本發(fā)明涉及一種脂肪組織的處理方法及間充質(zhì)干細(xì)胞、處理后單個(gè)脂肪細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)，屬于脂肪組織研究領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

間充質(zhì)干細(xì)胞是一種具有自我復(fù)制能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，具有分化為軟骨、骨、脂肪等組織的潛能，同時(shí)也具有免疫調(diào)節(jié)和分泌多種生長(zhǎng)因子的功能。

在骨髓、牙髓、脂肪等組織中均含有間充質(zhì)干細(xì)胞(可參見(jiàn)Gir P,Oni G,Brown SA et al.Human adipose stem cells:current clinical applications.Plastic and reconstructive surgery.2012；129:1277-1290.)。其中，脂肪組織容易大量獲取，資源較為充足，并且脂肪組織中的間充質(zhì)干細(xì)胞的含量較大，約為1/100-1/500。因此來(lái)自脂肪組織的干細(xì)胞目前已廣泛用于臨床治療。

目前在提取脂肪組織中的間充質(zhì)干細(xì)胞時(shí)，一般采用機(jī)械或者酶處理方法。盡管機(jī)械處理法不引入外源有害物質(zhì)，便于臨床應(yīng)用，但提取效率低，花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)。并且提取少量間充質(zhì)干細(xì)胞需要大量脂肪組織，增加了患者的創(chuàng)傷和手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)，大大限制了其臨床應(yīng)用。而現(xiàn)有的酶處理法使用研究用試劑而非醫(yī)用試劑，所提取的間充質(zhì)干細(xì)胞中可能混有熱原、內(nèi)毒素、胎牛血清等，因此，存在著嚴(yán)重安全隱患。

另外，膠原是皮膚的重要細(xì)胞外基質(zhì)組成，對(duì)于皮膚光澤、彈性、水分的保持具有重要的作用，目前用于皮膚注射用的膠原蛋白主要是異種動(dòng)物提取的膠原蛋白，例如牛和豬皮中提取的膠原蛋白，具有一定的異種抗原性，可能會(huì)引起機(jī)體的排異和過(guò)敏反應(yīng)。而脂肪組織中含有大量的細(xì)胞外基質(zhì)，其主要成分為膠原，但是目前沒(méi)有較好的方法以提取細(xì)胞外基質(zhì)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明要解決的問(wèn)題

本發(fā)明的目的是提供一種脂肪組織的處理方法，其能夠快速高效地從脂肪組織中提取間充質(zhì)干細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和/或處理后單個(gè)脂肪細(xì)胞，不僅能夠大幅提高從單位脂肪組織中所提取的間充質(zhì)干細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和/或處理后單個(gè)脂肪細(xì)胞的量，還改善所提取的間充質(zhì)干細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和/或處理后單個(gè)脂肪細(xì)胞的安全性。

用于解決問(wèn)題的方案

本發(fā)明提供一種脂肪組織的處理方法，其中，包括以下步驟：

破碎步驟：將脂肪組織機(jī)械破碎，得到肉糜狀的脂肪組織；

消化步驟：采用消化劑對(duì)所述肉糜狀的脂肪組織進(jìn)行消化處理，從所述肉糜狀的脂肪組織中釋放出細(xì)胞，得到間充質(zhì)干細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和/或處理后單個(gè)脂肪細(xì)胞；其中，所述消化劑含有注射用膠原酶，優(yōu)選地，所述消化劑中還包含有尿激酶。

根據(jù)本發(fā)明的方法，其中，所述肉糜狀的脂肪組織的粒徑為1-2mm，優(yōu)選為1-1.5mm；優(yōu)選地，所述處理后單個(gè)脂肪細(xì)胞的粒徑為15-40μm，優(yōu)選為20-30μm。

根據(jù)本發(fā)明的方法，其中，所述消化步驟之后，還包括：

中和步驟：采用中和劑對(duì)所述消化劑進(jìn)行中和處理；

優(yōu)選地，所述中和劑包括人血白蛋白、膠原蛋白填充劑中的一種或兩種。

根據(jù)本發(fā)明的方法，其中，所述消化劑和所述中和劑中不含內(nèi)毒素、熱原和/或異種動(dòng)物血清。

根據(jù)本發(fā)明的方法，其中，所述消化步驟中，消化處理1g脂肪組織使用的所述注射用膠原酶的加入量為50-250單位，優(yōu)選為80-200單位。

根據(jù)本發(fā)明的方法，其中，基于消化處理1g脂肪組織使用的所述中和劑的加入量為0.8-5mL，優(yōu)選為1.3-4mL。

根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中，在破碎步驟之前，還包括：洗滌步驟，沖洗所述脂肪組織，以除去所述脂肪組織中的腫脹液及白細(xì)胞；

優(yōu)選地，在消化步驟之后，還包括清洗步驟，更優(yōu)選地，所述清洗步驟后，還包括將所述間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞篩過(guò)濾的步驟。

本發(fā)明還提供一種間充質(zhì)干細(xì)胞，其通過(guò)本發(fā)明的方法制備得到。

本發(fā)明還提供一種消化劑組合物，其中，包括本發(fā)明所述的方法中的注射用膠原酶和尿激酶。

本發(fā)明還提供一種根據(jù)本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞在制備臨床用抗免疫排斥制劑、臨床用抗心肌梗死藥物中的用途。

本發(fā)明還提供一種處理后單個(gè)脂肪細(xì)胞，其通過(guò)本發(fā)明的方法制備得到。

本發(fā)明還提供一種細(xì)胞外基質(zhì)，其通過(guò)本發(fā)明的方法制備得到。

發(fā)明的效果

本發(fā)明的脂肪組織的處理方法，操作時(shí)間短，制備提取的效率高。進(jìn)一步地，由于制備過(guò)程使用的是CFDA已經(jīng)批準(zhǔn)的臨床使用的藥物，因此處理過(guò)程中不會(huì)再引入熱原、內(nèi)毒素、異種動(dòng)物血清等有害物質(zhì)。所制備得到的間充質(zhì)干細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和/或處理后單個(gè)脂肪細(xì)胞的安全性高，能夠進(jìn)行批量制備。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1、2及對(duì)比例1制備得到的細(xì)胞數(shù)目的柱狀圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例7制備得到的處理后單個(gè)脂肪細(xì)胞與常規(guī)脂肪的照片對(duì)比圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例7制備得到的處理后單個(gè)脂肪細(xì)胞與常規(guī)脂肪的顯微結(jié)構(gòu)對(duì)比圖；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例8制備得到的細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞的混合物的顯微結(jié)構(gòu)圖；

圖5為本發(fā)明實(shí)施例3與對(duì)比例2所制備得到的間充質(zhì)干細(xì)胞的活體細(xì)胞率的對(duì)比圖；

圖6為本發(fā)明實(shí)施例3制備的間充質(zhì)干細(xì)胞未加入成骨分化誘導(dǎo)液的體外成骨分化誘導(dǎo)結(jié)果圖；

圖7為本發(fā)明實(shí)施例3制備的間充質(zhì)干細(xì)胞加入成骨分化誘導(dǎo)液的體外成骨分化誘導(dǎo)結(jié)果圖；

圖8為本發(fā)明實(shí)施例3制備的間充質(zhì)干細(xì)胞未加入成脂分化誘導(dǎo)液的體外成脂分化誘導(dǎo)結(jié)果圖；

圖9為本發(fā)明實(shí)施例3制備的間充質(zhì)干細(xì)胞加入成脂分化誘導(dǎo)液的體外成脂分化誘導(dǎo)結(jié)果圖；

圖10為本發(fā)明實(shí)施例3制備的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行表面標(biāo)志的鑒定圖；

圖11為本發(fā)明實(shí)施例3制備的間充質(zhì)干細(xì)胞加入到脂肪中后的輔助脂肪充填以及防止脂肪吸收效果對(duì)比圖；

圖12為本發(fā)明的脂肪組織的處理方法的流程圖。

具體實(shí)施方式

如圖12所示，本發(fā)明提供一種脂肪組織的處理的方法，包括以下步驟：

破碎步驟：將脂肪組織進(jìn)行機(jī)械破碎，從而使所述脂肪組織變小，得到肉糜狀的脂肪組織；

消化步驟：采用消化劑對(duì)肉糜狀的脂肪組織進(jìn)行消化處理，從所述肉糜狀的脂肪組織中釋放出細(xì)胞，得到間充質(zhì)干細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和/或處理后單個(gè)脂肪細(xì)胞；其中，所述消化劑含有注射用膠原酶，優(yōu)選地，所述消化劑中還包括尿激酶。

需要說(shuō)明的是，本發(fā)明所得到的處理后單個(gè)脂肪細(xì)胞是一種優(yōu)化的納米脂肪，顆粒較細(xì)，能夠均勻分散。

在破碎步驟中，可以采用組織破碎儀(例如：超聲破碎儀)對(duì)沖洗后的脂肪組織進(jìn)行機(jī)械破碎?；蛘哂眉舻斗磸?fù)剪碎，使脂肪組織塊減小，且易于消化。例如可以使經(jīng)破碎處理的脂肪組織呈肉糜狀。本發(fā)明對(duì)破碎步驟的實(shí)現(xiàn)手段沒(méi)有限制，所屬技術(shù)領(lǐng)域人員可以根據(jù)需要，選擇具體的破碎方式，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。

根據(jù)本發(fā)明的脂肪組織的處理方法，所述肉糜狀的脂肪組織的粒徑為1-2mm，優(yōu)選為1-1.5mm。將細(xì)胞破碎至1-2mm的粒徑范圍時(shí)，能夠有利于后期在消化步驟中釋放出間充質(zhì)干細(xì)胞或者將脂肪組織進(jìn)一步細(xì)化，提高消化處理的效率，并且不會(huì)損壞細(xì)胞，最終提取的細(xì)胞存活率高，且花費(fèi)時(shí)間短。

在消化步驟中，用消化劑處理組織，從而釋放出間充質(zhì)干細(xì)胞，或者得到細(xì)胞外基質(zhì)和/或處理后單個(gè)脂肪細(xì)胞。所述消化劑可以為經(jīng)CFDA批準(zhǔn)的，優(yōu)選不含有熱原、內(nèi)毒素、異種動(dòng)物血清等有害物質(zhì)的消化劑，并且在制備過(guò)程中不引入熱原、內(nèi)毒素、異種動(dòng)物血清等有害物質(zhì)的消化劑。

優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的脂肪組織的處理的方法，在破碎步驟之前，優(yōu)選還包括洗滌步驟，沖洗所述脂肪組織，以除去所述脂肪組織中的腫脹液及白細(xì)胞。這樣，可以使得破碎步驟更容易進(jìn)行且所得細(xì)胞中間充質(zhì)干細(xì)胞含量更高。

在洗滌步驟中，可以采用例如生理鹽水等液體，在過(guò)濾網(wǎng)上用生理鹽水反復(fù)沖洗，也可以在盛放有生理鹽水的無(wú)菌容器中反復(fù)搖晃洗滌，從而有效地去除脂肪組織中所含有的腫脹液和脂肪組織的血管破裂所釋放出的白細(xì)胞。本發(fā)明對(duì)洗滌步驟的實(shí)現(xiàn)手段沒(méi)有限制，所屬技術(shù)領(lǐng)域人員可以根據(jù)需要，選擇具體的洗滌方式，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。

優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的方法，其中，所述消化步驟和清洗步驟之間，還包括中和步驟：采用中和劑對(duì)消化劑進(jìn)行中和處理。

在中和步驟中，本發(fā)明采用安全有效的中和劑，對(duì)消化劑進(jìn)行中和處理，避免殘留的消化劑進(jìn)一步消化脂肪組織細(xì)胞，且不會(huì)影響細(xì)胞活性，并且可以對(duì)提取出的間充質(zhì)干細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和/或處理后單個(gè)脂肪細(xì)胞起到保護(hù)作用。

本發(fā)明的中和劑均為安全，無(wú)異種動(dòng)物血清的中和劑，不引入任何其它雜質(zhì)。優(yōu)選地，所述中和劑包含人血白蛋白、膠原蛋白填充劑中的一種或兩種，例如：國(guó)藥準(zhǔn)字S10980016、雙美I號(hào)(國(guó)食藥監(jiān)械(許)字2014第3460092號(hào))、膚美達(dá)(國(guó)食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2012第3460454號(hào))等。

優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的脂肪組織的處理的方法，在消化步驟之后，還包括清洗步驟，對(duì)消化步驟所得到的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行沖洗，從而除去殘留的消化劑和中和劑。

在清洗步驟中，例如可以在2000-2400r/min的轉(zhuǎn)速下離心5-8min，除去上清液，用生理鹽水等重懸細(xì)胞沉淀，即為細(xì)胞懸液。進(jìn)一步用細(xì)胞篩(例如孔徑為70μm的細(xì)胞篩)過(guò)濾細(xì)胞懸液，以得到細(xì)胞的細(xì)胞懸液?？稍俅螌?duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行離心-去上清-重懸處理，以進(jìn)一步清洗除去殘留的消化劑。

本發(fā)明的注射用膠原酶，可以是國(guó)藥準(zhǔn)字H31022658、國(guó)藥準(zhǔn)字H31022659、國(guó)藥準(zhǔn)字H10960177、國(guó)藥準(zhǔn)字H10960178等，尿激酶可以是國(guó)藥準(zhǔn)字H44020645等。所述注射用膠原酶中還含有賦形劑和穩(wěn)定劑，所述注射用膠原酶中，活性膠原酶的含量為4％-6％，并且600單位的注射用膠原酶的重量為35mg。

優(yōu)選地，本發(fā)明的所述消化劑中不含有二甲基亞砜，二甲基亞砜通常用于細(xì)胞的凍存防止胞漿結(jié)晶對(duì)細(xì)胞的損害，但其具有明顯的細(xì)胞毒性，并且可能導(dǎo)致其在細(xì)胞及溶液中殘留，影響間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)部運(yùn)用的安全性，因此，本發(fā)明的消化劑中不含有二甲基亞砜。

優(yōu)選地，本發(fā)明所采用的注射用膠原酶的實(shí)質(zhì)效果相當(dāng)于膠原酶I型和膠原酶III型，適用于上皮、肺、脂肪和腎上腺組織細(xì)胞的分離，并且消化性能較溫和，對(duì)細(xì)胞傷害小，從而避免對(duì)細(xì)胞造成不必要的傷害。

根據(jù)本發(fā)明的脂肪組織的處理方法，其中，所述消化步驟中，消化處理1g脂肪組織使用的所述注射用膠原酶的加入量為50-250單位，優(yōu)選為80-200單位。

其中，本發(fā)明中，“單位”的定義為注射用膠原酶在37℃，pH7.5條件下作用于膠原蛋白，以每小時(shí)從膠原蛋白中釋放的多肽相當(dāng)于茚三酮染色，1微摩爾亮氨酸量為一個(gè)活性單位。

當(dāng)注射用膠原酶的加入量在50-90單位的范圍內(nèi)時(shí)，能夠釋放出少量的間充質(zhì)干細(xì)胞，并獲得較多的粒徑在15-40μm，優(yōu)選20-30μm的處理后單個(gè)脂肪細(xì)胞。

本發(fā)明的所述處理后單個(gè)脂肪細(xì)胞是均勻分散的單個(gè)脂肪細(xì)胞顆粒，并且可以采用28G或更細(xì)的針將所得到的處理后單個(gè)脂肪細(xì)胞充填皮膚的各個(gè)層次。

當(dāng)注射用膠原酶的加入量在91-120單位的范圍內(nèi)時(shí)，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間在10-20min時(shí)，更容易獲得處理后單個(gè)脂肪細(xì)胞和少量的間充質(zhì)干細(xì)胞；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間在20min-40min時(shí)，更容易獲得間充質(zhì)干細(xì)胞和少量的處理后單個(gè)脂肪細(xì)胞。

當(dāng)注射用膠原酶的加入量在121-150單位的范圍內(nèi)時(shí)，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間在10-20min時(shí)，更容易獲得較多的間充質(zhì)干細(xì)胞和較少的細(xì)胞外基質(zhì)；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間在20min-40min時(shí)，更容易獲得較多的細(xì)胞外基質(zhì)和較少的間充質(zhì)干細(xì)胞。

當(dāng)注射用膠原酶的加入量在151-250單位的范圍內(nèi)時(shí)，注射用膠原酶的用量較多，能夠獲得少量的活體細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)。

脂肪組織的細(xì)胞外基質(zhì)主要組成成分為膠原，因此通過(guò)對(duì)脂肪組織進(jìn)行進(jìn)一步的消化，從而分離其中的細(xì)胞外基質(zhì)成分能夠用于皮膚膠原充填的實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用，同樣可以采用28G或更細(xì)的針將該細(xì)胞外基質(zhì)充填皮膚的各個(gè)層次。

根據(jù)本發(fā)明的脂肪組織的處理方法，其中所述消化劑還可以包含有尿激酶，優(yōu)選地，所述消化步驟中，消化處理1g脂肪組織使用的所述尿激酶的加入量可以為3×10⁴-7×10⁴單位，更優(yōu)選為4×10⁴-6×10⁴單位。但是對(duì)尿激酶的含量不做具體限定，均在本發(fā)明的范圍內(nèi)。當(dāng)使用尿激酶時(shí)，在中和步驟使用中和劑時(shí)，根據(jù)尿激酶的含量適當(dāng)添加相應(yīng)量的中和劑。

其中，1單位尿激酶是指在37℃，1小時(shí)裂解α-乙酰基-L-賴氨酸甲基酯(alpha-N-acetyl-L-lysine methyl ester)釋放出46.2×10^-3μM甲醇的量。

根據(jù)本發(fā)明的脂肪組織的處理方法，其中，所述消化處理的反應(yīng)溫度為37-42℃，優(yōu)選37-39℃；反應(yīng)時(shí)間為10-40min，優(yōu)選15-35min。當(dāng)在上述反應(yīng)溫度時(shí)，消化劑的活性更強(qiáng)，制備的效率更高。

根據(jù)本發(fā)明的脂肪組織的處理方法，其中，所述中和步驟中，基于1g脂肪組織使用的所述中和劑的加入量0.8-5mL，優(yōu)選為1.3-4mL。其中，所述中和劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)優(yōu)選為10％-30％，優(yōu)選為20％。

當(dāng)中和劑的加入量在0.8-5mL的范圍內(nèi)時(shí)，能夠?qū)⑾瘎┤恐泻?，并且還可以對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用，當(dāng)中和劑的加入量低于0.8mL時(shí)，會(huì)不足以對(duì)消化劑全部中和；當(dāng)中和劑的加入量高于5mL時(shí)，會(huì)增加清洗細(xì)胞懸液的難度，并且在一定程度上增加成本。

另外，本發(fā)明在制備間充質(zhì)干細(xì)胞時(shí)，所有的步驟均在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行。并且本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞不來(lái)源于人體胚胎，也不意指胚胎干細(xì)胞。

本發(fā)明還提供一種間充質(zhì)干細(xì)胞，其通過(guò)本發(fā)明的脂肪組織的處理方法制備得到。

本發(fā)明還提供一種消化劑組合物，其包括本發(fā)明的脂肪組織的處理方法中所述的注射用膠原酶和尿激酶。

本發(fā)明還提供一種根據(jù)本發(fā)明所述的間充質(zhì)干細(xì)胞在制備臨床藥物中的用途。

根據(jù)本發(fā)明所述的用途，其中，所述間充質(zhì)干細(xì)胞在制備臨床用抗免疫排斥制劑、臨床用抗心肌梗死藥物中的用途。另外，本發(fā)明所述的間充質(zhì)干細(xì)胞還可以用于制備臨床用抗貧血制品，臨床用抗動(dòng)脈硬化制劑，臨床用抗風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎制品，臨床用抗腫瘤藥物等。

本發(fā)明還提供一種處理后單個(gè)脂肪細(xì)胞，其通過(guò)本發(fā)明的方法制備得到。

本發(fā)明還提供一種細(xì)胞外基質(zhì)，其通過(guò)本發(fā)明的方法制備得到。

實(shí)施例

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1

用生理鹽水對(duì)2.4g脂肪組織進(jìn)行反復(fù)沖洗，除去所述脂肪組織中的腫脹液及白細(xì)胞。然后用剪刀充分剪碎沖洗后的脂肪組織至呈肉糜狀后，且脂肪組織的粒徑在1-2mm之間，置于無(wú)菌容器中。加入300單位的注射用膠原酶(國(guó)藥準(zhǔn)字H31022658，下同)，37℃震蕩消化30min后，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20％的人血白蛋白5mL(國(guó)藥準(zhǔn)字：S10980016，下同)中和注射用膠原酶，經(jīng)70μm細(xì)胞篩過(guò)濾得到細(xì)胞總數(shù)約為2.35×10⁶個(gè)。

實(shí)施例2

用生理鹽水對(duì)2.4g脂肪組織進(jìn)行反復(fù)沖洗，除去所述脂肪組織中的腫脹液及白細(xì)胞。然后用剪刀充分剪碎沖洗后的脂肪組織至呈肉糜狀后，且脂肪組織的粒徑在1-2mm之間，置于無(wú)菌容器中。加入300單位的注射用膠原酶(國(guó)藥準(zhǔn)字H31022658)和12.5萬(wàn)單位的尿激酶(國(guó)藥準(zhǔn)字H44020645)，37℃震蕩消化30min后，然后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20％的10mL人血白蛋白中和注射用膠原酶和尿激酶，經(jīng)70μm細(xì)胞篩過(guò)濾得到細(xì)胞總數(shù)約為2.39×10⁶個(gè)。

實(shí)施例3

用生理鹽水對(duì)脂肪組織2.4g進(jìn)行反復(fù)沖洗，除去所述脂肪組織中的腫脹液及白細(xì)胞。然后用剪刀充分剪碎，沖洗后的脂肪組織至呈肉糜狀后，且脂肪組織的粒徑在1-1.5mm之間，置于無(wú)菌容器中。加入300單位的注射用膠原酶，37℃震蕩消化30min后，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20％的5mL人血白蛋白中和注射用膠原酶。在2400r/min的轉(zhuǎn)速下離心5min后，收集細(xì)胞沉淀物。加入生理鹽水重懸細(xì)胞沉淀物后用70μm孔徑的細(xì)胞篩過(guò)濾，得到單細(xì)胞懸液。然后在1200r/min的轉(zhuǎn)速下離心，收集沉淀，除去上清液，去除注射用膠原酶和人血白蛋白，得到細(xì)胞總數(shù)約為2.16×10⁶個(gè)。

實(shí)施例4

將實(shí)施例3中注射用膠原酶的用量由300單位變?yōu)?16單位，人血白蛋白的用量由5mL變?yōu)?.6mL，將37℃震蕩消化30min變?yōu)?8℃震蕩消化40min，其余按與實(shí)施例2相同的方法，得到細(xì)胞總數(shù)約為1.78×10⁶個(gè)。

實(shí)施例5

將實(shí)施例3中注射用膠原酶的用量由300單位變?yōu)?60單位，人血白蛋白的用量由5mL變?yōu)?mL，將37℃震蕩消化30min變?yōu)?9℃震蕩消化20min，其余按與實(shí)施例2相同的方法，得到細(xì)胞總數(shù)約為2.67×10⁶個(gè)。

實(shí)施例6

將實(shí)施例3中注射用膠原酶的用量由300單位變?yōu)?64單位，人血白蛋白的用量由5mL變?yōu)?.4mL，將37℃震蕩消化30min變?yōu)?0℃震蕩消化30min，其余按與實(shí)施例2相同的方法，得到細(xì)胞總數(shù)約為1.82×10⁶個(gè)。

實(shí)施例7

用生理鹽水對(duì)脂肪組織2.4g進(jìn)行反復(fù)沖洗，除去所述脂肪組織中的腫脹液及白細(xì)胞。然后用剪刀充分剪碎，沖洗后的脂肪組織至呈肉糜狀后，且脂肪組織的粒徑在1-1.5mm之間，置于無(wú)菌容器中。加入240單位的注射用膠原酶，37℃震蕩消化15min后，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20％的4mL人血白蛋白中和注射用膠原酶。在2400r/min的轉(zhuǎn)速下離心5min后，收集上層的處理后單個(gè)脂肪細(xì)胞為0.8g，如圖2和圖3所示，本申請(qǐng)制備得到的處理后單個(gè)脂肪細(xì)胞的粒徑更細(xì)，并且是均勻分散的單個(gè)脂肪細(xì)胞顆粒。

實(shí)施例8

用生理鹽水對(duì)脂肪組織2.4g進(jìn)行反復(fù)沖洗，除去所述脂肪組織中的腫脹液及白細(xì)胞。然后用剪刀充分剪碎，沖洗后的脂肪組織至呈肉糜狀后，且脂肪組織的粒徑在1-1.5mm之間，置于無(wú)菌容器中。加入420單位的注射用膠原酶，37℃震蕩消化35min后，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20％的7mL人血白蛋白中和注射用膠原酶。在2700r/min的轉(zhuǎn)速下離心5min后，收集下層的細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞的混合物0.6g。如圖4所示，本申請(qǐng)制備得到的細(xì)胞外基質(zhì)的10倍物鏡下的顯微結(jié)構(gòu)圖，其中，圖4-1為未采用臺(tái)盼藍(lán)染色，圖4-2為采用臺(tái)盼藍(lán)染料的結(jié)果圖。

對(duì)比例1

將實(shí)施例3中注射用膠原酶的用量替換為含有sigma公司的研究型膠原酶(牌號(hào)：C0255)的生理鹽水溶液，其中，研究型膠原酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.075％。其余按與實(shí)施例3相同的方法，得到細(xì)胞總數(shù)約為2.79×10⁶個(gè)。

對(duì)比例2

用生理鹽水對(duì)2.4g脂肪組織進(jìn)行反復(fù)沖洗，除去所述脂肪組織中的腫脹液及白細(xì)胞。然后用剪刀充分剪碎，沖洗后的脂肪組織至呈肉糜狀后，且脂肪組織的粒徑在1-2mm之間，置于無(wú)菌容器中。加入12.5萬(wàn)單位的尿激酶，37℃震蕩消化30min，然后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20％的人血白蛋白5mL(國(guó)藥準(zhǔn)字：S10980016)中和尿激酶，得到細(xì)胞總數(shù)約為0.74×10⁶個(gè)。

活體細(xì)胞率實(shí)驗(yàn)

對(duì)實(shí)施例3和對(duì)比例1消化所得到的細(xì)胞通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色(Beckman Coulter,Inc,Vi-CELL)及自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，計(jì)數(shù)比較實(shí)施例3和對(duì)比例1的活體細(xì)胞數(shù)目，具體結(jié)果如下表1所示，表1中，A1指的是注射用膠原酶，B1指的是sigma公司的研究型膠原酶(牌號(hào)：C0255)。

表1

由表1和圖5可以看出，采用注射用膠原酶所提取出的間充質(zhì)干細(xì)胞的活體細(xì)胞率更高，因此，采用注射用膠原酶提取的間充質(zhì)干細(xì)胞更加安全可靠。

并且，采用曼-惠特尼(Mann-Whitney)檢驗(yàn)，計(jì)算得到P＝0.019<0.05，因此實(shí)施例3提取方法制備得到的活體細(xì)胞比例與對(duì)比例1的提取方法制備得到的活體細(xì)胞具有顯著的差異。

體外分化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)

對(duì)實(shí)施例3中得到的細(xì)胞進(jìn)行體外成脂誘導(dǎo)和成骨誘導(dǎo)

體外成骨分化誘導(dǎo)：將細(xì)胞以1×10⁴/孔的密度接種于6孔板中，在體外成骨分化誘導(dǎo)液(所述成骨分化誘導(dǎo)液為：普通生長(zhǎng)培養(yǎng)基中含有10nmol的地塞米松、50μg/mL的L-抗壞血酸-2-磷酸、10mmol的β-甘油(Sigma-Aldrich公司)，)中誘導(dǎo)。每3天換一次成骨分化誘導(dǎo)液，在體外成骨分化誘導(dǎo)第21天固定細(xì)胞，利用茜素紅染色檢測(cè)鈣結(jié)節(jié)。

體外成脂分化誘導(dǎo)：將細(xì)胞以2×10⁴/孔的密度接種于6孔板中，在體外成脂分化誘導(dǎo)液(所述體外成脂分化誘導(dǎo)液為：普通生長(zhǎng)培養(yǎng)基中含有1μmol的地塞米松，0.5mmol的3-異丁基甲基黃嘌呤，10μg/mL的胰島素，0.2mmol的吲哚美辛(Sigma-Aldrich公司))，在體外成脂分化誘導(dǎo)第14天提取RNA，在體外成骨分化誘導(dǎo)第21天固定細(xì)胞，利用油紅O染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂滴的形成。

如圖6-9所示，在對(duì)誘導(dǎo)后的細(xì)胞進(jìn)行茜素紅和油紅O染色，能夠看出實(shí)施例3制備得到的細(xì)胞在體外具有成脂分化能力和成骨分化的能力，從而證明所得到的細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞。

按照上述體外分化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)的具體步驟，對(duì)實(shí)施例1-2以及實(shí)施例4-6制備得到的細(xì)胞進(jìn)行體外分化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，能夠得出在體外具有成脂分化能力和成骨分化的能力，因此實(shí)施例1-2以及實(shí)施例4-6制備得到的細(xì)胞也為間充質(zhì)干細(xì)胞。

表面標(biāo)志物的鑒定

通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)實(shí)施例3提取的細(xì)胞，進(jìn)行間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物的鑒定。將貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞，消化處理后，1500r/min離心細(xì)胞收集細(xì)胞沉淀，采用BD stemflow hMSC analysis Kit試劑盒(產(chǎn)品編號(hào)562245)，利用試劑盒中的緩沖溶液重懸細(xì)胞，清洗1遍后離心，得到密度為1×10⁶/mL細(xì)胞。并將CD90FITC、CD44PE、CD105PerCP-Cy5.5、CD73APC、僅細(xì)胞、陰性+陽(yáng)性同型對(duì)照混合液、陰性+陽(yáng)性標(biāo)記物混合液、陽(yáng)性同型對(duì)照混合液+同型對(duì)照、陽(yáng)性標(biāo)志物混合液+CD44PE共9種溶液分裝在9支離心管中，每支離心管中500μL溶液，按要求孵育相應(yīng)抗體。避光，在冰上分別孵育實(shí)驗(yàn)組以及同型對(duì)照組的表面標(biāo)志物抗體40分鐘。采用流式細(xì)胞緩沖液沖洗、重懸，采用BD C6型號(hào)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

其中，同型對(duì)照組中所采用的細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)組所采用的細(xì)胞均為間充質(zhì)干細(xì)胞，但是同型對(duì)照組中所采用的抗體是非特異性的免疫球蛋白。

如圖10所示，實(shí)施例3制備得到的細(xì)胞能夠表達(dá)CD90、CD105、CD73和CD44等間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志，其不表達(dá)CD45、CD34、CD11b、CD19、HLA-DR，從而證明所得到的細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞，并且本發(fā)明制備得到的間充質(zhì)干細(xì)胞呈陽(yáng)性，不是非特異性的假陽(yáng)性結(jié)合。

同樣的，實(shí)施例1-2以及實(shí)施例4-6制備得到的細(xì)胞能夠表達(dá)CD90、CD105、CD73和CD44等間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志，其不表達(dá)CD45、CD34、CD11b、CD19、HLA-DR，從而證明實(shí)施例1-2以及實(shí)施例4-6制備得到的細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞。

間充質(zhì)干細(xì)胞輔助脂肪充填

采用實(shí)施例3制備得到的間充質(zhì)干細(xì)胞1×10⁶個(gè)加入到1mL(0.8g)脂肪中，注射到裸鼠背部皮下。如圖11所示，本發(fā)明所得到的間充質(zhì)干細(xì)胞具有輔助脂肪充填，防止脂肪吸收的能力，在脂肪移植后減少移植脂肪組織的吸收。