專利名稱：含有解離素基因的抗癌藥物和治療方法
發(fā)明
背景技術：
領域本發(fā)明涉及表現(xiàn)出抑制癌轉移，癌組織的血管發(fā)生及生長的活性的抗癌藥物，以及利用所述藥物治療癌癥的方法。更具體的，本發(fā)明涉及用于抑制癌細胞生長的脂質體復合物，以及通過將復合物導入生物體預防或治療癌癥的方法，其中所述脂質體復合物包括saxatilin的基因，所述saxatilin是一種來自于韓國產的黑眉蝮蛇(Agkistrodonsaxatilis)的新的解離素(disintegrin)。
現(xiàn)有技術的描述癌癥是一種由非常復雜并且多種因素引起的疾病，是現(xiàn)代人類死亡的一個主要因素。正常細胞通過多種因素轉化為癌細胞，并且癌細胞(來自不同的正常細胞)的無限生長發(fā)展形成癌組織。特定大小的癌組織誘導血管發(fā)生給組織提供必須的營養(yǎng)，并且組織通過由血管發(fā)生形成的血管進行轉移，而且附著到身體的特定器官和生長。尤其是，已知癌組織通過第一個部位存在的癌細胞分泌一類能夠抑制癌在另一個部位生長的因子。尺寸不小于3mm的癌的最初階段可通過臨床診斷很容易的觀察到，并且在這個階段可通過外科手術除去。即使癌可通過外科手術去除，但是萬一如果外科手術未除去的癌細胞是在轉移期間的話，手術反而具有促進癌轉移的危險。因此，除一些特殊病例以外，大多數(shù)進行癌癥手術的病人應該用抗癌劑或者放射性治療進行治療，目的在于阻止可能在手術后發(fā)生的轉移引起的第二次癌癥。
雖然已經(jīng)發(fā)展了非常有效的抗癌藥物并且至今已經(jīng)被臨床應用，但是大多數(shù)抗癌藥物是細胞生長的抑制劑，不能從正常細胞區(qū)分癌細胞。目前還沒有開發(fā)出或者應用可阻止癌轉移和抑制癌生長的抗癌藥物。
血管發(fā)生是指從現(xiàn)有的血管形成新血管的一系列過程，是提供營養(yǎng)和氧氣的正常和重要的過程。血管發(fā)生可以在損傷，婦女月經(jīng)，增殖性視網(wǎng)膜病，風濕性關節(jié)炎，局部缺血性心血管疾病，癌癥等的恢復過程中觀察到。因為血管發(fā)生非常特異性地出現(xiàn)在癌細胞生長和轉移過程中，所以公知的作為治療癌組織的主要目標。含有膠原蛋白，糖蛋白和異質胞外基質(ECM)的毛細血管通過從癌細胞分泌的促血管形成的因子，諸如bFGF的作用形成，并且內皮細胞通過整聯(lián)蛋白的作用遷移到毛細血管與毛細血管結合。在血管發(fā)生的過程中，細胞融合物質，已知為αvβ3和αvβ5的整聯(lián)蛋白是非常重要的。據(jù)報道，如果用具有Arg-Gly-Asp(RGD)的氨基酸序列、選擇性拮抗整聯(lián)蛋白的解離素蛋白進行處理，那么可以抑制血管發(fā)生。
Saxatilin是從韓國產的蛇血清中發(fā)現(xiàn)的一種解離素，具有抑制血管發(fā)生的作用。據(jù)報道，最近從E.coli表達的重組saxalitin抑制由αvβ3整聯(lián)蛋白介導的癌細胞的血管發(fā)生，但是不影響對在尿囊絨膜(CAM)中正常胚胎發(fā)生必須的血管的生理形成過程。此外，據(jù)證明，日復一日接種saxatilin蛋白后抑制腫瘤細胞的生長以及血管的生成。但是，這種方法的缺點在于為了保持抗癌效果有每天注射的麻煩，很難保持恒定的濃度。為了克服這些缺點，已經(jīng)實行同時使用多種抗癌治療。但是，本發(fā)明最新證明了通過使用最近倍受關注的基因治療可以很容易的獲得長期的抗癌效果的事實，從而開發(fā)了本發(fā)明。
發(fā)明概述本發(fā)明進行了深入的研究以開發(fā)保持saxatilin長效抗癌的方法，結果我們發(fā)現(xiàn)，如果通過將陽離子脂質體和saxatilin基因混合制備的脂質體復合物(lipoplex)被用于處理癌組織進行基因治療，癌細胞的生長可被長期抑制。
本發(fā)明的主要目的就是提供抑制癌細胞生長的物質。
本發(fā)明的另一個目的就是提供通過利用上述物質抑制癌細胞生長的方法。
為了達到上述目的，本發(fā)明提供了抑制癌細胞生長的脂質體復合物(lipoplex)，包括陽離子脂質體和含有序列1的saxatilin基因的表達載體。
本發(fā)明的陽離子脂質體優(yōu)選為一種選自下列的脂質體含有DMDK(賴氨酸-天冬氨酸-十四烷醇)和膽固醇的脂質體，含有DMEK(賴氨酸-戊二醛酯-十四烷醇)和膽固醇的脂質體，含有DOTMA(N-[1-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N，N-氯化三乙銨)和膽固醇的脂質體，含有DC-Chol(3β-[N-(N’N’二甲基氨基乙烷)氨基甲?；鵠膽固醇)和DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)的脂質體，和含有DOTAP(1，2-二油酰氧丙基-3-N，N，N-氯化三甲銨)和膽固醇的脂質體。本發(fā)明的saxatilin基因不僅包括序列1的堿基序列還包括其突變體和其活性片段。
作為本發(fā)明的表達載體，可以使用任一的常規(guī)表達載體。尤其是，真核表達載體優(yōu)選為pAAV-CMV和pFLAG-CMV-1。
此外，本發(fā)明提供了通過利用saxatilin基因抑制癌細胞生長的方法，包括下列步驟將膽固醇與DOTAP混合，將混合物懸浮在水性介質中制備陽離子脂質體以及通過將序列1的saxatilin基因導入真核表達載體制備表達saxatilin的表達載體；將陽離子脂質體和上述表達載體混合在水性介質中并均質以制備脂質體復合物；以及將脂質體復合物導入癌組織。
附圖簡述本發(fā)明將參考附圖以詳細描述的示范性實施方案的方式進行解釋，所述附圖是以說明的方式給出的，因此并非限制本發(fā)明

圖1顯示了表達載體pAAV-CMV(a)和pFLAG-CMV-1(b)的基因結構。
圖2顯示了通過將saxatilin基因插入圖1的表達載體制備saxatilin表達載體(pAAV-CMV-saxatilin和pFLAG-CMV-1 saxatilin)。
圖3的照片顯示了在293細胞中體外表達saxatilin。質粒通過基于DOTAP的陽離子脂質體導入細胞。泳道1顯示分子量的標記，泳道2顯示未導入的介質作為陰性對照，而泳道3顯示pFLAG-CMV1-saxatilin。
圖4的照片顯示saxatilin基因抑制癌細胞生長的效果。在圖中，A代表用B16BL6小鼠肺癌細胞，和PBS處理的對照組，而B代表用pAAV-CMV-saxatilin(25μg/小鼠)處理的實驗組。
圖5的照片顯示saxatilin基因對癌轉移的抑制效果。在圖中，A代表注射PBS的對照組，而B代表在注射B16BL6細胞給小鼠后用pAAV-CMV-saxatilin處理的實驗組。
圖6顯示表達在298細胞中的saxatilin抑制BCE細胞的生長。在圖中，BCE細胞用表達在293細胞中的saxatilin處理，所述293細胞用pAAV-CMV-saxatilin在1ng/ml的bFGF存在下轉染72小時并且根據(jù)saxatilin的濃度對增生的抑制加以分析。
優(yōu)選實施方案的詳細描述現(xiàn)在，將更詳細的逐步描述根據(jù)本發(fā)明通過利用saxatilin基因抑制癌細胞生長的過程。
步驟1陽離子脂質體的制備膽固醇與DOTAP(1，2-二油酰氧丙基-2-N，N，N-氯化三乙銨)混合，混合物懸浮在水性介質中制備陽離子脂質體。作為水性介質，優(yōu)選使用獲得的脂質體可在其中穩(wěn)定化的介質，諸如PBS，葡萄糖水溶液等。
步驟2表達載體的制備表達saxatilin的表達載體通過將saxatilin基因的cDNA導入真核表達載體進行制備。真核表達載體優(yōu)選自pAAV-CMV和pFLAG-CMV-1。
步驟3脂質體復合物的制備陽離子脂質體和表達載體在水性介質中混合并均質以制備脂質體復合物。作為水性介質，優(yōu)選使用獲得的脂質體可在其中穩(wěn)定化的介質，諸如PBS，葡萄糖水溶液等。脂質體和表達載體的混合比例為從2∶1到20∶1(w/w)。
步驟4脂質體復合物的注射將脂質體復合物注射到癌組織。
因為根據(jù)上述方法處理的saxatilin基因長期有效的抑制癌組織的生長和轉移并且對正常組織沒有損傷作用，因此可被廣泛用于有效地預防和治療癌癥。
現(xiàn)在，本發(fā)明將參考下列實施例以詳細描述的示范性實施方案的方式進行解釋，所述實施例僅僅是以說明的方式給出，并顯而易見對本領域技術人員來說，考慮到本發(fā)明的宗旨，本發(fā)明的范圍不被這些實施例1重組蛋白的表達和濃度DOTAP和膽固醇以1∶1(v/v)比例混合。混合物均質并懸浮在生理鹽水中以制備具有片層結構的陽離子脂質體。
Saxatilin基因的cDNA被導入圖1的表達載體pAAV-CMV和pFLAG-CMV-1(Sigma Chem.Co.，U.S.A)分別制備saxatilin表達載體pAAV-CMV-saxatilin和pFLAG-CMV-1 saxatilin。Saxatilin基因的cDNA通過聚合酶鏈式反應(PCR)合成。使用CCCAAGCTTGCCACCATGGAGGCCGGAGAAGAATGT作為5-末端引物，而使用CGCGGATCCTTAGGCATGGAAGGGATT作為3-末端引物。通過聚合酶鏈式反應合成的DNA片段用限制酶，HindIII和BamHI進行酶切并且連接到pAAV-CMV載體和在N-末端編碼FLAG(DYKDDDDK)表位的pFLAG-CMV-1載體上(圖.2)。這樣制備的每個表達載體導入E.coli DH5α制備轉化子，然后進行培養(yǎng)。由此獲得的每種表達載體與上述陽離子脂質體以1∶10(w/w)的比例混合。混合物懸浮在5％(w/v)的葡萄糖水溶液中，并且將懸浮液均質制備脂質體復合物。將脂質體復合物添加到穩(wěn)定化介質[DMEM(Dulbecos修飾的eagle氏介質)，10mM丙酮酸鈉，500U/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素]中，然后在室溫下穩(wěn)定混合物30分鐘。
真核293細胞(美國典型培養(yǎng)物保藏中心，ATCC)在CO2(5％v/v)條件下培養(yǎng)在含10％(v/v)的穩(wěn)定化培養(yǎng)基中，并且注射含有pFLAG-CMV-1 saxatilin作為表達載體的上述穩(wěn)定化的脂質體復合物。用穩(wěn)定化培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基后，細胞在相同的條件下培養(yǎng)10天。培養(yǎng)后，通過使用抗-FLAG M2抗體將293細胞裂解物進行western印跡，從而證實saxatilin得以正常表達且在真核細胞中表達載體正常表達saxatilin(圖3)。
實施例2saxatilin基因抑制癌細胞的生長向50μl含有250μg陽離子脂質體的PBS中添加根據(jù)實施例1制備的25μg的pAAV-CMV-saxatilin以制備脂質體復合物lipoACS。
在喂養(yǎng)了7周的C57BK16小鼠的脊柱中間皮下注射B16BL6細胞(5×105)，小鼠肺癌細胞。動物喂養(yǎng)到癌組織的大小為50到100mm3，并分成3組。向對照組每4天靜脈內注射PBS，同時向實驗組靜脈內注射lipoACS(25μg/動物)，然后隨著時間的推移測定腫瘤的大小。如圖4所示，腫瘤體積的增長率在表達的saxatilin實驗組中顯著降低。
實施例3saxatilin抑制癌轉移的效果根據(jù)實施例2相同的方法制備脂質體復合物lipoACS。準備PBS皮下注射到喂養(yǎng)了7周的C57BK16小鼠的對照組，以及注射了lipoACS(25μg/動物)的實驗組。向每組小鼠的尾靜脈，每5天注射B16BL6細胞(4×104)[小鼠肺癌細胞]，喂養(yǎng)小鼠25天直到對照組的小鼠死亡。然后計算肺腫瘤的克隆數(shù)(參見表1和圖5)。從表1和圖5可以看出，實驗組與對照組相比表現(xiàn)出85-93％的轉移抑制效果。利用抗-saxatilin抗體對從每個實驗組獲得的蛋白進行蛋白質印跡。結果，在對照組中沒有檢測到saxatilin，而在實驗組中檢測到了saxatilin。因此，實驗組抗癌轉移的抑制效果是包含在脂質體復合物中的saxatilin基因引起的效果。
saxatilin基因對癌轉移的抑制效果

實施例4表達在293細胞中的saxatilin對牛毛細血管內皮(BCE)細胞生長的抑制效果培養(yǎng)在含有10％FBS的DMEM培養(yǎng)基中的BCE細胞轉化到搖瓶中使得細胞數(shù)為4×104/ml，并在37℃在5％(v/v)CO2的條件下培養(yǎng)在不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基中12小時。然后，用通過在293細胞中的pAAV-CMV-saxatilin表達載體表達的saxatilin進行處理。20分鐘后，加入1ng/ml的bFGF，并且將混合物在37℃在5％(v/v)CO2的條件下培養(yǎng)在含5％FBS的DMEM培養(yǎng)基中72小時。比較存活的細胞數(shù)，測定生長抑制率。如圖6所示，BCE細胞的生長的抑制與加入的saxatilin的量成正比。在saxatilin為2μg/ml時，出現(xiàn)90％或者更強的抑制效果。
如上所述，本發(fā)明提供了通過使用saxatilin基因抑制癌細胞生長的方法，包括下列步驟將膽固醇與DOTAP混合，將混合物懸浮在水性介質中制備陽離子脂質體以及通過將saxatilin基因導入真核表達載體中制備用于表達saxatilin的表達載體；將陽離子脂質體和上述表達載體混合在水性介質中并均質以制備脂質體復合物；以及將脂質體復合物導入癌組織。
根據(jù)本發(fā)明，通過利用saxatilin基因可以進行長期穩(wěn)定的抗癌治療。
序列表<110>鄭光會(CHUNG，KWANG-HOE)<120>含有解離素基因的抗癌藥物和治療方法(Anti-cancer agents comprising disintegrin genes and the treating methods)<130>SCT040639-47<160>3<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>222<212>DNA<213>黑眉腹蛇(Agkistrodon saxatilis)<400>1gaggccggag aagaatgtga ctgtggcgct cctgcaaatc cgtgctgcga tgctgcaacc60tgtaaactga gaccaggggc gcagtgtgca gaaggactgt gttgtgacca gtgcagattt120atgaaagaag gaacaatatg ccggatggca aggggtgatg acatggatga ttactgcaat180ggcatatctg ctggctgtcc cagaaatccc ttccatgcct aa 222<210>2<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR擴增saxatilin基因的5’引物<400>2
cccaagcttg ccaccatgga ggccggagaa gaatgt 36<210>3<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223)PCR擴增saxatilin基因的3’引物<400>3cgcggatcct taggcatgga agggatt2權利要求
1.一種抑制癌生長的脂質體復合物，包括(a)陽離子脂質體和(b)含有序列1的saxatilin基因的表達載體。
2.根據(jù)權利要求1的脂質體復合物，其中所述陽離子脂質體為一種選自含有DMDK和膽固醇的脂質體，含有DMEK和膽固醇的脂質體，含有DOTMA和膽固醇的脂質體，含有DC-Chol和DOPE的脂質體，和含有DOTAP和膽固醇的脂質體。
3.根據(jù)權利要求1的脂質體復合物，其中表達載體為pAAV-CMA或者pFLAG-CMV-1。
4.一種通過利用saxatilin基因抑制癌生長的方法，包括下列步驟(a)將膽固醇與DOTAP混合，使混合物懸浮在水性介質中制備陽離子脂質體以及把序列1的saxatilin基因導入真核表達載體；(b)將陽離子脂質體和上述表達載體混合在水性介質中并且均質以制備脂質體復合物；以及(c)將脂質體復合物導入癌組織。
5.根據(jù)權利要求4所述的通過利用saxatilin基因抑制癌生長的方法，其中水性介質為磷酸鹽緩沖液或者葡萄糖水溶液。
6.根據(jù)權利要求4所述的通過利用saxatilin基因抑制癌生長的方法，其中真核表達載體為pAAV-CMA或者pFLAG-CMV-1。
7.根據(jù)權利要求4所述的通過利用saxatilin基因抑制癌生長的方法，其中脂質體和表達載體的混合比例為2∶1-20∶1(w/w)。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含來自黑眉蝮蛇的一種新的解離素基因的脂質體復合物，以及通過將復合物轉移給生物體治療和預防腫瘤的方法。
文檔編號A61K48/00GK1545424SQ01823583
公開日2004年11月10日 申請日期2001年8月29日 優(yōu)先權日2001年8月29日
發(fā)明者樸容奭, 金秀仁, 洪性洧, 孫英德, 張桹洙, 許鎮(zhèn)奎, 金斗植, 樸容 申請人:鄭光會