專利名稱：：亞全能干細(xì)胞、其制備方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及干細(xì)胞領(lǐng)域，具體地涉及一種其來源于剪斷的人類臍帶或胎盤的亞全能干細(xì)胞。同時，本發(fā)明也涉及該亞全能干細(xì)胞的制備方法，以及該亞全能干細(xì)胞的用途。
背景技術(shù)：
：人體是由萬億個細(xì)胞構(gòu)成的。細(xì)胞是人體的基本結(jié)構(gòu)單位和功能單位，由干細(xì)胞分化而來，因此干細(xì)胞是人體各種組織器官的起源細(xì)胞。干細(xì)胞具有自我復(fù)制和多向分化的特征。在正常生殖生理過程中，干細(xì)胞由受精卵分化而來。受精卵最初發(fā)育形成原始胚胎干細(xì)胞，后者具有形成完整個體的全部潛能。原始胚胎干細(xì)胞進(jìn)一步分化增殖形成囊胚樣結(jié)構(gòu)，其內(nèi)層細(xì)胞群的細(xì)胞也稱胚胎干細(xì)胞。囊胚內(nèi)層的單個胚胎干細(xì)胞不能形成一個完整的個體，但具有形成人體各種組織的全能性。囊胚胚胎干細(xì)胞繼續(xù)分化發(fā)育，逐步形成胎兒各器官的功能執(zhí)行細(xì)胞，同時以不對稱分裂增殖的模式在機(jī)體組織特別是造血組織，包括連接胎兒和母體的胎盤臍帶血、骨髓、外周血、肝和脾中保留有不同分化潛能的干細(xì)胞。在整個胎兒發(fā)育到成年這個漫長而復(fù)雜的過程中，干細(xì)胞逐級喪失其全能性，形成亞全能干細(xì)胞(Pluripotentstemcell,PSC)、多能干細(xì)胞(Multipotentstemcell)和專能干細(xì)胞(Specializedstemcell)，后者按分化功能分別稱造血干細(xì)胞、血管干細(xì)胞、皮膚干細(xì)胞，等等。這些處于不同發(fā)育階段的干細(xì)胞在人體組織器官的發(fā)育生長、損傷修復(fù)過程中發(fā)揮著決定性的作用，因此干細(xì)胞可以用來新陳代謝、修復(fù)組織器官，使機(jī)體活力旺盛而保持健康狀況。迄今為止，人們對造血干細(xì)胞等專能干細(xì)胞的了解和臨床使用比較深入，對胚胎干細(xì)胞的了解也有長足的進(jìn)展，但對亞全能干細(xì)胞，即在發(fā)育階段及分化能力上與胚胎干細(xì)胞接近，表達(dá)胚胎干細(xì)胞的許多特征，又具備多能干細(xì)胞的許多生物學(xué)特征，移植到體內(nèi)不產(chǎn)生畸胎瘤，這樣一類干細(xì)胞了解甚少。但是，亞全能干細(xì)胞屬于成體干細(xì)胞范疇，避免了類似胚胎干細(xì)胞的醫(yī)學(xué)倫理問題，其在臨床上具有廣闊現(xiàn)實(shí)的應(yīng)用前景。因此，亞全能干細(xì)胞已經(jīng)成為干細(xì)胞研究的一個熱點(diǎn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明一個目的是提供一種亞全能干細(xì)胞，其來源于剪斷的人類臍帶或胎盤，可以用作基因治療藥物的載體細(xì)胞及用于制備治療細(xì)胞損傷或細(xì)胞衰老疾病的藥物。本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備亞全能干細(xì)胞的方法。本發(fā)明還有一個目的是提供上述亞全能干細(xì)胞的用途。為達(dá)上述目的，本發(fā)明提供了一種亞全能干細(xì)胞，其特征在于其來源于剪斷的人類臍帶或胎盤，表達(dá)標(biāo)志分子CD151和0CT4，不表達(dá)CD184，還表達(dá)一些其它胚胎干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞和血管干細(xì)胞的其它主要特異性免疫標(biāo)志，包括Sox-2、巢蛋白、CD90、CD29、CD13、CD166、CD105、CD44、CD73、CD49e、神經(jīng)節(jié)苷脂GD2和HLA-I。不表達(dá)CD34、CD31、CD45、CD133、CD106、CDlib、CD271、CD41、CD61、CD42b和HLA-II。其中0CT4是胚胎干細(xì)胞的一種特異性標(biāo)志。CD151屬于一個廣泛表達(dá)的表面分子，在部分干細(xì)胞、表皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血小板、樹束狀細(xì)胞等細(xì)胞表達(dá)，在淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞不表達(dá)。CD184是趨化因子受體4(CXCR4)，在淋巴細(xì)胞、樹束狀細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞和CD34+干細(xì)胞上有表達(dá)本發(fā)明亞全能干細(xì)胞的特征在于其在培養(yǎng)容器中貼壁生長，能向人體內(nèi)、中、外胚層組織，包括但不限于血管、神經(jīng)、肝臟、心肌、骨、軟骨和脂肪組織分化，注射至動物體內(nèi)不產(chǎn)生畸胎瘤。本發(fā)明提供了一種從剪斷的人類臍帶或胎盤制備亞全能干細(xì)胞的方法，該方法包括下列步驟a.無菌采集剪斷的人類臍帶和/或胎盤；b.進(jìn)行組織破碎，蛋白酶降解組織，過篩，分離得到原代單個核細(xì)胞；c.將原代單個核細(xì)胞接種于裝有干細(xì)胞培養(yǎng)液I或II的培養(yǎng)容器中貼壁生長，蛋白酶消化后培養(yǎng)擴(kuò)增傳代四代以上，收集干細(xì)胞，分裝后液氮低溫凍存；其中干細(xì)胞培養(yǎng)液I的制備過程如下50-70X體積的DMEM/F12培養(yǎng)液和30-50%體積的MCDB-201培養(yǎng)液混合成基礎(chǔ)培養(yǎng)液后，再添加下列終濃度的組分2-10%體積的血清，10—8mol/L的地塞米松，10-50mg/mL的ITS,0.l-10mmol/L的谷氨酰胺，l-100ng/mL的人表皮細(xì)胞生長因子和l-100ng/mL的堿性成纖維細(xì)胞生長因子；其中細(xì)胞培養(yǎng)液II的制備過程如下50-70%體積的DMEM/F12培養(yǎng)液和30-50%體積的MCDB-201培養(yǎng)液混合，再添加下列終濃度的組分0.1-5%W/V的人血清白蛋白，1-100iig/mL的亞麻酸，1-100iig/mL的亞油酸，O.1_5%體積的非必需氨基酸，10—8mol/L的地塞米松，10-50mg/mL的ITS，O.l-10mmol/L的谷氨酰胺，l-100ng/mL的人表皮細(xì)胞生長因子和l-100ng/mL的堿性成纖維細(xì)胞生長因子。本發(fā)明提供了一種從剪斷的人類臍帶或胎盤制備亞全能干細(xì)胞的方法，該方法包括下列步驟a.無菌采集剪斷的人類臍帶和/或胎盤；b.進(jìn)行組織破碎，蛋白酶降解組織，過篩，分離得到原代單個核細(xì)胞；c.使用常規(guī)的磁式細(xì)胞分選法，以CD184陰性、CD151陽性和0CT4陽性選擇組合分選，從采集的單個核細(xì)胞中分選出目的細(xì)胞，分裝后液氮低溫凍存。本發(fā)明制備亞全能干細(xì)胞的方法的特征在于其中所述的蛋白酶是膠原酶I或胰蛋白酶。本發(fā)明提供了亞全能干細(xì)胞在制備用于基因治療的藥物中作為載體細(xì)胞的用途。本發(fā)明也提供了亞全能干細(xì)胞在制備用于治療細(xì)胞損傷或細(xì)胞衰老疾病的藥物中的用途。本發(fā)明也提供了亞全能干細(xì)胞在制備促進(jìn)干細(xì)胞向成脂細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化及剌激造血的藥物中的用途。本發(fā)明也提供了亞全能干細(xì)胞在制備用于治療免疫調(diào)節(jié)異常疾病的藥物中的用途。本發(fā)明也提供了亞全能干細(xì)胞在制備用于治療大腦損傷疾病的藥物中的用途。5本發(fā)明也提供了亞全能干細(xì)胞在制備用于治療移植物抗宿主病(aGVHD)的藥物中的用途。本發(fā)明的有益效果是1.按照本發(fā)明的制備方法制備的CD151+CD184—0CT4+干細(xì)胞可以用作基因治療藥物的載體，轉(zhuǎn)染特定基因后直接移植到體內(nèi)組織，進(jìn)行相關(guān)疾病的基因治療。2.按照本發(fā)明的制備方法制備的CD151+CD184—0CT4+干細(xì)胞可以將干細(xì)胞從自體或他人的胎盤臍帶中分離出來，制備成適宜的干細(xì)胞產(chǎn)品供醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究和臨床治療使用。2.按照本發(fā)明的制備方法制備的CD151+CD184—0CT4+干細(xì)胞，由于其亞全能性，可以通過病變局部或靜脈輸注治療多種疾病。為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施方式對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，其中所述的實(shí)施例僅僅是示例本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。圖1是流式細(xì)胞儀檢測的干細(xì)胞(第6代)表面免疫標(biāo)志。圖2是流式細(xì)胞儀檢測的干細(xì)胞胞內(nèi)標(biāo)記檢測。圖3是本發(fā)明亞全能干細(xì)胞成脂分化染色圖。圖4是本發(fā)明亞全能干細(xì)胞成骨分化染色圖。圖5是本發(fā)明亞全能干細(xì)胞成軟骨分化染色圖。圖6是本發(fā)明亞全能干細(xì)胞向心肌分化的凝膠電泳圖。圖7是本發(fā)明亞全能干細(xì)胞向神經(jīng)分化的凝膠電泳圖。圖8是本發(fā)明亞全能干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的凝膠電泳圖。圖9是本發(fā)明亞全能干細(xì)胞轉(zhuǎn)染Ad-GFP48小時后的熒光照片。圖10是本發(fā)明亞全能干細(xì)胞對大鼠出血性腦損傷的治療試驗(yàn)的結(jié)果圖。圖11是本發(fā)明亞全能干細(xì)胞支持造血干細(xì)胞生長的圖表。圖12A是本發(fā)明亞全能干細(xì)胞對ConA剌激的小鼠脾細(xì)胞增殖的影響的曲線圖。圖12B是本發(fā)明亞全能干細(xì)胞對ConA剌激的小鼠脾細(xì)胞分泌IFN-Y的影響的曲線圖。圖12C是本發(fā)明亞全能干細(xì)胞對PHA剌激人外周血單個核細(xì)胞(PBMC)增殖的影響的曲線圖。圖12D是本發(fā)明亞全能干細(xì)胞對對PHA剌激人外周血單個核細(xì)胞(PBMC)分泌IFN-Y的影響的曲線圖。具體實(shí)施例方式下面就本發(fā)明中所涉及的培養(yǎng)基、術(shù)語及技術(shù)進(jìn)行說明本發(fā)明所用的干細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM/F12培養(yǎng)液(購自Invitrogen公司)MCDB-201培養(yǎng)液(購自Sigma公司)本發(fā)明所用的術(shù)語解釋表達(dá)指陽性率大于等于70%。不表達(dá)指陽性率小于等于5%。ITS:(insulintransferrinselenium)ITS,胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、硒酸鈉的混合物，Sigma等公司可以購買到。非必需氨基酸是人體非必需氨基酸的混合液，Sigma公司有售。本發(fā)明中所用技術(shù)包括流式細(xì)胞儀技術(shù)和磁珠分選，RT-PCR，細(xì)胞培養(yǎng)、傳代等技術(shù)主要參照以下專著或論文韓忠朝主編的《造血干細(xì)胞理論與移植技術(shù)》河南科技出版社，2000年出版；LvLL等.具有支持造血功能和其它潛能的人類臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和鑒定(Isolationandcharacterizationofhumanumbilicalcordmesenchymalstemcellswithhematopoiesis-s卯portivefunctionandotherpotentials).Haematologica，91(8):1017-26,2006。除非特別限定，本發(fā)明中的術(shù)語具有本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的普通含義，所使用的技術(shù)為本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)。配制細(xì)胞培養(yǎng)液細(xì)胞培養(yǎng)液A:5L的DMEM/F12培養(yǎng)液和5L的MCDB-201培養(yǎng)液混合成基礎(chǔ)培養(yǎng)液后，再添加下列終濃度的組分2%體積的胎牛血清，10—8mol/L的地塞米松，10mg/mL的ITS,0.lmmol/L的谷氨酰胺，Ing/mL的人表皮細(xì)胞生長因子和Ing/mL的堿性成纖維細(xì)胞生長因子。細(xì)胞培養(yǎng)液B:7L的MEM/F12培養(yǎng)液和3L的MCDB-201培養(yǎng)液混合成基礎(chǔ)培養(yǎng)液后，再添加下列終濃度的組分10%體積的胎牛血清，10—8mol/L的地塞米松，50mg/mL的ITS,10mmol/L的谷氨酰胺，100ng/mL的人表皮細(xì)胞生長因子和100ng/mL的堿性成纖維細(xì)胞生長因子。細(xì)胞培養(yǎng)液C:6L的DMEM/F12培養(yǎng)液和4L的MCDB-201培養(yǎng)液混合成基礎(chǔ)培養(yǎng)液后，再添加下列終濃度的組分6%體積的胎牛血清，10—8mol/L的地塞米松，30mg/mL的ITS,5mmol/L的谷氨酰胺，50ng/mL的人表皮細(xì)胞生長因子和50ng/mL的堿性成纖維細(xì)胞生長因子。細(xì)胞培養(yǎng)液D:5L的DMEM/F12培養(yǎng)液和5L的MCDB-201培養(yǎng)液混合，再添加下列終濃度的組分0.1%W/V的人血清白蛋白，1yg/mL的亞麻酸，1yg/mL的亞油酸，0.1%體積的非必需氨基酸，10—8mol/L的地塞米松，10mg/mL的ITS，O.lmmol/L的谷氨酰胺，lng/mL的人表皮細(xì)胞生長因子和lng/mL的堿性成纖維細(xì)胞生長因子。細(xì)胞培養(yǎng)液E:7L的DMEM/F12培養(yǎng)液和3L的MCDB-201培養(yǎng)液混合，再添加下列終濃度的組分5%W/V的人血清白蛋白，100iig/mL的亞麻酸，100yg/mL的亞油酸，5%體積的非必需氨基酸，10—8mol/L的地塞米松，50mg/mL的ITS，10mmol/L的谷氨酰胺，100ng/mL的人表皮細(xì)胞生長因子和100ng/mL的堿性成纖維細(xì)胞生長因子。細(xì)胞培養(yǎng)液F:6L的DMEM/F12培養(yǎng)液和4L的MCDB-201培養(yǎng)液混合，再添加下列終濃度的組分2.5XW/V的人血清白蛋白，50iig/mL的亞麻酸，50iig/mL的亞油酸，2.5%體積的非必需氨7基酸，10—8mol/L的地塞米松，25mg/mL的ITS，5mmol/L的谷氨酰胺，50ng/mL的人表皮細(xì)胞生長因子和50ng/mL的堿性成纖維細(xì)胞生長因子。實(shí)施例1用貼壁傳代培養(yǎng)法分離CD151+CD184—0ct4+亞全能干細(xì)胞取剪斷的人類胎盤，進(jìn)行CD151+CD184—0ct4+干細(xì)胞制品的制備。具體步驟如下1)無菌采集剪斷的人類胎盤；2)剪切至<0.5厘米的小碎片、將胎盤機(jī)械剪切成l-5mm3小組織塊，采用0.5mg/mL膠原酶I37°C消化1小時，lmg/mL胰酶37°C消化30分鐘，期間溫和震蕩5次，過篩，離心收集細(xì)胞懸液，接種于T75cm2培養(yǎng)瓶中，在細(xì)胞培養(yǎng)液A中培養(yǎng)5到7天，呈梭狀樣細(xì)胞貼壁生長；3)貼壁生長細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后進(jìn)一步培養(yǎng)傳代純化、擴(kuò)增傳代6代后收獲細(xì)胞、濃縮并用細(xì)胞保存液制備成細(xì)胞混懸液后，部分細(xì)胞送作質(zhì)量檢測，其余分裝置液氮罐深低溫保存，建CD151+CD184—0ct4+干細(xì)胞種子庫。分離的CD151+CD184—0ct4+干細(xì)胞，培養(yǎng)12-72小時內(nèi)貼壁，培養(yǎng)3-5天后增長速度增快，可見成纖維細(xì)胞樣克隆形成，此后增生成為形態(tài)相對均一的梭形細(xì)胞，呈平行排列生長或旋渦狀生長。胰蛋白酶消化后傳代，細(xì)胞經(jīng)2-4天培養(yǎng)即可鋪滿80%的瓶底表面。經(jīng)傳代擴(kuò)增4周天共收獲約109—1Q。成纖維樣細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示平均約每400個單個核細(xì)胞可形成1個CFU-F。細(xì)胞鑒定采用流式細(xì)胞儀(FACS)檢測干細(xì)胞(第6代)免疫標(biāo)志。參考圖1、圖2，檢測顯示，本方法制備的干細(xì)胞表面CD151陽性率高達(dá)99%以上，但不表達(dá)CD184、CD34、CD45、HLA-II等，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)高表達(dá)0CT4和Sox-2。實(shí)施例2用貼壁傳代培養(yǎng)法分離CD151+CD184—0ct4+亞全能干細(xì)胞與實(shí)施例1相同，所不同的是所用的細(xì)胞培養(yǎng)液是細(xì)胞培養(yǎng)液B。所得的結(jié)果與實(shí)施例1大體相同。實(shí)施例3用貼壁傳代培養(yǎng)法分離CD151+CD184—0ct4+亞全能干細(xì)胞與實(shí)施例1相同，所不同的是所用的細(xì)胞培養(yǎng)液是細(xì)胞培養(yǎng)液C。所得的結(jié)果與實(shí)施例1大體相同。實(shí)施例4用貼壁傳代培養(yǎng)法分離CD151+CD184—0ct4+亞全能干細(xì)胞與實(shí)施例1相同，所不同的是所用的細(xì)胞培養(yǎng)液是細(xì)胞培養(yǎng)液D。所得的結(jié)果與實(shí)施例1大體相同。實(shí)施例5用貼壁傳代培養(yǎng)法分離CD151+CD184—0ct4+亞全能干細(xì)胞與實(shí)施例1相同，所不同的是所用的細(xì)胞培養(yǎng)液是細(xì)胞培養(yǎng)液E。所得的結(jié)果與實(shí)施例1大體相同。實(shí)施例6用貼壁傳代培養(yǎng)法分離CD151+CD184—0ct4+亞全能干細(xì)胞與實(shí)施例1相同，所不同的是所用的細(xì)胞培養(yǎng)液是細(xì)胞培養(yǎng)液F。所得的結(jié)果與實(shí)施例1大體相同。實(shí)施例7用磁式細(xì)胞分選法分離CD151+CD184—0CT4+亞全能干細(xì)胞從臍帶中分離提取CD151陽性細(xì)胞的制備方法是無菌采集剪斷的臍帶；2)剪切組織至<0.5厘米的小碎片、將臍帶機(jī)械剪切成l-5mm3小組織塊，采用5mg/mL膠原酶I37"消化1小時，5mg/mL胰酶替代物(TyrpLEE鄧ress)37"消化30分鐘，期間溫和震蕩6次，加胎牛血清中和胰酶后將組織懸液通過細(xì)胞篩，離心收集細(xì)胞懸液；然后用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，先使用CD184+磁珠進(jìn)行陰性選擇得到CD184—細(xì)胞，然后用CD151+磁珠分離得到CD151+CD184—細(xì)胞，0CT4—磁珠分離作為干細(xì)胞種子，置液氮罐保存?zhèn)溆谩?shí)施例8CD151+CD184—0CT4+干細(xì)胞具有以下生物學(xué)特性干細(xì)胞的主要生物學(xué)特征是自我更新和多向分化。本發(fā)明研究表明本發(fā)明實(shí)施例1-7所制備的CD151+CD184—0CT4+干細(xì)胞具有以下生物學(xué)特性1.高增殖能力將實(shí)施例1的所制得的干細(xì)胞從106干細(xì)胞起始，置75cm2無菌塑料培養(yǎng)瓶傳代培養(yǎng)，3-4天便長滿瓶底，然后以1瓶傳擴(kuò)至3瓶的方式傳代，傳6至7代后干細(xì)胞總數(shù)量可達(dá)109—1Q。這些干細(xì)胞可以傳至20代以上，其細(xì)胞免疫標(biāo)志(表l)表達(dá)無明顯改變，完全滿足規(guī)模化生產(chǎn)和多人次臨床治療的需要。0103]表1:培養(yǎng)不同代數(shù)后的干細(xì)胞免疫標(biāo)志表達(dá)0104]表面免疫標(biāo)志P6陽性率(X)P20陽性率(0105]NestinFITC98.6798.730106]CD151PE99.2299.960107]CD90FITC99.5794.420108]HLA-IFITC99.7994.450109]HLA-IIFITC2.870.460110]CD34FITC0.510.050111]CD45FITC0.370.180112]CD41FITC0.340.380113]CD29PE99.9199.850114]CD13PE99.7399.540115]CD166PE99.5294.340116]CD31PE0.820.050117]CD133PE1.230.210118]CD105PE99.7894.70119]CD44PE99.9599.790120]CD73PE10099.720121]CD49ePE99.8799.790122]CD106PE1.091.540123]CD10PE95.9932.210124]CDlibPE2.022.730125]CD42bPE0.170.560126]GD2PE68.3779.020127]CD271PE1.750.780128]細(xì)胞內(nèi)免疫標(biāo)志0129]OCT-4PE98.9396.870130]Sox2PE98.5996.369NanoFITC94.8295.81c-MycPE99.1498.53注P，passage,傳代代數(shù)。2.向三個胚層組織的分化能力用干細(xì)胞分化培養(yǎng)液對CD151+CD184—0CT4+干細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步誘導(dǎo)能使其向多胚層分化1)成脂分化取實(shí)施例l所制得的第六代(P6代)干細(xì)胞在傳代的同時以2X104e/cm2的密度接種于24孔板中，每孔加入細(xì)胞培養(yǎng)液A0.8ml;待細(xì)胞達(dá)80%融合，換為誘導(dǎo)培養(yǎng)液(MDM，腦FBS，liiM地塞米松，O.5mM(IBMX)，100iiM吲哚美辛禾口10iig/ml胰島素)，用上述分化培養(yǎng)基每3-4天換液，持續(xù)3周。用油紅0染色。油紅O染色法步驟細(xì)胞PBS清洗兩次，每次5分鐘；用4%多聚甲醛固定15分鐘；PBS漂洗兩次，每次5分鐘；用60%異丙醇漂洗。加入油紅0染色15分鐘，結(jié)果見圖3?？梢钥闯?，本發(fā)明的亞全能干細(xì)胞可以成脂分化。2)成骨分化取實(shí)施例1所制得的P6代干細(xì)胞在傳代的同時以2X104/cm2的密度接種于24孔板中，每孔加入細(xì)胞培養(yǎng)液B0.8ml;待細(xì)胞達(dá)80%融合，換為誘導(dǎo)培養(yǎng)液(高糖DMEM，10—8M地塞米松，1.5mg/mlP-磷酸甘油，50yg/ml抗壞血酸)，以后每34天換一次液；21天后，進(jìn)行vonKossa染色固定后的細(xì)胞用PBS洗滌2遍；加入5%硝酸銀水溶液中10分鐘，紫外光曬10分鐘，蒸餾水洗滌；浸入5%次亞硫酸鈉溶液中，蒸餾水洗，結(jié)果見圖4?？梢钥闯?，本發(fā)明的亞全能干細(xì)胞可以成骨分化。3)成軟骨分化將實(shí)施例l所制得干細(xì)胞制成2.5X10s個細(xì)胞/ml濃度的細(xì)胞離心到15ml離心管，形成高密度微球，用如下培養(yǎng)基培養(yǎng)21天DMEM-HG，1XITS，1X亞油酸-牛血清白蛋白，100nM地塞米松，50iig/ml維生素C，和10ng/mlTGFP1.期間，每3-4天換一次液。21天后用石蠟包埋，切片成5iim厚，用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的番紅0法染色，結(jié)果見圖5?？梢钥闯?，本發(fā)明的亞全能干細(xì)胞可以成軟骨分化。4)向心肌分化以4X10Vcm2將實(shí)施例1制得的P3代亞全能干細(xì)胞接種6孔板內(nèi)，細(xì)胞達(dá)到80%融合后，用的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為DMEM-HG，10X體積FBS和6iiM5-脫氧雜氮胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine)處理24小時后，換含10%體積的FBS的DMEM-HG培養(yǎng)基培養(yǎng)14天.用RT-PCR心肌特異的標(biāo)志，a-肌動蛋白，肌間線蛋白，MyoDl，肌球蛋白和肌牽丐蛋白的表達(dá)，結(jié)果見圖6。心肌特異基因的RT-PCR的引物設(shè)計(jì)見表2?？梢钥闯?，本發(fā)明的亞全能干細(xì)胞可以向心肌分化。5)向神經(jīng)分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基DMEM/F12，B27，和增加以下條件(l)20ng/mlEGF，10ng/mlbFGF，和10ng/mlPDGF誘導(dǎo)實(shí)施例1制得的干細(xì)胞7天；(2)10ng/mlbFGF，10ng/mlPDGF和50ng/mlNGF誘導(dǎo)實(shí)施例1制得的干細(xì)胞7天.在十四天，提取細(xì)胞RNA檢測巢蛋白、GFAP、MAP2、NG2的表達(dá)，結(jié)果見圖7。神經(jīng)特異基因的RT-PCR的引物設(shè)計(jì)見表2?？梢钥闯觯景l(fā)明的亞全能干細(xì)胞可以向神經(jīng)分化。6)向肝細(xì)胞分化實(shí)施例1制得的干細(xì)胞在MDM中補(bǔ)充20ng/mlbFGF和20ng/mlHGF中誘導(dǎo)培養(yǎng)，3天換液一次，重新補(bǔ)充上述因子，在14天可以檢測得到肝特異基因，蛋白AFP、白蛋白的表達(dá)，結(jié)果見圖8。肝特異基因的RT-PCR的引物設(shè)計(jì)見表2。10:0146]可以看出，本發(fā)明的亞全能干細(xì)胞可以向肝細(xì)胞分化。:0147]表2誘導(dǎo)后組織特異性基因的RT-PCR的引物:0148]基因引物序列(5'—3'):0149]CCTGACCCTGAAGTACCCTATC:0150]Actin:0151]GCATTTGCGGTGGACGAT:0152]GACCGCTTCGCCAACTACAT:0153]Desmin:0154]TCCTCCAATTCCCGCATCT:0155]CCTGCTGTGCTGTATAACC:0156]Myosin:0157]GTCCATCCCGAAGTCAAT:0158]GCCGCCTGAGCAAAGTAAAT:0159]MyoDl:0160]ATAGCGGATGGCGTTGCGCA:0161]TGGACAAGGTGGATGAAGAG:0162]Troponin:0163]TTCTCGGTGTCCTCCTTCTT:0164]CAGCTGGCGCACCTCAAGATG:0165]Nestin:0166]AGGGAAGTTGGGCTCAGGACTGG:0167]GCACGCAGTATGAGGCAATG:0168]GFAP:0169]CGGTCTTCACCACGATGTT:0170]CTGGCATTGACCTCCCTAA:0171]MAP2:0172]CTGTTTCCCTTCCCATTTT:0173]CCTTGGCTTTGACCCTGACT:0174]NG2:0175]CACTGTTGTGGAGCAATACGG:0176]AAAAGCCCACTCCAGCATC:0177]aFP:0178]CAATCCAGCACATCTCCTC:0179]GATTGCCTTTGCTCAGTAT:0180]Albumin:0181]TTGGGTTGTCATCTTTGTG:0182]CTGTCCCTGTATGCCTCTG:0183]P-actin:0184]ATGTCACGCACGATTTCC:0185]實(shí)施例2-7所制得的干細(xì)胞也進(jìn)行了上述高增殖能力，及成脂、成骨、成軟骨、向心肌、向肝臟、向肝細(xì)胞的分化試驗(yàn)，結(jié)果大體相同。實(shí)施例9CD151+CD184—0CT4+干細(xì)胞作為基因治療的載體細(xì)胞本發(fā)明利用攜帶綠色熒光蛋白基因的腺病毒Ad-GFP轉(zhuǎn)染體外擴(kuò)增的實(shí)施例1所制得的PSC，取36代PSC，按1X107孔的密度接種于24孔板中培養(yǎng)24h后吸出培養(yǎng)液，加入用培養(yǎng)液稀釋的Ad-GFP，lXlQ8pFU/ml，加入培養(yǎng)孔，另設(shè)孔作為未加入病毒的空白對照，繼續(xù)培養(yǎng)48小時，用流式觀察轉(zhuǎn)染率，并用熒光顯微鏡照相。結(jié)果見圖9:轉(zhuǎn)染Ad-GFP48小時后檢測，轉(zhuǎn)染效率97.76%。實(shí)施例2-7所制得的干細(xì)胞也進(jìn)行了上述試驗(yàn)，結(jié)果大體相同。由此可見，本發(fā)明的亞全能干細(xì)胞可以作為制備用于基因治療的藥物中的載體細(xì)胞。實(shí)施例10CD151+CD184—0ct4+干細(xì)胞對大鼠出血性腦損傷的治療試驗(yàn)按照實(shí)施例1所述的制備方法制備得到CD151+CD184—0ct4+干細(xì)胞。參考Rosenberg等的方法[RosenbergGA，etal.，Stroke,1990，21:801-807]，制作大鼠腦出血模型制作。將大鼠麻醉后固定于立體定向儀上，頭頂部去毛消毒后正中縱向切口，于前顱偏右旁開3.0mm，向后1.4mm處在顱骨上鉆一小孔，用10微量進(jìn)樣器進(jìn)針5.6mm，緩慢分次注2ill含0.4U膠原酶VII的PBS，留針5min后緩慢拔針，縫合切口。實(shí)驗(yàn)動物完全蘇醒后，觀察到提尾懸空時出血對側(cè)前肢屈曲、內(nèi)收，自主運(yùn)動時身體向偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈，說明模型制作成功。在模型制作成功24小時后進(jìn)行CD151+CD184—0ct4+干細(xì)胞移植，大鼠麻醉后固定于立體定向儀上，拆線，在原孔內(nèi)用10y1微量進(jìn)樣器進(jìn)針5.6mm，緩慢分次注入10yl細(xì)胞懸液，留針5min后緩慢拔針，縫合切口。對照組用同樣方法注入等量PBS。免疫組織化學(xué)檢測于PSC移植后28天處死2組大鼠。4X多聚甲醛500ml經(jīng)左心室灌注后，斷頭取腦，置4%多聚甲醛后固定24小時，冠狀位切取以出血區(qū)域?yàn)橹行牡陌▊?cè)腦室室管膜下區(qū)、基底節(jié)區(qū)和海馬的厚度2mm的腦組織標(biāo)本，觀察移植后的損傷區(qū)的大小。結(jié)果見圖10，圖10是大鼠腦出血28天后腦切片，箭頭所示為損傷區(qū)；Normal是正常組，PBS是PBS注射組，PSC是CD151+CD184—0ct4+干細(xì)胞治療組。該圖顯示CD151+CD184—0ct4+干細(xì)胞移植組損傷區(qū)比PBS組明顯小，說明CD151+CD184—0ct4+干細(xì)胞可以明顯減少大鼠腦出血后對大腦的損傷。實(shí)施例2-7所制得的干細(xì)胞也進(jìn)行了上述試驗(yàn)，結(jié)果大體相同。實(shí)施例11CD151+CD184—0ct4+干細(xì)胞支持造血將實(shí)施例1的第6代CD151+CD184—0ct4+干細(xì)胞以2.OX104/孔的濃度種于24孔板，6°C。20Gy照射后種臍血CD34+細(xì)胞2.0X104，共同培養(yǎng)8周，每周半量換液。將換出的細(xì)胞種于甲基纖維素完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)兩周后計(jì)數(shù)集落，大于等于50個細(xì)胞為一個集落。對照組為單獨(dú)臍CD34+細(xì)胞培養(yǎng)組和PSC與臍CD34+細(xì)胞共同培養(yǎng)組。見圖11圖表所示，集落形成數(shù)量檢測結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。細(xì)胞培養(yǎng)集落計(jì)數(shù)結(jié)果顯示單獨(dú)臍血CD34+細(xì)胞培養(yǎng)組兩周后即無集落形成，而CD151+CD184—0ct4+干細(xì)胞和臍CD34+細(xì)胞共同培養(yǎng)組可維持6周尚可有集落形成，表明CD151+CD184—0ct4+干細(xì)胞具有支持長期造血的能力。實(shí)施例2-7所制得的干細(xì)胞也進(jìn)行了上述試驗(yàn)，結(jié)果大體相同。實(shí)施例12CD151+CD184—0ct4+干細(xì)胞調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的功能1.MTT檢測實(shí)施例1的CD151+CD184—0ct4+干細(xì)胞對T細(xì)胞增殖的抑制作用12T細(xì)胞在PHA剌激下成聚簇/克隆性增殖，在倒置顯微鏡下觀察，CD151+CD184—0ct4+干細(xì)胞共培養(yǎng)條件下的T細(xì)胞聚簇/克隆大小較對照組縮小，數(shù)量減少。MTT檢測提示在CD151+CD184—0ct4+干細(xì)胞共培養(yǎng)條件下，絲裂原剌激T細(xì)胞增殖受到抑制，增殖指數(shù)減低，差別有顯著意義(P<0.01)。通過比較不同梯度濃度下的T細(xì)胞增殖抑制情況可以發(fā)現(xiàn)在T細(xì)胞與CD151+CD184—0ct4+干細(xì)胞比值為4:1、2:l和l:1時的增殖抑制率由30.36%增加至為41.14%和51.92%，說明CD151+CD184—0ct4+干細(xì)胞對T細(xì)胞的增殖抑制作用具有劑量依賴性。2.CD151+CD184—0ct4+干細(xì)胞抑制ConA剌激后小鼠脾細(xì)胞Y_干擾素的表達(dá)材料與方法1)取C57小鼠脾臟，按常規(guī)制備脾細(xì)胞懸液106/ml備用。2)取足量實(shí)施例1制備的CD151+CD184—0ct4+干細(xì)胞，經(jīng)放射線(銫源)照射后制備以下濃度的懸液(細(xì)胞數(shù)/ml):1X106，5X105，1X105，5X104，1X104。按下表分組并在96孔板中加入相應(yīng)劑量的小鼠脾細(xì)胞、CD151+CD184—0ct4+干細(xì)胞和ConA，每組均設(shè)3重復(fù)孔。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>將96孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。72小時后取出96孔板，吸取培養(yǎng)液上清。以ELISA法測定干擾素-Y濃度。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理分析，結(jié)果如圖12A到12D所示，所示結(jié)果表明CD151+CD184—0ct4+干細(xì)胞有顯著的免疫調(diào)節(jié)作用。實(shí)施例2-7所制得的干細(xì)胞也進(jìn)行了上述試驗(yàn)，結(jié)果大體相同。實(shí)施例13CD151+CD184—0ct4+干細(xì)胞對小鼠移植物抗宿主病(aGVHD)的預(yù)防和治療作用使用實(shí)施例1所制備的CD151+CD184—0ct4+干細(xì)胞。1、aGVHD模型的建立取雄性、8周齡C57BL/6(H_2b)小鼠和BALB/C(H_2d)小鼠。BALB/c小鼠造模前60Coy射線照射清髓(照射劑量為10.OGy)。2、預(yù)防組的分組處置BALB/c小鼠于照射后5_6h、造模前3h給予CD151+CD184—0ct4+干細(xì)胞靜注，然后給予C57BL/6小鼠的骨髓細(xì)胞和脾細(xì)胞靜注造模。3、治療組的分組處置BALB/c小鼠于照射后8_10h內(nèi)給予C57BL/6小鼠的骨髓細(xì)胞和脾細(xì)胞靜注造模，然后于造模后第6天分別注射實(shí)施例1的CD151+CD184—0ct4+干細(xì)胞治療，第一次注射干細(xì)胞后間隔12天給予第二次MSC注射治療。4、對照空白對照組，照射組，同系干細(xì)胞對照組，模型組骨髓細(xì)胞制備無菌取小鼠股骨、脛腓骨，反復(fù)沖洗骨髓，過濾，制成單細(xì)胞懸液，離心、洗2-3次，臺盼藍(lán)染色進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)活性率在99%以上，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1X107ml，備用。脾細(xì)胞制備無菌取出脾細(xì)胞研碎，制成單細(xì)胞懸液，離心，洗2-3次，臺盼藍(lán)染色進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)活性率在99%以上。調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為2X107ml，備用。實(shí)驗(yàn)分組情況如下表組別(小鼠只數(shù))C57B1/6脾細(xì)胞/C57B1/6骨髓細(xì)胞/移植干細(xì)胞/口qh同系骨髓細(xì)胞組01Xl。7(10)GVHD模型組(10)lx1071x107——低量干細(xì)胞預(yù)防組lx1071x1071x105(10)高量干細(xì)胞預(yù)防組1x107lx1。7lx:106(10)低量干細(xì)胞治療組lx107lx107lx:105(10)中量干細(xì)胞移植組lx107lx107:105(10)高量干細(xì)胞移植組lx107lx107lx(10)照射組(10)000正常對照組(10)000全部小鼠于半屏障系統(tǒng)中實(shí)驗(yàn)和飼養(yǎng)，飼養(yǎng)于無菌層流間內(nèi)的層流架上，墊料、飼料和飲水經(jīng)過消毒處理。小鼠骨髓移植尾靜脈注射——局部常規(guī)消毒，無菌操作條件下按表1分組情況經(jīng)尾靜脈注射移植細(xì)胞。動物無菌飼養(yǎng)觀察存活率和小鼠GVHD臨床癥狀。觀察時間30天津，每天觀察并記錄各組動物的存活狀況，用于動物生存曲線的繪制以評價(jià)模14型與治療效果；每周稱量并記錄兩次動物體重，用于aGVHD模型建立成功與否與治療效果的評價(jià)；每天觀察并記錄試驗(yàn)動物的一般臨床表現(xiàn)，根據(jù)體重變化、體位、活動性、被毛質(zhì)地和皮膚完整性這五項(xiàng)指標(biāo)的變化程度來進(jìn)行試驗(yàn)動物臨床積分評價(jià)；試驗(yàn)結(jié)束時處死全部試驗(yàn)動物，取臟器(肝臟，肺臟和皮膚)，HE染色觀察各組織的病理變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下1小鼠生存情況照射組在急性期大部分死亡，10只存活1只，存活率10%;同系骨髓細(xì)胞移植組10只存活5只，存活率50%;GVHD組在急性期全部死亡，存活率0%，中位存活時間6天。CD151+CD184—0ct4+干細(xì)胞低劑量預(yù)防組小鼠10只存活2只，存活率20%，中位存活時間15天。CD151+CD184—0ct4+干細(xì)胞高劑量預(yù)防組小鼠10只存活3只，存活率30%，中位存活時間18天。CD151+CD184—0ct4+干細(xì)胞低劑量組小鼠10只存活3，存活率30%，中位存活時間18天。中劑量組小鼠10只存活5，存活率50%，中位存活時間22天。高劑量組小鼠10只存活6只，存活率60%，中位存活時間23天。經(jīng)秩和檢驗(yàn)，使用干細(xì)胞組與GVHD組在存活率和/或差異中位存活時間在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著性差異(p<0.05)。此外，GVHD小鼠經(jīng)CD151+CD184—0ct4+干細(xì)胞治療，GVHD癥狀表現(xiàn)減輕，經(jīng)U檢驗(yàn)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明CD151+CD184—0ct4+干細(xì)胞可減輕小鼠GVHD癥狀。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)成功建立了小鼠aGVHD模型，證實(shí)CD151+CD184—0ct4+干細(xì)胞移植可以預(yù)防治療GVHD，降低aGVHD的病變程度，提高移植小鼠的存活率和生存時間，同時證明CD151+CD184—0ct4+干細(xì)胞在體內(nèi)具有免疫調(diào)節(jié)作用，可以用于治療異基因造血干細(xì)胞后的GVHD。實(shí)施例2-7所制得的干細(xì)胞也進(jìn)行了上述試驗(yàn)，結(jié)果大體相同。1權(quán)利要求一種亞全能干細(xì)胞，其特征在于其來源于剪斷的人類臍帶或胎盤，表達(dá)標(biāo)志分子CD151和OCT4，不表達(dá)CD184。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的亞全能干細(xì)胞，其特征在于其還表達(dá)標(biāo)志分子Sox-2、巢蛋白、CD90、CD29、CD13、CD166、CD105、CD44、CD73、CD49e、神經(jīng)節(jié)苷脂GD2和HLA-I;其不表達(dá)CD34、CD31、CD45、CD133、CD106、CD1lb、CD271、CD41、CD61、CD42b和HLA-H。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的亞全能干細(xì)胞，其特征在于其在培養(yǎng)容器中貼壁生長，能向人體內(nèi)、中、外胚層組織分化，注射至動物體內(nèi)不產(chǎn)生畸胎瘤。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的亞全能干細(xì)胞，其特征在于所述胚層組織是血管、神經(jīng)、肝臟、心肌、骨、軟骨和脂肪組織。5.—種從剪斷的人類臍帶或胎盤制備亞全能干細(xì)胞的方法，該方法包括下列步驟a.無菌采集剪斷的人類臍帶和/或胎盤；b.進(jìn)行組織破碎，蛋白酶降解組織，過篩，分離得到原代單個核細(xì)胞；c.將原代單個核細(xì)胞接種于裝有干細(xì)胞培養(yǎng)液I或II的培養(yǎng)容器中貼壁生長，蛋白酶消化后培養(yǎng)擴(kuò)增傳代四代以上，收集干細(xì)胞，分裝后液氮低溫凍存；其中干細(xì)胞培養(yǎng)液I的制備過程如下50-70%體積的DMEM/F12培養(yǎng)液和30_50%體積的MCDB-201培養(yǎng)液混合成基礎(chǔ)培養(yǎng)液后，再添加下列終濃度的組分2-10%體積的血清，10—8mol/L的地塞米松，10-50mg/mL的ITS，O.l-10mmol/L的谷氨酰胺，1-100ng/mL的人表皮細(xì)胞生長因子和l-100ng/mL的堿性成纖維細(xì)胞生長因子；其中細(xì)胞培養(yǎng)液II的制備過程如下50-70%體積的DMEM/F12培養(yǎng)液和30-50%體積的MCDB-201培養(yǎng)液混合，再添加下列終濃度的組分0.1-5%W/V的人血清白蛋白，1-100iig/mL的亞麻酸，1-100iig/mL的亞油酸，O.1_5%體積的非必需氨基酸，10—8mol/L的地塞米松，10-50mg/mL的ITS，O.l-10mmol/L的谷氨酰胺，l-100ng/mL的人表皮細(xì)胞生長因子和l-100ng/mL的堿性成纖維細(xì)胞生長因子。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備亞全能干細(xì)胞的方法，其中所述的蛋白酶是膠原酶I或胰蛋白酶。7.—種從剪斷的人類臍帶或胎盤制備亞全能干細(xì)胞的方法，該方法包括下列步驟a.無菌采集剪斷的人類臍帶和/或胎盤；b.進(jìn)行組織破碎，蛋白酶降解組織，過篩，分離得到原代單個核細(xì)胞；c.使用常規(guī)的磁式細(xì)胞分選法，以CD184陰性、CD151陽性和0CT4陽性選擇組合分選，從采集的單個核細(xì)胞中分選出目的細(xì)胞，分裝后液氮低溫凍存。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備亞全能干細(xì)胞的方法，其中所述的蛋白酶是膠原酶I或胰蛋白酶。9.權(quán)利要求1至4中任一權(quán)利要求所述的亞全能干細(xì)胞在制備用于基因治療的藥物中作為載體細(xì)胞的用途。10.權(quán)利要求1至4中任一權(quán)利要求所述的亞全能干細(xì)胞在制備用于治療細(xì)胞損傷或細(xì)胞衰老疾病的藥物中的用途。11.權(quán)利要求1至4中任一權(quán)利要求所述的亞全能干細(xì)胞在制備促進(jìn)干細(xì)胞向成脂細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化及剌激造血的藥物中的用途。12.權(quán)利要求1至4中任一權(quán)利要求所述的亞全能干細(xì)胞在制備用于治療免疫調(diào)節(jié)異常疾病的藥物中的用途。13.權(quán)利要求1至4中任一權(quán)利要求所述的亞全能干細(xì)胞在制備用于治療大腦損傷疾病的藥物中的用途。14.權(quán)利要求1至4中任一權(quán)利要求所述的業(yè)全能干細(xì)胞在制備用于治療移植物抗宿主病的藥物中的用途。全文摘要本發(fā)明公開了一種亞全能干細(xì)胞，其來源于剪斷的人類臍帶或胎盤，細(xì)胞標(biāo)志是CD151+OCT4+CD184-，其在培養(yǎng)容器中貼壁生長，能向人體內(nèi)、中、外胚層組織分化。本發(fā)明也公開了該亞全能干細(xì)胞的制備方法，及其用于制備治療細(xì)胞損傷或細(xì)胞衰老疾病的藥物中的用途，以及其用作基因治療藥物的載體細(xì)胞的用途。文檔編號A61P37/06GK101748096SQ200810240040公開日2010年6月23日申請日期2008年12月17日優(yōu)先權(quán)日2008年12月17日發(fā)明者趙寶娜,韓之海申請人:北京漢氏聯(lián)合生物技術(shù)有限公司