專利名稱：一種用于形成藥物復(fù)合物的載體多肽、制備方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物輔料領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及一種載體多肽及其制備方法和用途，該多肽具有與極性較大的藥物(小分子、DNA、RNA、藥用多肽及蛋白類藥物)形成復(fù)合物的能力，能夠增加藥物對生物體內(nèi)降解因素的穩(wěn)定性，延長其在體內(nèi)的半衰期。
背景技術(shù)：
生物技術(shù)藥物(特別是蛋白質(zhì)、多肽)作為藥物的研究取得了快速發(fā)展，在2009年的一份調(diào)查報告中，3M種生物技術(shù)藥物(包括臨床試驗或者正在接受管理部門審查的藥物)幾乎覆蓋了 150種疾病，包括癌癥、自身免疫性疾病以及艾滋病等傳染病。蛋白質(zhì)和多肽也存在突出的問題，如給藥系統(tǒng)的不完善，穩(wěn)定性差，在體內(nèi)半衰期短，生物利用率低等。通過修飾來優(yōu)化蛋白質(zhì)的代謝動力學特性，以延長其半衰期是經(jīng)常采用的方法，而修改過程中一些蛋白和多肽藥物會部分或全部失活。所以，尋找一種簡便的、穩(wěn)定的藥物載體將具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及使用具有特殊理化性質(zhì)的多肽與其他極性藥物形成復(fù)合物，能夠有效提高藥物在血液中的半衰期及穩(wěn)定性。本發(fā)明的一個目的是針對極性藥物(特別是生物類藥物)在體內(nèi)存留時間較短，提供了一種能與極性藥物形成復(fù)合物的載體多肽，以增加藥物對生物體內(nèi)降解因素的穩(wěn)定性，延長其在體內(nèi)的半衰期。本發(fā)明的另一個目的是提供了載體多肽的制備方法。本發(fā)明的另一個目的是提供了包括所述載體多肽的載劑，及其在制備藥物組合物中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一個目的是提供了載體多肽與極性藥物形成的復(fù)合物與藥學上可接受的輔料(包括載體材料、賦形劑、穩(wěn)定劑或稀釋劑等等)形成的藥物組合物及其制備方法。結(jié)合本發(fā)明的目的對本發(fā)明逐一加以描述在本發(fā)明的一個方面，提供了載體多肽，及其藥學上可接受的鹽、酯、醚、酰胺或其混合物，所述載體多肽具有SEQ ID NO 1氨基酸序列(人工序列)GLffffX1X2WffX3X4WffX5X6X7WffX8X9X10X11X12X13X14SEQ ID NO 1其中，&或 Arg;X2 為 Ala 或 Val 或者 Leu ；& 為 Lys 或 Arg;X4 為 Ala 或 Val 或 Leu ；&或 Arg;
& 為 Ser 或 Thr;X7 為 Leu 或 Val;X8或 Arg;X9 為 Lys 或 Arg ；X1。為 Lys 或 Arg;X11 為 Lys 或 Arg 或 Leu ；X12 為 Lys 或 Arg ；X13 為 Lys 或 Arg ；X14 SAla 或沒有。通式序列的載體多肽的特點為人工合成的含有23或者M個氨基酸的多肽，N末端為非極性氨基酸末端同時C末端為極性氨基酸末端，在中間W-W用于形成所需結(jié)構(gòu)。上述載體多肽優(yōu)選下列序列的多肽載體多肽1 (SEQ ID NO 2) GLffffKAffffKAffffKSLffffRKRKRKA,載體多肽2 (SEQ ID NO 3) GLffffKVffffKLffffKSLffffRKRLRKA,載體多肽3 (SEQ ID NO 4) GLffffKLffffKLffffKSLffffRKRKRKA,載體多肽4 (SEQ ID NO 5) GLffffKLffffKLffffKSLffffRKRLRK。在本發(fā)明的一個方面，載體多肽的制備方法為化學合成法；優(yōu)選地，其采用Fmoc方法或者Boc方法并經(jīng)過HPLC純化及脫鹽。在本發(fā)明的一個實施方案中，使用Fmoc法進行專利所述的載體多肽的固相合成，多肽的固相合成方法為領(lǐng)域內(nèi)通用方法。產(chǎn)品適用HPLC進行純化及脫鹽。在本發(fā)明的另一個方面，提供了載體多肽和/或其藥學上可接受的鹽、酯、醚、酰胺或其混合物在制備藥物載體中的應(yīng)用。在本發(fā)明的另一個方面，提供了藥物組合物，其包括1)前述的載體多肽和/或其藥學上可接受的鹽、酯、醚、酰胺或其混合物；及幻極性藥物。本發(fā)明所述的藥物組合物可以采用本領(lǐng)域公知的一般技術(shù)制備。在本發(fā)明一個優(yōu)選的方面，所述極性藥物為小分子藥物、多肽藥物、RNA藥物或者蛋白類藥物；優(yōu)選地，所述極性藥物選自青霉素類、頭孢霉素類、GLP-I多肽、Exendin-4多肽、PKA競爭型多肽抑制、EGFR的siRNA、單克隆抗體藥物。在本發(fā)明一個優(yōu)選的方面，載體多肽與其他藥物的摩爾比為25 1到1 100;優(yōu)選地，優(yōu)選地，所述摩爾比為1 5 1 50 ；再優(yōu)選地，所述摩爾比為1 10到1 20。在本發(fā)明的一個實施方案中，將載體多肽與其他藥物制成不同比例的復(fù)合物，以摩爾計算，從10 1到1 100，不同的比例得到的復(fù)合物具有不同的釋放特性。按照摩爾比例，稱取適量的藥物，溶于適量的生理鹽水、純水、PBS緩沖液、或含一定比例(20%以下)的有機溶劑的上述溶液中，稱取適量的載體多肽，溶于適量的生理鹽水(或PBSdK)中，在0_5°C溫度下，超聲混合1-15分鐘，或者攪拌1-3小時，或者放置過夜，溶液可以直接加輔料做成制劑，也可以冷凍干燥后再與其他輔料一起制成制劑。注PBS為磷酸鹽。在本發(fā)明一個優(yōu)選的方面，所述藥物組合物還包括可溶性填充劑、pH調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、注射用水、滲透壓調(diào)節(jié)劑的一種或多種。其中，水溶性填充劑輔料為甘露醇、低分子右旋糖苷、山梨醇、聚乙二醇、葡萄糖、乳糖、半乳糖的一種或多種的組合。pH調(diào)節(jié)劑為非揮發(fā)性的酸，或者生理可接受的有機或無機酸和堿及鹽，或其組合；優(yōu)選地，其選自櫞酸、磷酸、乳酸、酒石酸、鹽酸、氫氧化鉀、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸銨、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、碳酸氫銨及其組合。穩(wěn)定劑為EDTA-2Na、硫代硫酸鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉、磷酸氫二鉀、碳酸氫鈉、碳酸鈉、精氨酸、谷氨酸、聚乙二醇6000、聚乙二醇4000、十二烷基硫酸鈉或三羥甲基氨基甲烷的一種或幾種的組合。優(yōu)選焦亞硫酸鈉、磷酸氫二鉀、精氨酸、聚乙二醇6000、三羥甲基氨基甲烷的一種或多種的組合。滲透壓調(diào)節(jié)劑，是氯化鈉、氯化鉀的一種或兩種的組合。在本發(fā)明一個優(yōu)選的方面，所述藥物組合物的劑型為凍干粉。在本發(fā)明一個優(yōu)選的方面，所述藥物組合物的劑型為溶液注射劑。在本發(fā)明的另一個方面，提供了劑型為凍干粉的藥物組合物的制備方法，其包括步驟1)取多肽藥物和載體多肽溶液，加入水溶性填充劑、穩(wěn)定劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑等，加入注射用水，調(diào)節(jié)PH值至4-8使其溶解，加水稀釋；2)加入0. 1-0.5%活性炭，在0-101下攪拌10-20分鐘，過濾將活性炭除去；幻采用微孔濾膜過濾除菌，濾液進行分裝，采用冷凍干燥法，制得白色疏松塊狀物并封口。在本發(fā)明的一個實施方案中，采取以下的方法制備劑型為凍干粉的藥物組合物 取多肽藥物和載體多肽溶液適量，加入水溶性填充劑、穩(wěn)定劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑等，加入注射用水適量，調(diào)節(jié)PH值至4-8使其溶解，加水稀釋至適當濃度，加入0. 1-0. 5 %活性炭，在 0-10°C下攪拌10-20分鐘，除去活性炭，采用微孔濾膜過濾除菌，濾液進行分裝，采用冷凍干燥法，制得白色疏松塊狀物，封口即得。在本發(fā)明的另一個方面，提供了劑型為溶液注射劑的藥物組合物的制備方法，其包括步驟1)取多肽藥物和載體多肽溶液或凍干粉，加入水溶性填充劑、穩(wěn)定劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑等，加入注射用水適量，調(diào)節(jié)PH值至4-8使其溶解，加水稀釋；2)加入0. 1-0. 5%活性炭， 在0-10°C下攪拌10-20分鐘，過濾將活性炭除去；幻采用微孔濾膜過濾除菌，濾液進行分裝并封口。在本發(fā)明的一個實施方案中，采取以下的方法制備劑型為溶液注射劑的藥物組合物取多肽藥物和載體多肽溶液或凍干粉適量，加入水溶性填充劑、穩(wěn)定劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑等，加入注射用水適量，調(diào)節(jié)PH值至4-8使其溶解，加水稀釋至適當濃度，加入0. 1-0. 5% 活性炭，在0-10°C下攪拌10-20分鐘，脫碳，采用微孔濾膜過濾除菌，濾液進行分裝，封口即得。本發(fā)明的藥用組合物可以用在制備治療藥物方面，治療的方向依據(jù)藥物原來治療方向一致，通常能夠減少給藥次數(shù)，提高依從性。具體地，本發(fā)明的組合物物可以靜脈、肌肉或皮下注射劑形式給藥。雖然劑量依治療對象、給藥方式、癥狀及其它因素而改變，本發(fā)明的組合物在相當寬的劑量范圍內(nèi)是有效的。實際劑量應(yīng)該由醫(yī)生根據(jù)有關(guān)的情況來決定， 這些情況包括被治療者的身體狀態(tài)、給藥途徑、年齡、體重、患者對藥物的個體反應(yīng)，患者癥狀的嚴重程度等等，因此上述劑量范圍并不是以任何方式限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明具有以下的優(yōu)點1，本發(fā)明的載劑能延長藥物在體內(nèi)的濃度持續(xù)時間，提供了緩釋的功能；
2，采用本發(fā)明的載劑制備的藥物組合物有助于減少藥物攝取，從而降低醫(yī)療成本。


以下，結(jié)合附圖來詳細說明本發(fā)明的實施方案，其中圖1載體多肽與其他多肽藥物可形成類似脂質(zhì)體的復(fù)合物示意圖；圖2表示在小鼠中，GLP-I與載體多肽1_4復(fù)合物與對照相比在不同時間的降血糖功能。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明。實施例僅為解釋性的內(nèi)容，決不意味著它以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實施例1載體多肽1-4的制備使用Fmoc策略的固相多肽合成方法，使用CSBio公司生產(chǎn)的CS 336X型儀器進行載體多肽1-4的合成。合成的方法按照生產(chǎn)商的儀器說明書進行。將制得的多肽使用HPLC C18半制備柱進行純化，流動相為乙腈。經(jīng)脫鹽及冷凍干燥得到多肽凍干粉。實施例2小分子藥物與載體多肽1的復(fù)合物極性小分子藥物選擇青霉素類藥物羥氨芐青霉素，按照摩爾比例(以下比例沒有注明同為摩爾比)羥氨芐青霉素與載體多肽1比例10 1。稱取羥氨芐青霉素，溶于生理鹽水形成lmmol/L溶液充分混勻后，稱取0. Immol的載體多肽1溶于IL的上述生理鹽水中，充分混勻后，在4°C溫度下，超聲混合5分鐘，得到復(fù)合物溶液，并凍干。實施例3GLP-1多肽與載體多肽1的復(fù)合物稱取0. 3mg的GLP-1凍干粉，溶于Iml生理鹽水，充分混勻后，稱取3. 3mg載體多肽1凍干粉溶于上述GLP-I生理鹽水中，充分混勻后，在4°C溫度下，攪拌3小時，冷凍干燥得到復(fù)合物固體粉末。實施例4EXendin-4多肽與載體多肽2的復(fù)合物稱取0. 42mg的Exendin-4凍干粉，溶于Iml生理鹽水，充分混勻后，稱取3. 4mg載體多肽2凍干粉溶于上述Exendin-4生理鹽水中，充分混勻后，在4°C溫度下，攪拌3小時， 冷凍干燥得到復(fù)合物固體粉末。實施例5RNA與載體多肽3的復(fù)合物稱取3nmol 的 EGFR siRNA 凍干粉(購自 Santa Cruz Biotechnology 公司， SW9301)，溶于Iml PBS緩沖液，充分混勻后，稱取0. 13mg載體多肽3凍干粉溶于上述含 EGFR siRNA凍干粉的PBS緩沖液中，充分混勻后，在4°C溫度下，攪拌1小時，冷凍干燥得到復(fù)合物固體粉末。實施例6蛋白藥物與載體多肽4的復(fù)合物稱取IOnmol的HER-2單克隆抗體凍干粉(赫塞汀)(麗23404. 2)，溶于Iml PBS 緩沖液，充分混勻后，稱取0. 34mg載體多肽4凍干粉溶于上述含赫塞汀的PBS緩沖液中，充分混勻后，在4°C溫度下，放置過夜，冷凍干燥得到復(fù)合物固體粉末。
實施例7藥物組合物的制備將加泊洛沙姆0. 05g，甘露醇0. 2g、乳糖0. lg、注射用水3ml置于IOml的容器中， 攪拌使溶解，加lmol/L的枸櫞酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至6. 0，冷卻至5°C，取實施例2方法制備的復(fù)合物溶液5ml加入其中，繼續(xù)調(diào)補pH至6. 0，加水至10ml。加入IOmg活性碳，在 5°C下攪拌20分鐘，過濾除去活性炭，采用微孔濾膜(Millipore，Inc)過濾除菌，濾液按每支0. 2ml進行分裝，預(yù)凍2小時后，冷凍下減壓干燥12小時，至樣品溫度到5°C后，再干燥 2小時，制得白色疏松塊狀物，封口即得復(fù)合物的藥物組合物，置于預(yù)充式的注射器中，規(guī)格為IOOug/支，4°C以下保存，注射前以200ul注射用水溶解，后給藥。實施例8藥物組合物的制備NaCl 20mg,枸櫞酸10mg，注射用水7ml置于IOml的容器中，攪拌使溶解，加lmol/ L的枸櫞酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至6. 5，冷卻至0°C，取以實施例3的方法制得的復(fù)合物粉末 (以Exendin-4重量計算為5mg)加入其中，繼續(xù)攪拌溶解，調(diào)補pH至6. 5，加水至10ml。加入IOmg活性碳，在0-4°C下攪拌20分鐘，過濾除去活性炭，采用微孔濾膜過濾除菌，濾液按每支IOOul分裝入預(yù)充式注射器，樣品溫度到5°C以下保存，規(guī)格為50ug/支。實施例9載體多肽1與小分子藥物復(fù)合物的血漿穩(wěn)定性測定以實施例1的復(fù)合物(折合Img羥氨芐青霉素)，溶在IOml大鼠血漿中，在37度下放置不同時間(0、0.5、1、4小時)，以HPLC法測定血中藥物含量，計算穩(wěn)定性。以相同濃度的藥物在水溶液中的穩(wěn)定性進行比較。結(jié)果如下表1所示。表1載體多肽1與羥氨芐青霉素復(fù)合物的血漿穩(wěn)定性
時間沒有形成復(fù)合物時羥氨芐青霉素實施例1的復(fù)合物0小時100%100%0.5小時90%98%1小時60%95%4小時20%90%實施例10載體多肽1與GLP-I多肽組合物的體內(nèi)半衰期實驗本實施例使用SD大鼠5組，每組10只，其得自上海SLAC動物中心。將大鼠注射GLP-I及其與載體多肽1的復(fù)合物(折合GLP-I為1000 μ g/kg，GLP-I 與載體多肽1的摩爾比例分別為1 5，1 10，1 20及1 50)，分別于注射前及注射后 0. 5、1、3、6、9、12、24、36、48、72及96小時后于眼叢靜脈取血約0. 2ml，制備血清備用。采用酶聯(lián)免疫吸附方法(ELISA)檢測大鼠血清中融合蛋白的濃度，操作如下4 °C，13，OOOrpm的速度下離心20分鐘得到血清。用GLP-1EIA試劑盒(Phoenix Pharmaceuticals, INC)對鼠血漿中的GLP-I的濃度進行測定。試驗方法參照公司說明書進行GLP-I濃度測定，并根據(jù)結(jié)果評價GLP-I穩(wěn)定性。GLP-I及其復(fù)合物的體內(nèi)藥代動力學結(jié)果見表2，結(jié)果顯示本發(fā)明的GLP-I復(fù)合物
在體內(nèi)的半衰期較單獨的GLP-I明顯延長，具有長效特性。
表2GLP-1及其復(fù)合物在大鼠體內(nèi)的半衰期
權(quán)利要求
1.一種載體多肽，其具有通式GLffffX1X2WffX3X4WffX5X6X7WffX8X9X10X11X12X13X14所述的結(jié)構(gòu)，其中X1 為 Lys 或 Arg ；X2 為 Ala 或 Val 或 Leu ；X3 為 Lys 或 Arg ；X4 為 Ala 或 Val 或 Leu ；X5 為 Lys 或 Arg ；X6 為 Ser 或 Thr ；X7 為 Leu 或 Val ；X8 為 Lys 或 Arg ；X9 為 Lys 或 Arg ；Xio 為 Lys 或 Arg ；Xn 為 Lys 或 Arg 或 Leu ；X12 為 Lys 或 Arg ；X13 為 Lys 或 Arg ；X14 SAla或沒有。
2.權(quán)利要求1所述的載體多肽，其特征在于其選自GLffffKAffffKAffffKSLffffRKRKRKA，GLffffKVffffKLffffKSLffffRKRLRKA，GLffffKLffffKLffffKSLffffRKRKRKA,以及GLffffKLffffKLffffKSLffffRKRLRK ；優(yōu)選地，其為 GLffffKAffffKAffffKSLffffRKRKRKA。
3.權(quán)利要求1-2任一所述的載體多肽和/或其藥學上可接受的鹽、酯、醚、酰胺或其混合物在制備藥物載體中的應(yīng)用。
4.藥物組合物，其特征在于包括1)權(quán)利要求1-4任一所述的載體多肽和/或其藥學上可接受的鹽、酯、醚、酰胺或其混合物；2)極性藥物；優(yōu)選地所述極性藥物為小分子藥物、多肽藥物、RNA藥物或者蛋白類藥物。
5.權(quán)利要求4所述的藥物組合物，其特征在于所述極性藥物選自青霉素類、頭孢霉素類、GLP-I多肽、Exendin-4多肽、PKA競爭型多肽抑制、EGFR的siRNA、單克隆抗體藥物。
6.權(quán)利要求4-5任一所述的藥物組合物，其特征在于載劑以多肽計，與其他藥物的摩爾比為25 1到1 100 ；優(yōu)選地，所述摩爾比為1 5 1 50 ；再優(yōu)選地，所述摩爾比為 1 10 至Ij 1 20。
7.權(quán)利要求4-6任一所述的藥物組合物，其特征在于其劑型為凍干粉或溶液注射劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種載體多肽，其制備方法，基于該載體多肽的載劑及由該載劑制備的藥物組合物，其中所述載體多肽具有通式GLWWX1X2WWX3X4WWX5X6X7WWX8X9X10X11X12X13X14。本發(fā)明的載劑能延長藥物在體內(nèi)的濃度持續(xù)時間，提供了緩釋的功能。同時，采用本發(fā)明的載劑制備的藥物組合物有助于減少藥物攝取，從而降低醫(yī)療成本。
文檔編號C07K14/00GK102558308SQ20101061802
公開日2012年7月11日 申請日期2010年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月31日
發(fā)明者付剛, 任曉文, 劉鵬, 徐為人, 湯立達, 王玉麗, 鄭學敏, 龔珉 申請人:天津藥物研究院