專利名稱：局部抗凝及細胞捕獲的脫細胞骨基質復合材料及制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種骨缺損、骨不連修復需要的植入材料及構建組織工程骨的支架材 料，特別涉及一種局部抗凝及細胞捕獲的脫細胞骨基質復合材料及制備方法。
背景技術：
臨床上，因各種原因所致骨缺損十分常見，其修復一直以來是骨科難題，理想的骨 缺損修復方法不斷地探索中。組織工程骨這種再生修復方式給骨缺損修復帶來新的希望， 經過20年的發(fā)展，在3個主要研究方面取得了豐富的成果。然而，種子細胞與支架復合物 植入機體后，血管新生需要數天時間，細胞耐受缺氧為數小時；細胞存活需要的氧和營養(yǎng)僅 能靠機體組織液滲透供應，而氧的擴散距離局限于0. 2mm內，這就決定種子細胞的成活及 體外構建組織工程化骨不能按照實際骨缺損的大小預購，尤其是大塊骨缺損，即構建組織 工程骨的厚度不能大于0. 5mm，否則其中的種子細胞因得不到氧和營養(yǎng)物質的供應而死亡。 現有的組織工程骨植入體內后，其血液供應均為滲透方式進行；而材料與血液接觸后將啟 動機體的凝血機制，使植入物周圍形成血凝塊從而進一步加劇植入組織工程骨的氧和營養(yǎng) 供應障礙。因此，血管化仍是組織工程骨研究和臨床應用所面臨的瓶頸之一。雖然生物反應 器內構建的組織工程骨植入體內有成骨作用，但植入初期與受區(qū)血液循環(huán)沒有直接銜接， 種子細胞成活及代謝產生的各種物質與受體間交換仍靠滲透進行，距離有限，效果難以保 證；另一方面，組織損傷創(chuàng)面或手術切口會啟動機體凝血系統產生保護反應，在骨缺損局部 被血凝塊包圍的移植物及內部營養(yǎng)物質和氧的運送極其有限。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提高一種局部抗凝及細胞捕獲的復合脫細胞的骨基質材料及制 備方法，采用本發(fā)明所述方法制備的骨基質復合材料具有骨組織的天然結構和特性，其抗 凝效果在局部發(fā)揮且可以控制，通過抗凝該材料能為種子細胞的存活提供更多血液。本發(fā)明的技術方案是局部抗凝及細胞捕獲的復合脫細胞骨基質材料，其特征在 于所述骨基質材料為在脫細胞的骨基質表面組裝有具有抗凝作用的硫酸多聚糖與殼聚糖 或纖維連接蛋白。硫酸多聚糖為肝素或硫酸軟骨素。所述骨基質材料為豬骨或人骨。局部抗凝及細胞捕獲的復合脫細胞骨基質材料的制備方法，有以下步驟1)取脫細胞的骨基質材料，放在質量百分比濃度為0.05% -0. 的肝素溶液中 浸泡，所述肝素溶液用PH = 4. 0的醋酸緩沖液配置，浸泡時間為1. 5 3小時，浸泡后，用 PH = 4. 0的醋酸緩沖液沖洗3次，每次3 8min ；2)離心，去除多余液體，得到表面形成結合肝素涂層的脫細胞骨基質材料； 3)步驟2)所得材料浸入質量百分比濃度為0. 05 %-0. 1%的殼聚糖或纖維連接蛋白溶液中，浸泡時間為1. 5 3小時后，浸泡后，用PH = 4. 0的醋酸緩沖液沖洗3次，每次 3 8min，得到殼聚糖或纖維連接蛋白與肝素復合形成涂層的脫細胞骨基質材料；4)重復步驟1)_3)若干次，再用磷酸緩沖液沖洗所得材料至PH = 7.4，37°C干燥， 60Co消毒，即得若干層由殼聚糖或纖維連接蛋白與肝素復合形成涂層的具有局部抗凝及細 胞捕獲功能的脫細胞骨基質復合材料。本發(fā)明以申請人于專利號為200310110871. O發(fā)明專利所述的方法制得的脫細胞 骨基質(ACBM)材料為基礎，以肝素/殼聚糖(或纖維連接蛋白)間帶有不同靜電或生物大 分子配體間結合的原理，使二者逐層組裝到ACBM表面形成由若干層殼聚糖或纖維連接蛋 白與肝素復合形成涂層的薄膜層。復合材料在一定時間內對肝素的緩釋在脫細胞骨基質 (ACBM)材料的局部(有復合層的)產生抗凝作用。再結合顯微外科技術使血管束植入材料 內部，從而使血液在組織工程骨內部實現持續(xù)“灌注”，為構建的“植入體”即時、持續(xù)提供氧 氣和營養(yǎng)物質，并排出代謝產物。采用本發(fā)明方法，使脫細胞骨基質局部抗凝(即有復合層的脫細胞骨基質具有抗 凝作用)，預防血凝塊的形成將延長滲透距離和時間，為種子細胞存活提供環(huán)境，結合其它 手術方法(如血管植入)，使血液灌注進入組織工程骨內部，加速血管化的進程。同時，在本 發(fā)明所述復合材料上的生物大分子對滲透或灌注血液中的種子細胞具有選擇性的捕獲并 結合到材料上，在局部微環(huán)境中細胞因子的影響下表達生物活性物質，發(fā)揮再生修復作用。 兩種作用的發(fā)揮是組織修復的方向，因此該方法構建的復合材料是未來發(fā)展的趨勢。本發(fā)明與現有的復合材料有以下不同1.本發(fā)明所述方法制備的復合材料除具備脫細胞骨基質的特性外，與現有復合材 料不同的是本發(fā)明利用靜電或分子間配體作用實現生物大分子的自組裝結合，而不是采 用蛋白膠、膠原或明膠等組成網孔結構包裹細胞因子的方式。2.現有的組織工程骨支架材料不具抗凝功能，可至血液凝固，使血液滲透距離降 低；本發(fā)明所述復合材料的抗凝功能可增加本發(fā)明復合材料及內部血液灌注。3.現有材料為釋放細胞因子，而本發(fā)明所述復合材料具有種子細胞捕獲功能。本發(fā)明所述復合材料仍保留骨組織的天然結構、生物學特性及低免疫原性，同時 復合涂層具有良好的局部抗凝功能及對種子細胞的捕獲作用。復合材料作為骨缺損充填材 料或組織工程骨支架具有明顯的促進血管化作用，加工制作科學合理、簡便易行。


圖1為掃描電鏡ACBM材料復合前后變化，其中圖Ia表示復合前材料仍保持骨組 織天然結構，圖Ib表示材料局部放大，表面粗糙；圖Ic為復合后材料表面變光滑，表明有涂 層形成；圖Id為圖Ic的局部放大。圖2為χ線衍射光電子能普分析(XPS)檢測本發(fā)明所述復合材料肝素復合結果；圖3為紅外光譜儀分析本發(fā)明所述復合材料靜電作用及結果；圖4為復合材料對肝素的緩釋效應及抗凝效果；檢測肝素釋放隨時間變化圖，2周 時仍有效釋放肝素(可有效抗凝)；圖5為復合前后的兩種材料對種子細胞的捕獲及影響；圖6為本發(fā)明所述復合材料體內血流灌注及血管化觀察，其中圖6a為HC-ACBM組
4(箭頭指1處為實驗側，2為對照側)；圖6b為ACBM植入組，其結果顯示a組血液灌注3_10 天顯著高于b組(ρ = 0.01)；圖7為本發(fā)明所述復合材料植入骨缺損局部后不同時間組織學觀察，其中圖7a為 植入后第3天組織學觀察，可見材料周圍輕度炎性細胞浸潤；圖7b為植入后第7天組織學 觀察，可見材料中骨小梁周圍見毛細血管形成(箭頭)。
具體實施例方式1.材料和試劑脫細胞骨基質ACBM(采用申請人的專利號為200310110871. 0發(fā)明專利所述的方 法制備)，所述脫細胞骨基質采用豬骨或人骨均可，本實施例采用豬骨和人骨分別做下述實驗。肝素鈉(Sigma，180u/mg)，殼聚糖(Sigma，脫乙酰化大于85% )；纖維連接蛋白(Sigma)，新生牛血清(gibco)，胰酶(Sigma)，采用市售的為生物制
品 ；臍靜脈內皮細胞(自制)；方法參見《復旦學報(醫(yī)學版)》2004-09-1，蔣紅軍，賈 兵，陳張根等“臍靜脈內皮細胞分離及冷凍保存技術”。Dispase酶，RPMI1640完全培養(yǎng)基(hyclone)采用市售的生物制劑；氯仿、甲醇、30% H202、無水乙醇、pH7. 4的磷酸鹽緩沖液(PBS)，亞甲胺藍(Sigma) 溶液均，采用市售的化學純試劑；儀器負壓倉、真空泵、環(huán)鉆、鋼鋸、通風櫥、燒杯(國產)，紫外分光光度計，細胞培 養(yǎng)箱(Thermo)實施例1制備復合肝素-殼聚糖的脫細胞骨基質Ofeparin chitosan coated ACBM, HC/ACBM)1)取脫細胞的骨基質材料(豬骨或人骨)一份，放在質量百分比濃度為 0. 05% -0. 的肝素溶液(PH = 4.0的醋酸緩沖液)中浸泡，浸泡時間為1. 5 3小時，浸 泡后，用PH = 4. 0的醋酸緩沖液沖洗3次，每次3 Smin ；浸泡時間為1. 5 3小時后，用 PH = 4. 0的醋酸緩沖液沖洗3次，每次3 8min ；，共12 25min左右。利用脫細胞骨基 質膠原暴露并帶正電荷，肝素在PH = 4. 0醋酸緩沖液條件下帶負電荷，利用脫細胞骨基質 材料表面的膠原纖維帶正電荷與肝素等(在特定PH條件下)帶負電荷的大分子物質通過 電荷間作用結合，形成結合肝素的涂層。2)離心，去除多余液體，得到表面形成結合肝素涂層的脫細胞骨基質材料。從圖 1中可以看到網孔率無明顯差異，仍保持骨組織天然結構；復合后可見材料表面變光滑(表 明有復合物涂層形成)。3)步驟2)所得材料浸入0. 05% -0. 1 %的殼聚糖或纖維連接蛋白溶液中浸泡，與 肝素復合形成涂層。浸泡時間為1. 5 3小時后，用PH = 4. 0的醋酸緩沖液沖洗3次，每 次3 8min;，共12 25min左右。4)重復步驟1)_3)若干次，如本實施例重復8次，再用磷酸緩沖液沖洗所得材料 至PH= 7. 4，37°C干燥，6tlCo消毒，即得若干層(本實施例為8層)殼聚糖或纖維連接蛋白 與肝素復合形成涂層的具有局部抗凝及細胞捕獲功能的脫細胞骨基質復合材料。即上述步驟重復多少次，再用磷酸緩沖液沖洗使所得材料至PH = 7. 4，37°C干燥，6tlCo消毒，即可得到 多少層局部抗凝及細胞捕獲功能的脫細胞骨基質復合材料。實施例2檢測1.材料形態(tài)結構掃描電鏡結果顯示復合前后材料仍保持骨組織天然結構；其網孔大小，網孔率無 明顯差異，材料的孔隙率為69. 9% 士8. 8%，孔徑大小為458. 16士 117. 87 μ m，而且微孔之 間相通(參見圖1)。復合后可見材料表面變光滑(圖1 表明有涂層形成)；X線衍射光電 子能譜分析(XPS)結果表明，隨著復合涂層增多，材料表面的硫元素增多(僅肝素中含有的 硫元素在材料中可檢測)，即肝素含量更多(參見圖2)。紅外光譜分析表明涂層成份中的 肝素帶負電荷與殼聚糖中正電荷通過靜電作用結合而成復合涂層，復合后肝素羥基負電荷 降低(3420nm處特征性吸收峰減低)；同時1860nm處胺基吸收峰也降低。(參見圖3)。2.肝素體外釋放有8層殼聚糖或纖維連接蛋白與肝素復合形成涂層的復合材料，肝素釋放可在2 周內維持在有效劑量(參見圖4)；此時測定結果顯示部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶原 時間(PT)、凝血酶時間(TT)在復合材料組顯著大于ACBM組(ρ = 0.02)，并高于正常。3.材料對種子細胞的影響復合材料中的大分子物質肝素對細胞的增值在各時間點與單純ACBM材料比較無 統計學差異；流式細胞法檢測結果顯示材料對細胞增值周期無明顯影響，無促進或抑制作 用。材料中的殼聚糖或纖維連接蛋白可促進脂肪源干細胞的早期粘附，與ACBM材料比較可 提前6小時。參見圖54.體內血液灌注及血管化觀察復合材料植入骨缺損局部后4周內HC-ACBM組血流量顯著高于ACBM組，尤其是在 植入后的初期；組織學觀察可見HC-ACBM材料植入后7天既有毛細血管出現，早于單純材料 植入組。參見圖6和圖7結論局部抗凝及細胞捕獲的脫細胞骨基質復合材料經體內外檢測結果顯示，均可以達 到良好的抗凝效果，有利于脂肪來源干細胞的粘附，對其增值無明顯影響；體內植入后初期 即可促進材料局部血液灌注并使材料早期血管化。采用本發(fā)明方法制備的復合材料可有效緩釋肝素達2-4周，APTT等試驗檢測結果 表明可延長凝血時間，且不影響全身情況。體內植入后可以顯著促進微血管形成。
權利要求
一種局部抗凝及細胞捕獲的脫細胞骨基質復合材料，其特征在于所述骨基質材料為在脫細胞的骨基質表面組裝有具有抗凝作用的硫酸多聚糖與殼聚糖或纖維連接蛋白。
2.根據權利要求1所述骨基質材料，其特征在于硫酸多聚糖為肝素或硫酸軟骨素。
3.根據權利要求1所述骨基質材料，其特征在于所述骨基質材料為豬骨或人骨。
4.權利要求1-3任一所述骨基質材料的制備方法，其特征在于有以下步驟1)取脫細胞的骨基質材料，放在質量百分比濃度為0.05% -0. 的肝素溶液中浸泡， 所述肝素溶液用PH = 4. 0的醋酸緩沖液配置，浸泡時間為1. 5 3小時，浸泡后，用PH = 4. 0的醋酸緩沖液沖洗3次，每次3 8min ；2)離心，去除多余液體，得到表面形成結合肝素涂層的脫細胞骨基質材料；3)步驟2)所得材料浸入質量百分比濃度為0.05% -0. 的殼聚糖或纖維連接蛋白溶 液中，浸泡時間為1. 5 3小時后，浸泡后，用PH = 4. 0的醋酸緩沖液沖洗3次，每次3 8min,得到殼聚糖或纖維連接蛋白與肝素復合形成涂層的脫細胞骨基質材料；4)重復步驟1)_3)若干次，再用磷酸緩沖液沖洗所得材料至PH = 7.4，37°C干燥，6°Co 消毒，即得若干層局部抗凝及細胞捕獲的脫細胞骨基質復合材料。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種局部抗凝及細胞捕獲的脫細胞骨基質復合材料，其骨基質材料為在脫細胞的骨基質表面組裝有具有抗凝作用的硫酸多聚糖與殼聚糖或纖維連接蛋白。其方法為先制備脫細胞骨基質材料，然后將具有抗凝作用的硫酸多聚糖(等)通過分子間靜電作用或配體間作用方式與殼聚糖或纖維連接蛋白在脫細胞骨基質表面(內、外表面)層層組裝形成緩釋涂層。該材料仍保留骨組織的天然結構、生物學特性及低免疫原性，同時復合涂層具有良好的局部抗凝功能及對種子細胞的捕獲作用。復合材料作為骨缺損充填材料或組織工程骨支架具有明顯的促進血管化作用，加工制作科學合理、簡便易行。
文檔編號A61L33/10GK101884808SQ20101023527
公開日2010年11月17日 申請日期2010年7月23日 優(yōu)先權日2010年7月23日
發(fā)明者任明亮, 劉大偉, 周繼紅, 孫新君, 張世昌, 張波, 張連陽, 朱佩芳, 楊在亮, 王正國 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學第三附屬醫(yī)院