基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的人流感嗜血桿菌快速檢測(cè)方法和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測(cè)人 流感嗜血桿菌（Haemophilusinfluenzae,Hi)抗原的快速檢測(cè)方法及檢測(cè)試劑盒，以及該 檢測(cè)試劑盒的制備及使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 流感嗜血桿菌（Haemophilusinfluenzae,Hi)是感染人類的一種重要的呼吸道病 原微生物，該菌由波蘭細(xì)菌學(xué)家費(fèi)佛博士在1892年的一次流行性感冒瘟疫中發(fā)現(xiàn)的，在隨 后的時(shí)間里被研究者們廣泛研究。現(xiàn)僅知人是該病原體的宿主。免疫力較差的老人和兒童 為易感人群，特別是5歲以下的嬰幼兒。Hi可引發(fā)肺炎、結(jié)膜炎、中耳炎、腦膜炎和菌血癥 等，在全球每年至少有300萬嚴(yán)重病例發(fā)生，可造成患兒致殘甚至死亡。Hi分為有莢膜的a、 b、c、d、e、f共6個(gè)血清型和無莢膜的不可分型流感嗜血桿菌（nontypeableHaemophilus influenzae，NTHi)，一度以莢膜b型Hi最為流行。目前我國開展的Hi血清學(xué)檢查大多也 只針對(duì)侵襲力較強(qiáng)的莢膜b型。而由于該型菌株莢膜多糖疫苗的成功研發(fā)與應(yīng)用，其流行 已被有效控制。近來的研究多顯示，在感染Hi的患者中最常見的菌株是NTHi，其分離率已 達(dá)50%以上。
[0003] 臨床上由于Hi與其他呼吸道病原體引起的感染癥狀類似，因此常難以根據(jù)臨床 表現(xiàn)、X-射線檢查等得出結(jié)論，確診往往依賴于實(shí)驗(yàn)室診斷。嬰幼兒疾病的特點(diǎn)是起病急、 轉(zhuǎn)歸快，因此敏感、快速、實(shí)用的Hi檢測(cè)對(duì)及早進(jìn)行有效的臨床干預(yù)具有非常重要的意義。
[0004] 盡管流感嗜血桿菌在全球范圍內(nèi)傳播，但可用于實(shí)驗(yàn)室診斷的標(biāo)準(zhǔn)化商品試劑的 種類極少。目前，Hi感染的診斷方法有血清學(xué)檢測(cè)法，核酸檢測(cè)法和病原體直接檢測(cè)法。檢 測(cè)血清中HiIgG、IgA、IgM抗體常用的方法有：微量免疫熒光抗體檢測(cè)（MIF)，補(bǔ)體結(jié)合試 驗(yàn)（CF)，重組酶免疫測(cè)定（rEIA)，血清補(bǔ)體結(jié)合一酶免疫測(cè)定試驗(yàn)（SeroCF-EIA)等。然 而Hi抗體的檢出只能說明該個(gè)體感染過Hi，卻不能反映體內(nèi)是否仍有Hi活菌存在，并且血 清學(xué)特異性抗體檢測(cè)常需要根據(jù)IgM抗體的動(dòng)態(tài)結(jié)果進(jìn)行判斷，需要較長的時(shí)間。更重要 的是，血清學(xué)檢測(cè)的主要檢測(cè)對(duì)象為抗莢膜抗體，而NTHi由于沒有莢膜，則會(huì)造成漏檢。同 時(shí)，這些技術(shù)均存在靈敏度低、操作步驟復(fù)雜、需要專業(yè)人員操作、重復(fù)性差、檢測(cè)時(shí)間長、 檢測(cè)特異性差、成本較高等缺陷，因而難以滿足臨床的實(shí)際需要。
[0005] 核酸檢測(cè)包括核酸雜交和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)，核酸雜交檢測(cè)Hi的特異性強(qiáng)， 但敏感性不高，主要用于PCR結(jié)果的檢測(cè)、判定，尚未直接用于臨床標(biāo)本的檢測(cè)；PCR具有較 高的敏感性，但PCR實(shí)驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)室有特殊要求，標(biāo)本處理、擴(kuò)增和檢測(cè)要求嚴(yán)格，且易出現(xiàn) 假陽性，在我國還不能作為常用的臨床診斷方法。
[0006] 病原體檢測(cè)方法主要為病原分離培養(yǎng)法，將標(biāo)本接種于添加了V和X因子的巧克 力血瓊脂培養(yǎng)基上，經(jīng)24小時(shí)培養(yǎng)后，挑取可疑菌落經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定后，用Hi鑒定卡、Vilek 一 60細(xì)菌自動(dòng)分析系統(tǒng)鑒定到種，系統(tǒng)自動(dòng)進(jìn)行生物分型。但該法存在操作步驟復(fù)雜，細(xì) 胞培養(yǎng)時(shí)間長等明顯缺陷，并不適合臨床應(yīng)用。更重要的是，其中的莢膜腫脹實(shí)驗(yàn)等僅限于 對(duì)有莢膜的菌株進(jìn)行鑒定，而無莢膜型（NTHi)則全部漏檢。
[0007] 因此，目前建立具高靈敏度、高特異性的人流感嗜血桿菌抗原快速檢測(cè)法以滿足 臨床的檢測(cè)需求就顯得非常必要了。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 針對(duì)【背景技術(shù)】中存在的這些技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種基于磁性分離和量子點(diǎn) 標(biāo)記的能簡便、快速、高靈敏度的檢測(cè)人流感嗜血桿菌抗原的檢測(cè)方法和試劑盒，以及該試 劑盒的制備及使用方法。
[0009] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：
[0010] -種基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測(cè)人流感嗜血桿菌抗原的方法，其特征在 于：所述方法包括以下步驟：
[0011] 1)兔抗人流感嗜血桿菌膜蛋白P6多克隆抗體的制備；
[0012] 2)鼠抗人流感嗜血桿菌膜蛋白P6多克隆抗體的制備；
[0013] 3)將步驟1)制備得到的兔抗人流感嗜血桿菌膜蛋白P6多克隆抗體與納米磁珠通 過共價(jià)偶聯(lián)，制備抗人流感嗜血桿菌免疫納米磁珠；
[0014] 4)將步驟2)制備得到的鼠抗人流感嗜血桿菌膜蛋白P6多克隆抗體與納米量子點(diǎn) 通過共價(jià)偶聯(lián)，制備量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人流感嗜血桿菌納米探針；
[0015] 5)取人呼吸道分泌物樣本（包括但不限于咽拭子），用PBST緩沖液溶解后，加入 步驟3)制備得到的抗人流感嗜血桿菌免疫納米磁珠，充分混合，反應(yīng)10-45min后進(jìn)行磁分 離，以PBST緩沖液洗滌2遍后，向磁分離得到的沉淀物中加入步驟4)制備得到的量子點(diǎn)標(biāo) 記的抗人流感嗜血桿菌納米探針，反應(yīng)l〇_45min后進(jìn)行磁分離，以上述PBST緩沖液洗滌2 遍后，使用熒光酶標(biāo)儀讀取熒光值；所述PBST緩沖液中各成分含量如下：8g/LNaCL，0. 2g/ LKCl，0.24g/LKH2P04，1.44g/LNa2HP04,0.3g/LNaN3,0.5ml/LTween-20;所述PBST緩沖 液的pH= 7. 4 ;
[0016] 6)根據(jù)步驟1)-步驟5)的方法分別檢測(cè)四份經(jīng)臨床確定為人流感嗜血桿菌陰性 的人群的呼吸道分泌物樣品，讀取熒光值；所述人流感嗜血桿菌陰性的人群的呼吸道分泌 物樣品簡稱人流感嗜血桿菌陰性對(duì)照樣品；所述四份人流感嗜血桿菌陰性對(duì)照樣品的熒光 值的平均值與3倍標(biāo)準(zhǔn)差之和即為⑶T-OFF值；若步驟5)中人呼吸道分泌物樣本的檢測(cè)熒 光值大于CUT-OFF值，則判斷為人呼吸道分泌物樣本中人流感嗜血桿菌抗原為陽性；若步 驟5)中人呼吸道分泌物樣本的檢測(cè)熒光值小于⑶T-OFF值，則判斷為人呼吸道分泌物樣本 中人流感嗜血桿菌抗原為陰性。
[0017] -種基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測(cè)人流感嗜血桿菌抗原的試劑盒，其特征在 于：所述試劑盒由具有富集人流感嗜血桿菌抗原功能的抗人流感嗜血桿菌免疫納米磁珠、 量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人流感嗜血桿菌納米探針、質(zhì)控品以及PBST緩沖液所組成；所述質(zhì)控品包 括陽性質(zhì)控品以及陰性質(zhì)控品；所述陽性質(zhì)控品由滅活的人流感嗜血桿菌干燥結(jié)合到拭子 上而成；所述陰性質(zhì)控品是經(jīng)臨床確定為人流感嗜血桿菌陰性的人群的咽拭子。
[0018] -種用于制備基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測(cè)人流感嗜血桿菌抗原的試劑盒 的方法，其特征在于：所述制備方法包括以下步驟：
[0019] 1)抗人流感嗜血桿菌免疫納米磁珠的制備：
[0020] I. 1)兔及鼠抗人流感嗜血桿菌膜蛋白P6多克隆抗體IgG的制備
[0021] I.I. 1)重組P6_His融合蛋白的制備、純化：
[0022] I.I.I. 1)對(duì)人流感嗜血桿菌膜蛋白P6進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲取其胞外保守結(jié) 構(gòu)域中抗原表位最為豐富的肽段；
[0023]I.I. 1. 2)找到步驟I.I.I. 1)中所得到肽段對(duì)應(yīng)的基因編碼序列，在上述基因序 列的5'端及3'端引入酶切位點(diǎn)并化學(xué)合成全基因序列，同時(shí)標(biāo)記記為P6;其基因序列如 序列表所示；
[0024]I.I. 1. 3)將步驟I.I. 1. 2)中所得到的P6按分子生物學(xué)方法克隆入表達(dá)載體 pET-28a(+)后轉(zhuǎn)入大腸桿菌中表達(dá)重組P6-His融合蛋白；所述重組P6-His融合蛋白以可 溶性表達(dá)方式存在于菌體中；
[0025] I.I. 1. 4)用鎳柱純化步驟I.I. 1. 3)所得到的重組蛋白，SDS-PAGE檢測(cè)其純度后， 以Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，調(diào)整蛋白濃度為0. 2mg/mL后備用；
[0026]I. 1. 2)兔及鼠抗人流感嗜血桿菌膜蛋白P6多克隆抗體IgG的制備：
[0027]I. 1. 2. 1)以步驟I.I. 1. 4)中所得到的重組P6_His融合蛋白為完全抗原，分別免 疫新西蘭大白兔及豚鼠；分別制備兔抗人流感嗜血桿菌膜蛋白P6抗血清及鼠抗人流感嗜 血桿菌膜蛋白P6抗血清；所述兔抗人流感嗜血桿菌膜蛋白P6抗血清及鼠抗人流感嗜血桿 菌膜蛋白P6抗血清的間接ELISA效價(jià)均大于IXIO5 ;
[0028]I. 1. 2. 2)采用ProteinG親和層析柱分別純化兔抗人流感嗜血桿菌膜蛋白P6抗 血清及鼠抗人流感嗜血桿菌膜蛋白P6抗血清中的多克隆抗體IgG;
[0029]I. 1. 2. 3)用凱基Braford蛋白含量檢測(cè)試劑盒測(cè)定步驟I. 1. 2. 2)所得到的二種 多克隆抗體IgG的濃度，將其蛋白濃度均調(diào)整為lmg/mL后備用；
[0030] 1. 2)免疫納米磁珠的包被：
[0031] 1. 2. 1)取5mg磁珠，用ImlMES緩沖液洗滌三次，置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離 后移除上清；所述磁珠是以超順磁性Fe3O4為內(nèi)核、粒徑為350nm的羧基磁珠；所述MES緩 沖液是質(zhì)量濃度是2g/L的2-(N-嗎啉代）乙磺酸；所述MES緩沖液的pH= 6. 0 ;所述納米 磁分離器的磁性強(qiáng)度是〇. 4T;
[0032]L2. 2)依次加入用步驟L2. 1)中的MES緩沖液配制的濃度是8-12mg/ml的EDC 溶液以及用步驟1. 2. 1)中的MES緩沖液配制的濃度是6-12mg/ml的sulfo-NHS溶液各 0. 5ml，以10-40rpm/min于旋轉(zhuǎn)混合儀中活化lhr，置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離后移除 上清，用Iml步驟1. 2. 1)中的MES緩沖液重懸，得到活化后的磁珠；
[0033] 1.2. 3)取5個(gè)離心管，在每個(gè)離心管中加入200iiL步驟1.2. 2)所得到的活化 后的磁珠，置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離后移除上清，向各離心管中加入用PBS緩沖液 稀釋的濃度為50-200iig/ml的由步驟I. 1)所制備的兔抗人流感嗜血桿菌膜蛋白P6多克 隆抗體IgG溶液各lml，室溫下以15rpm/min于旋轉(zhuǎn)混合儀中反應(yīng)2-6h，置于納米磁分離 器中進(jìn)行磁分離后移除上清后，各加入Iml含lmg/ml乙醇胺的上述PBS緩沖液，室溫下以 15rpm/min于旋轉(zhuǎn)混合儀中反應(yīng)2h以封閉磁珠上未與抗體反應(yīng)的羧基；所述PBS緩沖液中 各成分含量如下：8g/LNaCL，0.2g/LKCl，0.24g/LKH2PO4,1. 44g/LNa2HPO4，所述PBS緩沖 液的pH= 7. 4 ;
[0034]I. 2. 4)封閉反應(yīng)完成后，將該5個(gè)離心管置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離后移 除上清，各用Iml洗滌緩沖液洗滌三遍；所述洗滌緩沖液中各成分含量如下：8g/LNaCL， 0.2g/LKCl，0.24g/LKH2P04，1.44g/LNa2HP04,0.5ml/LTween-20,所述洗滌緩沖液的pH= 7.4 ；
[0035]I. 2. 5)向各個(gè)離心管中分別加入Iml保存緩沖液重懸磁珠，置于4°C保存?zhèn)溆茫?所述保存緩沖液中各成分含量如下：8g/LNaCL，0.2g/LKCl，0.24g/LKH2PO4,1.44g/L Na2HPO4,0. 3g/LNaN3, 5g/L牛血清白蛋白（BSA)，所述保存緩沖液的pH= 7. 4 ;
[0036] 2)量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人流感嗜血桿菌納米探針的制備：
[0037] 其具體制備方法包括：
[0038] 2. 1)向微量離心管中依次加入2nmol羧基水溶性量子點(diǎn)、300nmolN-羥基琥珀酰 亞胺sulfo-NHS以及300nmol碳二亞胺EDC，以磷酸鹽緩沖液定容為2ml，混合溶液，37°C反 應(yīng)30min后，透析去除過量的作為活化劑的sulfo-NHS及E：DC，得到活化后的量子點(diǎn)；所述 磷酸鹽緩沖液中各成分含量如下：2. 9g/L磷酸氫二鈉，0. 295g/L磷酸二