專利名稱：檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)記和采用該標(biāo)記識(shí)別間充質(zhì)干細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測(cè)、分離識(shí)別間充質(zhì)干細(xì)胞、尤其是涉及在檢測(cè)、分離識(shí)別間充質(zhì)干細(xì)胞中使用的用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的基因標(biāo)記和多肽標(biāo)記，以及采用所述標(biāo)記檢測(cè)、識(shí)別間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
眾所周知，間充質(zhì)干細(xì)胞是存在于哺乳類的骨髓等處，分化為脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞的多能性干細(xì)胞。由于其分化的多能性，間充質(zhì)干細(xì)胞作為以再生醫(yī)療為的目的多種組織的移植材料正受到人們關(guān)注(《基因醫(yī)學(xué)》第4卷第2期(2000)p58-61)。最近，發(fā)表了關(guān)于間充質(zhì)干細(xì)胞研究現(xiàn)狀與展望的綜述，作出了關(guān)于間充質(zhì)干細(xì)胞的收集與培養(yǎng)的報(bào)告(實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)、第19卷第3期(2月號(hào))2001、p350-356)。此外，已有報(bào)道間充質(zhì)干細(xì)胞也存在于脂肪組織中(Tissue Engineering，P.A.Zuk et al.，Multilineage cells from human adipose tissueimplications for cell-based therapies.7211-228，2001)。
近年，一些專利申請(qǐng)公開了關(guān)于間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)、分化等內(nèi)容。例如，特表平11-506610號(hào)公報(bào)中公開了關(guān)于在無(wú)血清環(huán)境下維持人間充質(zhì)前體細(xì)胞生存的組和物及其方法，在特表平10-512756號(hào)公報(bào)中公開了關(guān)于為了誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞的分化將其與由前列腺素、抗壞血酸、膠原細(xì)胞外基質(zhì)等組成的骨誘導(dǎo)因子、分化付隨因子、軟骨誘導(dǎo)因子等生物活性因子相接觸的方法，在特開2000-217576號(hào)公報(bào)中公開了關(guān)于在催乳激素或其等效物共存下培養(yǎng)多能性間充質(zhì)細(xì)胞，使間充質(zhì)細(xì)胞分化成脂肪細(xì)胞的方法。
首先，本發(fā)明人公開了一種通過(guò)在基底膜細(xì)胞外基質(zhì)存在條件下或是在含有成纖維細(xì)胞增殖因子(FGF)等物質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞，使得間充質(zhì)干細(xì)胞得以顯著的增殖，并且發(fā)現(xiàn)能夠維持其分化能力，與以前的培養(yǎng)方法相比獲得了效果顯著的間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法(特開2003-52360號(hào)公報(bào))。并且，公開了一種為了在采集間充質(zhì)干細(xì)胞時(shí)在采集母體以安全并且容易方式進(jìn)行采集，從口腔組織中分離采集間充質(zhì)干細(xì)胞的方法(特開2003-52365號(hào)公報(bào))。
近年，隨著再生醫(yī)療的進(jìn)展，由于其分化多能性，人們正關(guān)注于將間充質(zhì)干細(xì)胞作為骨、軟骨、肌肉、脂肪、齒周組織等多種組織的再生醫(yī)療性的移植材料。為了在組織的再生醫(yī)療中利用間充質(zhì)細(xì)胞，首先，從活體組織中采集所述干細(xì)胞，使其增殖，尤其是必需使其分化增殖，從而進(jìn)行組織的制備。間充質(zhì)干細(xì)胞存在于骨髓或骨膜中，為了能在組織再生醫(yī)療中實(shí)現(xiàn)實(shí)用化，首先，必須要開發(fā)出能夠安全地從所述組織中采集間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。而且，為了間充質(zhì)干細(xì)胞在組織再生醫(yī)療中實(shí)現(xiàn)實(shí)用化，必須要開發(fā)出足以確保干細(xì)胞數(shù)量的技術(shù)。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，重要的是開發(fā)出仍能維持所采集的間充質(zhì)干細(xì)胞的分化能力的培養(yǎng)增殖技術(shù)。
通過(guò)上述內(nèi)容，本發(fā)明人開發(fā)出一種實(shí)現(xiàn)在采集間充質(zhì)干細(xì)胞時(shí)從采集母體中以安全且容易的方式采集的分離采集的方法。尤其是，本發(fā)明人開發(fā)了一種通過(guò)在基底膜細(xì)胞外基質(zhì)存在條件下或是在含有成纖維細(xì)胞增殖因子(FGF)等物質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞，以維持其的分化能力的形式大量增殖間充質(zhì)干細(xì)胞的方法(特開2003-52360號(hào)公報(bào))。但是，為了使增殖培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞在再生醫(yī)療中實(shí)用化，必須確認(rèn)所培養(yǎng)的細(xì)胞是間充質(zhì)干細(xì)胞，必須開發(fā)出檢測(cè)、識(shí)別該間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。以前，在間充質(zhì)干細(xì)胞中，無(wú)法對(duì)該細(xì)胞的特征標(biāo)記基因進(jìn)行鑒定。因此、為了使間充質(zhì)干細(xì)胞在再生醫(yī)療中實(shí)現(xiàn)實(shí)用化解決的重要課題是必須要開發(fā)出鑒定間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)記基因，從而檢測(cè)分離識(shí)別間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。
本發(fā)明提供了用于檢測(cè)識(shí)別間充質(zhì)干細(xì)胞的間充質(zhì)干細(xì)胞檢測(cè)用基因標(biāo)記和間充質(zhì)干細(xì)胞檢測(cè)用多肽標(biāo)記，用于檢測(cè)該基因標(biāo)記的PCR擴(kuò)增用引物，以及采用該標(biāo)記和該引物檢測(cè)、識(shí)別間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。
本發(fā)明人為了發(fā)現(xiàn)檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞用的標(biāo)記基因，對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞中的各種基因的表達(dá)進(jìn)行了比較，對(duì)構(gòu)成標(biāo)記的基因進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與序列表所示的13個(gè)基因相關(guān)的間充質(zhì)干細(xì)胞與成纖維細(xì)胞之間的表達(dá)量存在差異，間充質(zhì)干細(xì)胞中特異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)這些基因是間充質(zhì)干細(xì)胞檢測(cè)用的標(biāo)記，從而完成本發(fā)明。本發(fā)明含有用于檢測(cè)該間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記基因的探針，和在檢測(cè)該間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記基因時(shí)用于擴(kuò)增被檢細(xì)胞的該基因子的PCR所用引物。此外，本發(fā)明還含有本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記基因表達(dá)的多肽構(gòu)成的用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的多肽標(biāo)記、用于檢測(cè)該多肽標(biāo)記的與該多肽標(biāo)記特異結(jié)合的抗體。更優(yōu)選本發(fā)明含有—種采用用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記基因的探針、與多肽標(biāo)記特異結(jié)合的抗體的間充質(zhì)干細(xì)胞識(shí)別方法和分離方法。
下面對(duì)完成本發(fā)明的過(guò)程進(jìn)行說(shuō)明，在各種干細(xì)胞中，間充質(zhì)干細(xì)胞在骨、軟骨、肌肉、脂肪、骨骼肌、心肌、血管、神經(jīng)等許多組織中保持了分化能力，因此間充質(zhì)干細(xì)胞作為再生用細(xì)胞有很大前景。但是，迄今為止未有過(guò)對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞特征標(biāo)記基因鑒定的描述。因此，本發(fā)明人為了確定間充質(zhì)干細(xì)胞的特征標(biāo)記基因，進(jìn)行了積極地研究。也就是，本發(fā)明人首次開發(fā)，通過(guò)在FGF等存在下培養(yǎng)間充質(zhì)于細(xì)胞，采用仍維持其分化能力的快速增殖方法，增殖間充質(zhì)干細(xì)胞，在FGF等存在下培養(yǎng)由該方法獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞與人成纖維細(xì)胞，從培養(yǎng)細(xì)胞中抽提mRNA，以該mRNA為模板，以DNA芯片(ィンサィト社insit公司)作為探針，通過(guò)DNA微陣列法對(duì)人源間充質(zhì)干細(xì)胞與成纖維細(xì)胞中表達(dá)的基因進(jìn)行比較。
9400個(gè)基因中有63個(gè)基因在間充質(zhì)干細(xì)胞中顯著高表達(dá)，141個(gè)基因顯著低表達(dá)。其中87個(gè)基因表達(dá)量差別達(dá)3倍以上(29個(gè)基因在間充質(zhì)干細(xì)胞中高表達(dá)、58個(gè)基因低表達(dá))。從來(lái)源于三個(gè)個(gè)體的間充質(zhì)干細(xì)胞以及來(lái)源于三個(gè)個(gè)體的成纖維細(xì)胞中抽提全RNA，以它們?yōu)槟０?，通過(guò)半定量的RT-PCR法對(duì)上述87個(gè)基因的表達(dá)量進(jìn)行調(diào)查。其結(jié)果是大多數(shù)基因的表達(dá)量未發(fā)現(xiàn)差異。此外，由于不同個(gè)體的間充質(zhì)干細(xì)胞，或成纖維細(xì)胞之間也存在表達(dá)量的差異，認(rèn)為由個(gè)體差異引起表達(dá)差異的情形也是很多的。
根據(jù)RT-PCR，經(jīng)確認(rèn)間充質(zhì)干細(xì)胞中高表達(dá)的是3個(gè)基因(組織因子途徑抑制劑2(tissue factor pathway inhibitor 2)，2類主要組織相容性復(fù)合體DRβ3(majorhistocompatibility complex class2 DR beta 3)，絲氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制劑)、經(jīng)確認(rèn)低表達(dá)的基因有10種(基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloprotease)1，XV-α型膠原酶(collagenase type XV alpha)，CUG三聯(lián)體重疊RNA結(jié)合蛋白(CUG triplet repeat RNAbinding protein)，皮膚橋蛋白，蛋白質(zhì)酪氨酸激酶7(蛋白tyrosine激酶7)，異檸檬酸脫氫酶2，Sam68樣磷酸酪氨酸蛋白(Sam68樣phosphotyrosine protein)，C-型凝集素超家族成員2，腎上腺髓質(zhì)素，載脂蛋白D)。通過(guò)測(cè)定這13個(gè)基因的表達(dá)量，使得在短時(shí)間內(nèi)便宜地對(duì)難以識(shí)別的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行鑒定成為可能。尤其是，本發(fā)明中，進(jìn)行基因檢索的結(jié)果是，確認(rèn)了在間充質(zhì)干細(xì)胞或成纖維細(xì)胞中表達(dá)量存在差異的許多基因。由于這些基因構(gòu)成了用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的基因表記物，其通過(guò)構(gòu)建成檢測(cè)基因用探針，以微陣列或DNA芯片等形式能夠用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明具體的是由下列物質(zhì)構(gòu)成的用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的基因標(biāo)記，特征在于其具有序列表1、2、4、6、7、9、10、11、12、14、15、17、19或46所示的堿基序列的基因、和用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的基因標(biāo)記，其特征在于其為整聯(lián)蛋白，ALPHA 6(ITGA6)基因，MRNA(NM_000210)；溶質(zhì)載體家族20(PHOSPHATE TRANSPORTER)、成員1(NM_005415)基因；核糖核苷酸還原酶M2多肽(RRM2)，MRNA(NM_001034)基因；濾泡素抑制素(FOLLISTATIN)(FST)，轉(zhuǎn)錄變異體FST317，MRNA基因(NM_006350)；SPROUTY(DROSOPHILA)HOMOLOG 2(SPRY2)，MRNA(NM_005842)；RAB3B，成員RAS ONCOGENE FAMILY(RAB3B)，MRNA(NM_002867)基因；溶質(zhì)載體家族2(FACILITATED GLUCOSE TRANSPORTER)(NM_006516)基因；白介素13受體，ALPHA2(IL13RA2)，MRNA(NM_000640)基因；絲氨酸/蘇氨酸激酶12(STK12)，MRNA(NM_004217)基因；MINICHROMOSOME MAINTENANCE DEFICIENT(S.CEREVISIAE)5(CE)(NM_006739)基因；甲狀腺激素受體中間子INTERACTOR 13(TRIP13)，MRNA(NM_004237)基因；類驅(qū)動(dòng)蛋白6(有絲分裂著絲粒相關(guān)驅(qū)動(dòng)蛋白)(K)(NM_006845)基因；細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子3(CDK2-ASSOCIATEDDUAL(NM_005192)基因；染色體凝縮蛋白G(HCAP-G)，MRNA(NM_022346)基因；CDC28蛋白激酶1(CKS1)，MRNA(NM_001826)基因；胞質(zhì)分裂蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)子1(PRC1)，MRNA(NM_003981)基因；細(xì)胞增殖周期2，G1→S→G2→M(CDC2)，MRNA(NM_001786)基因；CDC20(細(xì)胞增殖周期20，釀酒酵母，同源基因)(CD)(NM_001255)基因；LIKELY ORTHOLOG OF MATERNAL EMBRYONICLEUCINE ZIPPER KINAS(NM_014791)基因；微染色體維持缺陷蛋白(釀酒酵母)7(M)(NM_005916)基因；細(xì)胞周期蛋白A2(CCNA2)，MRNA(NM_001237)基因；胸苷激酶1，SOLUBLE(TK1)，MRNA(NM_003258)基因；和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子2A(黑色素瘤，p16，抑制CDK4)(CDKN2A)，mRNA基因(NM_000077)(權(quán)利要求2)、和用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的基因標(biāo)記，其特征在于其為EGF-containing fibulin-like細(xì)胞外基質(zhì)蛋白1(NM 018894)基因；人胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白5(IGFBP5)mRNA(AU132011)基因；人克隆24775 mRNA序列(AA402981)基因；蛋白聚糖1，分泌顆粒(AV734015)基因；人胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白5(AA374325)基因；溶質(zhì)載體家族21(有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)，成員3(AF085224)基因；谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶2(C多肽，蛋白質(zhì)-谷氨酰胺-γ-谷酰基轉(zhuǎn)移酶)(AL552373)基因；抗血友病因子II(凝血酶)受體(M62424)；纖維蛋白溶酶原活化因子，鳥激酶NM_002658)基因；金屬蛋白酶3組織抑制劑(Sorsby fundus dystrophy，pseudoinflammatory)(W96324)基因；基質(zhì)Gla蛋白(BF668572)基因；B-cell CLL/淋巴瘤1(Z23022)基因；CD74抗原(主要組織相容性復(fù)合體的不變多肽，II類相關(guān)抗原)(BG333618)基因；內(nèi)收蛋白(adducin)3(γ)(AL135243)基因；溶質(zhì)載體家族16(一元羧酸傳送子)，成員4(NM_004696)基因；S蛋白(α)(NM_000313)基因；磷脂酰肌醇(4，5)二磷酸5-磷酸酶同系物；磷脂酰肌醇多聚磷酸5-磷酸酶IV型(AF187891)基因；孕酮膜結(jié)合蛋白質(zhì)(BE858855)基因；腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(X60201)基因；或者載脂蛋白E(BF967316)基因(權(quán)利要求3)、和用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的基因標(biāo)記，特征在于其是人WNT抑制因子-1(WIF-1)，MRNA(NM_007191)基因；人假擬蛋白(HYPOTHETICAL PROTEIN)FLJ11175(FLJ11175)，MRNA(NM_018349)基因；人RHO GDP解離抑止劑(GDI)β(ARHGDIB)，MRNA(NM_001175)基因；人鉀中間體/少量電導(dǎo)的鈣活化(SMALL CONDUCTANCECALCIUM-ACTIVATE)(NM_021614)基因；人核因子(紅細(xì)胞衍生物2)-類似物3(NFE2L3)，MRNA(NM_004289)基因；人GS3955蛋白(GS3955)，MRNA(NM_021643)基因；人CDNA 3′端與糖蛋白相類似的MUC18(AA302605)基因；人假擬蛋白(HYPOTHETICAL PROTEIN)FLJ21841(FLJ21841)，MRNA(NM_024609)基因；人鋅指蛋白185(LIM區(qū)域)(ZNF185)，MRNA(NM_007150)基因；細(xì)胞周期控制中涉及的SC1＝假定的轉(zhuǎn)移-活化因子[人，MRNA，24](S53374)基因；人NADH酶(輔酶Q)1α子復(fù)合體，8(19K)(NM_014222)基因；酵母YEAST MCM10的人同系物；假擬蛋白(HYPOTHETICAL PROTEIN)PRO2249(PRO2)(NM_018518)基因；人膠原，VII型，α1(大皰性表皮松解癥，DYSTRO(NM_000094)基因；人自分泌運(yùn)動(dòng)因子受體(AMFR)，MRNA(NM_001144)基因；人克隆24421 MRNA序列/CDS＝未知/GB＝AF070641/GI＝3283914/UG＝(AF070641)基因；人MRNA基因；CDNA DKFZP586E1621(源自DKFZP586E1621克隆)/CDS＝未知/GB(AL080235)基因(權(quán)利要求4)、和用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的基因標(biāo)記，特征在于其是人RESERVED(KCNK12)，MRNA(NM_022055)基因；人泛素結(jié)合酶E2C(UBE2C)，MRNA(NM_007019)基因；人CDNA FLJ10517FIS，克隆NT2RP2000812/CDS＝(61，918)/GB＝AK001379/G(AK001379)基因；人軟骨連接蛋白1(CRTL1)，MRNA(NM_001884)基因；人MRNA基因；CDNA DKFZP434F2322(由克隆DKFZP434F2322獲得)/CDS＝未知/GB(AL133105)；人，克隆MGC9549IMAGE3857382，MRNA，完整CDS/CDS＝(92，1285)/G(BC012453)基因；人假擬蛋白(HYPOTHETICAL PROTEIN)DKFZP586J1119(DKFZP586J1119)，MRNA(NM_032270)基因；人GLIA成熟因子，γ(GMFG)，MRNA(NM_004877)基因人CDNAFLJ23095 FIS，克隆LNG07413/CDS＝未知/GB＝AK026748/GI＝10(AK026748)基因；人假擬蛋白(HYPOTHETICAL PROTEIN)DKFZP762E1312(DKFZP762E1312)，MRNA(NM_018410)基因；人IROQUOIS類同源域蛋白(IRX-2A)，MRNA(NM_005853)基因；或者人假擬蛋白(HYPOTHETICAL PROTEIN)FLJ10540(FLJ10540)，MRNA(NM_018131)基因(權(quán)利要求5)、和用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的基因標(biāo)記，特征在于其是人MRNA；CDNA DKFZP434C1915(由克隆DKFZP434C1915獲得)基因；PARTIAL CDS/C(AL137698)；人微染色體維持缺陷型(釀酒酵母(S.CEREVISIAE))7(M)(NM_005916)基因；人動(dòng)力蛋白，細(xì)胞質(zhì)的，中間體多肽1(DNCI1)，M(NM_004411)基因；蛋白質(zhì)基因產(chǎn)物的人MRNA(PGP)9.5.(X04741)基因；人RAD51-相互作用蛋白(PIR51)，MRNA(NM_006479)基因；人含有桿狀病毒IAP重復(fù)序列的5(SURVIVIN)(BIRC5)，MR(NM_001168)基因；人UDP-N-乙?；?ALPHA-D-半乳糖胺多肽N-乙?；鵊AL(NM_004482)基因；人細(xì)胞周期蛋白B1(CCNB1)，MRNA(NM_031966)基因；人FLAP結(jié)構(gòu)特異性內(nèi)切酶1(FEN1)，MRNA基因(NM_004111)；人絲氨酸/蘇氨酸激酶15(STK15)，MRNA基因(NM_003600)；人MAD2(有絲分裂抑止缺陷型，酵母，同系物)-類似物1(MA)基因(NM_002358)；人核仁蛋白ANKT(ANKT)，MRNA基因(NM_018454)；人與泛素結(jié)合酶類似的HSPC150蛋白(H)基因(NM_014176)；人細(xì)胞色素P450類維生素A代謝蛋白(P450RAI-2)基因，(NM_019885)；人NIMA(從未有絲分裂基因A)相關(guān)激酶2(NEK2)，MR基因(NM_002497)；人骨形態(tài)生成蛋白4(BMP4)，MRNA基因(NM_001202)；人CDNAFLJ10674 FIS，克隆NT2RP2006436/CDS＝未知/GB＝AK001536/GI(AK001536)基因；或者人著絲粒蛋白A(17KD)(CENPA)，MRNA(NM_001809)基因(權(quán)利要求6)、和用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的基因標(biāo)記基因，特征在于其是人MRNA；CDNA DKFZP564P116(FROM克隆DKFZP564P116)/CDS＝未知/GB＝A(AL049338)；人TTK蛋白質(zhì)激酶(TTK)，MRNA(NM_003318)基因；人KARYOPHERINα2(RAG COHORT 1，IMPORTINα1)基因(KPNA(NM_002266)；人聚合酶(DNA導(dǎo)向的)，θ(POLQ)，MRNA(NM_006596)基因；人ETS變異體基因5(ETS相關(guān)分子)(ETV5)，MRNA基因(NM_004454)；人含轉(zhuǎn)化酸性卷曲螺旋蛋白(TRANSFORMING，ACIDIC COILED-COILCONTAINING蛋白)3(TAC)(NM_006342)基因；人驅(qū)動(dòng)蛋白類似物1(KNSL1)，MRNA基因(NM_004523)；人著絲粒蛋白E(312KD)(CENPE)，MRNA基因(NM_001813)；人CDNA，3′END/克?。絀MAGE1651289/克隆END＝3′/GB＝AI12(AI123815)基因；人DISTAL-LESS HOMEO BOX 5(DLX5)，MRNA基因(NM_005221)；人V-MYB禽成髓細(xì)胞性白血病病毒癌基因同系物類似物2基因(NM_002466)；或者人血清剝奪反應(yīng)(磷脂酰絲氨酸結(jié)合PRO(NM_004657)基因(權(quán)利要求7)、和用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的基因標(biāo)記，特征在于其是人假擬蛋白(HYPOTHETICAL PROTEIN)FLJ10604(FLJ10604)，MRNA基因(NM_018154)；人核糖核酸酶HI基因，大亞基(RNASEHI)，MRNA(NM_006397)；人ANILLIN(果蠅SCRAPS同系物)，肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白基因(NM_018685)；人H4組蛋白家族，成員G(H4FG)基因，MRNA(NM_003542)；人G蛋白連結(jié)受體37(內(nèi)皮縮血管肽受體B型-(NM_005302)人泛素載體蛋白(E2-EPF)，MRNA基因(NM_014501)；人，類似于腫瘤差別表達(dá)1，克隆IMAGE3639252，(BC007375)基因；人假擬蛋白(HYPOTHETICALPROTEIN)MGC2577(MGC2577)，MRNA(NM_031299)基因；人假擬蛋白(HYPOTHETICAL PROTEIN)FLJ13912(FLJ13912)，MRNA基因(NM_022770)；人ANNEXIN A3(ANXA3)，MRNA(NM_005139)基因；人STATHMIN 1/ONCO蛋白18(STMN1)，MRNA基因(NM_005563)人，與核糖體蛋白L39類似，克隆MGC20168IMAGE4555759，M(BC012328)；人POLO(果蠅)類似物激酶(PLK)，MRNA基因(NM_005030)(權(quán)利要求8)、和用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的基因標(biāo)記，特征在于其是人蛋白酶復(fù)合體(PROSOME，MACROPAIN)26S亞基，ATP酶，5(PS)基因(NM_002805)；人真核翻譯起始因子4γ，2(EIF4G)基因(NM_001418)；人二氫嘧啶酶-LIKE 3(DPYSL3)基因，MRNA)(NM_001387)；人ADAPTOR相關(guān)蛋白復(fù)合體1，SIGMA 2亞基(AP1S2)基因(NM_003916)；人網(wǎng)蛋白1，中間絲結(jié)合蛋白，500KD(P)基因(NM_000445)；人異種核蛋白U(SCAFFOLD ATTAC(NM_031844)基因；人假擬蛋白(HYPOTHETICAL PROTEIN)MGC5306(MGC5306)，MRNA基因(NM_024116)；人MHC I類多肽相關(guān)序列A(MICA)，MRNA基因(NM_000247)；人PRK1相關(guān)蛋白(AWP1)，MRNA基因(NM_019006)；人孕酮受體膜成分2(PGRMC2)，MRNA基因(NM_006320)；人多聚谷氨酸結(jié)合蛋白1(PQBP1)，MRNA基因(NM_005710)；人S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶1(AMD1)，MRNA基因(NM_001634)；人干擾素誘導(dǎo)的C型肝炎相關(guān)MICROTUBULARAG(NM_006417)基因；人蛋白激酶，AMP-活化的，γ1非催化性亞基(NON-CATALYTIC SUBUN)基因(NM_002733)；人前膠原-脯氨酸，2-OXOGLUTARATE 4-DIOXYGENASE(脯氨酸(NM_004199)；人血管內(nèi)皮分化，溶血磷脂酸G-PROTE基因(NM_012152)；或人KIAA0127基因產(chǎn)物(KIAA0127)，MRNA基因(NM_014755)(權(quán)利要求9)、和具有與權(quán)利要求1-9中任一記載的用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的基因標(biāo)記在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的DNA序列的用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞基因標(biāo)記的探針(權(quán)利要求10)、和由上述任一記載的堿基序列的反義鏈的全部或者部分構(gòu)成的權(quán)利要求10記載的用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞基因標(biāo)記的探針(權(quán)利要求11)、和用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞基因標(biāo)記的微陣列或DNA芯片，特征在于其固定有至少一個(gè)及一個(gè)以上的權(quán)利要求10或11記載的DNA(權(quán)利要求12)、和上述的用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記基因的微陣列或DNA芯片，特征在于其固定有具有序列表序列號(hào)1、2、4、6、7、9、10、11、12、14、15、17、19或46所示堿基序列基因組、和檢測(cè)出權(quán)利要求2-9中任一記載的基因組的2個(gè)以上基因的探針(權(quán)利要求13)、和用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的多肽標(biāo)記，特征在于其是具有序列表的序列3、5、8、13、16或18所示的氨基酸序列的多肽(權(quán)利要求14)、和一種抗體，特征在于其受權(quán)利要求14記載的多肽誘導(dǎo)、與該多肽特異性結(jié)合(權(quán)利要求15)、和權(quán)利要求15記載的抗體，其特征在于抗體是單克隆抗體(權(quán)利要求16)和權(quán)利要求15記載的抗體，其特征在于抗體是多克隆抗體(權(quán)利要求17)。
此外，本發(fā)明還由下列物質(zhì)組成識(shí)別間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，特征在于從被檢細(xì)胞中檢測(cè)出權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)記載的間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記基因表達(dá)(權(quán)利要求18)、和權(quán)利要求18記載的間充質(zhì)干細(xì)胞的識(shí)別方法，其特征是采用RNA印跡法檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記基因的表達(dá)(權(quán)利要求19)、和權(quán)利要求18記載的間充質(zhì)干細(xì)胞的識(shí)別方法，其特征是采用用于檢測(cè)權(quán)利要求10或11記載的間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記基因的探針對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)(權(quán)利要求20)、和權(quán)利要求18記載的間充質(zhì)干細(xì)胞的識(shí)別方法，其特征是采用用于檢測(cè)權(quán)利要求12或13記載的間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記基因的微陣列或DNA芯片對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)(權(quán)利要求21)、和識(shí)別間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征是權(quán)利要求18-21中任一記載的間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記基因表達(dá)的檢測(cè)包括定量或半定量的PCR的使用(權(quán)利要求22)、和權(quán)利要求22記載的間充質(zhì)干細(xì)胞的識(shí)別方法，其特征是其使用的定量的或半定量的PCR是RT-PCR法(權(quán)利要求23)。
此外，本發(fā)明還由以下物質(zhì)組成由具有序列表的序列號(hào)20所示的堿基序列的正義引物以及具有序列表的序列號(hào)21所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)22所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)23所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)24所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)25所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)26所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)27所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)28所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)29所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)30所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)31所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)32所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)33所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)34所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)35所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)36所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)37所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)38所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)39所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)40所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)41所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)42所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)43所示的堿基序列的反義引物、或具有序列表的序列號(hào)44所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)45所示的堿基序列的反義引物構(gòu)成的用于擴(kuò)增間充質(zhì)干細(xì)胞的RT-PCR用引物(權(quán)利要求24)、和由具有序列表的序列號(hào)47所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)48所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)49所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)50所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)51所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)52所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)53所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)54所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)55所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)56所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)57所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)58所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)59所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)60所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)61所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)62所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)63所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)64所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)65所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)66所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)67所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)68所示的堿基序列的反義引物、或具有序列表的序列號(hào)69所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)70所示的堿基序列的反義引物構(gòu)成的擴(kuò)增間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記基因的實(shí)時(shí)PCR所使用的引物(權(quán)利要求25)、和具有序列表的序列號(hào)71所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)72所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)73所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)74所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)75所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)76所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)77所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)78所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)79所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)80所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)81所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)82所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)83所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)84所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)85所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)86所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)87所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)88所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)89所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)90所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)91所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)92所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)93所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)94所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)95所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)96所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)97所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)98所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)99所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)100所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)101所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)102所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)103所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)104所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)105所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)106所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)107所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)108所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)109所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)110所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)111所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)112所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)113所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)114所示的堿基序列的反義引物、或具有序列表的序列號(hào)115所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)116所示的堿基序列的反義引物構(gòu)成的用于擴(kuò)增間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記基因的RT-PCR所使用的引物(權(quán)利要求26)。
此外，本發(fā)明還由以下物質(zhì)組成權(quán)利要求1-8記載的間充質(zhì)干細(xì)胞的識(shí)別方法，其特征是采用權(quán)利要求10或11中記載的間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記基因檢測(cè)用探針對(duì)被檢細(xì)胞中的基因、用權(quán)利要求24-26其中之一記載的正義引物以及反義引物中至少一對(duì)以上的引物擴(kuò)增的基因進(jìn)行檢測(cè)(權(quán)利要求27)、和間充質(zhì)干細(xì)胞的識(shí)別方法，其特征是采用權(quán)利要求15-17其中之一記載的抗體對(duì)被檢細(xì)胞中的間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記多肽的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)(權(quán)利要求28)、和間充質(zhì)干細(xì)胞的識(shí)別方法，其特征是將被檢細(xì)胞中由序列表的序列號(hào)1、11和19構(gòu)成的間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記基因組成的組中一個(gè)以上基因的表達(dá)以及由序列表的序列號(hào)2、4、6、7、9、10、12、14、15和17構(gòu)成的間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記基因組成的組中一個(gè)以上基因的表達(dá)組合起來(lái)，進(jìn)行評(píng)價(jià)(權(quán)利要求29)、和間充質(zhì)干細(xì)胞的識(shí)別分離方法，其特征是采用權(quán)利要求10或權(quán)利要求11記載的間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記基因檢測(cè)用探針和/或權(quán)利要求15-17中任一記載的抗體對(duì)被檢細(xì)胞中間充質(zhì)干細(xì)胞檢測(cè)用標(biāo)記基因和/或間充質(zhì)干細(xì)胞檢測(cè)用標(biāo)記多肽的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)、對(duì)識(shí)別出的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行分離(權(quán)利要求30)、和權(quán)利要求30記載的間充質(zhì)干細(xì)胞的識(shí)別分離方法，其特征是通過(guò)采用權(quán)利要求15-17中任一記載的抗體的熒光抗體法將被檢細(xì)胞中的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)識(shí)、分離經(jīng)標(biāo)識(shí)的間充質(zhì)干細(xì)胞(權(quán)利要求31)、和用于識(shí)別間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒，其中裝備有權(quán)利要求10或11記載的用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記基因的探針、固定有該探針的權(quán)利要求12或13記載的用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記基因的微陣列或DNA芯片、和權(quán)利要求15-17中任一記載的抗體中至少一個(gè)以上的抗體(權(quán)利要求32)。


圖1.表示的是本發(fā)明的實(shí)施例中，由半定量RT-PCR法獲得的人間充質(zhì)干細(xì)胞或人成纖維細(xì)胞間由個(gè)體(的不同)產(chǎn)生差異很大的基因。
圖2.表示的是本發(fā)明的實(shí)施例中，由半定量RT-PCR法獲得的MSC中高表達(dá)的基因。
圖3.表示的是本發(fā)明的實(shí)施例中，由半定量RT-PCR法獲得的MSC中低表達(dá)的基因。
圖4.表示的是對(duì)于確認(rèn)了間充質(zhì)干細(xì)胞中高/低表達(dá)的13個(gè)基因，從來(lái)源于7個(gè)個(gè)體的間充質(zhì)干細(xì)胞和來(lái)源于4個(gè)個(gè)體的成纖維細(xì)胞中抽提全部RNA，以其為模板通過(guò)RT-PCR法，對(duì)它們的表達(dá)量進(jìn)行確認(rèn)的結(jié)果。
圖5.表示的是本發(fā)明的實(shí)施例中，間充質(zhì)干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中本發(fā)明的標(biāo)記基因表達(dá)狀況的試驗(yàn)結(jié)果。
圖6.表示的是本發(fā)明的實(shí)施例中，間充質(zhì)干細(xì)胞和成骨細(xì)胞中各標(biāo)記基因的差別基因表達(dá)的狀況。
圖7.表示的是本發(fā)明的實(shí)施例中，間充質(zhì)干細(xì)胞和成骨細(xì)胞中各標(biāo)記基因的差別基因表達(dá)的狀況。
圖8.表示的是本發(fā)明的實(shí)施例中，間充質(zhì)干細(xì)胞和成骨細(xì)胞中各標(biāo)記基因的差別基因表達(dá)的狀況。
圖9.表示的是本發(fā)明的實(shí)施例中，各個(gè)標(biāo)記基因在間充質(zhì)干細(xì)胞和人成纖維細(xì)胞中基因的表達(dá)狀況。
圖10.表示的是本發(fā)明的實(shí)施例中，各個(gè)標(biāo)記基因在間充質(zhì)干細(xì)胞和人成纖維細(xì)胞中基因的表達(dá)狀況。
圖11.表示的是本發(fā)明的實(shí)施例中，采用流式細(xì)胞儀對(duì)人細(xì)胞中間充質(zhì)干細(xì)胞DR的表達(dá)的測(cè)定結(jié)果。
圖12.表示的是本發(fā)明的實(shí)施例中，對(duì)在間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化誘導(dǎo)中各個(gè)基因的表達(dá)狀況的測(cè)定結(jié)果。
圖13.表示的是本發(fā)明的實(shí)施例中，各標(biāo)記基因在骨分化誘導(dǎo)的第4天-28天之間基因表達(dá)的變化。
圖14表示的是本發(fā)明的實(shí)施例中，各標(biāo)記基因在骨分化誘導(dǎo)的第4天-28天之間基因表達(dá)的變化。
圖15.表示的是本發(fā)明的實(shí)施例中，各標(biāo)記基因在骨分化誘導(dǎo)的第4天-28天之間基因表達(dá)的變化。
圖16.表示的是本發(fā)明的實(shí)施例中，各標(biāo)記基因在骨分化誘導(dǎo)的第4天-28天之間基因表達(dá)的變化。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明由對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞中的特異性表達(dá)的用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)記基因或用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)記多肽的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，識(shí)別間充質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)成。本發(fā)明中，用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的基因標(biāo)記構(gòu)成的基因是具有序列表中序列號(hào)1、2、4、6、7、9、10、11、12、14、15、17或19所示的堿基序列的基因。
此外，在本發(fā)明中用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的多肽標(biāo)記構(gòu)成的多肽是具有序列表中序列號(hào)3、5、8、13、16或18所示氨基酸序列的多肽。
序列表中序列號(hào)1所示的基因是“絲氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制劑”基因，序列表中序列號(hào)2所示的基因是“腎上腺髓質(zhì)素”基因，序列表中序列號(hào)4所示的基因是“載脂蛋白D(apolopoprotein D)”基因，序列表中序列號(hào)6所示的基因是“XV-α1型膠原酶(collagenase type XV alpha 1)”基因，序列表中序列號(hào)7所示的基因是“CUG三聯(lián)體重復(fù)RNA結(jié)合蛋白2(CUG triplet repeat RNA binding protein2)”基因，序列表中序列號(hào)9所示的基因是“皮膚橋蛋白”基因，序列表中序列號(hào)10所示的基因是“異檸檬酸脫氫酶2”基因，序列表中序列號(hào)11所示的基因是“2類主要組織相容性復(fù)合體DRβ3(majorhistocompatibility complex class2，DR beta 3)”基因，序列表中序列號(hào)12所示的基因是“蛋白質(zhì)酪氨酸激酶7(protein tyrosine kinase 7)”基因，序列表中序列號(hào)14所示的基因是“Sam68樣磷酸酪氨酸蛋白(Sam68-like phosphotyrosine protein)”基因，序列表中序列號(hào)15所示的基因是“C-型凝集素超家族(C-type lectin superfamily)成員2”基因，序列表中序列號(hào)17所示的基因是“基質(zhì)金屬酶1(matrix metalloprotease 1)”基因，和序列表中序列號(hào)19所示的基因是“組織因子途徑抑制劑2(tissue factor pathway inhibitor2)”基因，序列表中序列號(hào)46所示的基因是“主要組織相容性復(fù)合體DRα(major histocompatibilitycomplex DR alpha)”基因。
可以通過(guò)NCBI的基因數(shù)據(jù)庫(kù)中、各個(gè)登陸號(hào)AI133613(序列號(hào)1)、NM_001124(序列號(hào)2)、NM_001647(序列號(hào)4)、L01697(序列號(hào)6)、U69546(序列號(hào)7)、AW016451(序列號(hào)9)、AL545953(序列號(hào)10)、BF732822(序列號(hào)11)、AL157486(序列號(hào)12)、AA112001(序列號(hào)14)、XM_006626(序列號(hào)15)、NM_002421(序列號(hào)17)、AL550357(序列號(hào)19)、和BF795929(序列號(hào)46)獲得本發(fā)明的用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)記基因的DNA序列的信息。
進(jìn)而，經(jīng)確認(rèn)本發(fā)明中，與成纖維細(xì)胞相比在間充質(zhì)干細(xì)胞中表達(dá)量更多的基因列舉為如下基因整聯(lián)蛋白，α6(ITGA6)，MRNA基因(NM_000210)；溶質(zhì)載體家族20(PHOSPHATE TRANSPORTER)、成員1基因(NM_005415)；核苷酸還原酶M2多肽(RRM2)，MRNA基因(NM_001034)；卵泡抑制素(FST)，轉(zhuǎn)錄變異型FST317，MRNA基因(NM_006350)；SPROUTY(果蠅)同源基因2(SPRY2)，MRNA基因(NM_005842)；RAB3B，成員RAS癌基因家族成員(RAB3B)，MRNA基因(NM_002867)；溶質(zhì)載體家族2(FACILITATED GLUCOSE TRANSPORTER)基因(NM_006516)；白介素13受體，ALPHA 2(IL13RA2)，MRNA基因(NM_000640)；絲氨酸(或蘇氨酸)蛋白酶抑制劑12(STK12)，MRNA基因(NM_004217)；微染色體維持缺陷蛋白(釀酒酵母)5(CE)基因(NM_006739)；甲狀腺激素受體中間子13(TRIP13)，MRNA基因(NM_004237)；類驅(qū)動(dòng)蛋白6(MITOTIC CENTROMERE-ASSOCIATED KINESIN)(K)基因(NM_006845)；細(xì)胞周期蛋白依賴性抑止劑3(細(xì)胞周期蛋白依賴性抑止劑3(CYCLIN-DEPENDENT KINASE INHIBITOR 3))(CDK2-ASSOCIATED DUAL基因(NM_005192)；染色體凝集蛋白G(HCAP-G)，MRNA基因(NM_022346)；CDC28蛋白激酶(CKS1)，MRNA基因(NM_001826)；胞質(zhì)分裂的蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)子1(PRC1)，MRNA基因(NM_003981)；細(xì)胞分裂周期2，G1→S→G2→M(CDC2)，MRNA基因(NM_001786)；CDC20(CDC20細(xì)胞分裂周期20，釀酒酵母同源基因)(CD)基因(NM_001255)；LIKELY ORTHOLOG OF MATERNAL EMBRYONIC LEUCINEZIPPER KINAS基因(NM_014791)；微染色體維持缺陷蛋白(釀酒酵母)7(M)基因(NM_005916)；細(xì)胞周期蛋白A2(CCNA2)，MRNA基因(NM_001237)；胸苷激酶1，可溶性(TK1)，MRNA基因(NM_003258)；或細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑止劑2A(cyclin-dependent kinase inhibitor 2A)(黑色素瘤，p16，抑止CDK4)(CDKN2A)，mRNA基因(NM_000077)。
含EGF的細(xì)胞微絲(fibulin)樣細(xì)胞外基質(zhì)蛋白1基因(NM_018894)；人胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白5(IGFBP5)mRNA基因(AU132011)；人克隆24775 mRNA序列基因(AA402981)；蛋白聚糖1，分泌顆粒(AV734015)；胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白質(zhì)5(insulin-like growth factor binding protein 5)基因(AA374325)；基因溶質(zhì)載體家族21(有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)，成員3(AF085224)；谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶2(C多肽，蛋白質(zhì)-谷氨酰胺-γ-谷?；D(zhuǎn)移酶)(AL552373)基因；血友病因子II(凝血酶)受體基因(M62424)；纖維蛋白溶酶原活化因子，鳥激酶(NM_002658)基因；金屬蛋白酶組織抑制因子3(Sorsby fundus dystrophy，pseudoinflammatory)(W96324)基因；基質(zhì)Gla蛋白(BF668572)基因；B-cell CLL/淋巴瘤1(Z23022)基因；CD74抗原(主要組織相容性復(fù)合體的不變多肽，II類相關(guān)抗原)(BG333618)基因；內(nèi)收蛋白3(γ)(AL135243)基因；溶質(zhì)載體家族16(一元羧酸傳送子)，成員4(NM_004696)基因；S蛋白(α)(NM_000313)基因；磷脂酰肌醇(4，5)二磷酸5-磷酸酶同系物；磷脂酰肌醇多聚磷酸5-磷酸酶IV型(AF187891)基因；孕酮膜結(jié)合蛋白質(zhì)(BE858855)基因；腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(X60201)基因；或者載脂蛋白E(BF967316)基因。
人WNT抑止因子-1(WIF-1)，MRNA(NM_007191)基因；人假擬蛋白(HYPOTHETICAL PROTEIN)FLJ11175(FLJ11175)，MRNA基因(NM_018349)；人RHO GDP解離抑止劑(GDI)β(ARHGDIB)，MRNA基因(NM_001175)；人鉀中間體/少量電導(dǎo)的鈣活化(SMALL CONDUCTANCE CALCIUM-ACTIVATE)基因(NM_021614)；人核因子(紅細(xì)胞衍生物2)-類似物3(NFE2L3)，MRNA基因(NM_004289)；人GS3955蛋白(GS3955)，MRNA基因(NM_021643)；人CDNA 3′END與糖蛋白相類似的MUC18基因(AA302605)；人假擬蛋白(HYPOTHETICALPROTEIN)FLJ21841(FLJ21841)，MRNA基因(NM_024609)；人ZINC FINGER蛋白185(LIM域)(ZNF185)，MRNA基因(NM_007150)；SC1＝假定的轉(zhuǎn)移-活化因子，細(xì)胞周期控制中涉及的[人，MRNA，24](S53374)基因；人NADH脫氫酶(輔酶Q)1α子復(fù)合體，8(19K)基因(NM_014222)；人酵母MCM10的同系物基因；假擬蛋白(HYPOTHETICAL PROTEIN)PRO2249(PRO2)(NM_018518)；人XV-α1型膠原酶(COLLAGEN，TYPE VII，ALPHA 1)(大皰性表皮松解癥，DYSTRO基因(NM_000094)；人自分泌運(yùn)動(dòng)因子受體(AMFR)，MRNA基因(NM_001144)；人克隆24421 MRNA序列/CDS＝未知/GB＝AF070641/GI＝3283914/UG＝(AF070641)基因；人MRNA基因；CDNA DKFZP586E1621(FROM克隆DKFZP586E1621)/CDS＝未知/GB(AL080235)基因。
人保留(KCNK12)，MRNA(NM_022055)基因；人泛素結(jié)合酶E2C(UBE2C)，MRNA基因(NM_007019)；人CDNA FLJ10517 FIS，克隆NT2RP2000812/CDS＝(61，918)/GB＝AK001379/G基因(AK001379)；人骨連接蛋白1(CRTL1)，MRNA基因(NM_001884)；人MRNA；CDNA DKFZP434F2322(FROM克隆DKFZP434F2322)/CDS＝未知/GB(AL133105)基因；人，克隆MGC；9549IMAGE3857382，MRNA，完整CDS/CDS＝(92，1285)/G(BC012453)基因；人假擬蛋白(HYPOTHETICAL PROTEIN)DKFZP586J1119(DKFZP586J1119)，MRNA(NM_032270)基因；人神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子，γ(GMFG)，MRNA基因(NM_004877)；人CDNAFLJ23095 FIS，克隆LNG07413/CDS＝未知/GB＝AK026748/GI＝10(AK026748)基因；人假擬蛋白(HYPOTHETICAL PROTEIN)DKFZP762E1312(DKFZP762E1312)，MRNA基因(NM_018410)；人IROQUOIS類同源域蛋白(IRX-2A)，MRNA基因(NM_005853)；或人假擬蛋白(HYPOTHETICAL PROTEIN)FLJ10540(FLJ10540)，MRNA基因(NM_018131)。
人MRNA基因；CDNA DKFZP434C1915(FROM克隆DKFZP434C1915)；PARTIALCDS/C(AL137698)；人微染色體維持缺陷型(釀酒酵母(S.CEREVISIAE))7(M)(NM_005916)基因；人動(dòng)力蛋白，細(xì)胞質(zhì)的，中間體多肽1(DNCI1)，M基因(NM_004411)；蛋白質(zhì)基因產(chǎn)物的人MRNA(PGP)9.5.(X04741)基因；人RAD51-相互作用蛋白(PIR51)，MRNA基因(NM_006479)；人含有桿狀病毒LAP重復(fù)序列的5(SURVIVIN)(BIRC5)，MR基因(NM_001168)；人UDP-N-乙?；?ALPHA-D-半乳糖胺多肽N-乙?；鵊AL基因(NM_004482)；人細(xì)胞周期蛋白B1(CCNB1)，MRNA基因(NM_031966)；人FLAP結(jié)構(gòu)特異性內(nèi)切酶1(FEN1)，MRNA基因(NM_004111)；人絲氨酸/蘇氨酸激酶15(STK15)，MRNA基因(NM_003600)；人MAD2(有絲分裂抑止缺陷型，酵母，同系物)-類似物1(MA)基因(NM_002358)；人核仁蛋白ANKT(ANKT)，MRNA基因(NM_018454)；人與泛素結(jié)合酶類似的HSPC150蛋白(H)基因(NM_014176)；人細(xì)胞色素P450類維生素A代謝蛋白(P450RAI-2)，(NM_019885)基因；人NIMA(從未有絲分裂基因A)相關(guān)激酶2(NEK2)，MR基因(NM_002497)；人骨形態(tài)生成蛋白4(BMP4)，MRNA基因(NM_001202)；人CDNA FLJ10674 FIS，克隆NT2RP2006436/CDS＝未知/GB＝AK001536/G基因I(AK001536)；或人著絲粒蛋白A(17KD)(CENPA)，MRNA基因(NM_001809)。
人MRNA基因；CDNA DKFZP564P116(來(lái)自克隆DKFZP564P116)/CDS＝未知/GB＝A(AL049338)；人TTK蛋白質(zhì)激酶(TTK)，MRNA基因(NM_003318)；人KARYOPHERINα2(RAG COHORT 1，IMPORTINα1)(KPNA基因(NM_002266)；人聚合酶(DNA導(dǎo)向的)，θ(POLQ)，MRNA基因(NM_006596)；人ETS變異體基因5(ETS相關(guān)分子)(ETV5)，MRNA基因(NM_004454)；人含轉(zhuǎn)化酸性卷曲螺旋蛋白(TRANSFORMING，ACIDIC COILED-COIL CONTAINING蛋白)3(TAC)基因(NM_006342)；人驅(qū)動(dòng)蛋白類似物1(KNSL1)，MRNA基因(NM_004523)；人著絲粒蛋白E(312KD)(CENPE)，MRNA基因(NM_001813)；人CDNA，3′END/克隆＝IMAGE1651289/克隆_END＝3′/GB＝AI12(AI123815)；基因人DISTAL-LESSHOMEO BOX 5(DLX5)，MRNA基因(NM_005221)；人V-MYB禽成髓細(xì)胞性白血病病毒癌基因同系物類似物2基因(NM_002466)；或人血清剝奪反應(yīng)(磷脂酰絲氨酸結(jié)合PRO(NM_004657)基因。
用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的基因標(biāo)記，特征在于其是人假擬蛋白(HYPOTHETICAL PROTEIN)FLJ10604(FLJ10604)，MRNA基因(NM_018154)；人核糖核酸酶HI，大亞基(RNASEHI)，MRNA(NM_006397)基因；人ANILLIN(果蠅SCRAPS同系物)，肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白基因(NM_018685)；人H4組蛋白家族，成員G(H4FG)，MRNA基因(NM_003542)；人G蛋白連結(jié)受體37(內(nèi)皮縮血管肽受體B型-(NM_005302)人泛素載體蛋白(E2-EPF)，MRNA(NM_014501)基因；人，類似于腫瘤差別表達(dá)1，克隆IMAGE3639252，(BC007375)基因；人假擬蛋白(HYPOTHETICAL PROTEIN)MGC2577(MGC2577)，MRNA基因(NM_031299)；人假擬蛋白(HYPOTHETICAL PROTEIN)FLJ13912(FLJ13912)，MRNA基因(NM_022770)；人ANNEXIN A3(ANXA3)，MRNA基因NM_005139)；人STATHMIN 1/ONCO蛋白18(STMN1)，MRNA基因(NM_005563)人，與核糖體蛋白L39類似，克隆MGC20168 IMAGE4555759，M(BC012328)；人POLO(果蠅)類似物激酶(PLK)，MRNA基因(NM_005030)。
同時(shí)，本發(fā)明中經(jīng)確認(rèn)的、與纖維母細(xì)胞相比較、在間充質(zhì)細(xì)胞中不表達(dá)或表達(dá)量的基因是，如下列舉的基因
用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的基因標(biāo)記，特征在于人蛋白酶體(PROSOME，MACROPAIN)26S亞基，ATP酶，5(PS)基因(NM_002805)；人真核翻譯起始因子4γ，2(EIF4G)基因(NM_001418)；人二氫嘧啶酶類似物3(DPYSL3)，MRNA)基因(NM_001387)；人ADAPTOR相關(guān)蛋白復(fù)合體1，σ2亞基(AP1S2)基因(NM_003916)；人網(wǎng)蛋白1，中間絲結(jié)合蛋白，500KD(P)基因(NM_000445)；人異種核蛋白U基因(SCAFFOLD ATTAC(NM_031844)；人假擬蛋白(HYPOTHETICAL PROTEIN)MGC5306(MGC5306)，MRNA基因(NM_024116)；人MHC I類多肽相關(guān)序列A(MICA)，MRNA基因(NM_000247)；人PRK1相關(guān)蛋白(AWP1)，MRNA基因(NM_019006)；人孕酮受體膜成分2(PGRMC2)，MRNA基因(NM_006320)；人多聚谷氨酸結(jié)合蛋白1(PQBP1)，MRNA基因(NM_005710)；人S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶1(AMD1)，MRNA基因(NM_001634)；人干擾素誘導(dǎo)的C型肝炎相關(guān)MICROTUBULAR AG基因(NM_006417)；人蛋白質(zhì)激酶，AMP-活化的，γ1非催化性亞基(NON-CATALYTIC SUBUN)基因(NM_002733)；人前膠原-脯氨酸，2-氧代戊二酸鹽4-加雙氧酶(脯氨酸(NM_004199)基因；人血管內(nèi)皮分化，溶血磷脂酸G-PROTE基因(NM_012152)；或人KIAA0127基因產(chǎn)物(KIAA0127)，MRNA基因(NM_014755)本發(fā)明中，對(duì)本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記基因表達(dá)進(jìn)行的檢測(cè)中可以采用公知的基因表達(dá)檢測(cè)方法。例如，為了檢測(cè)本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記基因的表達(dá)，可以采用RNA印跡法(northern blot)。此外，為了通過(guò)本發(fā)明的基因標(biāo)記，檢測(cè)識(shí)別間充質(zhì)干細(xì)胞，可以采用具有與本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞基因標(biāo)記的DNA序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的DNA序列的探針。在采用該探針檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞中，可采用公知方法采取相應(yīng)措施。例如，由序列表所示基因標(biāo)記DNA序列制備出適應(yīng)長(zhǎng)度的DNA探針，給探針加上合適的熒光標(biāo)記等標(biāo)記，通過(guò)將其與被檢體雜交，從而對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。該DNA探針可以采用由序列表所示的本發(fā)明的基因標(biāo)記的堿基序列的反義鏈的全部或部分構(gòu)成的用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記基因的探針?；蛘撸部梢圆捎霉潭ㄓ兄辽?個(gè)以上所述探針的用于檢測(cè)標(biāo)記基因的微陣列或DNA芯片。
此外，在制備上述DNA探針時(shí)，本發(fā)明的堿基序列中，所謂“與用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)記基因的DNA序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交”是指，例如42℃下的雜交，以及在42℃下通過(guò)含有1×SSC(0.15M NaCl、0.015M檸檬酸鈉)、0.1％SDS(十二烷基硫酸鈉)的緩沖液進(jìn)行沖洗，最為理想的是65℃下的雜交，以及在65℃下通過(guò)含有1×SSC、0.1％SDS的緩沖液進(jìn)行沖洗。此外，影響雜交的嚴(yán)謹(jǐn)度的因素除上述溫度條件以外還存在各種因素，如果本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)各種因素進(jìn)行組合，就可能實(shí)現(xiàn)與上述列舉的雜交的嚴(yán)謹(jǐn)性等同的嚴(yán)謹(jǐn)度。
尤其是，本發(fā)明中檢測(cè)本發(fā)明的用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的多肽標(biāo)記時(shí)，可以使用由該蛋白質(zhì)的多肽誘導(dǎo)，與該多肽特異性結(jié)合的抗體。該抗體可以是例如多克隆抗體和單克隆抗體。作為本發(fā)明的多肽標(biāo)記的抗體，該抗體可以通過(guò)常規(guī)方法制得。采用本發(fā)明的抗體，在對(duì)被檢細(xì)胞中用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)記多肽的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)中，可以實(shí)施采用公知抗體的免疫學(xué)測(cè)定法。所述免疫學(xué)測(cè)定法可以是例如RIA法、ELISA法、熒光抗體發(fā)等公知的免疫學(xué)測(cè)定法。
本發(fā)明可通過(guò)采用本發(fā)明的用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的探針和/或本發(fā)明的用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的抗體，對(duì)被檢細(xì)胞中用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)記基因和/或用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)記多肽的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)識(shí)別出的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行分離得以實(shí)現(xiàn)。在對(duì)被檢細(xì)胞中用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)記基因檢測(cè)時(shí)，為了擴(kuò)增被檢細(xì)胞的基因，可采用定量或半定量的PCR。所述PCR可采用RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄PCR)。進(jìn)行所述PCR時(shí)，采用用于擴(kuò)增用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)記基因的正義引物和反義引物組成的引物。
用于擴(kuò)增本發(fā)明的用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)記基因的引物舉例如下具有序列表的序列號(hào)20所示的堿基序列的正義引物以及具有序列表的序列號(hào)21所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)22所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)23所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)24所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)25所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)26所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)27所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)28所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)29所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)30所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)31所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)32所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)33所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)34所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)35所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)36所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)37所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)38所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)39所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)40所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)41所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)42所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)43所示的堿基序列的反義引物、或具有序列表的序列號(hào)44所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)45所示的堿基序列的反義引物。
尤其是，用于擴(kuò)增本發(fā)明的用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)記基因的引物舉例如下由具有序列表的序列號(hào)47所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)48所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)49所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)50所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)51所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)52所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)53所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)54所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)55所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)56所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)57所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)58所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)59所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)60所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)61所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)62所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)63所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)64所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)65所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)66所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)67所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)68所示的堿基序列的反義引物、或具有序列表的序列號(hào)69所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)70所示的堿基序列的反義引物構(gòu)成的擴(kuò)增間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記基因的實(shí)時(shí)PCR所使用的引物。
進(jìn)而，用于擴(kuò)增本發(fā)明的用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)記基因的引物列舉如下由具有序列表的序列號(hào)71所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)72所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)73所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)74所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)75所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)76所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)77所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)78所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)79所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)80所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)81所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)82所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)83所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)84所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)85所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)86所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)87所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)88所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)89所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)90所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)91所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)92所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)93所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)94所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)95所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)96所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)97所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)98所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)99所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)100所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)101所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)102所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)103所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)104所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)105所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)106所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)107所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)108所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)109所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)110所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)111所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)112所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)113所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)114所示的堿基序列的反義引物、或具有序列表的序列號(hào)115所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)116所示的堿基序列的反義引物構(gòu)成的用于擴(kuò)增間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記基因的RT-PCR所使用的引物。
本發(fā)明中，對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的識(shí)別是以下述方式進(jìn)行在被檢細(xì)胞中以上述正義引物和反義引物的至少一對(duì)以上的引物進(jìn)行擴(kuò)增，采用用于檢測(cè)本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)記基因的探針對(duì)擴(kuò)增出的基因進(jìn)行檢測(cè)。
本發(fā)明的用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)記基因是在間充質(zhì)干細(xì)胞中特異性高表達(dá)的基因和特異性低表達(dá)的基因，通過(guò)以組合方式檢測(cè)這些基因表達(dá)，能夠提高間充質(zhì)干細(xì)胞檢測(cè)的精確度。因此，作為在間充質(zhì)干細(xì)胞中特異性高表達(dá)的基因，可例舉為序列表的序列號(hào)1、11和19構(gòu)成的間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記基因，作為在間充質(zhì)干細(xì)胞中特異性低表達(dá)的基因，可例舉為序列號(hào)2、4、6、7、9、10、12、14、15、17和46構(gòu)成的間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記基因。進(jìn)而，可以列舉出本發(fā)明中經(jīng)證實(shí)的間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記基因。因此，通過(guò)對(duì)各個(gè)基因的組合中的一個(gè)以上基因的表達(dá)進(jìn)行組合，可以以更高的檢測(cè)精確度對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別。
在通過(guò)采用利用本發(fā)明的抗體的熒光抗體法，對(duì)被檢細(xì)胞中的間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記多肽的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，從而識(shí)別分離間充質(zhì)干細(xì)胞的過(guò)程中可通過(guò)公知的方法對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記、分離。所述標(biāo)記方法，可舉例為如熒光抗體法。在通過(guò)熒光抗體法對(duì)未分化的造血細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記中，對(duì)與本發(fā)明的用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的多肽標(biāo)記特異性結(jié)合的抗體進(jìn)行熒光標(biāo)記，通過(guò)與表達(dá)所述抗原的間充質(zhì)干細(xì)胞結(jié)合，標(biāo)記間充質(zhì)干細(xì)胞(直接熒光抗體法)，或在表達(dá)抗原的間充質(zhì)干細(xì)胞與未標(biāo)記的本發(fā)明的特異抗體結(jié)合后，對(duì)與標(biāo)記的二次抗體結(jié)合的間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記(間接熒光抗體法)、對(duì)所述經(jīng)標(biāo)記的間充質(zhì)干細(xì)胞分離，收集。
本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞的檢測(cè)識(shí)別中所使用的用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記基因的探針，固定有該探針的用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記基因的微陣列或DNA芯片以及本發(fā)明的用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的抗體可以以裝備有上述物質(zhì)的用于識(shí)別間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒制品化形式存放。
下面，通過(guò)實(shí)施例更為具體地對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明，本發(fā)明的技術(shù)范圍不受其實(shí)施例所舉例的內(nèi)容限制。
實(shí)施例材料和方法(細(xì)胞)在Dalbecco’s modified Eagle’s medium(低葡萄糖)(Sigma公司制造)中添加了10％胎牛血清、1ng/ml bFGF的培養(yǎng)基中在37℃對(duì)人間充質(zhì)干細(xì)胞(human mesenchymal stemcell)和人成纖維細(xì)胞(human fibroblast)進(jìn)行培養(yǎng)。
(DNA微陣列)用TRIZOL試劑(Invitrogen公司制造)從一個(gè)10cm皿的各個(gè)細(xì)胞中抽提全部RNA，用micro poly(A)purist(Ambion公司制造)提取mRNA，進(jìn)行DNA微陣列(IncyteGenomics公司Kurabo Life Array analysis servis；Lot.No.KL01081)。并且，DNA微陣列分析委托Kurabo公司進(jìn)行。
(半定量RT-PCR)用TRIZOL試劑(Invitrogen公司制造)從各個(gè)細(xì)胞中抽提全部RNA后，以各個(gè)1mg全部RNA為模板，采用用于RT-PCR的SuperScript first-strand合成系統(tǒng)(Invitrogen公司)，42℃下進(jìn)行50分鐘逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)從而合成cDNA。以合成的cDNA為模板采用Advantage 2 PCR enzyme system(Clontech公司制造)對(duì)各個(gè)基因進(jìn)行擴(kuò)增。94℃下變性30秒，68℃下1分鐘內(nèi)退火30個(gè)循環(huán)。用于擴(kuò)增各個(gè)基因的引物序列匯集在表1中。通過(guò)采用1％瓊脂糖凝膠的電泳分離擴(kuò)增出的基因，通過(guò)溴乙錠染色進(jìn)行檢測(cè)。

實(shí)施例檢測(cè)結(jié)果(DNA微陣列)DNA微陣列的結(jié)果表明，9400個(gè)基因中，與在成纖維細(xì)胞中相比63個(gè)基因在間充質(zhì)干細(xì)胞中的顯著表達(dá)更高，141個(gè)基因表達(dá)較低。此外，還看出了除這些基因之外的其它基因的顯著差異。其中，發(fā)現(xiàn)存在3倍以上差異的87個(gè)基因中，在間充質(zhì)干細(xì)胞中高表達(dá)的基因?yàn)?9個(gè)基因，低表達(dá)的基因?yàn)?8個(gè)基因。
(半定量RT-PCR)從源于3個(gè)個(gè)體的間充質(zhì)干細(xì)胞和源于3個(gè)個(gè)體的成纖維細(xì)胞中抽提全長(zhǎng)RNA，以其為模板，通過(guò)半定量RT-PCR法就上述87個(gè)基因的表達(dá)量進(jìn)行調(diào)查。其結(jié)果是表達(dá)量未發(fā)現(xiàn)差異的基因最多。此外，不同個(gè)體的間充質(zhì)干細(xì)胞或成纖維細(xì)胞間表達(dá)量存在差異，認(rèn)為由個(gè)體不同產(chǎn)生的表達(dá)差異也很大(圖1)。
經(jīng)RT-PCR證實(shí)在間充質(zhì)干細(xì)胞中高表達(dá)的基因是絲氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑止劑(序列表的序列號(hào)1)、2類主要組織相容性復(fù)合體DRβ3(序列號(hào)11)、和組織因子途徑抑制物2(序列號(hào)19)這三個(gè)基因(圖2)。
此外，經(jīng)證實(shí)低表達(dá)的基因是(序列號(hào)2)、載脂蛋白D(序列號(hào)4)、XV-α型膠原酶(collagenase type XV alpha 1)(序列號(hào)6)、CUG三聯(lián)體重疊RNA結(jié)合蛋白(CUGtriplet repeat RNA binding protein)(序列號(hào)7)、皮膚橋蛋白(序列號(hào)9)、異檸檬酸脫氫酶2(序列號(hào)10)、酪氨酸激酶7(序列號(hào)12)、Sam68樣磷酸酪氨酸蛋白(序列號(hào)14)、C-型凝集素超家族成員2(序列號(hào)15)、和基質(zhì)金屬酶1(matrix metalloprotease 1)(序列號(hào)17)這10個(gè)基因(圖3)。并且，通過(guò)半定量RT-PCR法對(duì)這13個(gè)基因的表達(dá)量進(jìn)行證實(shí)，所述半定量RT-PCR法是以從源于7個(gè)個(gè)體的間充質(zhì)干細(xì)胞和4個(gè)個(gè)體成纖維細(xì)胞中抽提的全長(zhǎng)RNA作為模板的(圖4)。
實(shí)施例間充質(zhì)干細(xì)胞中各個(gè)基因的表達(dá)量的測(cè)定I以與實(shí)施例1相同方法，對(duì)本發(fā)明的基因標(biāo)記在人間充質(zhì)干細(xì)胞和人成纖維細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定。所使用的RT-PCR和實(shí)時(shí)PCR的引物和實(shí)時(shí)PCR所用探針示于表2中。

間充質(zhì)干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中的mRNA水平的表達(dá)狀況示于圖5。此外，間充質(zhì)干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中相對(duì)的mRNA水平的表達(dá)狀況示于圖6、7、8。
實(shí)施例間充質(zhì)干細(xì)胞中各個(gè)基因的表達(dá)量的測(cè)定II以與實(shí)施例1相同方法，對(duì)本發(fā)明的各個(gè)基因標(biāo)記在人間充質(zhì)干細(xì)胞和人成纖維細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定。所使用的RT-PCR的正義及反義引物如序列表的序列號(hào)71-116的序列所示。間充質(zhì)干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中的mRNA的表達(dá)狀況示于圖9和圖10。此外，間充質(zhì)干細(xì)胞/成纖維細(xì)胞的表達(dá)之比示于表3。
表3


實(shí)施例間充質(zhì)干細(xì)胞中各個(gè)基因的表達(dá)量的測(cè)定III以與實(shí)施例1相同方法，對(duì)本發(fā)明的各個(gè)基因標(biāo)記在人源間充質(zhì)干細(xì)胞和人成纖維細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定。間充質(zhì)干細(xì)胞/成纖維細(xì)胞的表達(dá)之比示于表4。
(表4)(間充質(zhì)干細(xì)胞/成纖維細(xì)胞) (基因名稱)







實(shí)施例間充質(zhì)干細(xì)胞中各個(gè)基因的表達(dá)量的測(cè)定IV以與實(shí)施例1相同方法，對(duì)本發(fā)明的各個(gè)基因標(biāo)記在人源間充質(zhì)干細(xì)胞和人成纖維細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定。間充質(zhì)干細(xì)胞/成纖維細(xì)胞的表達(dá)之比示于表5。表中的-表示的是在間充質(zhì)干細(xì)胞中基因不表達(dá)或極少量表達(dá)。
表5(間充質(zhì)干細(xì)胞/成纖維細(xì)胞) (基因名稱)


實(shí)施例人細(xì)胞中間充質(zhì)干細(xì)胞DR的表達(dá)的測(cè)定采用流式細(xì)胞儀測(cè)定人細(xì)胞中間充質(zhì)干細(xì)胞DR的表達(dá)。結(jié)果示于圖11中。
實(shí)施例8在間充質(zhì)干細(xì)胞的分化誘導(dǎo)中個(gè)基因的表達(dá)的變化以與實(shí)施例1相同方式進(jìn)行RT-PCR，測(cè)定間充質(zhì)干細(xì)胞的分化誘導(dǎo)中各基因表達(dá)的表化。成骨細(xì)胞的分化誘導(dǎo)中各基因的表達(dá)示于圖12-16中。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性近年來(lái)，隨著再生醫(yī)療的發(fā)展，間充質(zhì)干細(xì)胞作為可用于多種組織的再生醫(yī)療的移植材料受到人們關(guān)注。為了將間充質(zhì)干細(xì)胞利用于組織的再生醫(yī)療中，必須要開發(fā)出確保間充質(zhì)干細(xì)胞有足夠數(shù)量的技術(shù)，同時(shí)還必須證實(shí)所培養(yǎng)的細(xì)胞是間充質(zhì)干細(xì)胞，重要的是檢測(cè)、分離該間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。此外，采用抗體等從多種類型的細(xì)胞集團(tuán)中分離間充質(zhì)干細(xì)胞也是有用的。根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)對(duì)間充質(zhì)細(xì)胞的特征標(biāo)記基因進(jìn)行指示，就可能容易且確實(shí)地檢測(cè)識(shí)別間充質(zhì)干細(xì)胞，故而可期待為將間充質(zhì)干細(xì)胞在再生醫(yī)療中實(shí)用化作出重大貢獻(xiàn)。
序列表<110>獨(dú)立行政法人科學(xué)技術(shù)振興機(jī)構(gòu)(Japan Science and Technology Agency)加藤幸夫(Yukio KATO)智再如股份公司(Two Cells Co.，Ltd.)<120>檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)記和采用該標(biāo)記識(shí)別間充質(zhì)干細(xì)胞的方法<130>V320P006US(PCT)<150>JP2003-63077<151>2000-03-10<160>116<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>652<212>DNA<213>人<400>1gaattgccaa ttccttgttt gtgcaaaatg gatttcatgt caatgaggag tttttgcaaa 60tgatgaaaaa atattttaat gcagcagtaa atcatgtgga cttcagtcaa aatgtagccg 120
tggccaacta catcaataag tgggtggaga ataacacaaa caatctggtg aaagatttgg 180tatccccaag ggattttgat gctgccactt atctggccct cattaatgct gtctatttca 240aggggaactg gaagtcgcag tttaggcctg aaaatactag aaccttttct ttcactaaag 300atgatgaaag tgaagtccaa attccaatga tgtatcagca aggagaattt tattatgggg 360aatttagtga tggctccaat gaagctggtg gtatctacca agtcctagaa ataccatatg 420aaggagatga aataagcatg atgctggtgc tgtccagaca ggaagttcct cttgctactc 480tggagccatt agtcaaagca cagctggttg aagaatgggc aaactctgtg aagaagcaaa 540aagtagaagt atacctgccc aggttcacag tggaacagga aattgattta aaagatgttt 600tgaaggctct tggaataact gaaaattttc atcaaagatg caaattttga ca 652<210>2<211>1450<212>DNA<213>人<400>2ctggatagaa cagctcaagc cttgccactt cgggcttctc actgcagctg ggcttggact 60
tcggagtttt gccattgcca gtgggacgtc tgagactttc tccttcaagt acttggcaga 120tcactctctt agcagggtct gcgcttcgca gccgggatga agctggtttc cgtcgccctg 180atgtacctgg gttcgctcgc cttcctaggc gctgacaccg ctcggttgga tgtcgcgtcg 240gagtttcgaa agaagtggaa taagtgggct ctgagtcgtg ggaagaggga actgcggatg 300tccagcagct accccaccgg gctcgctgac gtgaaggccg ggcctgccca gacccttatt 360cggccccagg acatgaaggg tgcctctcga agccccgaag acagcagtcc ggatgccgcc 420cgcatccgag tcaagcgcta ccgccagagc atgaacaact tccagggcct ccggagcttt 480ggctgccgct tcgggacgtg cacggtgcag aagctggcac accagatcta ccagttcaca 540gataaggaca aggacaacgt cgcccccagg agcaagatca gcccccaggg ctacggccgc 600cggcgccggc gctccctgcc cgaggccggc ccgggtcgga ctctggtgtc ttctaagcca 660caagcacacg gggctccagc ccccccgagt ggaagtgctc cccactttct ttaggattta 720ggcgcccatg gtacaaggaa tagtcgcgca agcatcccgc tggtgcctcc cgggacgaag 780gacttcccga gcggtgtggg gaccgggctc tgacagccct gcggagaccc tgagtccggg 840aggcaccgtc cggcggcgag ctctggcttt gcaagggccc ctccttctgg gggcttcgct 900
tccttagcct tgctcaggtg caagtgcccc agggggcggg gtgcagaaga atccgagtgt 960ttgccaggct taaggagagg agaaactgag aaatgaatgc tgagaccccc ggagcagggg1020tctgagccac agccgtgctc gcccacaaac tgatttctca cggcgtgtca ccccaccagg1080gcgcaagcct cactattact tgaactttcc aaaacctaaa gaggaaaagt gcaatgcgtg1140ttgtacatac agaggtaact atcaatattt aagtttgttg ctgtcaagat tttttttgta1200acttcaaata tagagatatt tttgtacgtt atatattgta ttaagggcat tttaaaagca1260attatattgt cctcccccta ttttaagacg tgaatgtctc agcgaggtgt aaagttgttc1320gccgcgtgga atgtgagtgt gtttgtgtgc atgaaagaga aagactgatt acctcctgtg1380tggaagaagg aaacaccgag tctctgtata atctatttac ataaaatggg tgatatgcga1440acagcaaacc 1450<210>3<211>185<212>PRT<213>人
<400>3Met Lys Leu Val Ser Val Ala Leu Met Tyr Leu Gly Ser Leu Ala Phe1 5 10 15Leu Gly Ala Asp Thr Ala Arg Leu Asp Val Ala Ser Glu Phe Arg Lys20 25 30Lys Trp Asn Lys Trp Ala Leu Ser Arg Gly Lys Arg Glu Leu Arg Met35 40 45Ser Ser Ser Tyr Pro Thr Gly Leu Ala Asp Val Lys Ala Gly Pro Ala50 55 60Gln Thr Leu Ile Arg Pro Gln Asp Met Lys Gly Ala Ser Arg Ser Pro65 70 75 80Glu Asp Ser Ser Pro Asp Ala Ala Arg Ile Arg Val Lys Arg Tyr Arg85 90 95Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys Arg Phe100 105 110Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln Phe Thr115 120 125Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser Pro Gln130 135 140Gly Tyr Gly Arg Arg Arg Arg Arg Ser Leu Pro Glu Ala Gly Pro Gly145 150 155 160Arg Thr Leu Val Ser Ser Lys Pro Gln Ala His Gly Ala Pro Ala Pro165 170 175Pro Ser Gly Ser Ala Pro His Phe Leu180 185
<210>4<211>809<212>DNA<213>人<400>4atgcctgtct tcatcttgaa agaaaagctc caggtccctt ctccagccac ccagccccaa 60gatggtgatg ctgctgctgc tgctttccgc actggctggc ctcttcggtg cggcagaggg 120acaagcattt catcttggga agtgccccaa tcctccggtg caggagaatt ttgacgtgaa 180taagtatctc ggaagatggt acgaaattga gaagatccca acaacctttg agaatggacg 240ctgcatccag gccaactact cactaatgga aaacggaaag atcaaagtgt taaaccagga 300gttgagagct gatggaactg tgaatcaaat cgaaggtgaa gccaccccag ttaacctcac 360agagcctgcc aagctggaag ttaagttttc ctggtttatg ccatcggcac cgtactggat 420cctggccacc gactatgaga actatgccct cgtgtattcc tgtacctgca tcatccaact 480ttttcacgtg gattttgctt ggatcttggc aagaaaccct aatctccctc cagaaacagt 540ggactctcta aaaaatatcc tgacttctaa taacattgat gtcaagaaaa tgacggtcac 600agaccaggtg aactgcccca agctctcgta accaggttct acagggaggc tgcacccact 660
ccatgttact tctgcttcgc tttcccctac cccacccccc cccataaaga caaaccaatc 720aaccacgaca aaggaagttg acctaaacat gtaaccatgc cctaccctgt taccttgcta 780gctgcaaaat aaacttgttg ctgacctgc 809<210>5<211>189<212>PRT<213>人<400>5Met Val Met Leu Leu Leu Leu Leu Ser Ala Leu Ala Gly Leu Phe Gly1 5 10 15Ala Ala Glu Gly Gln Ala Phe His Leu Gly Lys Cys Pro Asn Pro Pro20 25 30Val Gln Glu Asn Phe Asp Val Asn Lys Tyr Leu Gly Arg Trp Tyr Glu35 40 45Ile Glu Lys Ile Pro Thr Thr Phe Glu Asn Gly Arg Cys Ile Gln Ala50 55 60Asn Tyr Ser Leu Met Glu Asn Gly Lys Ile Lys Val Leu Asn Gln Glu65 70 75 80Leu Arg Ala Asp Gly Thr Val Asn Gln Ile Glu Gly Glu Ala Thr Pro85 90 95Val Asn Leu Thr Glu Pro Ala Lys Leu Glu Val Lys Phe Ser Trp Phe
100 105 110Met Pro Ser Ala Pro Tyr Trp Ile Leu Ala Thr Asp Tyr Glu Asn Tyr115 120 125Ala Leu Val Tyr Ser Cys Thr Cys Ile Ile Gln Leu Phe His Val Asp130 135 140Phe Ala Trp Ile Leu Ala Arg Asn Pro Asn Leu Pro Pro Glu Thr Val145 150 155 160Asp Ser Leu Lys Asn Ile Leu Thr Ser Asn Asn Ile Asp Val Lys Lys165 170 175Met Thr Val Thr Asp Gln Val Asn Cys Pro Lys Leu Ser180 185<210>6<211>2127<212>DNA<213>人<400>6gaaagatgga tcactccagc tcaaagagaa catgtgggaa tgaaaggaca ggctgggccc 60aaaggagaaa agggtgatgc tggggaggag cttcctggcc ctcctgaacc ttctgggcct 120gttggaccca cggcaggagc agaagcagag ggctctggcc taggctgggg ctcggacgtc 180ggctctggct ctggtgacct ggtgggcagt gagcagctgc tgagaggtcc tccaggaccc 240
ccagggccac ctggcttacc tgggattcca ggaaaaccag gaactgatgt tttcatggga 300ccccctggat ctcctggaga ggatggacct gctggtgaac ctgggccccc gggccctgag 360ggacagcctg gagttgatgg agccaccggc cttcccggga tgaaagggga gaagggagca 420agagggccta atggctcagt tggtgaaaag ggtgaccctg gcaacagagg cttacctgga 480cccccgggga aaaagggaca agctggccct cctggggtca tgggaccccc agggcctcct 540ggaccccctg ggcccccagg ccctggatgc acaatgggac ttggattcga ggataccgaa 600ggctctggaa gcacccagct attgaatgaa cccaaactct ccagaccaac ggctgcaatt 660ggtctcaaag gagagaaagg agaccgggga cccaagggag aaagggggat ggatggagcc 720agtattgtgg gaccccctgg gccgagaggg ccacctgggc acatcaaggt cttgtctaat 780tccttgatca atatcaccca tggattcatg aatttctcgg acattcctga gctggtgggg 840cctccggggc cggacgggtt gcctgggctg ccaggatttc caggtcctag aggaccaaaa 900ggtgacactg gtttacctgg ctttccagga ctaaaaggag aacagggcga gaagggagag 960ccgggtgcca tcctgacaga ggacattcct ctggaaaggc tgatggggaa aaagggtgaa1020cctggaatgc atggagcccc aggaccaatg gggcccaaag gaccaccagg acataaagga1080
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Lys Glu Leu Phe Glu Pro Tyr Gly Ala Val Tyr Gln Ile Asn Val Leu35 40 45Arg Asp Arg Ser Gln Asn Pro Pro Gln Ser Lys Gly Cys Cys Phe Val50 55 60Thr Phe Tyr Thr Arg Lys Ala Ala Leu Glu Ala Gln Asn Ala Leu His65 70 75 80Asn Ile Lys Thr Leu Pro Gly Met His His Pro Ile Gln Met Lys Pro85 90 95Ala Asp Ser Glu Lys Ser Asn Ala Val Glu Asp Arg Lys Leu Phe Ile100 105 110Gly Met Val Ser Lys Lys Cys Asn Glu Asn Asp Ile Arg Val Met Phe115 120 125Ser Pro Phe Gly Gln Ile Glu Glu Cys Arg Ile Leu Arg Gly Pro Asp130 135 140Gly Leu Ser Arg Gly Cys Ala Phe Val Thr Phe Ser Thr Arg Ala Met145 150 155 160Ala Gln Asn Ala Ile Lys Ala Met His Gln Ser Gln Thr Met Glu Gly165 170 175Cys Ser Ser Pro Ile Val Val Lys Phe Ala Asp Thr Gln Lys Asp Lys180 185 190Glu Gln Arg Arg Leu Gln Gln Gln Leu Ala Gln Gln Met Gln Gln Leu195 200 205Asn Thr Ala Thr Trp Gly Asn Leu Thr Gly Leu Gly Gly Leu Thr Pro210 215 220Gln Tyr Leu Ala Leu Leu Gln Gln Ala Thr Ser Ser Ser Asn Leu Gly225 230 235 240Ala Phe Ser Gly Ile Gln Gln Met Ala Gly Met Asn Ala Leu Gln Leu
245 250 255Gln Asn Leu Ala Thr Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gln Thr Ser260 265 270Ala Thr Ser Thr Asn Ala Asn Pro Leu Ser Thr Thr Ser Ser Ala Leu275 280 285Gly Ala Leu Thr Ser Pro Val Ala Ala Ser Thr Pro Asn Ser Thr Ala290 295 300Gly Ala Ala Met Asn Ser Leu Thr Ser Leu Gly Thr Leu Gln Gly Leu305 310 315 320Ala Gly Ala Thr Val Gly Leu Asn Asn Ile Asn Ala Leu Ala Val Ala325 330 335Gln Met Leu Ser Gly Met Ala Ala Leu Asn Gly Gly Leu Gly Ala Thr340 345 350Gly Leu Thr Asn Gly Thr Ala Gly Thr Met Asp Ala Leu Thr Gln Ala355 360 365Tyr Ser Gly Ile Gln Gln Tyr Ala Ala Ala Ala Leu Pro Thr Leu Tyr370 375 380Ser Gln Ser Leu Leu Gln Gln Gln Ser Ala Ala Gly Ser Gln Lys Glu385 390 395 400Gly Pro Glu Gly Ala Asn Leu Phe Ile Tyr His Leu Pro Gln Glu Phe405 410 415Gly Asp Gln His Ile Leu Gln Met Phe Met Pro Phe Gly Asn Val Ile420 425 430Ser Ala Lys Val Phe Ile Asp Lys Gln Thr Asn Leu Ser Lys Cys Phe435 440 445Gly Phe Val Ser Tyr Asp Asn Pro Val Ser Ala Gln Ala Ala Ile Gln450 455 460
Ala Met Asn Gly Phe Gln Ile Gly Met Lys Arg Leu Lys Val Gln Leu465 470 475 480Lys Arg Ser Lys Asn Asp Ser Lys Pro Tyr485 490<210>9<211>419<212>DNA<213>人<400>9tttttttttt tttttttcag catagtgaac gttaatattt ttatttcttt tgtaatgaag 60agtacaaatg gttgggagca ggacatcaca ggaggaggaa agatagcgcc atctctgcag 120aagaactcct gagccacaca cagaaggaaa gttgatcccc agggcagcct ttcccaccaa 180aaaaatcagg cccaatccag gagagtttgc cagtagctcc ccagggttcc agggtgtctg 240ccagccttcc taggaatcgt gggcaggctt ctaggtgcca gtgactcaaa ctcctttttc 300cacttcccag ttcaacctgg tcactctcat ccccacaagt tcccaatctg aatcccattc 360tctgaccatt ctctgcttcc ttgtttttaa tctcatttga gagtgatcct cacgggttc 419<210>10
<211>762<212>DNA<213>人<400>10gccgggagga gcggcgcgcg ctcggacctc tcccgccctg ctcgttcgct ctccagcttg 60ggatggccgg ctacctgcgg gtcgtgcgct cgctctgcag agcctcaggc tcgcggccgg 120cctgggcgcc ggcggccctg acagccccca cctcgcaaga gcagccgcgg cgccactatg 180ccgacaaaag gatcaaggtg gcgaagccgt ggtggagatg gatggtgatg agatgacccg 240tattatctgg cagttcatca aggagaagct catcctgccc cacgtggaca tccagctaaa 300gtattttgac ctcgggctcc caaaccgtga ccagactgat gaccaggtca ccattgactc 360tgcactggcc acccagaagt acagtgtggc tgtcaagtgt gccaccatca cccctgatga 420ggcccgtgtg gaagagttca agctgaagaa gatgtggaaa agtcccaatg gaactatccg 480gaacatcctg ggggggactg tcttccggga gcccatcatc tgcaaaaaca tcccacgcct 540agtccctggc tggaccaagc ccatcaccat tggcaggcac gcccatggcg accagtacaa 600ggccacagac tttgtggcag accgggccgg cactttcaaa atggtcttca ccccaaaaga 660
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tgccctagtg caacaggcat tgctgaggtc tgagcagggc ctggcctttc ctcctcttcc1260tcaccctcat cctttgggag gctgacttgg acccaaactg ggcgactagg gctttgagct1320gggcagtttt ccctgccacc tcttcctcta tcagggacag tgtgggtgcc acaggtaacc1380ccaatttctg gccttcaact tctccccttg accgggtcca actctgccac tcatctgcca1440actttgcctg gggagggcta ggcttgggat gagctgggtt tgtggggagt tccttaatat1500tctcaagttc tgggcacaca gggttaatga gtctcttggc ccactggtcc cacttggggg1560tctagaccag gattatagag gacacagcaa gtgagtcctc cccactctgg gcttgtgcac1620actgacccag acccacgtct tccccaccct tctctccttt cctcatccta agtgcctggc1680agatgaagga gttttcagga gcttttgaca ctatataaac cgcccttttt gtatgcacca1740cgggcggctt ttatatgtaa ttgcagcgtg gggtgggtgg gcatgggagg taggggtggg1800ccctggagat gaggagggtg ggccatcctt accccacact tttattgttg tcgttttttg1860tttgttttgt ttttttgttt ttgtttttgt ttttacactc gctgctctca ataaataagc1920cttttttaca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1959
<210>13<211>364<212>PRT<213>人<400>13Glu His Ala Gly Val Arg Leu Pro Thr His Gly Arg Val Tyr Gln Lys1 5 10 15Gly His Glu Leu Val Leu Ala Asn Ile Ala Glu Ser Asp Ala Gly Val20 25 30Tyr Thr Cys His Ala Ala Asn Leu Ala Gly Gln Arg Arg Gln Asp Val35 40 45Asn Ile Thr Val Ala Thr Val Pro Ser Trp Leu Lys Lys Pro Gln Asp50 55 60Ser Gln Leu Glu Glu Gly Lys Pro Gly Tyr Leu Asp Cys Leu Thr Gln65 70 75 80Ala Thr Pro Lys Pro Thr Val Val Trp Tyr Arg Asn Gln Met Leu Ile85 90 95Ser Glu Asp Ser Arg Phe Glu Val Phe Leu Ala Lys Ala Gln Gly Leu100 105 110
Glu Glu Gly Val Ala Glu Thr Leu Val Leu Val Lys Ser Leu Gln Ser115 120 125Lys Asp Glu Gln Gln Gln Leu Asp Phe Arg Arg Glu Leu Glu Met Phe130 135 140Gly Lys Leu Asn His Ala Asn Val Val Arg Leu Leu Gly Leu Cys Arg145 150 155 160Glu Ala Glu Pro His Tyr Met Val Leu Glu Tyr Val Asp Leu Gly Asp165 170 175Leu Lys Gln Phe Leu Arg Ile Ser Lys Ser Lys Asp Glu Lys Leu Lys180 185 190Ser Gln Pro Leu Ser Thr Lys Gln Lys Val Ala Leu Cys Thr Gln Val195 200 205Ala Leu Gly Met Glu His Leu Ser Asn Asn Arg Phe Val His Lys Asp210 215 220Leu Ala Ala Arg Asn Cys Leu Val Ser Ala Gln Arg Gln Val Lys Val225 230 235 240Ser Ala Leu Gly Leu Ser Lys Asp Val Tyr Asn Ser Glu Tyr Tyr His245 250 255
Phe Arg Gln Ala Trp Val Pro Leu Arg Trp Met Ser Pro Glu Ala Ile260 265 270Leu Glu Gly Asp Phe Ser Thr Lys Ser Asp Val Trp Ala Phe Gly Val275 280 285Leu Met Trp Glu Val Phe Thr His Gly Glu Met Pro His Gly Gly Gln290 295 300Ala Asp Asp Glu Val Leu Ala Asp Leu Gln Ala Gly Lys Ala Arg Leu305 310 315 320Pro Gln Pro Glu Gly Cys Pro Ser Lys Leu Tyr Arg Leu Met Gln Arg325 330 335Cys Trp Ala Leu Ser Pro Lys Asp Arg Pro Ser Phe Ser Glu Ile Ala340 345 350Ser Ala Leu Gly Asp Ser Thr Val Asp Ser Lys Pro355 360<210>14<211>430<212>DNA<213>人
<400>14ggttgatgtt tcaacaaagt agttttaagt tccatccatt cagattttaa gcattttgat 60ttatttaaaa agggattgtt catagaaaaa aattactttg aacagtatac aggactggtg 120gagattggct atttcacaac atcagacagt acaatcagta tctgccatat ggctggtctc 180tgtagacgcc ctttgctgtc ctcgctgaag gtgccttgtg tcttgagtta gtccactctt 240cttgcccgta ggaatcataa gtctcctcac tgagtccatg tccgtaatca tagtaatcag 300caccactttg ggctggggtg ctatagctgt tatcatagga atcataactc tgttcatcat 360aagcagtgcc atatccatca tcatagtcat attctccata agtctcttgg tgtcgggggt 420ggcggtggaa430<210>15<211>616<212>DNA<213>人<400>15ggtatgatga ccaaacataa aaagtgtttt ataattgttg gtgttttaat aacaactaat 60
attattactc tgatagttaa actaactcga gattctcaga gtttatgccc ctatgattgg 120attggtttcc aaaacaaatg ctattatttc tctaaagaag aaggagattg gaattcaagt 180aaatacaact gttccactca acatgccgac ctaactataa ttgacaacat agaagaaatg 240aattttctta ggcggtataa atgcagttct gatcactgga ttggactgaa gatggcaaaa 300aatcgaacag gacaatgggt agatggagct acatttacca aatcgtttgg catgagaggg 360agtgaaggat gtgcctacct cagcgatgat ggtgcagcaa cagctagatg ttacaccgaa 420agaaaatgga tttgcaggaa aagaatacac taagttaatg tctaagataa tggggaaaat 480agaaaataac attattaagt gtaaaaccag caaagtactt ttttaattaa acaaagttcg 540agttttgtac ctgtctggtt aattctgctt acgtgtcagg ctacacataa aagccacttc 600aaagattggc aaaaaa 616<400>16Met Met Thr Lys His Lys Lys Cys Phe Ile Ile Val Gly Val Leu Ile1 5 10 15Thr Thr Asn Ile Ile Thr Leu Ile Val Lys Leu Thr Arg Asp Ser Gln20 25 30Ser Leu Cys Pro Tyr Asp Trp Ile Gly Phe Gln Asn Lys Cys Tyr Tyr
35 40 45Phe Ser Lys Glu Glu Gly Asp Trp Asn Ser Ser Lys Tyr Asn Cys Ser50 55 60Thr Gln His Ala Asp Leu Thr Ile Ile Asp Asn Ile Glu Glu Met Asn65 70 75 80Phe Leu Arg Arg Tyr Lys Cys Ser Ser Asp His Trp Ile Gly Leu Lys85 90 95Met Ala Lys Asn Arg Thr Gly Gln Trp Val Asp Gly Ala Thr Phe Thr100 105 110Lys Ser Phe Gly Met Arg Gly Ser Glu Gly Cys Ala Tyr Leu Ser Asp115 120 125Asp Gly Ala Ala Thr Ala Arg Cys Tyr Thr Glu Arg Lys Trp Ile Cys130 135 140Arg Lys Arg Ile His145<210>17<211>1973<212>DNA<213>人<400>17gggatattgg agtagcaaga ggctgggaag ccatcactta ccttgcactg agaaagaaga 60caaaggccag tatgcacagc tttcctccac tgctgctgct gctgttctgg ggtgtggtgt 120
ctcacagctt cccagcgact ctagaaacac aagagcaaga tgtggactta gtccagaaat 180acctggaaaa atactacaac ctgaagaatg atgggaggca agttgaaaag cggagaaata 240gtggcccagt ggttgaaaaa ttgaagcaaa tgcaggaatt ctttgggctg aaagtgactg 300ggaaaccaga tgctgaaacc ctgaaggtga tgaagcagcc cagatgtgga gtgcctgatg 360tggctcagtt tgtcctcact gaggggaacc ctcgctggga gcaaacacat ctgacctaca 420ggattgaaaa ttacacgcca gatttgccaa gagcagatgt ggaccatgcc attgagaaag 480ccttccaact ctggagtaat gtcacacctc tgacattcac caaggtctct gagggtcaag 540cagacatcat gatatctttt gtcaggggag atcatcggga caactctcct tttgatggac 600ctggaggaaa tcttgctcat gcttttcaac caggcccagg tattggaggg gatgctcatt 660ttgatgaaga tgaaaggtgg accaacaatt tcagagagta caacttacat cgtgttgcgg 720ctcatgaact cggccattct cttggactct cccattctac tgatatcggg gctttgatgt 780accctagcta caccttcagt ggtgatgttc agctagctca ggatgacatt gatggcatcc 840aagccatata tggacgttcc caaaatcctg tccagcccat cggcccacaa accccaaaag 900cgtgtgacag taagctaacc tttgatgcta taactacgat tcggggagaa gtgatgttct 960
ttaaagacag attctacatg cgcacaaatc ccttctaccc ggaagttgag ctcaatttca1020tttctgtttt ctggccacaa ctgccaaatg ggcttgaagc tgcttacgaa tttgccgaca1080gagatgaagt ccggtttttc aaagggaata agtactgggc tgttcaggga cagaatgtgc1140tacacggata ccccaaggac atctacagct cctttggctt ccctagaact gtgaagcata1200tcgatgctgc tctttctgag gaaaacactg gaaaaaccta cttctttgtt gctaacaaat1260actggaggta tgatgaatat aaacgatcta tggatccagg ttatcccaaa atgatagcac1320atgactttcc tggaattggc cacaaagttg atgcagtttt catgaaagat ggatttttct1380atttctttca tggaacaaga caatacaaat ttgatcctaa aacgaagaga attttgactc1440tccagaaagc taatagctgg ttcaactgca ggaaaaattg aacattacta atttgaatgg1500aaaacacatg gtgtgagtcc aaagaaggtg ttttcctgaa gaactgtcta ttttctcagt1560catttttaac ctctagagtc actgatacac agaatataat cttatttata cctcagtttg1620catatttttt tactatttag aatgtagccc tttttgtact gatataattt agttccacaa1680atggtgggta caaaaagtca agtttgtggc ttatggattc atataggcca gagttgcaaa1740
gatcttttcc agagtatgca actctgacgt tgatcccaga gagcagcttc agtgacaaac1800atatcctttc aagacagaaa gagacaggag acatgagtct ttgccggagg aaaagcagct1860caagaacaca tgtgcagtca ctggtgtcac cctggatagg caagggataa ctcttctaac1920acaaaataag tgttttatgt ttggaataaa gtcaaccttg tttctactgt ttt 1973<210>18<211>469<212>PRT<213>人<400>18Met His Ser Phe Pro Pro Leu Leu Leu Leu Leu Phe Trp Gly Val Val1 5 10 15Ser His Ser Phe Pro Ala Thr Leu Glu Thr Gln Glu Gln Asp Val Asp20 25 30Leu Val Gln Lys Tyr Leu Glu Lys Tyr Tyr Asn Leu Lys Asn Asp Gly35 40 45
Arg Gln Val Glu Lys Arg Arg Asn Ser Gly Pro Val Val Glu Lys Leu50 55 60Lys Gln Met Gln Glu Phe Phe Gly Leu Lys Val Thr Gly Lys Pro Asp65 70 75 80Ala Glu Thr Leu Lys Val Met Lys Gln Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp85 90 95Val Ala Gln Phe Val Leu Thr Glu Gly Asn Pro Arg Trp Glu Gln Thr100 105 110His Leu Thr Tyr Arg Ile Glu Asn Tyr Thr Pro Asp Leu Pro Arg Ala115 120 125Asp Val Asp His Ala Ile Glu Lys Ala Phe Gln Leu Trp Ser Asn Val130 135 140Thr Pro Leu Thr Phe Thr Lys Val Ser Glu Gly Gln Ala Asp Ile Met145 150 155 160
Ile Ser Phe Val Arg Gly Asp His Arg Asp Asn Ser Pro Phe Asp Gly165 170 175Pro Gly Gly Asn Leu Ala His Ala Phe Gln Pro Gly Pro Gly Ile Gly180 185 190Gly Asp Ala His Phe Asp Glu Asp Glu Arg Trp Thr Asn Asn Phe Arg195 200 205Glu Tyr Asn Leu His Arg Val Ala Ala His Glu Leu Gly His Ser Leu210 215 220Gly Leu Ser His Ser Thr Asp Ile Gly Ala Leu Met Tyr Pro Ser Tyr225 230 235 240Thr Phe Ser Gly Asp Val Gln Leu Ala Gln Asp Asp Ile Asp Gly Ile245 250 255Gln Ala Ile Tyr Gly Arg Ser Gln Asn Pro Val Gln Pro Ile Gly Pro
260 265 270Gln Thr Pro Lys Ala Cys Asp Ser Lys Leu Thr Phe Asp Ala Ile Thr275 280 285Thr Ile Arg Gly Glu Val Met Phe Phe Lys Asp Arg Phe Tyr Met Arg290 295 300Thr Asn Pro Phe Tyr Pro Glu Val Glu Leu Asn Phe Ile Ser Val Phe305 310 315 320Trp Pro Gln Leu Pro Asn Gly Leu Glu Ala Ala Tyr Glu Phe Ala Asp325 330 335Arg Asp Glu Val Arg Phe Phe Lys Gly Asn Lys Tyr Trp Ala Val Gln340 345 350Gly Gln Asn Val Leu His Gly Tyr Pro Lys Asp Ile Tyr Ser Ser Phe355 360 365
Gly Phe Pro Arg Thr Val Lys His Ile Asp Ala Ala Leu Ser Glu Glu370 375 380Asn Thr Gly Lys Thr Tyr Phe Phe Val Ala Asn Lys Tyr Trp Arg Tyr385 390 395 400Asp Glu Tyr Lys Arg Ser Met Asp Pro Gly Tyr Pro Lys Met Ile Ala405 410 415His Asp Phe Pro Gly Ile Gly His Lys Val Asp Ala Val Phe Met Lys420 425 430Asp Gly Phe Phe Tyr Phe Phe His Gly Thr Arg Gln Tyr Lys Phe Asp435 440 445Pro Lys Thr Lys Arg Ile Leu Thr Leu Gln Lys Ala Asn Ser Trp Phe450 455 460Asn Cys Arg Lys Asn465
<210>19<211>1141<212>DNA<213>人<400>19ccgccaggcg ctttctcgga cgccttgccc agcgggccgc ccgaccccct gcaccatgga 60ccccgctcgc cccctggggc tgtcgattct gctgcttttc ctgacggagg ctgcactggg 120cgatgctgct caggagccaa caggaaataa cgcggagatc tgtctcctgc ccctagacta 180cggaccctgc cgggccctac ttctccgtta ctactacgac aggtacacgc agagctgccg 240ccagttcctg tacgggggct gcgagggcaa cgccaacaat ttctacacct gggaggcttg 300cgacgatgct tgctggagga tagaaaaagt tcccaaagtt tgccggctgc aagtgagtgt 360ggacgaccag tgtgaggggt ccacagaaaa gtatttcttt aatctaagtt ccatgacatg 420tgaaaaattc ttttccggtg ggtgtcaccg gaaccggatt gagaacaggt ttccagatga 480agctacttgt atgggcttct gcgcaccaaa gaaaattcca tcattttgct acagtccaaa 540agatgaggga ctgtgctctg ccaatgtgac tcgctattat tttaatccaa gatacagaac 600
ctgtgatgct ttcacctata ctggctgtgg agggaatgac aataactttg ttagcaggga 660ggattgcaaa cgtgcatgtg caaaagcttt gaaaaagaaa aagaagatgc caaagcttcg 720ctttgccagt agaatccgga aaattcggaa gaagcaattt taaacattct taatatgtca 780tcttgtttgt ctttatggct tatttgcctt tatggttgta tctgaagaat aatatgacag 840catgaggaaa caaatcattg gtgatttatt caccagtttt tattaataca agtcactttt 900taaaaaattt ggattttttt atatataact agctgctatt caaatgtgag tctaccattt 960ttaatttatg gttcaactgt ttgtgagact gaattcttgc aatgcataag atataaaagc1020aaatatgact cactcatttc ttggggtcgt attcctgatt tcagaagagg atcataactg1080aaacaacata agacaatata atcatgtgct tttaacatat ttgagaataa aaaggactag1140c1141<210>20<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>序列絲氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制因子正義引物<400>20ccaaactttg aaagccaagg tg 22<210>21<211>21<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>絲氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制因子反義引物<400>21tgcacttcaa agaccagcag g21<210>22<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>腎上腺髓質(zhì)素正義引物<400>22
aggaatagtc gcgcaagcat c21<210>23<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>腎上腺髓質(zhì)素反義引物<400>23cacgcattgc acttttcctc tt 22<210>24<211>21<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>載脂蛋白D正義引物<400>24tgaagccacc ccagttaacc t21
<210>25<211>23<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>載脂蛋白D反義引物<400>25ggtcaacttc ctttgtgcgt ggt 23<210>26<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>a-1 XV型膠原蛋白正義引物<400>26accaaaccct atttcaagtg cc 22<210>27<211>21<212>DNA
<213>人工系列<220>
<223>a-1 XV型膠原蛋白反義引物<400>27tagttatcca caaggcggac g21<210>28<211>21<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>CUG三聯(lián)體重復(fù)RNA結(jié)合蛋白2正義引物<400>28atgtttgtcg gacagatccc c21<210>29<211>21<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>CUG三聯(lián)體重復(fù)RNA結(jié)合蛋白2反義引物<400>29atgtgacaaa cgcacagcct c21<210>30<211>20<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>皮膚橋蛋白正義引物<400>30atttgaaccg gcaaggcttc 20<210>31<211>21<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>皮膚橋蛋白反義引物<400>31
aagtggttgt tgctcctcgg a21<210>32<211>20<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>異檸檬酸脫氫酶正義引物<400>32tgccatccag aagaaatggc 20<210>33<211>19<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>異檸檬酸脫氫酶反義引物<400>33aggcaaagat gctggcgat 19
<210>34<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>MHC II類DRβ3正義引物<400>34tagctgtgga caaagccaac ct 22<210>35<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>MHC II類DRβ3反義引物<400>35ggcacacacc acgttctctg ta 22<210>36<211>22<212>DNA
<213>人工系列<220>
<223>蛋白質(zhì)酪氨酸激酶7正義引物<400>36tggaaccaga gcgtacgact gt 22<210>37<211>19<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>蛋白質(zhì)酪氨酸激酶7反義引物<400>37tggctttgca gcgcttctt 19<210>38<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>類Sam68磷酸化酪氨酸蛋白質(zhì)，T-STAR正義引物<400>38aggagaaggc aaggatgaag aa 22<210>39<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>類Sam68磷酸化酪氨酸蛋白質(zhì)，T-STAR反義引物<400>39tgttaactcc tggagctgtg ct 22<210>40<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>C-型凝集素超家族成員2正義引物<400>40
gcccctatga ttggattggt tt 22<210>41<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>C-型凝集素超家族成員2反義引物<400>41catccttcac tccctctcat gc 22<210>42<211>25<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>MMP(基質(zhì)金屬蛋白酶)1正義引物<400>42cgactctaga aacacaagag caaga25
<210>43<211>25<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>MMP(基質(zhì)金屬蛋白酶)1反義引物<400>43aaggttagct tactgtcaca cgctt25<210>44<211>17<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>TFPI(組織因子途徑抑制物)2正義引物<400>44gtcgattctg cttttcc 17<210>45<211>20<212>DNA
<213>人工系列<220>
<223>TFPI(組織因子途徑抑制物)2反義引物<400>45atggaatttt ctttggtgcg 20<210>46<211>1045<212>DNA<213>人<400>46ctcccgagct ctactgactc ccaacagagc gcccaagcaa gaaaatggcc ataagtggag 60tccctgtgct aggatttttc atcatagctg tgctgatgag cgctcaggaa tcatgggcta 120tcaaagaaga acatgtgatc atccaggccg agttctatct gaatcctgac caatcaggcg 180agtttatgtt tgactttgat ggtgatgaga ttttccatgt ggatatggca aagaaggaga 240cggtctggcg gcttgaagaa tttggacgat ttgccagctt tgaggctcaa ggtgcattgg 300ccaacatagc tgtggacaaa gccaacctgg aaatcatgac aaagcgctcc aactatactc 360
cgatcaccaa tgtacctcca gaggtaactg tgctcacgaa cagccctgtg gaactgagag 420agcccaacgt cctcatctgt ttcatcgaca agttcacccc accagtggtc aatgtcacgt 480ggcttcgaaa tggaaaacct gtcaccacag gagtgtcaga gacagtcttc ctgcccaggg 540aagaccacct tttccgcaag ttccactatc tccccttcct gccctcaact gaggacgttt 600acgactgcag ggtggagcac tggggcttgg actgagcctc ttctcaagca ctgggaggtt 660gatgctccaa gcccgtctcc agagacttac gagacgtggt gtgtgccctg gggctgactg 720tgggtctggt cgggcttcct ttgggaccct ctttcatcat ccacggcgag tgcgccaaaa 780gcattgccca gaaacccagg gggccctctg taaggcctgt gcgggggcag aacggtccct 840taaaaagaag aacctcgtgg gcaaaacctg gegcaagacg tcatacaaag ggggggcata 900taacacgcgt gccccagaac gaccgcactc agggctcgcc gcctataaca ccccggtgtg 960gtacccccaa ggcgcgctaa aactaaacag cgcgcacata gtagctcagg cgatacacca1020ctcacatata taatagcacc gctaa 1045<210>47<211>18
<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>用于RT-PCR的腎上腺髓質(zhì)素引物<400>47ggtttccgtc gccctgat18<210>48<211>24<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>用于RT-PCR的腎上腺髓質(zhì)素引物<400>48gagcccactt attccacttc tttc 24<210>49<211>22<212>DNA<213>人工系列
<220>
<223>用于RT-PCR的基質(zhì)金屬蛋白酶1引物<400>49gatggacctg gaggaaatct tg 22<210>50<211>24<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>用于RT-PCR的基質(zhì)金屬蛋白酶1引物<400>50ccgcaacacg atgtaagttg tact 24<210>51<211>21<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>用于RT-PCR的組織因子途徑抑制物2引物
<400>51ggcaacgcca acaatttcta c21<210>52<211>26<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>用于RT-PCR的組織因子途徑抑制物2引物<400>52caaactttgg gaactttttc tatcct 26<210>53<211>23<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>用于RT-PCR的絲氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑止因子引物<400>53tgggtggaga ataacacaaa caa 23
<210>54<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>用于RT-PCR的絲氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑止因子引物<400>54ccagataagt ggcagcatca aa 22<210>55<211>28<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>用于RT-PCR的蛋白質(zhì)酪氨酸激酶7引物<400>55gggagttcct taatattctc aagttctg 28<210>56<211>27
<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>蛋白質(zhì)酪氨酸激酶7<400>56gctgtgtcct ctataatcct ggtctag 27<210>57<211>20<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>用于RT-PCR的膠原蛋白，XV型，α1引物<400>57ccagcaaccc acatcagctt 20<210>58<211>23<212>DNA<213>人工系列
<220>
<223>用于RT-PCR的膠原蛋白，XV型，α1引物<400>58atgcagagca ggcttctcat aat 23<210>59<211>29<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>用于RT-PCR的類Sam68磷酸化酪氨酸蛋白質(zhì)引物<400>59tcacaacatc agacagtaca atcagtatc29<210>60<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>用于RT-PCR的類Sam68磷酸化酪氨酸蛋白質(zhì)引物
<400>60acgggcaaga agagtggact aa 22<210>61<211>23<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>用于RT-PCR的載脂蛋白D引物<400>61tgagaagatc ccaacaacct ttg 23<210>62<211>24<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>用于RT-PCR的載脂蛋白D引物<400>62tgatctttcc gttttccatt agtg 24
<210>63<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>主要組織相容性復(fù)合體DRβ<400>63ggctgaagtc cagagtgtcc tt 22<210>64<211>18<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>用于RT-PCR的主要組織相容性復(fù)合體DRβ引物<400>64gctgggcctg ctcttcct18<210>65<211>19
<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>用于RT-PCR的主要組織相容性復(fù)合體DRα引物<400>65gcccagggaa gaccacctt 19<210>66<211>23<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>用于RT-PCR的主要組織相容性復(fù)合體DR α引物<400>66cagtcgtaaa cgtcctcagt tga 23<210>67<211>27<212>DNA<213>人工系列
<220>
<223>用于RT-PCR的C型凝集素引物<400>67atccattttc tttcggtgta acatcta 27<210>68<211>23<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>用于RT-PCR的C型凝集素引物<400>68catgagaggg agtgaaggat gtg 23<210>69<211>24<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>用于RT-PCR的CUG三聯(lián)體重復(fù)RNA結(jié)合蛋白2引物
<400>69catgaatgct ttacagttgc agaa 24<210>70<211>19<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>用于RT-PCR的CUG三聯(lián)體重復(fù)RNA結(jié)合蛋白2引物<400>70gcgctgcteg tggtagaga 19<210>71<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>整聯(lián)蛋白，α6(ITGA6)，MRNA<400>71gatgacagtg ttccccgata cc 22
<210>72<211>20<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>整聯(lián)蛋白，α6(ITGA6)，MRNA<400>72tgtaagtcag ccacgccaaa 20<210>73<211>21<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>溶質(zhì)運(yùn)載蛋白家族20(磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn))成員1<400>73aatggagaag ctgacatggc c21<210>74<211>21
<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>溶質(zhì)運(yùn)載蛋白家族20(磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn))成員1<400>74ccaaacccac agaccaacac a21<210>75<211>21<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>核苷酸還原酶M2多肽(RRM2)MRNA<400>75tccaaggaca ttcagcactg g21<210>76<211>19<212>DNA<213>人工系列
<220>
<223>核苷酸還原酶M2多肽(RRM2)MRNA<400>76atcgacgcaa aagaaccgg 19<210>77<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>卵泡抑制素轉(zhuǎn)錄變異型FST317，MRNA<400>77ggaagtccag taccaaggca ga 22<210>78<211>19<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>卵泡抑制素轉(zhuǎn)錄變異型FST317，MRNA
<400>78tggcattgtc actggcaca 19<210>79<211>20<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>SPROUTY(果蠅)同源基因2(SPRY2)，MRNA<400>79gccatccgaa acaccaatga 20<210>80<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>SPROUTY(果蠅)同源基因2(SPRY2)，MRNA<400>80tgccacagtc ctcacacctg ta 22
<210>81<211>21<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>RAB3B，癌基因家族成員RAS，MRNA<400>81atgctgatga cacgttcacc c21<210>82<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>RAB3B，癌基因家族成員RAS，MRNA<400>82ggcctgcctt acactgatgt tc 22<210>83<211>21
<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>溶質(zhì)運(yùn)載蛋白家族2(利于葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn))<400>83gccttttcgt taaccgcttt g21<210>84<211>19<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>溶質(zhì)運(yùn)載蛋白家族2(利于葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn))<400>84tcctcgttgc ggttgatga 19<210>85<211>21<212>DNA<213>人工系列
<220>
<223>白介素13受體，α2(IL13RA2)，MRNA<400>85tgaaggctat ttgaagtcgc c21<210>86<211>19<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>白介素13受體，α2(IL13RA2)，MRNA<400>86cttcgcttca atgcccttg 19<210>87<211>21<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>絲氨酸/蘇氨酸激酶12(STK12)，MRNA
<400>87tggaaacgtg tacttggctc g21<210>88<211>21<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>氨酸/蘇氨酸激酶12(STK12)，MRNA<400>88accagcc gaa gtcagcaatc t 21<210>89<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>微染色體維持缺陷蛋白(啤酒酵母)5<400>89aagtttggcc tgactaccag ca 22
<210>90<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>微染色體維持缺陷蛋白(啤酒酵母)5<400>90ccagacgtgt ataccccaat gg 22<210>91<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>甲狀腺激素受體中間子13(TRIP13)，MRNA<400>91cctgtgtaaa gcgttagccc ag 22<210>92<211>22
<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>甲狀腺激素受體中間子13(TRIP13)，MRNA<400>92gtggcccaat gtactgcttg at 22<210>93<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>類驅(qū)動(dòng)蛋白6(KINESIN-LIKE 6)<400>93ccagctttaa cgaagccatg ac 22<210>94<211>22<212>DNA<213>人工系列
<220>
<223>類驅(qū)動(dòng)蛋白6(KINESIN-LIKE 6)<400>94gcatttacca gaacctgtcc ca 22<210>95<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制物3<400>95tcggtttatg tgctcttcca gg 22<210>96<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制物3<400>96atcctcttag gtctcgcagg ct 22
<210>97<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>染色體凝集蛋白G(HCAP-G)，MRNA<400>97gctcgccaga aattcgagtc ta 22<210>98<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>染色體凝集蛋白G(HCAP-G)，MRNA<400>98catgatcact ttcagagtcg gc 22<210>99
<211>21<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>CDC28蛋白激酶1(CKS1)，MRNA<400>99gcccactacc caagaaacca a21<210>100<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>CDC28蛋白激酶1(CKS1)，MRNA<400>100cataaatccg caagtcacca ca 22<210>101<211>20<212>DNA<213>人工系列
<220>
<223>胞質(zhì)分裂的蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)子1(PRC1)，MRNA<400>101cccaagtgga attgatgcga 20<210>102<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>胞質(zhì)分裂的蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)子1(PRC1)，MRNA<400>102cccctcacac actgcttcat tt 22<210>103<211>21<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>細(xì)胞分裂循環(huán)2，G1→S→G2→M(CDC2)，MRNA
<400>103ctgattttgg ccttgccaga g21<210>104<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>細(xì)胞分裂循環(huán)2，G1→S→G2→M(CDC2)，MRNA<400>104ggatgattca gtgccatttt gc 22<210>105<211>21<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>CDC20細(xì)胞分裂周期20，釀酒酵母，同源基因<400>105acagttcgcg ttcgagagtg a21
<210>106<211>21<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>CDC20細(xì)胞分裂周期20，釀酒酵母，同源基因<400>106ttccactgag ccgaaggatc t21<210>107<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>LIKELY ORTHOLOG OF MATERNAL EMBRYONIC LEUCINE ZIPPER KINAS<400>107tggctctctc ccagtagcat tc 22<210>108
<211>21<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>LIKELY ORTHOLOG OF MATERNAL EMBRYONIC LEUCINE ZIPPER KINAS<400>108tcacttgcgg tcacatcttc c21<210>109<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>微染色體維持缺陷蛋白(啤酒酵母)7<400>109agagaacaca aggattgccc ag 22<210>110<211>22<212>DNA<213>人工系列
<220>
<223>微染色體維持缺陷蛋白(啤酒酵母)7<400>110atgacaggag ctgagacttg gc 22<210>111<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>細(xì)胞周期蛋白A2(CCNA2)，MRNA<400>111ggcactgctg ctatgctgtt ag 22<210>112<211>21<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>細(xì)胞周期蛋白A2(CCNA2)，MRNA
<400>112tgaaggtcca tgagacaagg c21<210>113<211>19<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>胸苷激酶1，可溶性(TK1)，MRNA<400>113ggcgcaatga gctgcatta 19<210>114<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>胸苷激酶1，可溶性(TK1)，MRNA<400>114aaatggcttc ctctggaagg tc 22
<210>115<211>21<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制物2A(黑素瘤，p16，inhibits CDK4)(CDKN2A)，mRNA<400>115tccccgattg aaagaaccag a21<210>116<211>22<212>DNA<213>人工系列<220>
<223>細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑止劑2A(cyclin-dependent kinase inhibitor2A)(黑色素瘤p16，抑止CDK 4)(CDKN2A)，mRNA<400> 16aagagaagcc agtaaccccc ct 2權(quán)利要求
1.用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的基因標(biāo)記，特征在于其是具有序列表的序列號(hào)1、2、4、6、7、9、10、11、12、14、15、17、19或46所示堿基序列的基因。
2.用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的基因標(biāo)記，特征在于其是整聯(lián)蛋白，ALPHA 6(ITGA6)，MRNA基因(NM_000210)；溶質(zhì)載體家族20(磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn))、成員1(NM_005415)基因；核糖核苷酸還原酶M2多肽(RRM2)，MRNA(NM_001034)基因；FOLLISTATIN(FST)，轉(zhuǎn)錄變異體FST317，MRNA(NM_006350)基因；SPROUTY(果蠅)同源基因G2(SPRY2)，MRNA(NM_005842)；RAB3B，成員RAS原癌基因(RAB3B)，MRNA(NM_002867)基因；溶質(zhì)載體家族2(促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)(NM_006516)基因；白介素13受體，ALPHA 2(IL13RA2)，MRNA(NM_000640)基因；絲氨酸/蘇氨酸激酶12(STK12)，MRNA(NM_004217)基因；微染色體維持缺陷蛋白(釀酒酵母)5(CE)(NM_006739)基因；甲狀腺激素受體中間子13(TRIP13)，MRNA(NM_004237)基因；類驅(qū)動(dòng)蛋白6(有絲分裂著絲粒相關(guān)驅(qū)動(dòng)蛋白)(K)(NM_006845)基因；細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子3(CDK2-ASSOCIATED DUAL(NM_005192)基因；染色體凝縮蛋白G(HCAP-G)，MRNA(NM_022346)基因；CDC28蛋白激酶1(CKS1)，MRNA(NM_001826)基因；胞質(zhì)分裂蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)子1(PRC1)，MRNA(NM_003981)基因；細(xì)胞增殖周期2，G1→S→G2→M(CDC2)，MRNA(NM_001786)基因；CDC20(細(xì)胞增殖周期20，釀酒酵母，同源基因)(CD)(NM_001255)基因；LIKELY ORTHOLOG OF MATERNAL EMBRYONICLEUCINE ZIPPER KINAS(NM_014791)基因；微染色體維持缺陷蛋白(釀酒酵母)7(M)(NM_005916)基因；細(xì)胞周期蛋白A2(CCNA2)，MRNA(NM_001237)基因；胸苷激酶1，SOLUBLE(TK1)，MRNA(NM_003258)基因；或細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子2A(黑色素瘤，p16，抑制CDK4)(CDKN2A)，mRNA基因(NM_000077)。
3.用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的基因標(biāo)記，特征在于其是含EGF的細(xì)胞微絲樣細(xì)胞外基質(zhì)蛋白1基因(NM_018894)；人胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白5(IGFBP5)mRNA基因(AU132011)；人克隆24775mRNA序列基因(AA402981)；蛋白聚糖1，分泌顆?；?AV734015)；人胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白5基因(AA374325)；溶質(zhì)載體家族21(有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)，成員3基因(AF085224)；谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶2(C多肽，蛋白質(zhì)-谷氨酰胺-γ-谷?；D(zhuǎn)移酶)(AL552373)基因；抗血友病因子II(凝血酶)受體(M62424)；纖維蛋白溶酶原活化因子，鳥激酶(NM_002658)基因；金屬蛋白酶組織抑制因子3(Sorsby fundusdystrophy，pseudoinflammatory)(W96324)基因；基質(zhì)Gla蛋白(BF668572)基因；B-cellCLL/淋巴瘤1(Z23022)基因；CD74抗原(主要組織相容性復(fù)合體的不變多肽，II類相關(guān)抗原)(BG333618)基因；內(nèi)收蛋白3(γ)(AL135243)基因；溶質(zhì)載體家族16(一元羧酸傳送子)，成員4(NM_004696)基因；S蛋白(α)(NM_000313)基因；磷脂酰肌醇(4，5)二磷酸5-磷酸酶同系物；磷脂酰肌醇多聚磷酸5-磷酸酶IV型(AF187891)基因；孕酮膜結(jié)合蛋白質(zhì)(BE858855)基因；腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(X60201)基因；或者載脂蛋白E(BF967316)基因。
4.用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的基因標(biāo)記，其特征在于其是為人WNT抑制因子-1(WIF-1)，MRNA(NM_007191)基因；人假擬蛋白FLJ11175(FLJ11175)，MRNA(NM_018349)基因；人RHO GDP解離抑止劑(GDI)BETA(ARHGDIB)，MRNA(NM_001175)基因；人鉀中間體/少量電導(dǎo)的鈣活化(NM_021614)基因；人核因子(紅細(xì)胞衍生物2)-類似物3(NFE2L3)，MRNA(NM_004289)基因；人GS3955蛋白(GS3955)，MRNA(NM_021643)基因；人CDNA 3′端與糖蛋白相類似的MUC18(AA302605)基因；人假擬蛋白FLJ21841(FLJ21841)，MRNA(NM_024609)基因；人鋅指蛋白185(LIM區(qū)域)(ZNF185)，MRNA(NM_007150)基因；細(xì)胞周期控制中涉及的SC1＝假定的轉(zhuǎn)移-活化因子[人，MRNA，24](S53374)基因；人NADH酶(輔酶Q)1α子復(fù)合體，8(19K)(NM_014222)基因；酵母MCM10的人同系物；假擬蛋白PRO2249(PRO2)(NM_018518)基因；人膠原，VII型，α1(大皰性表皮松解癥，DYSTRO(NM_000094)基因；人自分泌運(yùn)動(dòng)因子受體(AMFR)，MRNA(NM_001144)基因；人克隆24421MRNA序列/CDS＝未知/GB＝AF070641/GI＝3283914/UG＝(AF070641)基因；人MRNA基因；以CDNADKFZP586E1621(源自克隆DKFZP586E1621)/CDS＝未知/GB(AL080235)基因。
5.用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的基因標(biāo)記，特征在于其是人RESERVED(KCNK12)，MRNA(NM_022055)基因；人泛素結(jié)合酶E2C(UBE2C)，MRNA(NM_007019)基因；人CDNA FLJ10517FIS，克隆NT2RP2000812/CDS＝(61，918)/GB＝AK001379/G(AK001379)基因；人軟骨連接蛋白1(CRTL1)，MRNA(NM_001884)基因；人MRNA基因；CDNADKFZP434F2322(由克隆DKFZP434F2322獲得)/CDS＝未知/GB(AL133105)；人，克隆MGC9549IMAGE3857382，MRNA，完整CDS/CDS＝(92，1285)/G(BC012453)基因；人假擬蛋白DKFZP586J1119(DKFZP586J1119)，MRNA(NM_032270)基因；人GLIA成熟因子，GAMMA(GMFG)，MRNA(NM_004877)基因人CDNAFLJ23095FIS，克隆LNG07413/CDS＝未知/GB＝AK026748/GI＝10(AK026748)基因；人假擬蛋白DKFZP762E1312(DKFZP762E1312)，MRNA(NM_018410)基因；人IROQUOIS類同源域蛋白(IRX-2A)，MRNA(NM_005853)基因；或者人假擬蛋白FLJ10540(FLJ10540)，MRNA(NM_018131)基因。
6.用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的基因標(biāo)記，特征在于其是人MRNA；CDNADKFZP434C1915(由克隆DKFZP434C1915獲得)基因；PARTIAL CDS/C(AL137698)；人微染色體維持缺陷型(釀酒酵母)7(M)(NM_005916)基因；人動(dòng)力蛋白，細(xì)胞質(zhì)的，中間體多肽1(DNCI1)，M(NM_004411)基因；蛋白質(zhì)基因產(chǎn)物的人MRNA(PGP)9.5.(X04741)基因；人RAD51-相互作用蛋白(PIR51)，MRNA(NM_006479)基因；人含有桿狀病毒IAP重復(fù)序列的5(SURVIVIN)(BIRC5)，MR(NM_001168)基因；人UDP-N-乙?；?α-D-半乳糖胺N-乙?；鵊AL多肽(NM_004482)基因；人細(xì)胞周期蛋白B1(CCNB1)，MRNA(NM_031966)基因；人FLAP結(jié)構(gòu)特異性內(nèi)切酶1(FEN1)，MRNA基因(NM_004111)；人絲氨酸/蘇氨酸激酶15(STK15)，MRNA基因(NM_003600)；人MAD2(有絲分裂抑止缺陷型，酵母，同系物)-類似物1(MA)(NM_002358)；基因人核仁蛋白ANKT(ANKT)，MRNA基因(NM_018454)；人與泛素結(jié)合酶類似的HSPC150蛋白(H)基因(NM_014176)；人細(xì)胞色素P450類維生素A代謝蛋白(P450RAI-2)基因，(NM_019885)；人NIMA(從未有絲分裂基因A)相關(guān)激酶2(NEK2)，MR基因(NM_002497)；人骨形態(tài)生成蛋白4(BMP4)，MRNA基因(NM_001202)；人CDNAFLJ10674FIS，克隆NT2RP2006436/CDS＝未知/GB＝AK001536/GI(基因AK001536)；或者人著絲粒蛋白A(17KD)(CENPA)，MRNA(NM_001809)基因。
7.用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的基因標(biāo)記，特征在于其是人MRNA基因；CDNADKFZP564P116(FROM克隆DKFZP564P116)/CDS＝未知/GB＝A(AL049338)；人TTK蛋白質(zhì)激酶(TTK)，MRNA基因(NM_003318)；人KARYOPHERINα2(RAG COHORT1，IMPORTINα1)(KPNA基因(NM_002266)；人聚合酶(DNA導(dǎo)向的)，θ(POLQ)，MRNA基因(NM_006596)；人ETS變異體基因5(ETS相關(guān)分子)(ETV5)，MRNA(NM_004454)基因；人含轉(zhuǎn)化酸性卷曲螺旋蛋白3基因(TAC)(NM_006342)；人驅(qū)動(dòng)蛋白類似物1基因(KNSL1)，MRNA(NM_004523)；人著絲粒蛋白E(312KD)(CENPE)，MRNA基因(NM_001813)；人CDNA，3′END/克?。絀MAGE1651289/克隆_END＝3′/GB＝AI12基因(AI123815)；人DISTAL-LESS HOMEO BOX 5(DLX5)，MRNA基因(NM_005221)；人V-MYB禽成髓細(xì)胞性白血病病毒癌基因同系物類似物2(NM_002466)基因；或者人血清剝奪反應(yīng)(磷脂酰絲氨酸結(jié)合)PRO(NM_004657)基因。
8.用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的基因標(biāo)記，特征在于其是人假擬蛋白FLJ10604(FLJ10604)，MRNA基因(NM_018154)；人核糖核酸酶HI，大亞基(RNASEHI)，MRNA基因(NM_006397)；人ANILLIN(果蠅SCRAPS同系物)，肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白基因(NM_018685)；人H4組蛋白家族，成員G(H4FG)基因，MRNA(NM_003542)；人G蛋白連結(jié)受體37(內(nèi)皮縮血管肽受體B型-基因(NM_005302)；人泛素載體蛋白(E2-EPF)，MRNA基因(NM_014501)；人，類似于腫瘤差別表達(dá)1基因，克隆IMAGE3639252，(BC007375)；人假擬蛋白MGC2577(MGC2577)，MRNA基因(NM_031299)；人假擬蛋白FLJ13912(FLJ13912)，MRNA基因(NM_022770)；人ANNEX IN A3(ANXA3)，MRNA基因(NM_005139)；人STATHMIN 1/ONCO蛋白18(STMN1)，MRNA基因(NM_005563)人，與核糖體蛋白L39類似，克隆MGC20168 IMAGE4555759，M(BC012328)；人POLO(果蠅)類似物激酶(PLK)，MRNA基因(NM_005030)。
9.用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的基因標(biāo)記，特征在于其是人蛋白酶復(fù)合體(PROSOME，MACROPAIN)26S亞基，ATP酶，5(PS)基因(NM_002805)；人真核翻譯起始因子4γ，2(EIF4G)基因(NM_001418)；人二氫嘧啶酶類似物3(DPYSL3)基因，MRNA)(NM_001387)；人ADAPTOR相關(guān)蛋白復(fù)合體1，σ2亞基(AP1S2)基因(NM_003916)；人網(wǎng)蛋白1，中間絲結(jié)合蛋白，500KD(P)基因(NM_000445)；人異種核蛋白U基因(SCAFFOLD ATTAC(NM_031844)；人假擬蛋白MGC5306(MGC5306)，MRNA基因(NM_024116)；人MHC I類多肽相關(guān)序列A(MICA)，MRNA基因(NM_000247)；人PRK1相關(guān)蛋白(AWP1)，MRNA基因(NM_019006)；人孕酮受體膜成分2(PGRMC2)，MRNA基因(NM_006320)；人多聚谷氨酸結(jié)合蛋白1(PQBP1)，MRNA基因(NM_005710)；人S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶1(AMD1)，MRNA基因(NM_001634)；人干擾素誘導(dǎo)的C型肝炎相關(guān)MICROTUBULAR AG基因(NM_006417)；人蛋白質(zhì)激酶，AMP-活化的，γ1非催化性亞基(NON-CATALYTICSUBUN)基因(NM_002733)；人前膠原-脯氨酸，2-OXOGLUTARATE 4-DIOXYGENASE(脯氨酸(NM_004199)基因；人血管內(nèi)皮分化，溶血磷脂酸G-PROTE基因(NM_012152)；或人KIAA0127基因產(chǎn)物(KIAA0127)，MRNA基因(NM_014755)。
10.用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞基因標(biāo)記的探針，其具有與權(quán)利要求1～9中任一記載的用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的基因標(biāo)記在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的DNA序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求10記載的用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞基因標(biāo)記的探針，其由權(quán)利要求1～9中任一記載的堿基序列的反義鏈的全部或者部分構(gòu)成。
12.用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞基因標(biāo)記的微陣列或DNA芯片，特征在于其固定有至少一個(gè)以上的權(quán)利要求10或11記載的DNA。
13.根據(jù)權(quán)利要求12記載的用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記基因的微陣列或DNA芯片，其特征在于其固定有具有序列表序列號(hào)1、2、4、6、7、9、10、11、12、14、15、17、19、或46所示堿基序列的基因組合和檢測(cè)出權(quán)利要求2～9中任一記載的基因組合的2個(gè)以上基因的探針。
14.用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的多肽標(biāo)記，其特征在于其是具有序列表的序列3、5、8、13、16或18所示的氨基酸序列的多肽。
15.一種抗體，其特征在于其受權(quán)利要求14記載的多肽誘導(dǎo)、與該多肽特異性結(jié)合。
16.根據(jù)權(quán)利要求15記載的抗體，其特征在于抗體是單克隆抗體。
17.根據(jù)權(quán)利要求15記載的抗體，其特征在于抗體是多克隆抗體。
18.識(shí)別間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，特征在于對(duì)被檢細(xì)胞中權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)記載的間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。
19.根據(jù)權(quán)利要求18記載的間充質(zhì)干細(xì)胞的識(shí)別方法，其特征是采用RNA印跡法檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記基因的表達(dá)。
20.根據(jù)權(quán)利要求18記載的間充質(zhì)干細(xì)胞的識(shí)別方法，其特征是采用用于檢測(cè)權(quán)利要求10或11記載的間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記基因的探針對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。
21.根據(jù)權(quán)利要求18記載的間充質(zhì)干細(xì)胞的識(shí)別方法，其特征是采用用于檢測(cè)權(quán)利要求12或13記載的間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記基因的微陣列或DNA芯片對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。
22.識(shí)別間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征是權(quán)利要求18-21中任一記載的對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記基因表達(dá)的檢測(cè)包括定量或半定量PCR的使用。
23.根據(jù)權(quán)利要求22記載的識(shí)別間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征是其使用的定量的或半定量的PCR是RT-PCR法。
24.用于擴(kuò)增間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記基因的RT-PCR所使用的引物，其由以下物質(zhì)組成由具有序列表的序列號(hào)20所示的堿基序列的正義引物以及具有序列表的序列號(hào)21所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)22所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)23所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)24所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)25所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)26所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)27所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)28所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)29所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)30所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)31所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)32所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)33所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)34所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)35所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)36所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)37所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)38所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)39所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)40所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)41所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)42所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)43所示的堿基序列的反義引物、或具有序列表的序列號(hào)44所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)45所示的堿基序列的反義引物。
25.擴(kuò)增間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記基因的實(shí)時(shí)PCR所使用的引物，其由下列物質(zhì)構(gòu)成具有序列表的序列號(hào)47所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)48所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)49所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)50所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)51所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)52所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)53所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)54所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)55所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)56所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)57所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)58所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)59所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)60所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)61所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)62所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)63所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)64所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)65所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)66所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)67所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)68所示的堿基序列的反義引物、或具有序列表的序列號(hào)69所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)70所示的堿基序列的反義引物。
26.用于擴(kuò)增間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記基因的RT-PCR所使用的引物，其由下列物質(zhì)組成具有序列表的序列號(hào)71所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)72所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)73所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)74所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)75所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)76所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)77所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)78所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)79所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)80所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)81所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)82所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)83所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)84所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)85所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)86所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)87所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)88所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)89所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)90所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)91所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)92所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)93所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)94所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)95所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)96所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)97所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)98所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)99所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)100所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)101所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)102所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)103所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)104所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)105所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)106所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)107所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)108所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)109所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)110所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)111所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)112所示的堿基序列的反義引物、具有序列表的序列號(hào)113所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)114所示的堿基序列的反義引物、或具有序列表的序列號(hào)115所示的堿基序列的正義引物和具有序列表的序列號(hào)116所示的堿基序列的反義引物。
27.根據(jù)權(quán)利要求18記載的間充質(zhì)干細(xì)胞的識(shí)別方法，其特征在于用權(quán)利要求24-26其中之一記載的正義引物以及反義引物中至少一對(duì)以上的引物擴(kuò)增被檢細(xì)胞中的基因，采用權(quán)利要求10或11中記載的用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞基因標(biāo)記的探針對(duì)擴(kuò)增的基因進(jìn)行檢測(cè)。
28.間充質(zhì)干細(xì)胞的識(shí)別方法，其特征在于采用權(quán)利要求15-17其中之一記載的抗體對(duì)被檢細(xì)胞中的間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記多肽的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。
29.間充質(zhì)干細(xì)胞的識(shí)別方法，其特征在于將被檢細(xì)胞中由序列表的序列號(hào)1、11和19構(gòu)成的間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記基因組成的組中一個(gè)以上基因的表達(dá)以及由序列表的序列號(hào)2、4、6、7、9、10、12、14、15和17構(gòu)成的間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記基因組成的組中一個(gè)以上基因的表達(dá)組合起來(lái)，進(jìn)行評(píng)價(jià)。
30.間充質(zhì)干細(xì)胞的識(shí)別分離方法，其特征在于采用權(quán)利要求10或權(quán)利要求11記載的用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞基因標(biāo)記的探針和/或權(quán)利要求15-17中任一記載的抗體對(duì)被檢細(xì)胞中用于間充質(zhì)干細(xì)胞檢測(cè)的標(biāo)記基因和/或用于間充質(zhì)干細(xì)胞檢測(cè)的標(biāo)記多肽的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)、對(duì)識(shí)別出的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行分離。
31.根據(jù)權(quán)利要求30記載的間充質(zhì)干細(xì)胞的識(shí)別分離方法，其特征是通過(guò)采用權(quán)利要求15-17中任一記載的抗體的熒光抗體法將被檢細(xì)胞中的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)識(shí)、分離經(jīng)標(biāo)識(shí)的間充質(zhì)干細(xì)胞。
32.用于識(shí)別間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒，其中裝備有權(quán)利要求10或11記載的用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞基因標(biāo)記的探針、固定有該探針的權(quán)利要求12或13記載的用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記基因的微陣列或DNA芯片、和至少一個(gè)以上的權(quán)利要求15-17中任一記載的抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)、分離識(shí)別間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)記以及采用該標(biāo)記檢測(cè)、分離識(shí)別間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。序列表所示基因在間充質(zhì)干細(xì)胞中特異表達(dá)。該基因構(gòu)成作為檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)記。尤其是，本發(fā)明含有用于檢測(cè)該間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記基因的探針，以及在檢測(cè)該間充質(zhì)干細(xì)胞基因標(biāo)記時(shí)擴(kuò)增被檢細(xì)胞所述基因的PCR所使用的引物，還含有本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記基因表達(dá)的多肽構(gòu)成的用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的多肽標(biāo)記、用于檢測(cè)該多肽標(biāo)記的與該多肽標(biāo)記特異結(jié)合的抗體，尤其是含有一種采用用于檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記基因的探針、與多肽標(biāo)記特異結(jié)合的抗體對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別、分離的方法。
文檔編號(hào)C12P21/08GK1761749SQ200480007550
公開日2006年4月19日 申請(qǐng)日期2004年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月10日
發(fā)明者加藤幸夫, 辻纮一郎, 小池千加 申請(qǐng)人:獨(dú)立行政法人科學(xué)技術(shù)振興機(jī)構(gòu), 加藤幸夫, 智再如股份有限公司