專利名稱：放射性核素標記的rgd多肽藥物及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及腫瘤診斷及治療的放射性藥物，特別涉及用于integrin avp3陽性 腫瘤診斷和治療的放射性核素標記的RGD多肽藥物及其制備方法。
背景技術：
腫瘤生長過程中關鍵的一環(huán)是腫瘤血管生成。沒有新的血管生成腫瘤在長 到幾個厘米大小之后便不能再繼續(xù)生長。腫瘤血管生成被各種蛋白分子調控， 其中包括integrin av(33。 integrin av|33是一種細胞外基質受體，它是由a和卩兩個 亞基組成的異源二聚體跨膜糖蛋白。integrin av(33是整合素家族重要的組成成員， 作為與新生血管相關的分子標志物之一，它高表達在新生血管內皮細胞表面和 某些腫瘤細胞表面(成神經(jīng)細胞瘤、骨肉瘤、成膠質細胞瘤、乳腺癌和前列腺癌 等)，而在已存在的血管和正常組織中不表達或表達很低。integrin avp3在腫瘤生 長和轉移過程中的高度限制表達，使其成為一個非常有吸引力的靶點，用于腫 瘤的診斷和治療。
研究證實含有RGD(Arg-Gly-Asp,精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)序列的配體與 integrin ^(33具有高親和力和特異性。不同放射性核素標記的RGD序列配體，如 RGD環(huán)肽二聚體和四聚體等已被用于腫瘤的顯像和治療研究。RGD 二聚體或四 聚體比其單體具有更高的integrin av(33親和力，主要源于兩個因素， 一是兩個 RGD模序(motif)能同時與細胞表面的integrin av|33相結合，或者是一個RGD模 序與integrin av(33結合之后增加了細胞表面結合位點局部RGD濃度。如果兩個 RGD模序之間的距離足夠長，那么它們可以同時與integrinav卩3結合；如果兩個 RGD模序之間的距離不是足夠長，那么它們只能增加局部RGD濃度。目前報 道的RGD環(huán)肽二聚體E[c(RGDxK)]2 (E代表谷氨酸，c代表環(huán)化，R代表精氨 酸，G代表甘氨酸，D代表天冬氨酸，x為f或y，分別代表苯丙氨酸或酪氨酸)， 其兩個RGD模序之間的距離為6個鍵，由于距離不夠長，因此E[c(RGDxK)h 的兩個RGD模序很難同時與細胞表面相鄰的兩個integrin av(33受體結合(參見圖 1)。從這個意義上講，兩個RGD模序(motif)能同時與細胞表面的integrin av(33
5相結合具有更重要的作用。為此，有必要提出新型的RGD多肽二聚體，使二聚
體分子中的兩個RGD模序之間距離足夠長以能同時與細胞表面表達的相鄰的 integrin otvp3受體相結合，增強RGD多肽與integrin ctvp3的親和力，提高腫瘤對 藥物的攝取，并在此基礎上發(fā)明用于integrin av|33陽性腫瘤診斷和治療的放射性 藥物，以達到更好的診治效果。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種放射性核素標記的RGD多肽藥物及其制備方法。 該藥物首先將三個甘氨酸分子(G3， G-glycine)或四個聚乙二醇分子(PEG4， PEG =Polyethylene glycol)與RGD單體連接，然后再將此二聚化，使二聚體分子中的 兩個RGD模序之間距離足夠長以使其能同時與細胞表面表達的相鄰的integrin avp3受體相結合(參見圖2)，即以雙價形式與integrin (33結合，這樣會進一步 增強結合親和力以及腫瘤對藥物的攝取，達到更好的診治效果。該藥物通過 MAG2 (S-Acetyl-Mercaptocacetyl-glycyl-glycine， 61H戈乙酰-甘氨酸-甘氨酸)或 N》2或N3S等雙功能螯合劑將放射性核素99mTc或188Re標記到新型RGD環(huán)肽 二聚體分子上，在體內標記藥物通過RGD多肽的靶向作用濃聚到腫瘤部位，利 用核醫(yī)學的單光子斷層顯像技術對integrin av(33陽性腫瘤進行顯像診斷，還可以 通過放射性核素放射的P—粒子殺傷腫瘤細胞，對integrin av(33陽性腫瘤進行放射 靶向治療。當通過MAG2或N》2或N3S等雙功能螯合劑標記放射性核素99mTc 時，本發(fā)明放射性核素標記的RGD多肽藥物用于對integrin avp3陽性腫瘤進行單 光子斷層顯像診斷。當通過MAG2或N2S2或N3S等雙功能螯合劑標記放射性核 素188Re時，本發(fā)明放射性核素標記的RGD多肽藥物用于integrin (^|33陽性腫瘤 的放射靶向治療。
本發(fā)明的目的是通過如下技術方案實現(xiàn)
一種放射性核素標記的RGD多肽藥物，包括RGD多肽、雙功能螯合劑 (Chelator)和放射性核素(Nuclide),所述RGD多肽為RGD環(huán)肽二聚體，所 述RGD環(huán)肽二聚體是將連接劑L與RGD多肽單體連接，再將兩個連接有連接 劑L的RGD多肽單體二聚化而合成的RGD環(huán)肽二聚體，即E[L-c(RGDxK)]2， 所述放射性核素通過一個雙功能螯合劑標記所述RGD環(huán)肽二聚體，所述RGD 環(huán)肽二聚體與所述雙功能螯合劑之間還連接有藥代動力學修飾分子PKM;所述 放射性核素標記的RGD多肽藥物為Nuclide-Chelator-PKM-E[L-c(RGDxK)]2，所 述放射性核素標記的RGD多肽藥物為無色透明液體針劑。所述放射性核素為"mTc。 所述放射性核素為188Re。 所述連接劑L為PEG4或G3。
所述藥代動力學修飾分子PKM為G2或G3或G4或PEG4。 所述雙功能螯合劑為MAG2或N2S2或N3S。
一種放射性核素標記的RGD多肽藥物的制備方法，所述方法包括以下步驟
a、 L-c(RGDxK)的制備 (L-PEG4或G3)
將Boc(t-Butyl carbamate,叔丁氧羰基)保護的連接劑L溶于1 mL DMF(二甲 基甲酰胺)中，加入NHS (N-羥基琥珀酰亞胺,也為HOSu)和DCC(二環(huán)己基碳二 亞胺)，室溫下攪拌反應2小時；將c(RGDxK)加入到上述反應液中，用DIEA(N,N-二異丙基乙胺)將pH調節(jié)到8.0-8.5，室溫攪拌過夜；向反應液中加入3 mL 0.5 M NH4OAc緩沖溶液(pH = 7.0)并過濾，濾液經(jīng)Zorbax C18半制備柱HPLC分離純 化，收集目標物的餾分，合并收集液并凍干；獲得產(chǎn)物經(jīng)ESI-MS質譜分析確認 為預期產(chǎn)物Boc-L-c(RGDxK);將Boc-L-c(RGDxK)加入到3.0 mL TFA(三氟乙酸) 中，室溫反應30分鐘；旋蒸去除TFA，殘留物溶于2mL0.5MNH4OAc緩沖溶 液(pH = 7.0)，經(jīng)Zorbax C18半制備柱HPLC方法分離純化，收集目標物的餾分， 合并收集液并凍干；獲得產(chǎn)品經(jīng)ESI-MS質譜分析確認為預期產(chǎn)物L-c(RGDxK);
b、 E[L-c(RGDxK)]2的制備
將Boc保護的谷氨酸(E)溶于5mLDMF，加入NHS和DCC，室溫攪拌10 小時；濾掉副產(chǎn)物DCU(二環(huán)己基脲)，濾液真空蒸干得到粗產(chǎn)物；用3 mL CH2C12 溶解粗產(chǎn)物，濾掉不溶物，濾液濃縮至l mL左右；緩慢逐滴加入到30 mL乙 醚中，析出白色沉淀，過濾并真空干燥得到產(chǎn)品；獲得產(chǎn)物經(jīng)NMR核磁譜 分析確認為預期產(chǎn)物Boc-E(OSu)2;將Boc-E(OSu)2溶于無水1 mL DMF中，加 入L-c(RGDxK);使用DIEA調節(jié)pH值至8.0-9.0，室溫攪拌過夜，經(jīng)Zorbax C18 半制備柱HPLC分離純化，合并收集液并凍干，獲得產(chǎn)物經(jīng)ESI-MS質譜分析確 認為預期產(chǎn)物Boc-E[L-c(RGDxK)]2;用無水TFA浸泡Boc-E[L-c(RGDxK)]25分 鐘，去除Boc-保護基團；粗產(chǎn)品經(jīng)Zorbax C18半制備柱HPLC分離純化，合并 收集液并凍干，得到產(chǎn)品經(jīng)ESI-MS質譜分析確認為預期產(chǎn)物E[L-c(RGDxK)]2;
c、 PKM-E[L-c(RGDxK)]2的制備 (PKM = G2或G3或G4或PEG4)
將Boc-PKM-OSu和E[L-c(RGDxK)]2溶于2 mL DMF和H20的混合液 (l:l=v:v)，使用O.l NNaOH調節(jié)pH值至8.0-9.0，室溫攪拌過夜；將反應液真
7空蒸千，得到粗產(chǎn)品并將之溶于2mLTFA，將溶液在室溫下攪拌15分鐘；產(chǎn)品 經(jīng)ZorbaxC18半制備柱HPLC分離純化，收集目標物的餾分，合并收集液并凍 干，獲得產(chǎn)物經(jīng)ESI-MS質譜分析確認為預期產(chǎn)品PKM-E[L-c(RGDxK)]2;
d、 Chelator-PKM-E[L-c(RGDxK)]2的制備(Chelator =MAG2或N2S2或N3S)
將Chelator和PKM-E[L-c(RGDxK)]2溶于1 mL DMF(二甲基甲酰胺)中，用 D正A(N,N-二異丙基乙胺)將pH調節(jié)到8.5-9.0，室溫攪拌過夜；產(chǎn)品經(jīng)Zorbax C18半制備柱HPLC分離純化，收集目標物的餾分，合并收集液并凍千；
e、 Nuclide畫Chelator-PKM-E[L畫c(RGDxK)]2的制備(Nuclide =99mTc或188Re)
配置lmL含40 mg葡庚糖，25-50 (ig Chelator-PKM-E[L-c(RGDxK)]2偶聯(lián)物 和50嗎SnCl2的PB (pH = 7.4)緩沖溶液于10 mL西林瓶中，然后加入10-50 (iL 放射性核素99mTc或188Re (20-50 mCi)， 10(TC水浴加熱西林瓶，反應20-25分鐘， 反應結束后室溫冷卻10分鐘，制成放射性核素標記的RGD多肽藥物 Nuclide-Chelator-PKM-E[L-c(RGDxK)]2。
所述HPLC方法為使用LabAlliance HPLC系統(tǒng)配備Zorbax C18半制備柱， 梯度淋洗36分鐘，流速2.5 mL/min，其中流動相A為25 mM NH4OAc， B為乙 睛；淋洗梯度設定為起始時90。/。A和10%B， 5分鐘時85。/。A和15°/。B， 30分 鐘時65% A和35% B， 32-36分鐘時50% A和50% B。
本發(fā)明的有益效果
1、 在本發(fā)明放射性核素標記的RGD多肽藥物，首先將三個甘氨酸分子(G3) 或四個聚乙二醇分子(PEG4)與RGD多肽單體連接，然后再將此二聚化，即合成 E[Grc(RGDxK)]2或E[PEG4-c(RGDxK)]2，這樣兩個RGD模序之間的距離就從6 個鍵增加到26個鍵或38個鍵，使二聚體分子中的兩個RGD模序之間距離足夠 長以使其能同時與細胞表面表達的相鄰的integrinctvp3受體相結合，即以雙價形 式與integrinoM33結合，這樣會進一步增強結合親和力以及腫瘤對藥物的攝取， 達到更好的診治效果。
2、 本發(fā)明不僅在兩個RGD模序之間引入G3和PEG4，同時在RGD多肽分 子與雙功能螯合劑之間引入藥代動力學修飾分子PKM ，即 Chelator-PKM-E[L-c(RGDxK)]2，以進-一步改善藥代動力學性質，特別是從非腫 瘤組織的清除動力學。
3、 本發(fā)明中使用MAG2或N2S2或N3S等化合物作為雙功能螯合劑，標記放射性核素99mTc用于單光子斷層顯像，標記放射性核素188Re用于腫瘤的放射 耙向治療。
以下結合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步說明。


圖1為結構改造前RGD環(huán)肽二聚體與integrin av|33受體結合示意圖； 圖2為結構改造后RGD環(huán)肽二聚體與integrin avp3受體結合示意圖； 圖3為RGD環(huán)肽二聚體及其"mTc標記物結構示意圖； 圖4為不同RGD多肽體外受體競爭結合分析；
圖5為99mTc標記的不同RGD多肽于注射后不同時間在神經(jīng)膠質瘤攝取的對比； 圖6為注射99raTc-MAG2-3PEG4-dimer后30 min神經(jīng)膠質瘤動物模型的y顯像圖。
具體實施例方式
本發(fā)明實施例中所采用的材料Dicyclcohexylcarbodiimide (DCC， N，N'-二 環(huán)己基碳二亞胺)，N-hydroxysuccinimide (NHS ， N-羥基琥珀酰亞胺)， N,N-Diisopropylethylamine (DIEA， N,N-二異丙基乙胺)，N,N-Dimethylform amide (DMF， N，N-二甲基甲酰胺)，Trifluoroacetic a'cid (TFA，三氟乙酸)、MAG2 (S-Acetyl-Mercaptocacetyl-glycyl-glycine，硫代乙酰-甘氨酸-甘氨酸)、N2S2、 N3S 購自美國Sigma-Aldrich公司。環(huán)化RGD多肽單體c(RGDfK)]2購自美國Peptide International, Inc.公司。Na99mTc04洗脫液購自北京原子高科股份有限公司。188Re 核素購自美國PerkinElmer公司。 實施例1:
本實施例以放射性核素99mTc標記的RGD多肽藥物 99mTc-MAG2-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2 (簡稱99mTc-MAG2-3PEG4-dimer)及其制備 方法為例。
在"，c-MAG2-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2中，RGD環(huán)肽二聚體是將連接劑 PEG4與RGD多肽單體c(RGDfK)連接，再將兩個連接有PEG4的RGD多肽單體 二聚化而合成的RGD環(huán)肽二聚體，即E[PEG4-c(RGDfK)]2，放射性核素99mTc 通過一個雙功能螯合劑MAG2標記所述RGD環(huán)肽二聚體，所述RGD環(huán)肽二聚 體與所述雙功能螯合劑之間還連接有藥代動力學修飾分子PEG4，所述放射性核 素標記的RGD多肽藥物為無色透明液體針劑。
該藥物首先將四個聚乙二醇分子(PEG4， PEG = Polyethylene glycol)與RGD
9單體連接，然后再將此二聚化合成新型RGD環(huán)肽二聚體E[L-c(RGDxK)]2，使二 聚體分子中的兩個RGD模序之間距離足夠長以使其能同時與細胞表面表達的相 鄰的integrin av(33受體相結合(參見圖2)，即以雙價形式與integrin av|33結合， 與現(xiàn)有技術RGD環(huán)肽二聚體E[c(RGDxK)]2的兩個RGD模序很難同時與細胞表 面相鄰的兩個的integrin av(33受體結合(參見圖l)相比，新型RGD環(huán)肽二聚體 E[L-c(RGDxK)]2兩個RGD模序(motif)能同時與細胞表面的integrin 0^3相結合 具有更重要的作用，進一步增強了結合親和力以及腫瘤對藥物的攝取，達到更 好的診治效果。
該藥物通過MAG2作為雙功能螯合劑將放射性核素99mTc標記到新型RGD 環(huán)肽二聚體分子上，在體內標記藥物通過RGD多肽的耙向作用濃聚到腫瘤部位， 利用核醫(yī)學的單光子斷層顯像技術對integrin avp3陽性腫瘤進行顯像診斷。 99mTc-MAG2-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2制備方法如下 預先配備Zorbax C18半制備柱，HPLC方法一使用LabAlliance HPLC 系統(tǒng)，配備Zorbax C18半制備柱(9.4 mm x 250 mm, 100 A pore size),梯度淋洗 36分鐘，流速2.5 mL/min，其中流動相A為25 mM NH4OAc (pH 5.0)， B為乙 腈。淋洗梯度設定為起始時90。/。A和10%B， 5分鐘時85。/oA和15%B， 30分 鐘時65% A和35% B，. 32-36分鐘時50% A和50% B。
PEG4-c(RGDfK)的制備將Boc(t-Butyl carbamate,叔丁氧羰基)保護的 PEG4-OH溶于1 mL DMF(二甲基甲酰胺)中，加入NHS (N-羥基琥珀酰亞胺,也為 HOSu) (3.5 mg, 0.03 mmol)和DCC(二環(huán)己基碳二亞胺)(6.2 mg, 0.03 mmol)，室溫 下攪拌反應2小時。將c(RGDfK) (26.3 mg, 0.02 mmol)加入到以上反應液中，用 DIEA(N，N-二異丙基乙胺)將pH調節(jié)到8.0-8.5，室溫攪拌過夜。向反應液中加入 3 mL 0.5 M NH4OAc緩沖溶液(pH = 7.0)并過濾，濾液經(jīng)Zorbax CI8半制備柱 (HPLC方法一)分離純化，收集保留時間約為14分鐘的餾分，合并收集液并凍 干。獲得產(chǎn)品Boc-PEG4-c(RGDfK)約7.5 mg 。 ESI-MS質譜分析結果為 m/z=1665([M+H]+)， [C75H117N20O23]+理論值為1665.85。
將上述所得Boc-PEG4-c(RGDfK) (10 mg, 6 mol)加入到3.0 mL TFA (三氟乙 酸)中，室溫反應30分鐘。旋蒸去除TFA，殘留物溶于2mL0.5MNH4OAc緩 沖溶液(pH^7.0),經(jīng)Zorbax C18半制備柱(HPLC方法一)分離純化，收集保留時 間約為14分鐘的餾分，合并收集液并凍干。獲得產(chǎn)品PEG4-c(RGDfK)約7.0 mg。
10ESI-MS質譜分析結果為m/z=1565.2([M+H]+)， [C7QH1()9N2()021]+理論值為 1565.80。
E[PEG4-c(RGDfK)]2的制備將Boc-保護的谷氨酸(E) (0.247 g, 1.0 mmol)溶 于5mLDMF，加入NHS (0.253 g, 2.2 mmol)禾B DCC (0.453 g， 2.2 mmol)，室溫 攪拌10小時。濾掉副產(chǎn)物DCU(二環(huán)己基脲)，濾液真空蒸干得到粗產(chǎn)物。用3 mLCH2Cl2溶解粗產(chǎn)物，濾掉不溶物，濾液濃縮至lmL左右。緩慢逐滴加入到 30mL乙醚中，析出白色沉淀，真空干燥得到產(chǎn)品0.27§。獲得產(chǎn)物經(jīng)'HNMR 核磁譜分析確認為預期產(chǎn)物Boc-E(OSu》。
將上述所得Boc-E(OSu)2(4.4 mg， 0.01 mmol)溶于無水1 mL DMF中，加入 PEG4-c(RGDfK) (5,28 mg, 0.03 mmol)。使用DIEA調節(jié)pH值至8.0-9.0，室溫攪 拌過夜，經(jīng)ZorbaxC18半制備柱(HPLC方法一)分離純化，合并收集液并凍干， 得到15 mg白色粉末。經(jīng)ESI-MS質譜分析確認為預期產(chǎn)物 Boc-E[PEG4-c(RGDfK)]2 。 ESI-MS質譜分析結果為m/z=1913.13([M+H]+)， [C86H138N21028]+理論值為1912.99。
用無水TFA浸泡上述產(chǎn)物Boc-E[PEG4-c(RGDfK)]2 5分鐘，去除Boc-保護 基團。粗產(chǎn)品經(jīng)Zorbax C18半制備柱(HPLC方法一)分離純化，合并收集液并 凍干，得到產(chǎn)品經(jīng)ESI-MS質譜分析確認為預期產(chǎn)物E[PEG4-c(RGDfK)]2 。 ESI-MS 質譜分析結果為m/z^813.0([M+H]+)， [C81H13GN21026]+理論值為1812.99。
PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2的制備將Boc-PEG4-OSu(5.1mg， lliumol)和 E[PEG4-c(RGDfK)]2(5 mg, 2.76 nmol)溶于2 mL DMF和H20的混合液(1 :l=v:v)， 使用0.1 N NaOH調節(jié)pH值至8.0-9.0，室溫攪拌過夜。然后反應液真空蒸干， 得到粗產(chǎn)品，溶于2mLTFA，將溶液在室溫下攪拌15分鐘。產(chǎn)品經(jīng)ZorbaxC18 半制備柱(HPLC方法一)分離純化，收集保留時間為16.4分鐘時的餾分，合并收 集液并凍干。獲得預期產(chǎn)品PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]J々2.4 mg，純度大于95%。 ESI-MS質譜分析結果為m/z=2061.46([M+H]+)， [C92H151N22031]+理論值為 2061.1。
MAGrPEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2 (簡稱MAG2-3PEG4-dimer)的制備將 MAGrOSu (4 mg, 9.7 一mol)和PEG4-E[PEG4-c(RGDfk)]2 (5 mg， 2.43 |iimol)溶于 2mLDMF(二甲基甲酰胺)和H20的混合液(l:l=v:v)，用D正A(N,N-二異丙基乙 胺)將pH調節(jié)到8.5-9.0，室溫攪拌過夜；反應液經(jīng)Zorbax CI8半制備柱HPLC(方
11法一)分離純化，收集保留時間為19.5分鐘時的餾分，合并收集液并凍干，得到
產(chǎn)物4.0mg (產(chǎn)率為33%)。 ESI-MS質譜分析結果m/z^ 176.95 ([M+2H]+/2)， [C105H164N24O35S]2+/2理論值為1177。
99mTc-MAG2-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2 (""nt-MAG2-3PEG4-dimer)的制備 配置lmL含40 mg葡庚糖，25-50 jig MAG2-PKM-E[L-c(RGDxK)]2偶聯(lián)物和50嗎 SnCl2的PB (pH = 7.4)緩沖溶液于10 mL西林瓶中，然后加入10-50 放射性 核素99mTc (20-50 mCi)， IO(TC水浴加熱西林瓶，反應20-25分鐘，反應結束后 室溫冷卻10分鐘，制成放射性核素標記的RGD多肽藥物 99mTc-MAG2-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2 (99mTc-MAG2-3PEG4-dimer)。
本發(fā)明的放射性核素標記的RGD多肽藥物中，當連接劑L為G3、藥代動 力學修飾分子PKM為G3時，本發(fā)明藥物為99mTc-MAG2-GrE[Grc(RGDfK)]2 (99mTc-MAG2-3G3-dimer)，其制備方法同實施例1。藥代動力學修飾分子PKM也
可以是G2或G4。
本發(fā)明的放射性核素標記的RGD多肽藥物中，當雙功能螯合劑為N2SJf， 本發(fā)明藥物可以是99mTc-N2S2-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2 (99mTc-N2S2-3PEG4-dimer) 或99mTc- N2S2-GrE[G3-c(RGDfK)]2(99mTc-N2S2-3Grdimer)，其制備方法同實施例 1。藥代動力學修飾分子PKM也可以是G2或G4。
本發(fā)明的放射性核素標記的RGD多肽藥物中，當雙功能螯合劑為N3S時， 本發(fā)明藥物可以是99mTc-N3S-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2 (99mTc-N3S-3PEG4-dimer) 或"mTc-N3S-G3-E[G3-c(RGDfK)]2("，c-N3S-3Grdimer)，其制備方法同實施例1。 藥代動力學修飾分子PKM也可以是02或G4
參見圖3，圖3為RGD環(huán)肽二聚體及其"nt標記物結構示意圖。
對依據(jù)本發(fā)明方法制備的放射性核素標記的RGD多肽藥物 99mTc-MAG2-3PEG4-dimer取樣進行放射性HPLC分析(HPLC方法二使用 LabAllianceHPLC系統(tǒng)，配備放射性在線檢測器和Zorbax C18分析柱(4.6 mm x250mm， 300 Aporesize)，梯度淋洗30分鐘，流速1.0mL/min，其中流動相A 為25mMNH40Ac(pH5.0)， B為乙腈。淋洗梯度設定為起始至2分鐘時90% A 和10% B， 5分鐘時85% A和15% B， 15分鐘時80% A和20% B， 20-25分鐘 時50°/0 A禾B 50% B， 26-30回到基線梯度90% A和10% B淋洗)， 99mTc-MAG2-3PEG4-dimer的標記率>95%，經(jīng)Sep-Pak C18柱純化后放射化學純 度>98%。MAG2-3PEG4-dimer與integrin avp3結合親和力測定高表達integrin av|33的 U87MG人神經(jīng)膠質瘤細胞作為實驗樣本，使用"I-c(RGDyK)作為integrin avp3 受體特異性結合的放射性配基，采用競爭結合實驗測定MAG2-3PEG4-dimer的 IC50值(半抑制濃度)，并設 c(RGDyK) 、 MAG2-PEG4-c(RGDfK) (MAG2-PEG4-monomer)、 MAG2-GrE[G3-c(RGDfK)]2(MAG2-3Grdimer)、 HYNIC隱 PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2 (HYNIC-3PEG4-dimer)和PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2 (3PEG4-dimer)為對照。實驗結果顯示，c(RGDyK)、 MAG2-PEG4-monomer、 HYNIC-3PEG4-dimer、 MAG2-3PEG4-dimer、 MAG2-3G3-dimer和3PEG4-dimer競 爭'25l-c(RGDyK)與U87MG細胞結合的IC5o值分別為50.6 士 5.5 nM， 23.5 ±3.5 nM， 4.1士2.8nM， 3.9士l,2nM， 3.7士1.3nM禾口 4.6 ± 2.1 nM (如圖4所示)，表 明MAG2-3PEG4-dimer、 MAG2-3Grdimer與integrin av(33的親和力明顯好于其 RGD多肽單體和現(xiàn)有二聚體(7.5 ± 2.3 nM)，說明改造后的RGD環(huán)肽二聚體能 以雙價形式與integrin av(33結合。
99mTc-MAG2-3PEG4-dime在荷瘤裸鼠生物分布將荷U87MG人神經(jīng)膠質 瘤BALB/c裸鼠隨機分成若干組，每組4只。各組實驗裸鼠分別經(jīng)尾靜脈注射 100 (-74kBq)不同的99mTc標記的RGD多肽，于注射后0.5小時，1.0小時和 2.0小時按組分別處死實驗裸鼠，取血及主要臟器，稱重并測量放射性計數(shù)，經(jīng) 衰變校正后計算每克組織百分注射劑量率(。/。ID/g)。在U87MG人神經(jīng)膠質瘤動 物模型中，腫瘤對99mTc-MAG2-3PEG4-dimer和99mTc-MAG2-3Grdimer的攝取 明顯高于腫瘤對99mTc-HYNIC-dimer的攝取(圖5)，注射后1 h腫瘤對 99mTc-MAG2-3PEG4-dimer禾卩99mTc-MAG2-3G3-dimer的攝取為腫瘤對 ""^c-HYNIC-dimer攝取的兩倍，這與體外受體親和力實驗結果相一致，充分說 明99mTc-MAGr3PEG4-dimer、99mTc-MAG2-3Grdimer是以雙價形式與integrin av(33 結合，而99mTc-HYNIC-dimer是以單價形式與integrin av(33結合。圖6為荷U87MG 人神經(jīng)膠質瘤裸鼠注射"mTc-MAG;r3PEG4-dimer后30 min的y顯像圖，注射后 30 min腫瘤清晰可見，除腎臟以外全身放射性本底較低(標記藥物主要經(jīng)腎臟排 泄)，更利于腫瘤的顯像診斷。 實施例2:
本實施例以放射性核素188Re標記的RGD多肽藥物 鵬Re-]VlAG3-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2(簡稱'88Re -MAGr3PEG4-dimer)為例。
13在188Re -MAG2-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2中，RGD環(huán)肽二聚體是將連接劑 PEG4與RGD多肽單體c(RGDfK)連接，再將兩個連接有PEG4的RGD多肽單體 二聚化而合成的RGD環(huán)肽二聚體，即E[PEG4-c(RGDfK)]2，放射性核素188Re 通過一個雙功能螯合劑MAG2標記所述RGD環(huán)肽二聚體，所述RGD環(huán)肽二聚 體與所述雙功能螯合劑之間還連接有藥代動力學修飾分子PEG4，所述放射性核 素標記的RGD多肽藥物為無色透明液體針劑。
本實施例的放射性核素標記的RGD多肽藥物為188Re -MAG2-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2，該藥物通過雙功能螯合劑MAG2將放射性核 素188Re標記到新型RGD環(huán)肽二聚體分子上，在體內標記藥物通過RGD多肽的 靶向作用濃聚到腫瘤部位。本實施例中的放射性核素標記的RGD多肽藥物用于 integrin avp3陽性腫瘤的放射靶向治療。
本實施例的放射性核素標記的RGD多肽藥物制備方法同實施例1。 本發(fā)明的放射性核素標記的RGD多肽藥物中，當連接劑L為G3、藥代動 力學修飾分子PKM為G3時，本發(fā)明藥物為188Re-MAG2-GrE[Grc(RGDfK)]2 (l88Re-MAG2-3Grdimer)，其制備方法同實施例1。藥代動力學修飾分子PKM也
可以是G2或G4。
本發(fā)明的放射性核素標記的RGD多肽藥物中，當雙功能螯合劑為N2S2時， 本發(fā)明藥物可以是188Re-N2S2-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2 (188Re-N2S2-3PEG4-dimer) 或188Re- N2S2-GrE[Grc(RGDfK)]2 (188Re-N2Sr3Grdimer)，其制備方法同實施例 1。藥代動力學修飾分子PKM也可以是G2或G4。
本發(fā)明的放射性核素標記的RGD多肽藥物中，當雙功能螯合劑為N3S時， 本發(fā)明藥物可以是188Re-N3S-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2 (188Re-N3S-3PEG4-dimer) 或188Re-N3S-G3-E[G3-c(RGDfK)]2(188Re-N3S-3Grdimer)，其制備方法同實施例1。 藥代動力學修飾分子PKM也可以是02或G4。
權利要求
1、一種放射性核素標記的RGD多肽藥物，包括RGD多肽、雙功能螯合劑(Chelator)和放射性核素(Nuclide)，其特征在于所述RGD多肽為RGD環(huán)肽二聚體，所述RGD環(huán)肽二聚體是將連接劑L與RGD多肽單體連接，再將兩個連接有連接劑L的RGD多肽單體二聚化而合成的RGD環(huán)肽二聚體，即E[L-c(RGDxK)]2，所述放射性核素通過一個雙功能螯合劑標記所述RGD環(huán)肽二聚體，所述RGD環(huán)肽二聚體與所述雙功能螯合劑之間還連接有藥代動力學修飾分子PKM；所述放射性核素標記的RGD多肽藥物為Nuclide-Chelator-PKM-E[L-c(RGDxK)]2，所述放射性核素標記的RGD多肽藥物為無色透明液體針劑。
2、 根據(jù)權利要求1所述的放射性核素標記的RGD多肽藥物，其特征在于 所述放射性核素為99mTc。
3、 根據(jù)權利要求1所述的放射性核素標記的RGD多肽藥物，其特征在于 所述放射性核素為188Re。
4、 根據(jù)權利要求2或3所述的放射性核素標記的RGD多肽藥物，其特征 在于所述連接劑L為PEG4或G3。
5、 根據(jù)權利要求2或3所述的放射性核素標記的RGD多肽藥物，其特征 在于所述藥代動力學修飾分子PKM為G2或G3或G4或PEG4。
6、 根據(jù)權利要求2或3所述的放射性核素標記的RGD多肽藥物，其特征在于所述雙功能螯合劑為MAG2或N2S2或N3S。
7、 一種權利要求1所述的放射性核素標記的RGD多肽藥物的制備方法，其特征在于所述方法包括以下步驟a、 L-c(RGDxK)的制備 (L:PEG4或G3)將Boc(t-Butyl carbamate,叔丁氧羰基)保護的連接劑L溶于1 mL DMF(二甲 基甲酰胺)中，加入NHS (N-羥基琥珀酰亞胺,也為HOSu)和DCC (二環(huán)己基碳二 亞胺)，室溫下攪拌反應2小時；將c(RGDxK)加入到上述反應液中，用 DIEA(N,N-二異丙基乙胺)將pH調節(jié)到8.0-8.5，室溫攪拌過夜；向反應液中加 入3 mL 0.5 M NH4OAc緩沖溶液(pH = 7.0)并過濾，濾液經(jīng)Zorbax C18半制備柱 HPLC分離純化，收集目標物的餾分，合并收集液并凍干；獲得產(chǎn)物經(jīng)ESI-MS 質譜分析確認為預期產(chǎn)物Boc-L-c(RGDxK);將Boc-L-c(RGDxK)加入到3.0 mL TFA(三氟乙酸)中，室溫反應30分鐘；旋蒸去除TFA，殘留物溶于2mL0.5MNH4OAc緩沖溶液(pH = 7.0)，經(jīng)ZorbaxC18半制備柱HPLC方法分離純化，收 集目標物的餾分，合并收集液并凍干；獲得產(chǎn)品經(jīng)ESI-MS質譜分析確認為預期 產(chǎn)物L-c(RGDxK);b、 E[L-c(RGDxK)]2的制備將Boc保護的谷氨酸(E)溶于5 mLDMF，加入NHS和DCC，室溫攪拌10 小時；濾掉副產(chǎn)物DCU(二環(huán)己基脲)，濾液真空蒸干得到粗產(chǎn)物；用3 mL CH2C12 溶解粗產(chǎn)物，濾掉不溶物，濾液濃縮至l mL左右；緩慢逐滴加入到30mL乙 醚中，析出白色沉淀，過濾并真空干燥得到產(chǎn)品；獲得產(chǎn)物經(jīng)〗H NMR核磁譜 分析確認為預期產(chǎn)物Boc-E(OSu)2;將Boc-E(OSu)2溶于無水1 mLDMF中，加 入L-c(RGDxK);使用DIEA調節(jié)pH值至8.0-9.0，室溫攪拌過夜，經(jīng)Zorbax C18 半制備柱HPLC分離純化，合并收集液并凍干，獲得產(chǎn)物經(jīng)ESI-MS質譜分析確 認為預期產(chǎn)物Boc-E[L-c(RGDxK)]2;用無水TFA浸泡Boc-E[L-c(RGDxK)]2 5 分鐘，去除Boc-保護基團；粗產(chǎn)品經(jīng)ZorbaxC18半制備柱HPLC分離純化，合 并收集液并凍干，得到產(chǎn)品經(jīng)ESI-MS質譜分析確認為預期產(chǎn)物 E[L-c(RGDxK)]2;c、 PKM-E[L-c(RGDxK)]2的制備 (PKM = G2或G3或G4或PEG4)將Boc-PKM-OSu禾B E[L-c(RGDxK)]2溶于2 mL DMF和H20的混合液 (l:l=v:v)，使用0.1 NNaOH調節(jié)pH值至8.0-9.0，室溫攪拌過夜；將反應液真 空蒸干，得到粗產(chǎn)品并將之溶于2 mL TFA，將溶液在室溫下攪拌15分鐘；產(chǎn) 品經(jīng)Zorbax C18半制備柱HPLC分離純化，收集目標物的餾分，合并收集液并 凍干，獲得產(chǎn)物經(jīng)ESI-MS質譜分析確認為預期產(chǎn)品PKM-E[L-c(RGDxK)]2;d、 Chdator-PKM-E[L-c(RGDxK)]2的制備(Chelator =MAG2或N2S2或N3S)將Chelator和PKM-E[L-c(RGDxK)]2溶于1 mL DMF(二甲基甲酰胺)中，用 DIEA(N,N-二異丙基乙胺)將pH調節(jié)到8.5-9.0，室溫攪拌過夜；產(chǎn)品經(jīng)Zorbax C18半制備柱HPLC分離純化，收集目標物的餾分，合并收集液并凍干；e、 Nuclide-Chelator-PKM-E[L-c(RGDxK)]2的制備(Nuclide =99mTc或188Re)配置lmL含40 mg葡庚糖，25-50嗎Chelator-PKM-E[L-c(RGDxK)]2偶聯(lián)物 和50昭SnCl2的PB (pH = 7.4)緩沖溶液于10 mL西林瓶中，然后加入10-50 放射性核素Nuclide (20-50 mCi)， 10(TC水浴加熱西林瓶，反應20-25分鐘，反應結束后室溫冷卻10分鐘，制成放射性核素標記的RGD多肽藥物Nuclide-Chelator-PKM隱E[L-c(RGDxK)]2。
8、根據(jù)權利要求7所述的放射性核素標記的RGD多肽藥物的制備方法， 其特征在于所述HPLC方法為使用LabAlliance HPLC系統(tǒng)配備Zorbax C18半 制備柱，梯度淋洗36分鐘，流速2.5 mL/min，其中流動相A為25 mMNH4OAc， B為乙睛；淋洗梯度設定為起始時90。/。A和10%B， 5分鐘時85。/。A和15%B， 30分鐘時65% A和35% B， 32-36分鐘時50% A和50% B。
全文摘要
本發(fā)明涉及放射性核素標記的RGD多肽藥物及其制備方法，該藥物包括RGD多肽、雙功能螯合劑(Chelator)和放射性核素(Nuclide)，所述RGD多肽為RGD環(huán)肽二聚體，所述RGD環(huán)肽二聚體是將連接劑L與RGD多肽單體連接，再將兩個連接有連接劑L的RGD多肽單體二聚化而合成的RGD環(huán)肽二聚體，即E[L-c(RGDxK)]₂，所述放射性核素通過一個雙功能螯合劑標記所述RGD環(huán)肽二聚體，所述RGD環(huán)肽二聚體與所述雙功能螯合劑之間還連接有藥代動力學修飾分子PKM；所述放射性核素標記的RGD多肽藥物為Nuclide-Chelator-PKM-E[L-c(RGDxK)]₂，所述放射性核素標記的RGD多肽藥物為無色透明液體針劑。本發(fā)明用于integrin α_vβ₃陽性腫瘤的診斷和治療。
文檔編號A61K51/08GK101485891SQ200910077728
公開日2009年7月22日 申請日期2009年2月13日 優(yōu)先權日2009年2月13日
發(fā)明者史繼云, 凡 王, 兵 賈 申請人:北京大學