本發(fā)明屬于復(fù)合生物材料制備領(lǐng)域，具體涉及一種胎盤干細(xì)胞復(fù)合再生纖維素組織修復(fù)材料的制備方法。
背景技術(shù)：
近年來，具有增殖和分化潛能的干細(xì)胞己經(jīng)成為皮膚組織工程中好的種子細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞在皮膚組織工程中應(yīng)用研究，為構(gòu)建組織工程皮膚在皮膚損傷修復(fù)的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。但是胚胎干細(xì)胞在醫(yī)學(xué)應(yīng)用上存在道德倫理問題和致瘤性等限制因素，而具有多向分化潛能的多能干細(xì)胞一一間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells，mscs)作為良好的種子細(xì)胞，在皮膚組織工程研究中倍受關(guān)注。以往的研究主要是集中于骨髓來源的bmscs但bmscs需要通過骨髓穿刺而獲得，且數(shù)量隨年齡增長(zhǎng)而下降，這都限制了bmscs的應(yīng)用，且支架材料的選擇和應(yīng)用一直影響該技術(shù)發(fā)展的重要難題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中存在問題，本發(fā)明采用新生兒娩后“廢棄物”的胎盤組織獲取cmscs，并選用再生纖維素材料作為支架材料，制得胎盤干細(xì)胞復(fù)合再生纖維素組織修復(fù)材料。
本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
一種胎盤干細(xì)胞復(fù)合再生纖維素組織修復(fù)材料的制備方法，包括以下步驟：
步驟一：機(jī)械剝除胎盤羊膜組織，將剝離后剩下的絨毛組織，過質(zhì)量濃度75％的酒精，再用pbs沖洗洗盡血漬，并將其剪成1mm2小塊后，浸沒于含有質(zhì)量濃度0.1％的iv型膠原酶的低糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基(l-dmem)中，37℃消化15-45分鐘,得細(xì)胞組織液；
步驟二：細(xì)胞組織液經(jīng)200目篩網(wǎng)過篩后轉(zhuǎn)移至干凈的離心管，1200rpm離心lomin，棄上清液后接種于含有質(zhì)量濃度10％的胎牛血清的低糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基(l-dmem)中，于37℃、5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天后進(jìn)行第一次換液，隨后每隔兩天進(jìn)行換液，待細(xì)胞融合至90％使用質(zhì)量濃度0.25％的胰酶進(jìn)行消化，得胎盤絨毛膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞(cmscs)；
步驟三：稱取0.2g殼聚糖，溶于40ml去離子水中，配制質(zhì)量體積比為20％的殼聚糖溶液，另加入0.32g氯化鈉晶體及0.5ml冰醋酸，調(diào)節(jié)ph至5.0混合攪拌均勻得殼聚糖溶液；
步驟四：稱取0.2g藻酸鹽，溶于40ml去離子水中，配制質(zhì)量體積比為20％的藻酸鹽溶液，另加入0.32g氯化鈉晶體，攪拌至充分溶解得藻酸鹽溶液；
步驟五：稱取棉短絨5g，將其溶解在氫氧化鋰/尿素水溶液中，配制成質(zhì)量濃度4％的纖維素溶液，并加入殼聚糖溶液及藻酸鹽溶液，其中氫氧化鋰/尿素水溶液是采用氫氧化鋰8.76g、尿素12g及水79.24g配制而成；混合溶液充分?jǐn)嚢杈鶆?、過濾、靜置24h，于20kv條件下靜電紡絲得纖維膜；
步驟六：取生長(zhǎng)狀況良好的胎盤絨毛膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞(cmscs)接種于纖維膜上，接種時(shí)間為2-12h，即得胎盤干細(xì)胞復(fù)合再生纖維素組織修復(fù)材料。
優(yōu)選的，所述的步驟一還包括：將剝離后剩下的絨毛組織制成面積為10cm2。
優(yōu)選的，步驟一中所述的pbs中含有質(zhì)量濃度0.1％的青-鏈霉素。
優(yōu)選的，所述的步驟五還包括：將纖維膜冷凍干燥，并置于24孔板中，于放射co60輻射消毒。
優(yōu)選的，所述的步驟五中靜電紡絲針頭內(nèi)徑為0.9mm，紡絲距離在8-15cm，速度為0.1-o.5m/h。
本發(fā)明的有益效果在于：
1)胎盤絨毛膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞(cmscs)具有較強(qiáng)的增殖、分化能力，且取材的便利，不涉及社會(huì)倫理等問題的優(yōu)勢(shì)，其作為種子細(xì)胞在皮膚組織工程中具有極大的運(yùn)用前景。
2)纖維素作為一種生物材料，具有良好的生物適應(yīng)性和生物活性，能作用于創(chuàng)面修復(fù)的多個(gè)環(huán)節(jié)，促進(jìn)創(chuàng)面的快速愈合。以纖維素為原料制成的傷口敷料柔軟透明、舒適；有良好的通透性，能為創(chuàng)面提供濕潤(rùn)、微酸的修復(fù)環(huán)境；能調(diào)節(jié)創(chuàng)面氧張力，促進(jìn)毛細(xì)血管形成，從而加速傷口的愈合。
3)殼聚糖和藻酸鹽均被視為細(xì)胞支架材料并廣泛運(yùn)用在組織工程領(lǐng)域。殼聚糖是一種來源于海洋蟹類生物的天然多糖，生物相容性好，可降解，無毒性而且有其對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和大腸桿菌等均具有一定的抗菌效果。藻酸鹽除了良好生物相容性，可降解性及無毒性之外，還對(duì)細(xì)胞的粘附、遷移有促進(jìn)作用。
4)本發(fā)明制得的組織修復(fù)材料，可以加快皮膚修復(fù)，具有優(yōu)良的組織修復(fù)的功效。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
一種胎盤干細(xì)胞復(fù)合再生纖維素組織修復(fù)材料的制備方法，包括以下步驟：
步驟一：機(jī)械剝除胎盤羊膜組織，將剝離后剩下的絨毛組織制成面積為10cm2，過質(zhì)量濃度75％的酒精，再用含有質(zhì)量濃度0.1％的青-鏈霉素的pbs沖洗洗盡血漬，并將其剪成1mm2小塊后，浸沒于含有質(zhì)量濃度0.1％的iv型膠原酶的低糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基(l-dmem)中，37℃消化15-45分鐘,得細(xì)胞組織液；
步驟二：細(xì)胞組織液經(jīng)200目篩網(wǎng)過篩后轉(zhuǎn)移至干凈的離心管，1200rpm離心lomin，棄上清液后接種于含有質(zhì)量濃度10％的胎牛血清的低糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基(l-dmem)中，于37℃、5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天后進(jìn)行第一次換液，隨后每隔兩天進(jìn)行換液，待細(xì)胞融合至90％使用質(zhì)量濃度0.25％的胰酶進(jìn)行消化，得胎盤絨毛膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞(cmscs)；
步驟三：稱取0.2g殼聚糖，溶于40ml去離子水中，配制質(zhì)量體積比為20％的殼聚糖溶液，另加入0.32g氯化鈉晶體及0.5ml冰醋酸，調(diào)節(jié)ph至5.0混合攪拌均勻得殼聚糖溶液；
步驟四：稱取0.2g藻酸鹽，溶于40ml去離子水中，配制質(zhì)量體積比為20％的藻酸鹽溶液，另加入0.32g氯化鈉晶體，攪拌至充分溶解得藻酸鹽溶液；
步驟五：稱取棉短絨5g，將其溶解在氫氧化鋰/尿素水溶液中，配制成質(zhì)量濃度4％的纖維素溶液，并加入殼聚糖溶液及藻酸鹽溶液，其中氫氧化鋰/尿素水溶液是采用氫氧化鋰8.76g、尿素12g及水79.24g配制而成；混合溶液充分?jǐn)嚢杈鶆?、過濾、靜置24h，靜電紡絲得纖維膜，其中紡絲針頭內(nèi)徑為0.9mm，紡絲電壓為20kv，紡絲距離為8-15cm，速度為0.1-0.5m/h；將纖維膜冷凍干燥，并置于24孔板中，于放射co60輻射消毒；
步驟六：取生長(zhǎng)狀況良好的胎盤絨毛膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞(cmscs)接種于消毒后的纖維膜上，接種時(shí)間為2-12h，即得胎盤干細(xì)胞復(fù)合再生纖維素組織修復(fù)材料。
取200g左右sd大鼠12只，將sd大鼠麻醉后造模處理，背部剃毛消毒滅菌后，剪開5cm直徑大小圓形皮膚缺損創(chuàng)面，將實(shí)施例制得的胎盤干細(xì)胞復(fù)合再生纖維素組織修復(fù)材料植入其中，得實(shí)驗(yàn)組；空白對(duì)照組在相同創(chuàng)面處，覆蓋凡士林紗布。于術(shù)后每天觀察創(chuàng)面情況，并于30天后進(jìn)行組織切片he染色，將實(shí)驗(yàn)組、空白組進(jìn)行比較。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與未加入任何材料的空白對(duì)照組相比，本發(fā)明制得的胎盤干細(xì)胞復(fù)合再生纖維素組織修復(fù)材料能夠更好更快的修復(fù)大鼠皮膚損傷。手術(shù)5天后，實(shí)驗(yàn)組大鼠背部創(chuàng)面?zhèn)诳p線處己經(jīng)愈合，創(chuàng)面干燥，無分泌物。lod后，實(shí)驗(yàn)組大鼠的創(chuàng)面基本愈合，創(chuàng)口伴有鮮紅色的肉芽組織生成，空白對(duì)照組創(chuàng)面可見大量膿性分泌物。30天后，實(shí)驗(yàn)組的大鼠創(chuàng)面面積縮小，創(chuàng)面完全愈合，創(chuàng)面處己生長(zhǎng)毛發(fā)，與周圍皮膚幾乎融為一體；空白對(duì)照組創(chuàng)面結(jié)癡，暗紅色血塊，皮膚未修復(fù)完成。