一種制備利拉魯肽的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種合成利拉魯膚的方法，具體地設(shè)及利拉魯膚主鏈的化學(xué)合成方 法。 技術(shù)背景
[0002] 利拉魯膚（CAS:204656-20-2)是膜高糖素樣膚1 (GLP-I)的類(lèi)似物，它承擔(dān)著 GLP-I受體激動(dòng)劑的作用，它與GLP-I有97%的相似性，用于2型糖尿病人控制血糖，適用于 單用二甲雙脈或橫脈類(lèi)藥物最大可耐受劑量治療后血糖仍控制不佳的患者，由諾和諾德公 司研制，2009年在歐盟首次上市，2011年在中國(guó)獲準(zhǔn)上市。它的序列為：L-Histicbd-L-Al anyl-L-曰-Glutamylglycyl-L-Threonyl-L-Phenylalanyl-L-Threonyl-L-Seryl-L-曰-As partyI-L-ValyI-L-SeryI-L-SeryI-L-TyrosyI-L-LeucyI-L-口 -Glutamylglycyl-L-Gluta minyl-L-Alanyl-L-Alanyl-N6-陽(yáng)-(1-Oxohexadecyl) -L-y-Glutamyl] -L-Lysyl-L- 口-Gl utamyI-L-Phenylalanyl-L-Isoleucyl-L-Alanyl-L-Tryptophyl-L-Leucyl-L-Valyl-L-Ar ginylglycyl-L-Arginyl-Glycine。
[0003] 諾和諾德的工藝采用是生物和化學(xué)相結(jié)合的方法生產(chǎn)利拉魯膚，其中用生物發(fā)酵 法合成主鏈膚，主鏈經(jīng)過(guò)純化后與側(cè)鏈進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)后得到利拉魯膚，由于生物發(fā)酵工藝 不適用于大工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)，所W利拉魯膚主鏈的化學(xué)合成方法就顯得尤為重要。
[0004] 該多膚的主鏈有31個(gè)殘基，與GLP-I的序列相比，僅有的區(qū)別是34Lys變?yōu)?4ArgD 由于GLP-I被稱(chēng)為GLP-I(7-37)，所W目前利拉魯膚的主鏈也是從7-37來(lái)進(jìn)行編號(hào)，由于 其主鏈跟GLP-I只有一個(gè)氨基酸的區(qū)別，所W可W命名為34ArgGLP-I(7-37)，其序列為H2N-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-L yS-Glu-Phe-Ile-Ala-T;rp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-COOH除 了在主鏈上有一個(gè)殘基的區(qū) 另IJ外，在26Lys的側(cè)鏈上有一個(gè)棟桐酸和Glu的二膚，正是有了運(yùn)個(gè)結(jié)構(gòu)，才使得改造后的結(jié) 構(gòu)人體內(nèi)的穩(wěn)定性大大增加。
[0005] 目前所報(bào)道的專(zhuān)利合成利拉魯膚合成方法包括兩種，一種是將主鏈膚 34ArgGLP-I(7-37)合成好，然后在側(cè)鏈Lys26上偶聯(lián)Glu及棟桐酸，例如US6268343B1、 US6458924B2就是采用的運(yùn)種方式，34ArgGLP-I(7-37)的合成有基因重組和固相偶聯(lián)兩種 方法，其中固相方法采用普通的保護(hù)氨基酸，偶聯(lián)完成之后，將多膚從樹(shù)脂上切割下來(lái)，就 可W得到34ArgGLP-I(7-37)。由于該序列上有很多的疏水性氨基酸，導(dǎo)致在固相合成過(guò)程 中容易形成0折疊而使得偶聯(lián)尤其困難，很多氨基酸需要多次重復(fù)偶聯(lián)，既不經(jīng)濟(jì)也容易 產(chǎn)生大量難去除的雜質(zhì)。另外一種方法是在樹(shù)脂上將整個(gè)利拉魯膚的序列合成完，再將其 從樹(shù)脂上切割下來(lái)就可W得到產(chǎn)品，例如CN102286092A介紹的是Alloc保護(hù)Lys側(cè)鏈的方 法，在固相上將Alloc脫除然后偶聯(lián)Glu和棟桐酸；CN102875665A仍然是WAlloc作為保 護(hù)基團(tuán)，采用片段縮合的方法合成整條膚鏈；CN103275208A采用普通二膚片段取代單個(gè) 氨基酸來(lái)進(jìn)行縮合，Lys的側(cè)鏈采用ivDde保護(hù)的策略；由于運(yùn)些方法都沒(méi)有采用方法避免 產(chǎn)品合成過(guò)程中的縮聚問(wèn)題，而且在整個(gè)合成中還要包括側(cè)鏈的鏈接，所W仍然存在合成 困難的問(wèn)題需要提高偶聯(lián)時(shí)間并增加偶聯(lián)次數(shù)，由此引起收率低，雜質(zhì)多的狀況，目前的運(yùn) 些手段對(duì)于解決縮聚的作用有限，化學(xué)合成利拉魯膚的想法仍然比較難W實(shí)現(xiàn)。
[0006] 0折疊（0-sheet)是多膚合成中常見(jiàn)的問(wèn)題，多膚鏈上的幾基氧和膚鏈上的酷 胺氨相互締合形成氨鍵，從P折疊結(jié)構(gòu)上可W看出沿著膚鏈延伸的方向主鏈兩側(cè)存在大 量的氨鍵(結(jié)構(gòu)1)。它們可W使膚鏈之間緊緊地聚集（aggregation)在一起，造成樹(shù)脂縮 聚，樹(shù)脂縮聚引起的后果就是偶聯(lián)困難，偶聯(lián)不完全，雜質(zhì)增多，消旋成倍增加。對(duì)于疏水氨 基酸較多，序列比較長(zhǎng)的多膚來(lái)說(shuō)，縮聚尤為嚴(yán)重，影響了高純度多膚的合成。
[0007] 對(duì)于利拉魯膚來(lái)說(shuō)，其序列中含有大量的疏水性氨基酸例如 Ala,Val,Phe,Trp,Ile等，運(yùn)些氨基酸的存在使得利拉魯膚從合成的中端就開(kāi)始面臨著嚴(yán) 重的縮聚問(wèn)題。
[0008] 目前打破0折疊并避免縮聚最常用的思路是將膚鏈酷胺上的氨用其他官能團(tuán)取 代，從而打破氨鍵締合，由于膚鏈上的運(yùn)種氨鍵被打破，就能很好的避免0折疊從而減少 縮聚，該官能團(tuán)在最終的多膚切割過(guò)程中可W-起除去，而不會(huì)影響產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)。
[0009] CN103288951A選用的是偽脯氨酸二膚作為原料來(lái)合成多膚W避免縮聚，但是由于 偽脯氨酸二膚的價(jià)格很高，在工業(yè)上很難大量使用，同時(shí)其側(cè)鏈連接也是在固相上完成，運(yùn) 就使得最終很難得到高純度的純品多膚。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本專(zhuān)利的發(fā)明方法主要是為了解決多膚鏈縮聚嚴(yán)重引起副反應(yīng)眾多的問(wèn)題。通過(guò) 運(yùn)種方法可W解決利拉魯膚合成過(guò)程中的嚴(yán)重的縮聚和消旋引起的反應(yīng)收率低的問(wèn)題，得 到的產(chǎn)品不僅收率高，而且雜質(zhì)很少。
[0011] 為了解決運(yùn)些問(wèn)題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案包括W下幾個(gè)步驟： (1) 通過(guò)固相合成法依次偶聯(lián)與利拉魯膚主鏈相應(yīng)的氨基酸，所述氨基酸均采用N端 Fmoc保護(hù)，部分或全部氨基酸的側(cè)鏈予W保護(hù)，并且包含一種或多種W下形式的氨基酸： Fmoc- (Hmb)Gl}f-〇H、Fmoc- (Hmb)Ala-〇H、Fmoc- (Dmb)Gl}f-〇H和Fmoc- (Dmb)Ala-OH; (2) 將步驟（I)得到的多膚與固相載體切割并脫除所有側(cè)鏈保護(hù)基，于液相中連接 Palmitoyl-Glu(OSu)-OtBu; (3) 脫除步驟（2)得到的產(chǎn)物的保護(hù)基，純化得到利拉魯膚。
[0012] 步驟（1)中的固相載體可W采用本領(lǐng)域常用的樹(shù)脂；優(yōu)選使用Wang樹(shù)脂或者CTC 樹(shù)脂，取代度在0.1-1. 5mol/g之間均可。本發(fā)明偶聯(lián)過(guò)程中可W采用偶聯(lián)劑。具體可W采 用DIC/H0Bt，DCC/H0Bt，DIC/H0At，DCC/H0At，PyB0P/DIPEA，EDCI/H0Bt/DIPEA，HATU/NMM, 皿TU/DIPEA,皿TU，PyA0P/NMM,BOPCl/DIPEA,B0P，A0P，PyB0P/H0Bt，DPPA/TEA，DECP, TSTU/NMM，TNTU/DIPEA,TDBTU/DIPEA,BEMT/DIPEA,邸P/NMM，CIP/NMM，CIB/NMM，CBM口/ NMM，B孤C/NMM,B0MI/NMM，HAP州/NMM,皿P州/NMM或者其中的任意組合。偶聯(lián)劑的用量可 W在1-5個(gè)當(dāng)量，優(yōu)選3當(dāng)量。在脫除Fmoc時(shí)，優(yōu)選采用15-30%的贓晚/DMF，更優(yōu)選20% 的贓晚/DMF。可W采用單次或者多次脫除的方式，除去Fmoc保護(hù)基團(tuán)。本發(fā)明步驟（1)可 W獲得一類(lèi)多膚樹(shù)脂，其結(jié)構(gòu)為R-樹(shù)脂，優(yōu)選結(jié)構(gòu)為R-Wang樹(shù)脂或R-CTC樹(shù)脂，其中R為 具有W下結(jié)構(gòu)的多膚： (Hmb)Ala"GLP*-l,

其中GLP*-1代表的是其他氨基酸的側(cè)鏈帶有常規(guī)保護(hù)基團(tuán)的GLP-1，該保護(hù)基團(tuán)選用His(T;rt),Glu(0巧11),T虹（tBu),Ser(tBu),Asp(0巧11),Ser(tBu),TyrUBu),Gln(IYt), 和Arg(Pbf)。
[001引采用Hmb或者Dmb保護(hù)的Gly或者Ala的偶聯(lián)條件仍然采用DIC/HOBt，DCC/ 冊(cè)化，DIC/H0At，DCC/H0At，PyB0P/DI陽(yáng)A,邸CI/HOBt/DIPEA，HATU/NMM,皿TU/DIPEA, 皿TU,PyAOP/NMM,B0PC1/DIPEA,BOP,A0P，PyB0P/H0Bt，DPPA/TEA,DECP,TSTU/ NMM，TNTU/DIPEA,TDBTU/DIPEA,CIP/NMM，CIB/NMM,CBMIT/NMM，B孤C/NMM，HAP州/NMM, 皿P州/NMM或者其中的任意組合。本發(fā)明的偶聯(lián)反應(yīng)優(yōu)選在40°CW下進(jìn)行。
[0014] 本發(fā)明還著重探討了血b或者Dmb保護(hù)的氨基酸使用的個(gè)數(shù)極其所在的位置。優(yōu) 選在AlaS,Glyin,Gly22,Ala"4,Ala25,Ala^,Gly35中的1-7個(gè)氨基酸上采用血b或者Dmb保護(hù)； 更優(yōu)選在上述1-4個(gè)氨基酸上采用血b或者Dmb保護(hù)。！個(gè)Dmb或者血b的氨基酸能大大 改善多膚序列的縮聚，增加主鏈膚的收率，在將Dmb或者血b的氨基酸提高到兩個(gè)后，能最 好地消除多膚的縮聚，序列上每個(gè)氨基酸的縮合都變得更為容易，偶聯(lián)反應(yīng)容易進(jìn)行完全。 增加序列中Dmb或者血b保護(hù)的氨基酸的個(gè)數(shù)，位阻逐漸增加，偶聯(lián)反應(yīng)也逐漸變得困難。 從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，比較好的證明了運(yùn)一點(diǎn)，在i°Gly和25Ala上使用Dmb或者血b保護(hù)的替代 氨基酸，能夠很好的解決多膚縮聚的問(wèn)題。Dmb和血b保護(hù)的氨基酸具有等價(jià)的作用，沒(méi)有 看到明顯的差別。
[0015] 第（2)步中將多膚從固相載體上切割下來(lái)的切割液可W使用本領(lǐng)域常用的類(lèi) 型。選擇TFA作為切除成分，苯酪、純水、乙二硫醇或茵香硫酸作為清除劑，避免副反應(yīng)的 發(fā)生，TFA可W和任意清除劑做組合，其中優(yōu)選組成為T(mén)FA、苯酪、純水、乙二硫醇和茵香硫 酸，各組分的配比可W做一定的調(diào)整，優(yōu)選其配比為T(mén)FA:苯酪：純水：乙二硫醇：茵香硫酸 =87. 5:2. 5:2. 5:2. 5:5。該切割液除了能將多膚與固相樹(shù)脂進(jìn)行分離，還能夠切除多膚側(cè)鏈 的保護(hù)基W及血b或者Dmb。該切割過(guò)程的反應(yīng)溫度為優(yōu)選0-40度，更優(yōu)選10-20度；反 應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為0. 5-4小時(shí)，更優(yōu)選1-2小時(shí)。
[0016] 偶聯(lián)側(cè)鏈的方法可W參考US6268343B1的工藝。本發(fā)明對(duì)US6268343B1進(jìn)行了改 進(jìn)，改進(jìn)后化Imitoyl-Glu(OSu) -OtBu的用量為多膚的0. 8-8. 0倍，優(yōu)選1. -1. 5倍，提高了 該項(xiàng)目的可操作性，極大的降低了原料的使用，減少了雜質(zhì)的生成。
[0017] 側(cè)鏈連接完成后，可W采用酸澤滅或者堿澤滅兩個(gè)系列條件來(lái)澤滅反應(yīng)，終止過(guò) 量的化Imitoyl-Glu(OSu)-化Bu產(chǎn)生的副反應(yīng)。本發(fā)明優(yōu)選使用鹽酸，硫酸，憐酸，甲酸，乙 酸，硝酸，=氣乙酸，巧樣酸，氨氣酸，次氯酸，高氯酸，亞硫酸，氨漠酸，氨艦酸來(lái)澤滅反應(yīng)， 運(yùn)其中任何一種酸都在本發(fā)明的保護(hù)范圍，在實(shí)際操作過(guò)程中，TFA是最優(yōu)選。本發(fā)明優(yōu)選 使用贓晚，苯胺，二異丙胺，鹽酸徑胺，乙二胺，丙二胺，甲胺，二甲胺，乙胺，節(jié)胺，丙胺，對(duì)甲 基節(jié)胺，下胺，環(huán)己胺，環(huán)戊胺，碳酸鋼，碳酸鐘，碳酸氨鋼，氨氧化鐘，氨氧化鋼，氨氧化裡， 氨水作為堿來(lái)澤滅反應(yīng)，其中贓晚是最優(yōu)選條件。
[0018] 第（3)步中脫除側(cè)鏈膚保護(hù)基可W使用本領(lǐng)域常用的脫保護(hù)試劑TFA與TIS或 者水分的任意配比，用于脫除簇基上的巧U。優(yōu)選使用TFA:TIS:H20=95:2. 5:2. 5或者 TFA:H20=95:5。反應(yīng)溫度優(yōu)選0-40度，更優(yōu)選5-15度，反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選0. 5-4小時(shí)，更優(yōu)選 1-2小時(shí)。
[0019] 說(shuō)明書(shū)中及權(quán)利要求書(shū)中所設(shè)及到的英文縮寫(xiě)含義如下：

[0030] 下面通過(guò)具體實(shí)例，對(duì)本發(fā)明之前的內(nèi)容作一些具體的闡述。
[0031] 本發(fā)明中，若無(wú)特指，所有的原料，試劑及儀器都是市面購(gòu)得或者本領(lǐng)域常用。除 血b或者Dmb保護(hù)的氨基酸外，偶聯(lián)的其余普通氨基酸的保護(hù)基分別為Fmoc-Gly-OH,Fmoc -Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Val-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-T;rp度OC)-冊(cè)，F(xiàn)m