專利名稱：具有抗血管生成活性且沒有抗凝作用的作為類肝素酶抑制劑的部分脫硫酸化糖胺聚糖衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及部分脫硫酸化的糖胺聚糖衍生物，特別是肝素，其制備方法，其作為活性組分在制備用于治療病癥，例如腫瘤，包括轉(zhuǎn)移形式腫瘤，以及可受益于抑制類肝素酶(heparanase)的任何治療適應(yīng)癥的藥物中的應(yīng)用，和含有它們的藥物組合物。
現(xiàn)有技術(shù)狀況在Hadassah-Hebrew University Hospital-Israel的TumorBiological Research Unit中進(jìn)行的研究(Is r.Med.Assoc.J.2000，2，37-45；J.Med.Chem.2000，43，2591-600；Invasion Metastasis 1994-95，14，290-302；Exp.Cell Res.1992，201，208-15；)關(guān)注于肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子、硫酸乙酰肝素和硫酸乙酰肝素降解酶(類肝素酶)參與腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移。已經(jīng)應(yīng)用這些研究來(lái)篩選和鑒定具有有效類肝素酶抑制活性的肝素衍生物和肝素/硫酸乙酰肝素模擬物(Nature Med.1999，5，735-6；Science，1999，285，33-4]。
腫瘤細(xì)胞釋放類肝素酶，這是一種內(nèi)型-β-D-葡糖醛酸酶，其降解在細(xì)胞表面上和在細(xì)胞外基質(zhì)中的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的多糖鏈。
已將類肝素酶參與腫瘤血管生成與其從它貯存在ECM(細(xì)胞外基質(zhì))內(nèi)的貯庫(kù)中釋放bFGF(FGF-2)和其它生長(zhǎng)因子的能力相關(guān)聯(lián)。這些生長(zhǎng)因子提供了在正常和病理情況下誘導(dǎo)新血管生成的機(jī)制。
因此，類肝素酶可能不僅促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，而且還促進(jìn)腫瘤血管生成，二者都是腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵步驟。
類肝素酶的特異性抑制劑阻止由硫酸乙酰肝素貯存的生長(zhǎng)因子的釋放和激活以及ECM的破裂，并被視為開發(fā)抗癌藥物的非常有希望的途徑。
所以，對(duì)于抗血管生成藥物，一種可能的治療途徑是開發(fā)有效的和選擇性的類肝素酶抑制劑。
關(guān)于血管生成的討論可參見在本申請(qǐng)人名下的WO 01/55221。
類肝素酶的另一重要參與是炎癥和自身免疫。實(shí)際上，類肝素酶活性還與免疫系統(tǒng)的激活細(xì)胞離開循環(huán)并引起炎性和自身免疫性反應(yīng)的能力有關(guān)。血小板、粒細(xì)胞、T和B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞與內(nèi)皮下ECM的相互作用與類肝素酶活性降解硫酸乙酰肝素有關(guān)。該酶作為對(duì)多種不同激活信號(hào)的反應(yīng)而從細(xì)胞內(nèi)區(qū)室(即溶酶體，特殊顆粒)中釋放出來(lái)，這表明其在炎性位點(diǎn)和自身免疫性損傷中的受調(diào)節(jié)的參與和存在。用類肝素酶抑制劑(即非抗凝種類的低分子量肝素-LMWH)治療實(shí)驗(yàn)動(dòng)物顯著降低了在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)、佐劑關(guān)節(jié)炎和移植物排斥的發(fā)生率，這表明可以使用類肝素酶抑制劑來(lái)抑制自身免疫性和炎性疾病。
肝素肝素是具有不同長(zhǎng)度和不同硫酸化度的天然存在的多糖的異質(zhì)混合物，其具有抗凝活性，并且是由存在于肝臟(首先從肝臟中分離出來(lái))、肌肉、肺、胸腺和脾臟中的結(jié)締組織肥大細(xì)胞分泌的。
除了規(guī)則序列之外，在肝素中已經(jīng)鑒定出了相應(yīng)于抗凝血酶活性的活性位點(diǎn)的序列。
肝素及其衍生物的抗腫瘤和抗轉(zhuǎn)移活性是由于其抑制類肝素酶、阻斷生長(zhǎng)因子和調(diào)節(jié)血管生成的能力所致。
硫酸乙酰肝素(HS)硫酸乙酰肝素(HS)是普遍存在的蛋白配體。蛋白與HS鏈結(jié)合，產(chǎn)生了從對(duì)抗蛋白酶解作用的簡(jiǎn)單固定或保護(hù)到特異性調(diào)節(jié)生物活動(dòng)例如血管生成的各種作用。
肝素和硫酸乙酰肝素(HS)中的糖骨架是由交替的D-葡糖胺(GlcN)和己糖醛酸(GlcA或IdoA)構(gòu)成的。
在肝素中，GlcN殘基主要是N-硫酸化的，而在HS中，它們既是N-硫酸化的，又是N-乙?；?，具有少量未被取代的NH2基團(tuán)。
HS平均的O-硫酸化比肝素低。
肝素在治療血管生成性疾病例如腫瘤，特別是腫瘤轉(zhuǎn)移方面的應(yīng)用受到了肝素抗凝活性的嚴(yán)重限制。
已經(jīng)對(duì)肝素進(jìn)行了化學(xué)修飾，以降低其抗凝能力，同時(shí)保存其抗腫瘤性質(zhì)。
把抗凝血酶位點(diǎn)中的葡糖醛酸單元打開可降低肝素對(duì)抗凝血酶的親和力這樣，在使用時(shí)，肝素可具有降低的抗凝作用，但是仍然保留抗血管生成性質(zhì)。
類肝素酶類肝素酶是屬于內(nèi)切糖苷酶(內(nèi)型-β-D-葡糖醛酸酶)家族的酶，其水解硫酸乙酰肝素(HS)和肝素的鏈的內(nèi)糖苷鍵。
這些內(nèi)切糖苷酶參與腫瘤細(xì)胞增殖、腫瘤轉(zhuǎn)移和新血管生成。這些酶是抗血管生成活性的生物靶標(biāo)。在科學(xué)文獻(xiàn)中有大量結(jié)構(gòu)/活性關(guān)系研究(參見例如Lapierre F.等人，Glycobiology，vol.6，(3)，355-366，1996)。雖然有很多方面仍然有待澄清，但是已報(bào)道了有關(guān)肝素及其衍生物對(duì)類肝素酶的抑制作用的研究，使用特殊測(cè)試已導(dǎo)致出現(xiàn)對(duì)結(jié)構(gòu)類型的考慮，其可用作指導(dǎo)來(lái)獲得新的、選擇性更強(qiáng)的衍生物。
在上述Lapierre等人的文章中，肝素衍生物被描述為是通過(guò)2-O脫硫酸化或“二醇裂解(glycol split)”(用高碘酸鹽氧化，然后用硼氫化鈉還原)而獲得的。在此分別定義為“2-O-脫硫酸化肝素”和“RO-肝素”的這些衍生物部分保持了肝素的抗血管生成活性，所述活性是在皮質(zhì)類固醇存在下通過(guò)CAM實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)的(出處同上，第360頁(yè))。
據(jù)報(bào)道，是比肝素更近似的硫酸乙酰肝素模擬物的N-酰基肝素衍生物抑制類肝素酶的活性僅比N-硫酸衍生物稍弱一些(Irimira T.，Biochemistry 1986，25，5322-5328；Ishai-Michaeli R.，等人，Biochemistry 1992，31，2080-2088)。
肝素和FGFFGF調(diào)節(jié)多種生理過(guò)程例如細(xì)胞生長(zhǎng)和分化，但是也參與病理過(guò)程例如腫瘤血管生成。
FGF是生長(zhǎng)因子(10個(gè)以上多肽的家族)，其中酸性(FGF-1)和堿性FGF(FGF-2)是研究最充分的，其需要多糖輔因子肝素或HS來(lái)與FGF受體(FGFR)結(jié)合并激活它。
雖然肝素和HS激活FGF的確切機(jī)制尚不清楚，但是已知肝素/FGF/FGFR形成“三分子”或“三元”復(fù)合物。
一種假定的機(jī)制是，肝素與HS引起FGF發(fā)生所謂的夾層二聚化，由此二聚化的后者與FGFR形成穩(wěn)定的復(fù)合物。
肝素衍生物的抗轉(zhuǎn)移活性原發(fā)性腫瘤產(chǎn)生轉(zhuǎn)移性細(xì)胞的能力也許是抗癌治療所面對(duì)的主要問題。
具有阻斷類肝素酶的顯著能力的肝素衍生物似乎同樣能夠抑制原發(fā)性腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤中的血管生成。
此外，抑制類肝素酶降低了腫瘤細(xì)胞從原發(fā)性腫瘤遷移到其它器官的能力。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在動(dòng)物模型中的抗轉(zhuǎn)移活性與肝素和肝素衍生物(Bitan M.等人，Isr.J.Med.Sci.1995，31，106-108)以及其它硫酸化多糖(Miao，H.Q.等人，Int.J.Cancer 1999，83，424-431，和其中所引用的參考文獻(xiàn))的類肝素酶抑制能力有關(guān)。對(duì)于抗轉(zhuǎn)移活性的分子量依賴性所進(jìn)行的研究表明，非常低MW的肝素(Sciumbata，T.，等人，InvasionMetastasis 1996，16，132-143)和多硫酸低聚糖(Parish，C.R.，等人，Cancer Res.1999，59，3433-3441)也保留顯著的抗轉(zhuǎn)移活性。雖然除去N-硫酸基團(tuán)(N-脫硫酸化)通常會(huì)降低肝素的抗轉(zhuǎn)移潛能，但是在將所形成的游離NH2基團(tuán)N-酰化(N-乙酰化、N-己酰化(Bitan M.，1995)，和N-琥珀?；?Sciumbata，T.，1996)之后，這種活性部分恢復(fù)。已發(fā)現(xiàn)肝素的抗轉(zhuǎn)移活性與其O-硫酸化度負(fù)相關(guān)(Bitan M.，1995)。然而，艾杜糖醛酸殘基的選擇性2-O-脫硫酸化不導(dǎo)致肝素抗轉(zhuǎn)移活性的顯著下降(Lapierre，F(xiàn).，Glycobiology 1996，6，355-366)。
一般情況下，肝素和其它硫酸化多糖的類肝素酶抑制和抗轉(zhuǎn)移活性隨著分子量以及硫酸化度的下降而降低(Bitan M.，1995；Parish，C.R.，1999)。然而，這些活性還取決于多糖的糖主鏈(殘基的類型以及糖苷鍵的位置)(Parish，C.R.，1999)。由于類肝素酶活性位點(diǎn)的三維結(jié)構(gòu)仍然是未知的，所以難以預(yù)測(cè)哪種多糖主鏈和硫酸化模式會(huì)最有效地抑制該酶。
基于目前的知識(shí)，有利于血管生成抑制作用的肝素樣分子的結(jié)構(gòu)要求可根據(jù)欲阻斷的靶而分為2類a)抑制類肝素酶雖然該酶識(shí)別并裂解含有N-酰基-葡糖胺-葡糖醛酸(或N-硫酸化葡糖胺殘基，參見例如D.Sandback-Pikas等人J.Biol.Chem.，273，18777-18780(1998)以及其中引用的參考文獻(xiàn))的至少8個(gè)單糖單元的肝素和HS序列，但是其抑制可有效地由長(zhǎng)于十四糖的肝素片段來(lái)完成(Bitan M.，1995)，或由廣泛硫酸化的較短低聚糖例如硫酸麥芽己糖(MHS)和硫酸磷酸甘露戊糖(PI-88)來(lái)完成(Parish，C.R.，1999)。然而，長(zhǎng)的肝素片段和重度硫酸化的低聚糖都是抗凝劑，而對(duì)于可能的抗轉(zhuǎn)移藥物來(lái)說(shuō)，這是應(yīng)當(dāng)避免的性質(zhì)；b)抑制血管生成生長(zhǎng)因子(成纖維細(xì)胞型FGF-1和FGF-2；血管內(nèi)皮型VEGF；血管通透型VPF)對(duì)于此，肝素樣化合物優(yōu)選具有這樣的序列，長(zhǎng)度為至少5個(gè)單糖單元，含有2-硫酸化艾杜糖醛酸和N，6-硫酸化葡糖胺(參見例如M.Maccarana等人，J.Biol.Chem.，268，23989-23905(1993))。
文獻(xiàn)公開了具有抗血管生成活性的小肽(5-13個(gè)氨基酸)(University of Washington的US 5,399,667)，其通過(guò)結(jié)合血小板反應(yīng)蛋白受體來(lái)起作用，或更長(zhǎng)的肽(約50個(gè)氨基酸)。
已知修飾的血小板因子(EP 0589719，Lilly)能以IC50＝7nM抑制內(nèi)皮增殖。
具有抗血管生成活性的低聚糖片段也已充分描述過(guò)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，實(shí)際上，通過(guò)改變糖序列，可提高相互作用選擇性。
此外，肝素還可用作自身具有抗血管生成作用的物質(zhì)例如某些甾族化合物的載體，這是采用肝素對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的親和力；參見例如University of Texas和Imperial Cancer Research Technology的WO93/18793，其中所要求保護(hù)的肝素通過(guò)酸不穩(wěn)定連接物例如己二酸肼結(jié)合到氫化可的松上。該綴合分子的抗血管生成作用大于未綴合分子(即使在同時(shí)給藥時(shí))。
在Biochim.Biophys.Acta(1996)，1310，86-96中，描述了在C-20經(jīng)由腙基團(tuán)與甾族化合物(例如氫化可的松)結(jié)合的肝素，其抗血管生成活性大于這兩種未綴合的分子。
Daiichi Sc.的EP 0246654描述了進(jìn)行II期研究的具有抗血管生成活性的硫酸化多糖。Pharmacia & Upiohn-Harvard Coll.的EP 0 394 971描述了具有低硫酸化的己糖-肝素片段，其能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)和FGF-1刺激的血管生成。Alfa Wasserman的EP 0 618 234描述了制備具有攜帶親核基團(tuán)的肝素或類肝素結(jié)構(gòu)的半合成糖胺聚糖的方法。Glycomed的WO 95/05182描述了具有抗凝、抗血管生成和抗炎活性的多種硫酸化低聚糖。Glycomed的US 5,808,021描述了制備基本上非解聚的2-O、3-O脫硫酸化肝素的方法，所述肝素在艾杜糖醛酸2-位(I，2-O)和葡糖胺單元3-位(A，3-O)的脫硫酸化百分比是初始百分比的約99-約97％。在該方法中，脫硫酸化是在二價(jià)金屬陽(yáng)離子，例如鈣離子或銅離子存在下進(jìn)行的，然后將所得產(chǎn)物冷凍干燥。所得脫硫酸化肝素具有抗血管生成活性。Yeda Res& Dev Co Ltd等的EP 0 251 134公開了亞凝血?jiǎng)┝康母嗡鼗蚱溲苌镌陬A(yù)防同種移植物排斥和治療自身免疫性疾病中的應(yīng)用。其中肝素的活性是通過(guò)抑制類肝素酶來(lái)實(shí)現(xiàn)的。Univ.Australian Nat.的WO 88/05301公開了包含作為類肝素酶抑制劑的硫酸化多糖的抗轉(zhuǎn)移和/或抗炎組合物。其中提供了肝素、巖藻多糖、硫酸戊聚糖、硫酸葡聚糖。Univ.Texas System的WO 92/01003公開了沒有抗凝活性的肝素衍生物作為類肝素酶抑制劑的應(yīng)用。這些衍生物具有磺氨基或O-硫酸酯基團(tuán)，M.W.為1000-15000，并且每個(gè)末端單體單元是具有結(jié)合到阻斷基團(tuán)上的末端O原子的單體重復(fù)單元。Glycomed的WO 94/14851和WO 96/06867提供了2-O，3-O-脫硫酸化粘膜肝素或其片段，其在2-O位至少96.7％脫硫酸化，在3-O位至少75％脫硫酸化，可用作非抗凝性類肝素酶抑制劑。Glycomed的WO95/09637和WO 96/09828公開了具有肝素樣特性的高度硫酸化麥芽低聚糖化合物。Glycomed的WO 95/30424提供了具有類肝素酶抑制活性的6-O-脫硫酸化肝素或其片段。Univ.Australian Nat.的WO 96/33726公開了作為具有類肝素酶抑制活性的類肝素模擬物的硫酸化低聚糖。Knoll AG的WO 01/35967提供了通過(guò)施用類肝素酶抑制劑來(lái)治療心功能不全和相關(guān)病癥的方法，在所述類肝素酶抑制劑中提及了具有部分還原的COOH基團(tuán)，或至少部分N-脫硫酸化和N-乙酰化，或至少部分N，O-脫硫酸化和N-再硫酸化或O-乙?；母嗡亍?br> 本發(fā)明的目的是發(fā)現(xiàn)最佳的糖胺聚糖結(jié)構(gòu)，以基于類肝素酶抑制和/或FGF生長(zhǎng)因子抑制機(jī)制產(chǎn)生抗血管生成活性。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供具有抗血管生成活性的藥物，所述藥物基本上不具有肝素衍生物的典型副作用例如抗凝活性。
在本申請(qǐng)人名下的WO 01/55221公開了糖胺聚糖，特別是脫硫酸化度不超過(guò)總糖醛酸單元的60％的脫硫酸化肝素。所提供的這些衍生物具有抗血管生成活性，并且沒有抗凝活性。所述化合物發(fā)揮其抗血管生成活性是基于抑制了FGF。沒有預(yù)見到抑制類肝素酶的活性。
WO 01/55221還以非常一般性的描述提供了包含葡糖胺殘基的改性肝素，其具有不同N-脫硫酸化度以及任選隨后完全或部分乙?；Ｋ鰠⒖嘉墨I(xiàn)的一般性教導(dǎo)沒有清楚地描述N-脫硫酸化和任選隨后完全或部分乙?；牟襟E。
發(fā)明概述現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，對(duì)于包含具有不同N-脫硫酸化度以及任選隨后完全或部分N-?；?優(yōu)選N-乙?；?的葡糖胺殘基的糖胺聚糖，例如肝素樣糖胺聚糖、肝素或改性肝素，將其進(jìn)行受控制的艾杜糖醛酸單元2-O-脫硫酸化處理，直至脫硫酸化度最高不超過(guò)總糖醛酸單元的60％，可維持生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的血管生成性質(zhì)。
令人驚奇的是，上述WO 01/55221中公開的2-O-脫硫酸化肝素也是類肝素酶抑制劑。發(fā)現(xiàn)通過(guò)將未硫酸化的糖醛酸殘基進(jìn)行二醇裂解可進(jìn)一步增強(qiáng)該性質(zhì)。還發(fā)現(xiàn)，二醇裂解—導(dǎo)致抗凝活性顯著喪失的化學(xué)修飾(Casu B.，等人，Arzneim.Forsch.(Drug Res.)1986，36，637-642)顯著增強(qiáng)了部分N-乙?；嗡睾?-O-脫硫酸化化合物的類肝素酶抑制性質(zhì)，其中所述部分N-乙?；嗡厥峭ㄟ^(guò)50％N-脫硫酸化，然后對(duì)所得游離氨基進(jìn)行N-乙?；@得的。
在本發(fā)明所述條件下進(jìn)行的脫硫酸化還使得形成了在2，3位具有oxyranic環(huán)的艾杜糖醛酸單元。在本發(fā)明所述條件下打開oxyranic環(huán)導(dǎo)致形成L-艾杜糖醛酸或L-半乳糖醛酸單元。
本發(fā)明的一個(gè)目的是所述糖胺聚糖衍生物在制備具有類肝素酶和/或FGF生長(zhǎng)因子抑制活性的藥物中的應(yīng)用。
依據(jù)本發(fā)明，所述糖胺聚糖衍生物優(yōu)選是肝素樣糖胺聚糖。依據(jù)本發(fā)明，所述糖胺聚糖衍生物是改性的肝素，其中包含具有不同N-脫硫酸化度以及任選隨后完全或部分乙?；钠咸前窔埢?。
在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及式(I)化合物 其中U環(huán)可具有下列含義
X和X’可相同或不同，是醛基或-CH2-D基團(tuán)，其中D是羥基或氨基酸、肽或者糖或低聚糖的殘基；R和R1可相同或不同，是SO3，C1-8?；鶜埢?，所述殘基可任選攜帶至少一個(gè)另外的羧基；乙酰基、己?；?、琥珀酰基、新戊酰基是優(yōu)選的?；鶜埢?；n和m可相同或不同，可以是1-40；n+m的和為6-40；m∶n比例為10∶2-1∶1；符號(hào) 是指用m和n表示的單元是沿著多糖鏈統(tǒng)計(jì)學(xué)分布，并且無(wú)需按順序分布。
可任選攜帶至少一個(gè)另外的羧基的C1-8?；鶜埢膶?shí)例是乙?；?、丙酰基、丁?；⑽祯；?、己酰基、庚?；约八锌赡艿漠悩?gòu)體、草酰基、丙二?；?、琥珀?；⑿挛祯；?、戊二酰基；乙?；?、己?；⑿挛祯；莾?yōu)選的酰基殘基。
當(dāng)R或R1是N-?；鶗r(shí)，它們優(yōu)選為R+R1之和的40-60％。m優(yōu)選大于或等于n。n優(yōu)選為m+n之和的40-60％。
其中R和R1是C1或C3-C8?；鶜埢纳鲜鍪?I)化合物是新的。
作為本發(fā)明主題的化合物的特征在于，以高效力抑制類肝素酶，具有引人關(guān)注的抗血管生成特性，因此可作為活性組分用于制備用來(lái)治療可受益于抑制類肝素酶的病癥、基于異常血管生成的病癥和特別是用來(lái)治療轉(zhuǎn)移瘤的藥物。
本發(fā)明化合物還抑制FGF。
有利的是，本發(fā)明化合物表現(xiàn)出降低(如果不是不存在的話)的抗凝性質(zhì)，因此避免或減少了肝素的典型副作用。另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)來(lái)自下述事實(shí)，即本發(fā)明化合物可用儀器分析技術(shù)例如NMR光譜來(lái)表征，由此允許從工業(yè)角度看絕對(duì)理想的過(guò)程控制。
同樣對(duì)于改性肝素，在制備血管生成抑制劑時(shí)，分子量(MW)具有非常重要的功能。眾所周知，實(shí)際上，最高達(dá)相當(dāng)于五糖單元的值的分子量(MW)降低不導(dǎo)致抗血管生成活性喪失。另一方面，已經(jīng)確立的是，盡管超過(guò)一定長(zhǎng)度時(shí)肝素鏈?zhǔn)谴俪啥皇且种艶GF的激活，它們是比較短鏈甚至更好的類肝素酶抑制劑。然而，對(duì)于抑制類肝素酶來(lái)說(shuō)，最佳鏈長(zhǎng)度取決于抑制劑的結(jié)構(gòu)(糖主鏈、鍵位置、硫酸化模式)，并且應(yīng)當(dāng)確立任何新型潛在抑制劑的最佳鏈長(zhǎng)度。
發(fā)明詳述本文具體公開包含具有不同N-脫硫酸化度以及任選隨后完全或部分乙?；钠咸前窔埢谋景l(fā)明化合物，并將它們作為新化合物要求保護(hù)。
脫硫酸化度是指未硫酸化的艾杜糖醛酸占起始肝素中原本存在的總糖醛酸的百分比。脫硫酸化百分比的一個(gè)最初優(yōu)選范圍是約40-約60％。
在式(I)化合物當(dāng)中，第一個(gè)優(yōu)選的化合物是部分2-O-脫硫酸化的肝素，其分子量(MW)為11200，多分散指數(shù)D為1.3，脫硫酸化度為1.99(以SO3-∶COO-摩爾比表示)，修飾的糖醛酸占總糖醛酸的百分比是約50％。所述化合物(下文中還稱為ST1514)包含在式(I)中，其中除了其它相應(yīng)的定義以外，m∶n＝1∶1，并且以m和n表示的單元是以規(guī)則、交替的方式沿著多糖鏈分布。
第二個(gè)優(yōu)選的化合物是部分2-O-脫硫酸化的LMW肝素，其分子量(MW)為3050，多分散指數(shù)為2.2，脫硫酸化度為1.99(以SO3-∶COO-摩爾比表示)，修飾的糖醛酸占總糖醛酸的百分比是約50％。所述化合物(下文中還稱為ST2010)包含在式(I)中，其中除了其它相應(yīng)的定義以外，m∶n＝1∶1，并且以m和n表示的單元是以規(guī)則、交替的方式沿著多糖鏈分布。該化合物是這樣獲得的用亞硝酸將ST1514解聚，然后將醛基還原，這樣大部分其還原端殘基是脫水甘露糖殘基 第三個(gè)優(yōu)選的化合物是部分2-O-脫硫酸化的LMW肝素，其分子量為Mn＝5800，Mw＝7520，多分散指數(shù)為1.294，修飾的糖醛酸占總糖醛酸的百分比是約50％。所述化合物(下文中還稱為ST2184)包含在式(I)中，其中除了其它相應(yīng)的定義以外，m∶n＝1∶1，并且以m和n表示的單元是以規(guī)則、交替的方式沿著多糖鏈分布。該化合物是這樣獲得的用亞硝酸將ST1514解聚，然后將醛基還原，這樣大部分其還原端殘基是脫水甘露糖殘基。
第四個(gè)優(yōu)選的化合物是部分N-脫硫酸化和N-重乙酰化肝素，其分子量(MW)為11200，多分散指數(shù)為1.3，脫硫酸化度為1.6(以SO3-∶COO-摩爾比表示)，修飾的糖醛酸占總糖醛酸的百分比是約30％。所述化合物(下文中還稱為ST1518)包含在式(I)中，其中除了其它相應(yīng)的定義以外，R+R1之和的50％是N-乙酰基。
第五個(gè)優(yōu)選的化合物是部分N-脫硫酸化和N-重乙酰化LMW肝素，其分子量為Mn＝4780，Mw＝10000，多分散指數(shù)為2.092，修飾的糖醛酸占總糖醛酸的百分比是約30％。所述化合物(下文中還稱為ST2168)包含在式(I)中，其中除了其它相應(yīng)的定義以外，R+R1之和的50％是N-乙?；?br> 第六個(gè)優(yōu)選的化合物是部分N-脫硫酸化和N-重乙?；嗡?，其分子量為Mn＝10890，Mw＝22370，多分散指數(shù)為2.054。所述化合物(下文中還稱為ST2037)包含在式(I)中，其中除了其它相應(yīng)的定義以外，R+R1之和的27％是N-乙?；?。
第七個(gè)優(yōu)選的化合物是部分N-脫硫酸化和N-重乙?；嗡兀浞肿恿繛镸n＝10210，Mw＝21270，多分散指數(shù)為2.083。所述化合物(下文中還稱為ST2038)包含在式(I)中，其中除了其它相應(yīng)的定義以外，R+R1之和的39％是N-乙?；?br> 第八個(gè)優(yōu)選的化合物是部分N-脫硫酸化和N-重乙酰化肝素，其分子量為Mn＝11070，Mw＝22000，多分散指數(shù)為1.987。所述化合物(下文中還稱為ST2041)包含在式(I)中，其中除了其它相應(yīng)的定義以外，R+R1之和的64％是N-乙酰基。
第九個(gè)優(yōu)選的化合物是部分N-脫硫酸化和N-重乙酰化肝素，其中修飾的糖醛酸占總糖醛酸的百分比是約30％。所述化合物包含在式(I)中，其中除了其它相應(yīng)的定義以外，R+R1之和的27％是N-乙酰基(ST2185)。
第十個(gè)優(yōu)選的化合物是部分N-脫硫酸化和N-重乙?；嗡?，其中修飾的糖醛酸占總糖醛酸的百分比是約30％。所述化合物(下文中還稱為ST2186)包含在式(I)中，其中除了其它相應(yīng)的定義以外，R+R1之和的39％是N-乙?；?。
第十一個(gè)優(yōu)選的化合物是部分N-脫硫酸化和N-重乙酰化肝素，其中修飾的糖醛酸占總糖醛酸的百分比是約30％。所述化合物(下文中還稱為ST2187)包含在式(I)中，其中除了其它相應(yīng)的定義以外，R+R1之和的64％是N-乙?；?。
第十二個(gè)優(yōu)選的化合物是部分2-O-脫硫酸化肝素，其分子量(MW)為12900D，多分散指數(shù)D為1.5，脫硫酸化度為1.9(以SO3-∶COO-摩爾比表示)，修飾的糖醛酸占總糖醛酸的百分比為5％環(huán)氧基，29％氧化和還原的糖醛酸殘基。所述化合物(下文中還稱為ST1513)包含在式(I)中，其中除了其它相應(yīng)的定義以外，m∶n＝1∶1，并且以m和n表示的單元是以規(guī)則、交替的方式沿著多糖鏈分布。
第十三個(gè)優(yōu)選的化合物是部分2-O-脫硫酸化肝素，其分子量(MW)為9200D，多分散指數(shù)D為1.5，修飾的糖醛酸占總糖醛酸的百分比為11％環(huán)氧基，27.5％氧化和還原的糖醛酸殘基。所述化合物(下文中還稱為ST1515)包含在式(I)中，其中除了其它相應(yīng)的定義以外，m∶n＝1∶1，并且以m和n表示的單元是以規(guī)則、交替的方式沿著多糖鏈分布。
第十四個(gè)優(yōu)選的化合物是部分2-O-脫硫酸化肝素，其分子量(MW)為11000D，多分散指數(shù)D為1.5，脫硫酸化度為1.93(以SO3-∶COO-摩爾比表示)，修飾的糖醛酸占總糖醛酸的百分比為5％環(huán)氧基，29％氧化和還原的糖醛酸殘基。
化合物ST1514、ST1513、ST1516和ST1515的制備具體公開在WO 01/55221中。
本發(fā)明的部分2-O-脫硫酸化衍生物是按照上述WO01/55221中公開的方法制備的。
至于本發(fā)明N-脫硫酸化和任選N-乙?；前肪厶?，它們可通過(guò)還能夠制備2-O-部分脫硫酸化肝素的方法制得，所述方法包括a)通過(guò)下述操作進(jìn)行N-脫硫酸化將磺氨基殘基在DMSO∶H2O95∶5 v∶v中于室溫下溶劑分解水解0.5-8小時(shí)，甚至更優(yōu)選約2小時(shí)，以完全或部分除去在葡糖胺殘基2-位的硫酸根基團(tuán)；b)通過(guò)下述操作將所述在葡糖胺殘基2-位完全或部分脫硫酸化的基團(tuán)N-?；趬A性水溶液(pH8-9)中用酰化劑例如?；幚恚陨稍谄咸前窔埢?-位完全或部分?；幕鶊F(tuán)；然后將所得化合物進(jìn)行下述步驟c)、d)或e)與f-g)，或直接進(jìn)行下述步驟f)；c)在室溫-約100℃，優(yōu)選50-70℃，甚至更優(yōu)選約65℃溫度下進(jìn)行堿處理，導(dǎo)致在艾杜糖醛酸2-位的受控制百分比的硫酸根基團(tuán)被除去，和形成環(huán)氧基團(tuán)；和如果需要的話d)在約pH 7，于約50℃-約100℃，優(yōu)選約70℃溫度下打開所述環(huán)氧環(huán)，以產(chǎn)生半乳糖醛酸殘基；或者e)在約0℃-30℃，優(yōu)選約25℃溫度下打開所述環(huán)氧環(huán)，以產(chǎn)生艾杜糖醛酸殘基；和如果需要的話f)用高碘酸鈉將二醇氧化，以打開糖苷環(huán)和形成2個(gè)醛基/個(gè)修飾的殘基；和如果需要的話g)將所述醛基還原成伯醇，和如果需要的話，將D基團(tuán)轉(zhuǎn)化成如在式(I)中給出的不同含義所表示的非羥基基團(tuán)；h)任選對(duì)在步驟g)中獲得的化合物進(jìn)行酸水解，以獲得與規(guī)則序列相對(duì)應(yīng)的低聚糖，優(yōu)選通過(guò)用亞硝酸脫氨基來(lái)實(shí)現(xiàn)。經(jīng)常用于通過(guò)裂解N-硫酸葡糖胺殘基與下一個(gè)糖醛酸之間的鍵來(lái)獲得LMW肝素的該反應(yīng)導(dǎo)致獲得在非還原端具有由糖醛酸組成的殘基和在還原端具有脫水甘露糖殘基的LMW化合物，可通過(guò)用硼氫化鈉還原來(lái)將脫水甘露糖殘基進(jìn)一步修飾成脫水甘露醇。所獲得的LMW化合物含有至少一個(gè)二醇裂解的艾杜糖醛酸殘基；或者i)用選自裂解酶、肝素酶、類肝素酶或同等物的酶將在步驟g)中獲得的產(chǎn)物進(jìn)行部分酶促水解，以獲得低聚糖，優(yōu)選四糖或八糖，其非還原末端殘基由不飽和艾杜糖醛酸組成，還原殘基由N-硫酸葡糖胺組成，并含有至少一個(gè)開環(huán)艾杜糖醛酸殘基。
i)任選地通過(guò)部分酶促水解來(lái)處理在步驟c)中獲得的化合物或在步驟d)中獲得的產(chǎn)物；和如果需要的話j)將在步驟b)、c)和f)之一中獲得的產(chǎn)物部分6-O-脫硫酸化；或者k)將部分或完全6-脫硫酸化的起始肝素進(jìn)行步驟b)、c)和f)。
本發(fā)明2-O-脫硫酸化衍生物是用省去步驟a)和b)的上述方法獲得的。
本發(fā)明方法還可以通過(guò)下面的反應(yīng)方案來(lái)說(shuō)明
依據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的化合物是-部分2-O-脫硫酸化的肝素，其可通過(guò)省去步驟a)和b)的上述方法獲得，其中步驟c)是在60℃進(jìn)行45分鐘，步驟d)是在70℃于pH7進(jìn)行的，其分子量(MW)為11200，多分散指數(shù)D為1.3，脫硫酸化度為1.99 (以SO3-∶COO-摩爾比表示)，修飾的糖醛酸占總糖醛酸的百分比是約50％(下文中還稱為ST1514)；-部分2-O-脫硫酸化的LMW肝素，其可通過(guò)省去步驟a)和b)的上述方法獲得，其中步驟c)是在60℃進(jìn)行45分鐘，步驟d)是在70℃于pH7進(jìn)行的，然后進(jìn)行步驟f)、g)和通過(guò)脫氨基來(lái)進(jìn)行h)，其分子量(MW)為3050，多分散指數(shù)D為2.2，脫硫酸化度為1.99(以SO3-∶COO-摩爾比表示)，修飾的糖醛酸占總糖醛酸的百分比是約50％(下文中還稱為ST2010)；-部分2-O-脫硫酸化的LMW肝素，其可通過(guò)省去步驟a)和b)的上述方法獲得，其中步驟c)是在60℃進(jìn)行45分鐘，步驟d)是在70℃于pH7進(jìn)行的，然后進(jìn)行步驟f)、g)和通過(guò)脫氨基來(lái)進(jìn)行h)，其分子量為Mn＝5800，Mw＝7520，多分散指數(shù)D為1.294，修飾的糖醛酸占總糖醛酸的百分比是約50％(下文中還稱為ST2184)；-肝素N-乙?；?50％)，其可通過(guò)上述方法獲得，其中步驟a)在室溫進(jìn)行2小時(shí)，步驟b)在4℃進(jìn)行2小時(shí)，步驟c)、d)、e)省去，步驟f)在4℃進(jìn)行一夜，步驟g)在室溫進(jìn)行3小時(shí)，其分子量(MW)為11200，多分散指數(shù)D為1.3，脫硫酸化度為1.6(以SO3-∶COO-摩爾比表示)，修飾的糖醛酸占總糖醛酸的百分比是約30％(下文中還稱為ST1518)。
-LMW肝素N-乙酰基(50％)，其可通過(guò)上述方法獲得，其中步驟a)在室溫進(jìn)行2小時(shí)，步驟b)在4℃進(jìn)行2小時(shí)，步驟c)、d)、e)省去，步驟f)在4℃進(jìn)行一夜，步驟g)在室溫進(jìn)行3小時(shí)，步驟h)通過(guò)用亞硝酸脫氨基于4℃進(jìn)行17分鐘，然后于室溫用硼氫化物還原醛基3小時(shí)，其分子量為Mw＝4780，Mn＝10000，多分散指數(shù)D為2.092，修飾的糖醛酸占總糖醛酸的百分比是約30％(下文中還稱為ST2168)。
-肝素N-乙?；?27％)，其可通過(guò)上述方法獲得，其中步驟a)在室溫進(jìn)行2小時(shí)，步驟b)在4℃進(jìn)行2小時(shí)，步驟c)、d)、e)、f)、g)、h)省去，其分子量為Mn＝10890，Mw＝22370，多分散指數(shù)D為2.054(下文中還稱為ST2037)。
-肝素N-乙?；?39％)，其可通過(guò)上述方法獲得，其中步驟a)在室溫進(jìn)行2小時(shí)，步驟b)在4℃進(jìn)行2小時(shí)，步驟c)、d)、e)、f)、g)、h)省去，其分子量為Mn＝10210，Mw＝21270，多分散指數(shù)D為2.083(下文中還稱為ST2038)。
-肝素N-乙酰基(64％)，其可通過(guò)上述方法獲得，其中步驟a)在室溫進(jìn)行2小時(shí)，步驟b)在4℃進(jìn)行2小時(shí)，步驟c)、d)、e)、f)、g)、h)省去，其分子量為Mn＝11070，Mw＝22000，多分散指數(shù)D為1.987(下文中還稱為ST2041)。
-肝素N-乙酰基(27％)，其可通過(guò)上述方法獲得，其中步驟a)在室溫進(jìn)行2小時(shí)，步驟b)在4℃進(jìn)行2小時(shí)，步驟c)、d)、e)、f)、g)、h)省去，修飾的糖醛酸占總糖醛酸的百分比是約30％(在下文中還稱為ST2185)。
-肝素N-乙?；?39％)，其可通過(guò)上述方法獲得，其中步驟a)在室溫進(jìn)行2小時(shí)，步驟b)在4℃進(jìn)行2小時(shí)，步驟c)、d)、e)、f)、g)、h)省去，修飾的糖醛酸占總糖醛酸的百分比是約30％(在下文中還稱為ST2186)。
-肝素N-乙?；?64％)，其可通過(guò)上述方法獲得，其中步驟a)在室溫進(jìn)行2小時(shí)，步驟b)在4℃進(jìn)行2小時(shí)，步驟c)、d)、e)、f)、g)、h)省去，修飾的糖醛酸占總糖醛酸的百分比是約30％(在下文中還稱為ST2187)。
化合物ST1514、ST1513、ST1516和ST1515的制備具體公開在WO 01/55221中。
分子量可通過(guò)HPLC-GPC(高效液相色譜-凝膠滲透層析)測(cè)定。脫硫酸化度是通過(guò)電導(dǎo)分析法測(cè)定的，并且修飾的糖醛酸的百分比是通過(guò)13C-NMR測(cè)定的。
MW是分子量，D是以MW/Mn表示的多分散指數(shù)。
依據(jù)本發(fā)明，原料是不同來(lái)源的糖胺聚糖，優(yōu)選天然肝素。還可能使用N，6二硫酸酯的百分比含量為0-100％的化學(xué)改性的肝素。使用具有不同6-O-硫酸化葡糖胺含量的產(chǎn)物作為原料，可調(diào)節(jié)一個(gè)打開的艾杜糖醛酸與另一個(gè)之間的規(guī)則序列的長(zhǎng)度。糖苷環(huán)被打開的本發(fā)明糖胺聚糖按慣例被本領(lǐng)域技術(shù)人員稱為RO衍生物，這是指該糖苷環(huán)已經(jīng)通過(guò)氧化作用，然后還原而被打開(還原-氧化-RO)。這種糖苷環(huán)的打開通常還稱為“二醇裂解”，之所以這樣稱謂是因?yàn)樾纬闪舜嬖谟陂_環(huán)上的兩個(gè)伯羥基。這樣的化合物還稱為“RO”或“二醇裂解”衍生物。
在另一個(gè)本發(fā)明實(shí)施方案中，通過(guò)上述開環(huán)反應(yīng)(“二醇裂解”)而形成的醛和伯羥基還可使自身發(fā)生隨后的官能化。因此，式(I)化合物還可以在衍生自二醇裂解的伯羥基上攜帶如上文關(guān)于X和X’所定義的相同或不同的基團(tuán)，例如從單糖或一個(gè)氨基酸到一個(gè)以上單元長(zhǎng)度優(yōu)選2或3個(gè)單元的低聚糖或肽基團(tuán)。
其中X和X’是-CH2OH的式(I)化合物還可用作其它類型藥物的載體，通過(guò)與肝素部分的適當(dāng)結(jié)合，所述肝素部分能在正常的配制藥物生產(chǎn)和貯存條件下提供穩(wěn)定的鍵，而在體內(nèi)，優(yōu)選在靶器官附近釋放出所運(yùn)送的藥物?？蛇\(yùn)送的藥物的實(shí)例是甾類和非甾類抗炎藥物、皮質(zhì)類固醇以及具有抗轉(zhuǎn)移作用的其它藥物，在這種情況下，作為本發(fā)明化合物與其所結(jié)合的抗轉(zhuǎn)移劑的單獨(dú)內(nèi)在活性的總和，抗轉(zhuǎn)移作用將被有利地增強(qiáng)，并且具有較高的靶目標(biāo)選擇性以及較低的系統(tǒng)毒性這樣的相關(guān)優(yōu)點(diǎn)。這些藥物的實(shí)例是金屬蛋白酶抑制劑。其它可有用運(yùn)送的藥物是在內(nèi)皮水平上起作用的藥物。其中X和X’不是羥基或醛的式(I)化合物也可用作藥物的載體，在這種情況下，X和X’基團(tuán)將起被運(yùn)送的分子，即本發(fā)明糖胺聚糖與起載體作用的分子之間的“間隔物”的作用，這些情況可能由于藥動(dòng)學(xué)或藥效學(xué)的原因而是期望的。
對(duì)于衍生自肝素的本發(fā)明化合物，它們是用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的技術(shù)，通過(guò)N-脫硫酸化，然后N-?；筛嗡卦现频玫摹＠?，N-脫硫酸化是這樣進(jìn)行的在DMSO∶H2O溶液95∶5 v∶v中于室溫溶劑分解0.5-8小時(shí)，然后在堿性條件下，用例如?；?即乙?；⒓乎；㈢牾；⑿挛祯；?N-酰化。
接下來(lái)的2-O-脫硫酸化是在堿性試劑例如氫氧化鈉存在下于室溫-100℃，優(yōu)選50-70℃，例如在60℃溫度下進(jìn)行足夠長(zhǎng)的時(shí)間以獲得所需2-O-脫硫酸化。2-O-脫硫酸化是通過(guò)作用于過(guò)程參數(shù)例如反應(yīng)物濃度、溫度和反應(yīng)時(shí)間來(lái)控制。一個(gè)優(yōu)選的實(shí)例是保持恒定的濃度底物(糖胺聚糖)濃度為80mg/ml，NaOH濃度為1M，60℃的恒定溫度，并將脫硫酸化的反應(yīng)時(shí)間控制在15-60分鐘。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)操作誤差以及個(gè)體的一般知識(shí)來(lái)改變條件，例如提高反應(yīng)溫度和縮短反應(yīng)時(shí)間。
用堿性試劑處理可生成特征為在脫硫酸化單元上存在環(huán)氧環(huán)的中間產(chǎn)物。令人十分驚訝的是，經(jīng)證實(shí)，這些中間體具有類似于式(I)化合物的類肝素酶抑制性質(zhì)。因此，本發(fā)明的另一個(gè)目的是部分2-O-脫硫酸化肝素，因此是具有減少的電荷的肝素，特別是2-O-脫硫酸化不超過(guò)60％的肝素的衍生物，其特征在于在脫硫酸化位點(diǎn)存在環(huán)氧環(huán)。特征是存在環(huán)氧環(huán)的所述化合物也屬于本發(fā)明范圍內(nèi)。
在形成環(huán)氧環(huán)之后，將所述環(huán)氧環(huán)打開，這同樣采用已知技術(shù)。所形成的環(huán)氧化物的百分比是通過(guò)在約55ppm的13C-NMR信號(hào)面積(是含有環(huán)氧化物的糖醛酸環(huán)的碳2和3的特征)與全體數(shù)目異頭碳信號(hào)面積(葡糖胺與糖醛酸殘基的C1)之間的比例計(jì)算的。如果在加熱條件下進(jìn)行開環(huán)，則獲得半乳糖醛酸殘基，而如果環(huán)氧環(huán)的開環(huán)是在冷條件下進(jìn)行，則獲得艾杜糖醛酸殘基。含有環(huán)氧環(huán)的化合物的優(yōu)選實(shí)例是可通過(guò)上述方法獲得的，并且環(huán)氧化糖醛酸含量分別為14％(下文中稱為ST1509)、24％(下文中稱為ST1525)和30％(下文中稱為ST1526)的那些。
然后依據(jù)上述方法將部分脫硫酸化肝素進(jìn)行“二醇裂解”(縮寫為RO)和Smith降解(縮寫為SD)。
或者，式(I)化合物也可不經(jīng)由環(huán)氧化物中間體來(lái)獲得，也就是說(shuō)，通過(guò)直接二醇裂解和隨后的Smith降解獲得。
上述方法還導(dǎo)致形成其中X和X’基團(tuán)都是-CH2OH的式(I)化合物。
對(duì)于不是-CH2OH的X和X’，本領(lǐng)域技術(shù)人員可采用用于將羥基轉(zhuǎn)化成其它如上所定義的基團(tuán)的方法(參見例如第14-15頁(yè)的反應(yīng)方案，化合物ST1828、ST1829、ST1917和ST1919)。例如，與氨基酸或肽的綴合可通過(guò)用還原胺化反應(yīng)處理得自二醇裂解反應(yīng)的中間體醛來(lái)進(jìn)行(Hoffmann J.等人，Carbohydrate Research，117，328-331(1983))，該反應(yīng)可在含水溶劑中進(jìn)行，并且不會(huì)妨礙肝素結(jié)構(gòu)的保持。
如果需要的話，并且也構(gòu)成本發(fā)明另一個(gè)目的的是，可用酸試劑在合適的pH條件下，例如在pH4將式(I)化合物進(jìn)一步降解，以生成保持抗血管生成性質(zhì)的低聚糖混合物。
同樣，本發(fā)明的目的是通過(guò)上述方法的步驟g)、h)、i)和j)當(dāng)中的一個(gè)步驟獲得的化合物。
本發(fā)明的目的是藥物組合物，其中含有至少一種式(I)化合物作為活性組分，所述式(I)化合物單獨(dú)或者與一種或多種式(I)化合物聯(lián)合，或者所述式(I)化合物與上述N-?；?脫硫酸化肝素例如環(huán)氧化中間體聯(lián)合；后者還可單獨(dú)用作為藥物組合物中的活性組分。本發(fā)明活性組分可以與制藥技術(shù)中常用的合適的載體和/或賦形劑，例如在“Remington′s Pharmaceutical Sciences Handbook”，最新版中描述的那些形成混合物。本發(fā)明組合物將含有治療有效量的活性組分。劑量由本領(lǐng)域技術(shù)人員例如臨床醫(yī)師或主治醫(yī)師根據(jù)欲治療的疾病類型和患者身體狀況決定，或者與其它活性組分的給藥相伴。例如，劑量范圍可以是0.1-100mg/kg。
藥物組合物的實(shí)例是可口服給藥或非胃腸道、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、透皮給藥或者呈鼻用或口腔用噴霧劑形式的那些。適用于這些目的的藥物組合物是片劑、硬或軟膠囊、粉劑、溶液、懸浮液、糖漿劑和用于臨時(shí)制備液體制劑的固體劑型。用于非胃腸道給藥的組合物是例如所有肌內(nèi)、靜脈內(nèi)和皮下注射劑型以及溶液、懸浮液和乳液。還可以提及的是脂質(zhì)體制劑。片劑還包括用于控制釋放活性組分的形式，它們可以是口服給藥形式，用適當(dāng)層包衣的片劑、微包囊粉劑、與環(huán)糊精的復(fù)合物，也可以是貯庫(kù)形式，例如皮下施用的貯庫(kù)形式，例如貯庫(kù)注射劑或植入劑。
本發(fā)明化合物具有抗類肝素酶和抗血管生成活性。這使得它們適于制備用于治療患有改變的血管生成或需要抑制類肝素酶活性的治療的個(gè)體，一般是哺乳動(dòng)物，特別是人個(gè)體的藥物。
可用本發(fā)明藥物治療的疾病的實(shí)例是原發(fā)性腫瘤、轉(zhuǎn)移瘤、糖尿病性視網(wǎng)膜病、牛皮癬、晶狀體后纖維組織形成、血管成形術(shù)后的再狹窄、冠狀動(dòng)脈旁路、炎癥、關(guān)節(jié)炎、自身免疫性疾病、同種移植物排斥、心血管疾病、纖維增殖性疾病、異常血小板聚集引起的疾病、平滑肌增殖引起的疾病、Goodpasture綜合征、急性腎小球腎炎、新生兒肺動(dòng)脈高血壓、哮喘、充血性心力衰竭、成人肺動(dòng)脈高血壓、腎血管性高血壓、增殖性視網(wǎng)膜病、實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎、多發(fā)性硬化、胰島素依賴型糖尿病、炎性腸病、潰瘍性結(jié)腸炎、局限性回腸炎。
有利的是，本發(fā)明化合物基本上沒有肝素的典型副作用。特別是，本發(fā)明化合物基本上沒有抗凝活性。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，基本上沒有這樣的活性，從臨床應(yīng)用的角度上來(lái)看，是指沒有或僅有可忽略的活性。
類肝素酶抑制活性是依據(jù)Vlodavsky′s小組建立的方法測(cè)定的(Bitan M.等人，1995)。該方法是基于評(píng)價(jià)由類肝素酶引起的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)的硫酸乙酰肝素鏈斷裂的程度。硫酸鹽標(biāo)記的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)是最常用的HSPG來(lái)源。在缺乏和存在遞增濃度的測(cè)試化合物的情況下，將硫酸鹽標(biāo)記的ECM與重組類肝素酶在pH6.2培養(yǎng)。為了評(píng)價(jià)蛋白聚糖降解的發(fā)生，收集培養(yǎng)基，施加到Sepharose6B柱(0.9×30cm)上來(lái)進(jìn)行凝膠過(guò)濾。用PBS以5ml/小時(shí)的流速洗脫級(jí)份(0.2ml)，并計(jì)數(shù)放射性。用藍(lán)色葡聚糖標(biāo)記排除體積(Vo)，用酚紅標(biāo)記總包括體積(Vt)。以0.5＜Kav＜0.8(峰II)將HS側(cè)鏈的降解片段從Sepharose 6B上洗脫下來(lái)。在所報(bào)道的實(shí)驗(yàn)條件下，良好的類肝素酶抑制劑以10μg/ml或更小的濃度抑制HS斷裂。
結(jié)果如下表1所示。
表1在25μ/ml-5μ/ml劑量下的類肝素酶抑制
值得注意的是，即使在1μg/ml的濃度下，ST1518也具有高抑制活性。
使用在WO 01/55221中描述的相同實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，測(cè)定本發(fā)明化合物，特別是新化合物對(duì)于FGF生長(zhǎng)因子的活性，結(jié)果表明它們表現(xiàn)出與在引用文獻(xiàn)中公開的化合物相當(dāng)?shù)幕钚浴?br> 下列實(shí)施例進(jìn)一步舉例說(shuō)明了本發(fā)明。
實(shí)施例1ST1518將過(guò)量吡啶加到1g肝素的水溶液中，其中所述肝素是預(yù)先從Amberlite IR 120柱上洗脫下來(lái)的。將該溶液減壓蒸發(fā)；把所得的肝素吡啶鹽溶解在50ml DMSO/H2O 95∶5混合物中，在20℃攪拌2小時(shí)以獲得約50％的脫硫酸化度。
然后用等體積的飽和碳酸氫鈉溶液稀釋該溶液。用在膜(截止分子量為1000-2000D)中的蒸餾水將該溶液透析。通過(guò)減壓蒸發(fā)分離出終產(chǎn)物。
通過(guò)將50％N-脫硫酸化肝素N-乙?；瘉?lái)制備N-乙酰化肝素。將1g肝素溶解在10ml蒸餾水中；將該溶液冷卻至4℃，用碳酸氫鈉飽和；向該溶液中加入625μl乙酸酐，將該混合物在4℃攪拌2小時(shí)。在反應(yīng)期間，通過(guò)加入碳酸氫鈉來(lái)控制pH并保持在約8。然后用在膜(截止分子量為2000-1000D)中的蒸餾水將所得溶液透析。
將1g該50％N-乙?；嗡厝芙庠?5ml蒸餾水中，并冷卻至4℃。加入25ml NaIO40.2M溶液后，將該溶液在黑暗條件下攪拌20小時(shí)，通過(guò)加入乙二醇來(lái)停止該反應(yīng)，并通過(guò)切向超濾除去鹽。向該脫鹽的溶液中分批加入400mg NaBH4。將該溶液在室溫?cái)嚢?小時(shí)，然后用稀鹽酸中和，通過(guò)切向超濾脫鹽。
該化合物的13C NMR光譜如附

圖1所示。
實(shí)施例2ST2010和ST2184將5g肝素溶解在63ml NaOH 1N溶液中。將該溶液在60℃攪拌45分鐘，冷卻，并用稀鹽酸中和。然后將該溶液在70℃攪拌48小時(shí)，冷卻，用在膜(截止分子量為2000-1000D)中的水透析。
將2g2-O-脫硫酸化肝素溶解在50ml蒸餾水中，冷卻至4℃。加入50ml NaIO40.2M溶液后，將該溶液在黑暗條件下攪拌20小時(shí)，通過(guò)加入乙二醇來(lái)停止該反應(yīng)，通過(guò)切向超濾除去鹽。向該脫鹽的溶液中分批加入800mg NaBH4。將該溶液在室溫?cái)嚢?小時(shí)，然后用稀鹽酸中和，通過(guò)切向超濾脫鹽。
將400mg氧化-還原的肝素溶解在25ml蒸餾水中。加入7mgNaNO2后，用稀鹽酸將pH調(diào)節(jié)至2，將該溶液在4℃攪拌17分鐘。通過(guò)中和停止該反應(yīng)。向該脫鹽的溶液中分批加入60mg NaBH4。將該溶液在室溫?cái)嚢?小時(shí)，然后用稀鹽酸中和，通過(guò)凝膠過(guò)濾來(lái)分級(jí)分離。分離出具有不同分子量的兩個(gè)級(jí)份ST2010，具有Mw＝3050；和ST2184，具有Mn＝5800，Mw＝7520。
化合物ST2010的13C NMR光譜如附圖2所示。
實(shí)施例3ST2041將過(guò)量吡啶加到2g肝素的水溶液中，其中所述肝素是預(yù)先從Amberlite IR 120柱上洗脫下來(lái)的。將該溶液減壓蒸發(fā)；把所得的肝素吡啶鹽溶解在100ml DMSO/H2O 95∶5混合物中，在20℃攪拌4小時(shí)，以獲得約64％的脫硫酸化度。
然后用等體積的飽和碳酸氫鈉溶液稀釋該溶液。用在膜(截止分子量為1000-2000D)中的蒸餾水將該溶液透析。通過(guò)減壓蒸發(fā)分離出終產(chǎn)物。
化合物ST2041的13C NMR光譜如附圖3所示。
權(quán)利要求
1.糖胺聚糖衍生物，特別是脫硫酸化度不超過(guò)總糖醛酸單元的60％的脫硫酸化肝素在制備具有類肝素酶抑制活性和/或FGF生長(zhǎng)因子抑制活性的藥物中的應(yīng)用。
2.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述衍生物是肝素樣糖胺聚糖。
3.權(quán)利要求1或2的應(yīng)用，其中所述衍生物是包含具有不同N-脫硫酸化度以及任選隨后完全或部分N-酰化的葡糖胺殘基的改性肝素。
4.權(quán)利要求1或3的應(yīng)用，其中所述衍生物具有下式(I) 其中U環(huán)可具有下列含義 X和X’可相同或不同，是醛基或-CH2-D基團(tuán)，其中D是羥基或氨基酸、肽或者糖或低聚糖的殘基；R和R1可相同或不同，是SO3，C1-C8?；鶜埢?，所述殘基可任選攜帶至少一個(gè)另外的羧基；n和m可相同或不同，可以是1-40；n+m的和為6-40；m∶n比例為10∶2-1∶1；符號(hào) 是指用m和n表示的單元是沿著多糖鏈統(tǒng)計(jì)學(xué)分布，并且無(wú)需按順序分布。
5.權(quán)利要求4的衍生物的應(yīng)用，其中R或R1是N-?；?，并且為R+R1之和的40-60％。
6.權(quán)利要求4或5的應(yīng)用，其中可相同或不同的R和R1是乙?；?br> 7.權(quán)利要求4-6任一項(xiàng)的衍生物的應(yīng)用，其中m大于或等于n。
8.權(quán)利要求5或6的衍生物的應(yīng)用，其中n為m+n之和的40-60％。
9.權(quán)利要求4的應(yīng)用，其中所述衍生物選自-部分2-O-脫硫酸化的肝素，其分子量(MW)為11200，多分散指數(shù)D為1.3，脫硫酸化度為1.99(以SO3-∶COO-摩爾比表示)，修飾的糖醛酸占總糖醛酸的百分比是約50％，m∶n＝1∶1，并且以m和n表示的單元是以規(guī)則、交替的方式沿著多糖鏈分布；-部分2-O-脫硫酸化的LMW肝素，其分子量(MW)為3050，多分散指數(shù)為2.2，脫硫酸化度為1.99(以SO3-∶COO-摩爾比表示)，修飾的糖醛酸占總糖醛酸的百分比是約50％。m∶n＝1∶1，并且以m和n表示的單元是以規(guī)則、交替的方式沿著多糖鏈分布；-部分2-O-脫硫酸化的LMW肝素，其分子量為Mn＝5800，Mw＝7520，多分散指數(shù)為1.294，修飾的糖醛酸占總糖醛酸的百分比是約50％，m∶n＝1∶1，并且以m和n表示的單元是以規(guī)則、交替的方式沿著多糖鏈分布；-部分2-O-脫硫酸化肝素，其分子量(MW)為12900D，多分散指數(shù)D為1.5，脫硫酸化度為1.9(以SO3-∶COO-摩爾比表示)，修飾的糖醛酸占總糖醛酸的百分比為5％環(huán)氧基，29％氧化和還原的糖醛酸殘基，m∶n＝1∶1，并且以m和n表示的單元是以規(guī)則、交替的方式沿著多糖鏈分布；-部分2-O-脫硫酸化肝素，其分子量(MW)為9200D，多分散指數(shù)D為1.5，修飾的糖醛酸占總糖醛酸的百分比為11％環(huán)氧基，27.5％氧化和還原的糖醛酸殘基，m∶n＝1∶1，并且以m和n表示的單元是以規(guī)則、交替的方式沿著多糖鏈分布；-2-O-脫硫酸化肝素，其分子量(MW)為11000D，多分散指數(shù)D為1.5，脫硫酸化度為1.93(以SO3-∶COO-摩爾比表示)，修飾的糖醛酸占總糖醛酸的百分比為5％環(huán)氧基，29％氧化和還原的糖醛酸殘基。
10.權(quán)利要求4的應(yīng)用，其中所述衍生物選自-部分N-脫硫酸化和N-重乙酰化肝素，其分子量(MW)為11250，多分散指數(shù)為1.66，脫硫酸化度為1.7(以SO3-COO-摩爾比表示)，修飾的糖醛酸占總糖醛酸的百分比是約30％，R+R1之和的50％是N-乙?；?；-部分N-脫硫酸化和N-重乙酰化LMW肝素，其分子量為Mn＝4780，Mw＝10000，多分散指數(shù)D為2.092，修飾的糖醛酸占總糖醛酸的百分比是約30％，R+R1之和的50％是N-乙?；?；-部分N-脫硫酸化和N-重乙?；嗡兀浞肿恿繛镸n＝10890，Mw＝22370，多分散指數(shù)為2.054，R+R1之和的27％是N-乙?；?；-部分N-脫硫酸化和N-重乙?；嗡?，其分子量為Mn＝10210，Mw＝21270，多分散指數(shù)為2.083，R+R1之和的39％是N-乙?；?部分N-脫硫酸化和N-重乙?；嗡兀浞肿恿繛镸n＝11070，Mw＝22000，多分散指數(shù)為1.987，R+R1之和的64％是N-乙?；?；-部分N-脫硫酸化和N-重乙?；嗡?，其中修飾的糖醛酸占總糖醛酸的百分比是約30％，R+R1之和的27％是N-乙?；?部分N-脫硫酸化和N-重乙?；嗡?，其中修飾的糖醛酸占總糖醛酸的百分比是約30％，R+R1之和的39％是N-乙?；?；-部分N-脫硫酸化和N-重乙酰化肝素，其中修飾的糖醛酸占總糖醛酸的百分比是約30％，R+R1之和的64％是N-乙?；?。
11.權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述藥物具有抗血管生成活性。
12.權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述藥物可用于治療炎癥。
13.權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述藥物可用于治療自身免疫性疾病。
14.權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述欲治療的疾病選自原發(fā)性腫瘤、轉(zhuǎn)移瘤、糖尿病性視網(wǎng)膜病、牛皮癬、晶狀體后纖維組織形成、血管成形術(shù)后的再狹窄、冠狀動(dòng)脈旁路、炎癥、關(guān)節(jié)炎、自身免疫性疾病、同種移植物排斥、心血管疾病、纖維增殖性疾病、異常血小板聚集引起的疾病、平滑肌增殖引起的疾病、Goodpasture綜合征、急性腎小球腎炎、新生兒肺動(dòng)脈高血壓、哮喘、充血性心力衰竭、成人肺動(dòng)脈高血壓、腎血管性高血壓、增殖性視網(wǎng)膜病、多發(fā)性硬化、實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎、胰島素依賴型糖尿病、炎性腸病、潰瘍性結(jié)腸炎、局限性回腸炎。
15.式(I)化合物 其中U環(huán)可具有下列含義 X和X’可相同或不同，是醛基或-CH2-D基團(tuán)，其中D是羥基或氨基酸、肽或者糖或低聚糖的殘基；R和R1可相同或不同，是SO3，C1或C3-C8?；鶜埢籲和m可相同或不同，可以是1-40；n+m的和為6-40；m∶n比例為10∶2-1∶1；符號(hào) 是指用m和n表示的單元是沿著多糖鏈統(tǒng)計(jì)學(xué)分布，并且無(wú)需按順序分布。
16.權(quán)利要求15的化合物，其中所述化合物選自-部分N-脫硫酸化和N-重乙?；嗡兀浞肿恿?MW)為11250，多分散指數(shù)為1.66，脫硫酸化度為1.7(以SO3-∶COO-摩爾比表示)，修飾的糖醛酸占總糖醛酸的百分比是約30％，R+R1之和的50％是N-乙酰基；-部分N-脫硫酸化和N-重乙?；疞MW肝素，其分子量為Mn＝4780，Mw＝10000，多分散指數(shù)為2.092，修飾的糖醛酸占總糖醛酸的百分比是約30％，R+R1之和的50％是N-乙酰基；-部分N-脫硫酸化和N-重乙?；嗡?，其分子量為Mn＝10890，Mw＝22370，多分散指數(shù)為2.054，R+R1之和的27％是N-乙?；?部分N-脫硫酸化和N-重乙?；嗡?，其分子量為Mn＝10210，Mw＝21270，多分散指數(shù)為2.083，R+R1之和的39％是N-乙?；?部分N-脫硫酸化和N-重乙酰化肝素，其分子量為Mn＝11070，Mw＝22000，多分散指數(shù)為1.987，R+R1之和的64％是N-乙?；?部分N-脫硫酸化和N-重乙?；嗡?，其中修飾的糖醛酸占總糖醛酸的百分比是約30％，R+R1之和的27％是N-乙?；?br> 17.制備權(quán)利要求15或16的化合物的方法，所述方法包括下列步驟a)通過(guò)下述操作進(jìn)行N-脫硫酸化將磺氨基殘基在DMSO∶H2O95∶5 V∶V中于室溫下溶劑分解水解0.5-8小時(shí)，以完全或部分除去在葡糖胺殘基2-位的硫酸根基團(tuán)；b)通過(guò)下述操作將所述在葡糖胺殘基2-位完全或部分脫硫酸化的基團(tuán)N-?；趬A性水溶液(pH 8-9)中用?；瘎┨幚?，以生成在葡糖胺殘基2-位完全或部分?；幕鶊F(tuán)；然后將所得化合物進(jìn)行下述步驟c)、d)或e)與f-g)處理，或直接進(jìn)行下述步驟f)處理；c)在室溫至約100℃溫度下進(jìn)行堿處理，導(dǎo)致在艾杜糖醛酸2-位的控制百分比的硫酸根基團(tuán)被除去，和形成環(huán)氧基團(tuán)；和如果需要的話d)在約pH 7，于約50℃-約100℃溫度下打開所述環(huán)氧環(huán)，以產(chǎn)生半乳糖醛酸殘基；或者e)在約0℃-30℃溫度下打開所述環(huán)氧環(huán)，以產(chǎn)生艾杜糖醛酸殘基；和如果需要的話f)用高碘酸鈉將二醇氧化，以打開糖苷環(huán)和形成2個(gè)醛基/個(gè)修飾的殘基；g)將所述醛基還原成伯醇，和如果需要的話，將D基團(tuán)轉(zhuǎn)化成如在式(I)中給出的不同含義所表示的非羥基基團(tuán)；h)任選對(duì)在步驟g)中獲得的化合物進(jìn)行酸水解，以獲得與規(guī)則序列相對(duì)應(yīng)的低聚糖；或者i)用選自裂解酶、肝素酶、類肝素酶的酶或同等物對(duì)在步驟g)中獲得的產(chǎn)物進(jìn)行部分酶促水解，以獲得低聚糖，優(yōu)選四糖或八糖，其具有由不飽和艾杜糖醛酸組成的非還原末端殘基，由N-硫酸葡糖胺組成的還原殘基，并含有至少一個(gè)開環(huán)的艾杜糖醛酸殘基；j)任選通過(guò)部分酶促水解來(lái)處理在步驟c)中獲得的化合物或在步驟d)中獲得的產(chǎn)物；和如果需要的話k)將在步驟b)、c)和f)之一中獲得的產(chǎn)物部分6-O-脫硫酸化；或者l)將部分或完全6-脫硫酸化的起始肝素進(jìn)行步驟b)、c)和f)。
18.可通過(guò)權(quán)利要求17的方法獲得的化合物。
19.可通過(guò)權(quán)利要求17的方法獲得的化合物，其中所述化合物選自-肝素N-乙?；?50％)，其中步驟a)在室溫進(jìn)行2小時(shí)，步驟b)在4℃進(jìn)行2小時(shí)，步驟c)、d)、e)省去，步驟f)在4℃進(jìn)行一夜，步驟g)在室溫進(jìn)行3小時(shí)，其分子量(MW)為11200，多分散指數(shù)D為1.3，脫硫酸化度為1.6(以SO3-∶COO-摩爾比表示)，修飾的糖醛酸占總糖醛酸的百分比是約50％；-LMW肝素N-乙?；?50％)，其中步驟a)在室溫進(jìn)行2小時(shí)，步驟b)在4℃進(jìn)行2小時(shí)，步驟c)、d)、e)省去，步驟f)在4℃進(jìn)行一夜，步驟g)在室溫進(jìn)行3小時(shí)，步驟h)通過(guò)用亞硝酸脫氨基于4℃進(jìn)行17分鐘，然后用硼氫化物于室溫將醛基還原3小時(shí)，其分子量為Mw＝4780，Mn＝10000，多分散指數(shù)D為2.092，修飾的糖醛酸占總糖醛酸的百分比是約30％；-肝素N-乙?；?27％)，其中步驟a)在室溫進(jìn)行2小時(shí)，步驟b)在4℃進(jìn)行2小時(shí)，步驟c)、d)、e)、f)、g)、h)省去，其分子量為Mn＝10890，Mw＝22370，多分散指數(shù)D為2.054；-肝素N-乙?；?39％)，其中步驟a)在室溫進(jìn)行2小時(shí)，步驟b)在4℃進(jìn)行2小時(shí)，步驟c)、d)、e)、f)、g)、h)省去，其分子量為Mn＝10210，Mw＝21270，多分散指數(shù)D為2.083；-肝素N-乙?；?64％)，其中步驟a)在室溫進(jìn)行2小時(shí)，步驟b)在4℃進(jìn)行2小時(shí)，步驟c)、d)、e)、f)、g)、h)省去，其分子量為Mn＝11070，Mw＝22000，多分散指數(shù)D為1.987；-肝素N-乙?；?27％)，其中步驟a)在室溫進(jìn)行2小時(shí)，步驟b)在4℃進(jìn)行2小時(shí)，步驟c)、d)、e)、f)、g)、h)省去，修飾的糖醛酸占總糖醛酸的百分比是約30％；-肝素N-乙?；?39％)，其中步驟a)在室溫進(jìn)行2小時(shí)，步驟b)在4℃進(jìn)行2小時(shí)，步驟c)、d)、e)、f)、g)、h)省去，修飾的糖醛酸占總糖醛酸的百分比是約30％；-肝素N-乙酰基(64％)，可通過(guò)上述方法獲得，其中步驟a)在室溫進(jìn)行2小時(shí)，步驟b)在4℃進(jìn)行2小時(shí)，步驟c)、d)、e)、f)、g)、h)省去，修飾的糖醛酸占總糖醛酸的百分比是約30％。
20.藥物組合物，其中包含至少一種權(quán)利要求15或16和/或19的化合物作為活性組分以及與其混合的可藥用載體和賦形劑。
21.權(quán)利要求15-16和19的化合物作為藥物的應(yīng)用。
22.權(quán)利要求15-16和19的化合物作為藥物載體的應(yīng)用。
23.權(quán)利要求22的應(yīng)用，其中所述藥物選自甾體和非甾體抗炎藥物、皮質(zhì)類固醇、具有抗轉(zhuǎn)移作用的藥物、在內(nèi)皮水平上作用的藥物。
24.權(quán)利要求23的應(yīng)用，其中所述抗轉(zhuǎn)移藥物是金屬蛋白酶抑制劑。
全文摘要
本申請(qǐng)描述了部分脫硫酸化糖胺聚糖衍生物，特別是肝素，更特別是式(I)化合物，其中U、R和R
文檔編號(hào)A61K45/00GK1547477SQ01823632
公開日2004年11月17日 申請(qǐng)日期2001年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月12日
發(fā)明者B·卡蘇, G·托里, A·納吉, G·吉安尼尼, C·皮薩諾, S·潘科, B 卡蘇, 材崮 申請(qǐng)人:希格馬托制藥工業(yè)公司