本發(fā)明屬于多肽藥物合成的技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種利拉魯肽的固相合成方法。

背景技術(shù)：

利拉魯肽，多肽序列為HAEGTFTSDVSSYLEGQAAK(E-pal)EFIAWLVRGRG，分子式為C172H265N43O51，分子量為3751.20Da。利拉魯肽是通過基因重組技術(shù)，利用酵母生產(chǎn)的人胰高糖素樣肽-1(GLP-1)類似物，具有降低血糖、減輕體重、促進胰島細胞再生以及心血管系統(tǒng)保護等多種效應，臨床應用前景廣闊。

現(xiàn)有的利拉魯肽合成方法多為固液合成法，且合成周期長，生產(chǎn)成本高，不利于利拉魯肽的大規(guī)模生產(chǎn)。US6268343B1和US6458924B2的合成方法中，中間體GLP-1(7-37)-OH均是在液相條件下與Nα-alkanoyl-Glu(ONSu)-OtBu反應，由此會導致產(chǎn)生許多雜質(zhì)，降低產(chǎn)品的純度和使用效果。

授權(quán)公告號CN 103145828 B一種利拉魯肽的全固相合成方法，以2-Cl-TrtResin為固相載體，以DIC/HOBt為縮合劑，經(jīng)過微波反應技術(shù)的處理，縮短了反應時間，提高了縮合效率。側(cè)鏈修飾采用新穎ivDde側(cè)鏈保護的賴氨酸，進行側(cè)鏈修飾合成，期間采用20％哌啶脫Fmoc保護，直至直鏈多肽合成完畢。其次采用水合肼脫ivDde保護后，進行側(cè)鏈修飾反應，得到的在固相載體上的全保護利拉魯肽通過三氟醋酸的處理得到利拉魯肽粗品。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種利拉魯肽的固相合成方法，該合成方法反應條件溫和、反應效率高、成本低、具有生產(chǎn)利拉魯肽粗肽產(chǎn)品的廣泛應用前景,以用于大規(guī)模生產(chǎn)利拉魯肽。

本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種利拉魯肽的固相合成方法，包括如下步驟：

(1)以2-Cl Resin為起始樹脂載體，通過固相合成法，并采用特異性微波技術(shù)反應，依次連接利拉魯肽序列中相對應的氨基酸，得到Fmoc-利拉魯肽Ⅰ-2-Cl-Resin如下：

Fmoc-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAK(Dde)EFIAWLVRGRG-2-Cl-Resin；

(2)脫除賴氨酸的側(cè)鏈保護基Dde，通過固相合成法，在賴氨酸側(cè)鏈偶聯(lián)Fmoc-Glu(OtBu)-OH，并在谷氨酸上連接棕櫚酸，得到利拉魯肽Ⅱ-2-Cl-Resin如下：

HAEGTFTSDVSSYLEGQAAK(E-pal)EFIAWLVRGRG-2-Cl-Resin；

(3)切割沉降、凍干后，得到利拉魯肽粗肽產(chǎn)品如下：

HAEGTFTSDVSSYLEGQAAK(E-pal)EFIAWLVRGRG；

步驟(1)所述氯樹脂優(yōu)選為2-Cl Resin；反應中以DIC/HOBt為縮合劑和活化試劑，以20％Pip/DMF溶液為脫保護試劑，進行多肽的連續(xù)縮合反應；所述特異性微波反應技術(shù)指在氨基酸的縮合反應步驟，縮合反應15min后，將Fmoc-利拉魯肽-2-Cl Resin使用特異性的微波合成反應20s。

步驟(1)中縮合的Fmoc-保護氨基酸為：Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Dde)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH，縮合反應中氨基酸投料量為1.5倍所投樹脂摩爾數(shù)，縮合反應溫度為25℃。

步驟(2)所述脫除賴氨酸的側(cè)鏈保護基Dde的脫除反應，脫除試劑為水合肼：DMF＝1:15體積比的混合溶液，反應液體積為反應器容積的1/3-1/2。

步驟(3)所述切割沉降反應，切割試劑為TFA：茴香硫醚：水：EDT：苯酚＝35：2：2：1：2摩爾比，切割液體積為反應器容積的1/2，樹脂切割兩次，將切割液分別吹入到冰乙醚中，離心沉淀去上清，重復操作3次得到利拉魯肽粗肽產(chǎn)品。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明采用Fmoc固相合成法，以2-Cl Resin為固相載體，以DIC/HOBt為縮合劑，采用特異性微波合成技術(shù)，提高了縮合效率。本發(fā)明大大縮短了反應時間，提高了產(chǎn)品的收率，具有可觀的經(jīng)濟適用價值和廣泛的應用前景。

具體實施方式

通過下述實施例將有助于理解本發(fā)明，但不能限制本發(fā)明的內(nèi)容。對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單替換或推演，都視為屬于本發(fā)明的保護范圍。

實施例一

利拉魯肽Ⅰ-2-Cl-Resin的合成

1、2-Cl Resin的溶脹

稱量取代度為0.64mmol/g的2-Cl Resin 1g，從開口端加入至多肽合成反應器中，取DCM試劑加入至反應器中，使樹脂完全浸沒在DCM溶劑中，與溶劑充分接觸，溶脹0.5h。

2、Fmoc-利拉魯肽Ⅰ-2-Cl-Resin的合成

Fmoc-利拉魯肽Ⅰ-2-Cl-Resin為：

Fmoc-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAK(Dde)EFIAWLVRGRG-2-Cl-Resin

本實施例使用的保護氨基酸從樹脂起算第1-31個氨基酸相對應的保護氨基酸及分子量如下表所示：

本發(fā)明中一些常用的縮寫具有以下含義：

Fmoc：芴甲氧羰基

DMF：N,N-二甲基甲酰胺

DCM：二氯甲烷

Pbf：2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰

Pip：六氫吡啶

TFA：三氟醋酸

tBu：叔丁基

DIC：N,N-二異丙基碳化二亞胺

DIEA：N,N-二異丙基乙胺

HOBt：1-羥基苯并三唑

(1)Fmoc-Gly-2-Cl-Resin的合成

稱取118.92mg Fmoc-Gly-OH和122mg HOBT放于10ml離心管中，加3ml DCM將其溶解，再用滴管向溶液中加DIEA活化20s，混合均勻。最后將混合液加到抽干的反應器中反應1h。

(2)Fmoc-Gly-2-Cl-Resin的封頭反應

配制甲醇：DIEA＝1:1(體積比)的混合液2ml，將其加入到抽干的反應器中，置于20-30r/min的搖床上搖20min。

(3)樹脂的洗滌方法

用真空泵將反應器中的脫保護溶液抽干，然后加入1/3-1/2反應器體積的DMF溶液，置于30r/min的脫色搖床上搖1min，抽干反應器中溶液再加入DMF洗滌，重復操作3次。

(4)脫除Fmoc保護基

加入1/3-1/2反應器體積的20％哌啶/DMF脫保護溶液到抽干的反應器中，置于30r/min的脫色搖床上搖晃反應20min。

(5)保護氨基酸的活化方法

以Fmoc-Arg(pbf)-Gly-2-Cl-Resin的縮合為例，稱取583.9mg Fmoc-Arg(pbf)-OH和122mg HOBT放于10ml離心管中，加入3ml DMF將其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均勻得到活化的保護氨基酸溶液。

(6)Fmoc-利拉魯肽Ⅰ-2-Cl-Resin的合成

將上述活化的保護氨基酸溶液加到抽干的反應器中，再將反應器置于25℃的恒溫震蕩器中反應20-30min，然后將反應器置于微波化學反應器中微波反應20s后洗滌。采用上述同樣方法，依次縮合第2-31個Fmoc-保護氨基酸，即得到Fmoc-利拉魯肽Ⅰ-2-Cl-Resin。

實施例二

利拉魯肽Ⅱ-2-Cl-Resin的合成

(1)連接Boc保護基

多肽連接至最后一個氨基酸縮合成功后，洗滌4次，將Boc酸酐(Mw＝218.25，ρ＝1.02g/cm3)按照第一個氨基酸投料量的三倍物質(zhì)的量計算體積，DIEA:DCM＝1:4溶液3ml，溶液混合均勻，加入到反應器中反應20min。

(2)脫除Dde保護基

Boc接上后用DMF洗4遍后脫Dde，按照水合肼：DMF＝1:15配置溶液，每次用三倍樹脂體積的混合溶液脫Dde，震蕩反應5min后用DMF洗滌3次，第3次水合肼溶液脫Dde后，DMF洗滌5次。

(3)側(cè)鏈氨基酸的連接

待脫Dde完成后，按固相氨基酸的縮合方法，連接側(cè)鏈氨基酸Fmoc-Glu(OtBu)-OH，并在谷氨酸上連接棕櫚酸，縮合成功后用DMF洗5次，抽干，得到利拉魯肽Ⅱ-2-Cl-Resin。

實施例三

利拉魯肽粗肽產(chǎn)品的切割沉降

(1)配置切割試劑

100ml配方為:87.5ml TFA+5ml茴香硫醚+5ml水+2.5ml EDT+5g苯酚，置于棕色試劑瓶中?，F(xiàn)配備用，配制量一般為1g樹脂加10ml切割試劑。

(2)利拉魯肽-2-Cl-Resin的切割

向抽干的反應器中加入切割試劑，置于脫色搖床上搖晃反應1h，速度20r/min。切割結(jié)束后，加入約35ml冰乙醚至50ml離心管中，將反應器中溶液經(jīng)砂芯過濾到冰乙醚中，蓋上離心管蓋子，上下震蕩離心管，混合均勻。將離心管放入離心機中，3000r/min，3min，離心棄上清，重復操作3次得到利拉魯肽粗肽產(chǎn)品。

實施例四

利拉魯肽粗肽產(chǎn)品的收率

切割沉降后的粗品呈乳膠狀態(tài)，其中含有較多的TFA鹽和切割試劑，本發(fā)明采用C18色譜柱進行除鹽，以便計算粗品得率。

將樣品溶解并過濾，采用流動相：A 0.1％乙酸/水，B 0.1％乙酸/乙腈，在214nm下按照如下程序進樣分析：

稱量凍干后的利拉魯肽粗肽產(chǎn)品，質(zhì)量為1075.3mg，經(jīng)分析計算，粗品純度為58.3％，粗品收率為85.8％，比現(xiàn)有技術(shù)僅60-70％的收率有大幅度提高。

以上內(nèi)容僅僅是對本發(fā)明所作的舉例和說明，所屬本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對所描述的具體實施例做各種各樣的修改或補充或采用類似的方式替代，只要不偏離發(fā)明或者超越本權(quán)利要求書所定義的范圍，均應屬于本發(fā)明的保護范圍。