性漿膜炎的發(fā)生。滅活疫苗中鴨疫里默氏桿菌6832的數(shù)量不低于1×108CFU/mL。本發(fā)明篩選得到的鴨疫里默氏桿菌具有高致病性，用其制備的滅活疫苗，能夠預(yù)防以神經(jīng)癥狀、纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎為特征的鴨傳染性漿膜炎的發(fā)生，具有良好的市場(chǎng)推廣前景。
文檔編號(hào)A61K39/02GK103007261SQ20121057397
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月26日
發(fā)明者蔣皓靜, 凌紅麗, 叢雁方, 蔣貽海, 孫海新 申請(qǐng)人:青島康地恩藥業(yè)股份有限公司, 青島寶依特生物制藥有限公司