專利名稱：：肽類抗凝劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及到新的肽，其可用作抗凝劑。抗凝劑在藥理治療方面是非常有用途的治療劑，如急性深度靜脈血栓形成，肺栓塞，急性肢體動(dòng)脈栓塞，心肌炎及血管內(nèi)凝血的擴(kuò)散。據(jù)信預(yù)防性地給予抗凝劑可防止風(fēng)濕性或動(dòng)脈硬化性心臟病患者的血栓形成，也可防止手術(shù)后的某些血栓栓塞綜合癥。也有報(bào)導(dǎo)使用抗凝劑治療冠狀動(dòng)脈及靜脈疾病，動(dòng)脈血栓栓塞，尤其是分布于心肌和腦部的動(dòng)脈，是死亡的一主要原因。水蛭素是從水蛭唾液腺中分離出的65肽，它是一種抗凝劑，并且是血栓栓塞的特異性抑制劑，盡管作用很強(qiáng)，但是從水蛭提取物中分離得到的水蛭素在臨床上似不適用，原因在于其提取量的限制，價(jià)格昂貴，以及隨給予如此大小的任何外來蛋白質(zhì)而普遍產(chǎn)生的過敏反應(yīng)。申請(qǐng)人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)水蛭素的一個(gè)特定片段可以代表，至少是部分代表其抗凝活性。這個(gè)片段已經(jīng)化學(xué)合成，某些其類似物看來是結(jié)合于凝血酶的識(shí)別部位，而非是空間分離的酶解部位，合成肽的結(jié)合竟?fàn)幮缘匾种屏死w維蛋白酶原和凝血酶識(shí)別部位結(jié)合，而這正是纖維蛋白酶生成及血凝形成的先決條件。本發(fā)明的肽具有明顯的抗凝活性，其只結(jié)合于凝血酶的識(shí)別部位而不結(jié)合于酶解部位的特性在抗凝劑治療中具有科學(xué)的吸引力和臨床治療的重要性。分子式的肽衍生物X-A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10-y于此X是氨基末端基團(tuán)，可以為氫、1或2個(gè)含有1～6個(gè)C原子的烷基、1或2個(gè)含2～10個(gè)C原子的?；Ⅴセ蚴?丁氧?；1是一個(gè)鍵或含有1-11個(gè)任意氨基酸基團(tuán)的肽。A2是苯丙氨酸，取代苯丙氨酸，β-(2-和3-噻吩基)丙氨酸，β-(2-和3-呋喃基)丙氨酸，β-(2-，3-和4-吡啶基)丙氨酸，β-(苯并噻吩-2-和3-)丙氨酸，β-(1-和2-萘基)丙氨酸，酪氨酸或色氨酸。A3谷氨酸或天門冬氨酸A4任意氨基酸或X1-X23中的任一基團(tuán)。A5異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸、己氨酸或苯丙氨酸。A6脯氨酸、羥脯氨酸、3，4-脫H脯氨酸，四氫噻唑-4-羧酸酯，N-甲基甘氨酸，N-甲基-苯基甘氨酸，D-丙氨酸，或X1-X23中的任一基團(tuán)，A7一個(gè)鍵或任意氨基酸。A8任意氨基酸。A9是親脂氨基酸，可以是酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、己氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、環(huán)己丙氨酸、和脯氨酸，或是含有至少一個(gè)如上親脂氨基酸的二肽。A10是一個(gè)鍵或是含有1-5個(gè)任意氨基酸基團(tuán)的肽段。y是羧基末端基團(tuán)。其可以是OH、(C1-C6)烷氧基、氨基、單一或二-(C1-C4)烷氧基取代的氨基或氨基。X1-X23如下于此R7是H、烷基、鹵素基團(tuán)、OH、NH-CO(C1-C4)烷基，NH2，NR22R23，NH-CO-(CH2)mPh，(CH2)m-y，OCO-N(R15)2，O-烷基，O-(CH2)m-F1，(C1-C4)硫代烷基或S-(CH2)m-F1。y是Ph1，噻吩基、呋喃基、環(huán)烷基、吡啶基1-或2-Nap;Ph1苯基被(R13)p-任意取代Nap萘基被(R5)p-任意取代F1是Ph1或NapR8是烯丙基、鹵素基團(tuán)，-O-CO-N(R15)2，-O-(CH2)m-F1，(C1-C4)烷氧基，(C1-C4)硫代烷基或S-(CH2)mF1，R9是(C1-C4)烷基，酮基或-(CH2)m-ph1;R10是鹵素基團(tuán)或y1-R16。R11，R111，和R12和R112是H或(C1-C4)烷基;或R111，R12和R112是H，R11是ph;R13是(C1-C4)烷基，(C1-C4)烷氧基，(C1-C4)硫代烷基，Cl，Br，F(xiàn)，CF3，OH，苯基、苯氧基，硫代苯基或苯基甲基。R5是(C1-C4)烷基，(C1-C4)烷氧基，(C1-C4)硫代烷基、Cl，Br，F(xiàn)，CF3或OH，m是0-4。p是1-3，只有當(dāng)R13或R5是Me，MeO，Cl，Br或F時(shí)，p大于1。R14是H，(C1-C4)烷基，ph，噻吩基，呋喃基，或吡啶基。R15是H或(C1-C4)烷基。y′是0或S。R16是(C1-C4)烷基或(CH2)m-ph1;或R16基團(tuán)結(jié)合形成一個(gè)五元或六元環(huán)，其中一個(gè)或數(shù)個(gè)O原子可被(C1-C4)烷基或二-(1-4C)烷基任意取代。R17是H，(C1-C4)烷基、(C4-C8)環(huán)烷基或苯基。R18是H，(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基或苯基。V是O-2。R19是(C1-C4)烷基或(CH2)r-苯基。R20是H、烷基、-(CH2)m-Z(當(dāng)Z未被苯基取代時(shí)則否)，二氫-2-茚基，全氫化-2-茚基。R21是H，(C1-C4)烷基或(CH2)r-G。G是苯基，4-羥基，或3，4-二羥基苯基，OH，1H-吲哚-3-，1H-咪唑-4-，NH2，SH，S-烷基，胍基，或CoNH2;R22是(C1-C4)烷基、基或苯乙基。R23是H(C1-C4)烷基，基，或苯乙基。R6是H，(C1-C4)烷基，基，二苯甲基，堿金屬或堿土金屬鹽離子，-CH(R17)-O-COR18或(CH2)2SiMe3。條件是A4和A6之一或二者必須從X1-X23中選擇，而且，A4和A6不能同時(shí)為脯氨酸。在本說明書中，使用下列通用氨基酸縮寫Gly-甘氨酸Ala-丙氨酸Val-纈氨酸Leu-亮氨酸Ile-異亮氨酸Cha-環(huán)己丙氨酸Orn-鳥氨酸Pro-脯氨酸Phe-苯丙氨酸Trp-色氨酸Met-蛋氨酸Ser-絲氨酸Thr-蘇氨酸Cys-半胱胺酸Tyr-酪氨酸Asn-天門冬酰胺Gln-谷酰胺Asp-天門冬氨酸Glu-谷氨酸Lys-賴氨酸Arg-精氨酸His-組氨酸Nle-己氨酸Hyp-羥脯氨酸Glt-戊二?；鵐al-馬來?；鵑pa-β-(2-萘基)-氨基丙酸3，4-dehydroPro-，3，4-脫氫脯氨酸Tyr(SO3H)-酪氨酸硫酸鹽pgl-苯基甘氨酸NMePgl-N-甲基苯基甘氨酸Sar-N-甲基甘氨酸pSubPhe-對(duì)位取代苯丙氨酸SubPhe-鄰、間或?qū)ξ唬瑔位蚨〈奖彼酓Ala-D-丙氨酸Ac-乙?；鵖uc-琥珀?；鵳ClPhe-對(duì)-氯-苯丙氨酸pNO2Phe-對(duì)-硝基-苯丙氨酸Pip-L-2-呱啶酸Azd-L-氮雜環(huán)丁烷-2-羧酯Tig-L-1，2，3，4-四氫異喹啉-3-羧酯Thz-L-四氫噻吩-4-羧酯烷基基團(tuán)和烷氧基基團(tuán)的烷基部分主要包括直鏈的，支鏈的和環(huán)狀的烷基，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、戊基、異戊烷基、仲戊烷基、環(huán)戊烷鹽、己烷基、異己烷基、環(huán)己烷基和環(huán)戊烷基甲基。2到10個(gè)碳原子的酰基基團(tuán)通常包括直鏈的，支鏈的，環(huán)狀的，飽和的及不飽和的每個(gè)基團(tuán)含有1或2個(gè)羰基部分的?；鶊F(tuán)。例如乙?；?、苯甲?；㈢牾；ⅠR來?；拔於；?、鹵素基團(tuán)為氟、氯、溴、碘。這里所用的術(shù)語“任何氨基酸”包括天然存在的氨基酸，以及那些在多肽化學(xué)中制備天然存在的多肽類似物時(shí)通常所用的其它“非蛋白質(zhì)”的α-氨基酸，天然存在的氨基酸為甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、組氨酸、天門冬氨酸、天門冬酰胺、谷氨酸、谷酰胺、精氨酸、鳥氨酸及賴氨酸?！胺堑鞍住宝?氨基酸的例子為正亮氨酸、正纈氨酸、別異亮氨酸、高精氨酸、硫脯氨酸、脫氫脯氨酸、羥脯氨酸(Hyp)，高絲氨酸、環(huán)己烷基氨基酸(Chg)，α-氨基-n-丁氨酸(Aba)，環(huán)己烷基丙氨酸(Cha)，氨苯丁氨酸(Pba)，苯丙氨酸苯基部分在鄰、間或?qū)ξ槐灰换蚨€(gè)下列基團(tuán)取代(C1-C4)烷基，(C1-C4)烷氧基，鹵素或硝基，或被二氧次甲基取代。β-2-和3-噻吩丙氨酸，β-2-和3-呋喃丙氨酸，β-2-，3-，和4-吡啶丙氨酸，β-(苯并噻吩-2-和3-)丙氨酸，β-(1-和2-萘基)丙氨酸，絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸的氧烷基化衍生物。S-烷基化半胱氨酸、酪氨酸的O-硫酸酯，3，5-二碘酪氨酸，以及自然界存在氨基酸的D-異構(gòu)體。術(shù)語“親脂性氨基酸”包括酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、己氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、組氨酸和脯氨酸。天然氨基酸除甘氨酸外，均含有一個(gè)手性碳原子。除非在特別指定的情況下，這里指出的旋光活性氨基酸為L(zhǎng)-構(gòu)型。例如，A1或A10基團(tuán)的任何氨基酸，均可為D-或L-構(gòu)型。按習(xí)慣寫法，這里所寫的肽結(jié)構(gòu)為氨基末端在鏈左側(cè)，而羧基末端在鏈右側(cè)。分子式1代表的多肽可以形成藥理上可接受的無毒的有機(jī)或無機(jī)鹽。可形成適宜的鹽的無機(jī)酸例如鹽酸、氫溴酸、硫酸和磷酸，以及酸性金屬鹽例如正磷酸氫二鈉，及硫酸氫鉀?？尚纬蛇m宜的鹽的有機(jī)酸例如單、二或三羧酸、這些酸的例子為乙酸、乙二酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、富馬酸、蘋果酸、酒石酸、枸椽酸，抗壞血酸、馬來酸、羥基馬來酸、苯甲酸、羥基苯甲酸、苯乙酸、肉桂酸、水楊酸、2-苯氧基苯甲酸及磺酸類如甲磺酸、2-羥基乙基磺酸。羧基端的氨基酸鹽包括與任何適宜的無機(jī)或有機(jī)堿基所形成的無毒的羧酸鹽。例如這些鹽包括堿金屬鹽、如鈉鹽、鉀鹽。堿土金屬鹽如鈣鹽、鎂鹽、ⅢA族的輕金屬鹽，如鋁鹽。以及有機(jī)的伯、仲、叔胺鹽。例如叔胺包括三乙胺、普魯卡因、二胺、1-乙烯胺，N，N′-二乙烯二胺鹽，二氫松香胺，N-(降)烷基呱啶鹽以及任何其它適宜的胺鹽。在化合物中的任何同屬基團(tuán)，有某些基團(tuán)被優(yōu)先選擇。申請(qǐng)人建議優(yōu)先選用分子式1的肽衍生物。其中X為氫、乙?；蜱牾；Ｍ瑫r(shí)優(yōu)先選擇的還有那些分子式1的化合物A1A2優(yōu)先選擇Phe，β-2-或3-噻吩丙氨酸，酪氨酸、色氨酸β-(2-萘基)-氨基丙氨酸或?qū)β缺奖彼帷3是谷氨酸A4是谷氨酸，天門冬氨酸，脯氨酸、丙氨酸L-2-呱啶酸，L-氮雜環(huán)丁烷-2-羧酯。L-1，2，3，4-四氫異喹啉-3-羧酯，或L-四氫噻吩-4-羧酯。A5是異亮氨酸、亮氨酸、A6是脯氨酸，N-甲基甘氨酸、D-丙氨酸，羥脯氨酸，N-甲基-苯基甘氨酸，L-2-呱啶酸、L-氮雜環(huán)丁烷-2羧酯，L-1，2，3，4-四氫異喹啉-3-羧酯或L-四氫噻吩-4-羧酯。A7是谷氨酸，谷酰胺，門冬氨酸，或丙氨酸。A8是谷氨酸，門冬氨酸，或丙氨酸。A9是脯氨酸、丙氨酸-酪氨酸，丙氨酸-環(huán)己丙氨酸，酪氨酸-亮氨酸、丙氨酸-苯丙氨酸、酪氨酸-酪氨酸A10是谷氨酸、門冬酰胺、門冬氨酸-谷氨酸、脯氨酸、谷酰胺、丙氨酸、單鍵、D-賴氨酸、賴氨酸，D-門冬氨酸、或鳥氨酸Y是OH或NH2尤其優(yōu)先選擇的是那些分子式1的肽衍生物，其中X是乙酰基，A1是甘氨酸一門冬氨酸或門冬氨酸;或者X是琥珀酰基，A1是單鍵，其中A2是苯丙氨酸;β-(2-噻吩丙氨酸)，或酪氨酸。A3是谷氨酸。A4是谷氨酸、脯氨酸、L-2-呱啶酸，或L-氮雜環(huán)丁烷-2-羧酯。A5是異亮氨酸A6是脯氨酸、L-2-呱啶酸或L-氮雜環(huán)丁烷-2-羧酯A7是谷氨酸A8是谷氨酸或門冬氨酸A9是酪氨酸-亮氨酸、丙氨酸-酪氨酸，酪氨酸-酪氨酸，丙氨酸-苯丙氨酸，丙氨酸-環(huán)己丙氨酸，或酪氨酸。A10谷酰胺，門冬氨酸、脯氨酸、單鍵，D-門冬氨酸，D-賴氨酸，D-谷氨酸，或一門冬氨酸一谷氨酸，Y是OH或NH2本發(fā)明中的蛋白質(zhì)可被那些具有這方面工作經(jīng)驗(yàn)的人，用已知的不同方法進(jìn)行制備。這些方法包括固相連續(xù)反應(yīng)保護(hù)合成，基因克隆，以及這些方法的綜合應(yīng)用，固相連續(xù)反應(yīng)法可以利用已經(jīng)建立的自動(dòng)化的方法進(jìn)行，例如自動(dòng)肽合成儀。在這方法中，一個(gè)α-氨基保護(hù)的氨基酸接于一擔(dān)體樹脂上，在多肽的固相制備技術(shù)中，所用的擔(dān)體樹脂，可以是常規(guī)使用的任何適宜的擔(dān)體樹脂，通常用交聯(lián)有0.5-3%二乙烯基苯的聚苯乙烯，其已被氯甲基化或羥甲基化，以提供與最初引入的α-氨基保護(hù)的氨基酸形成酯的部位。羥甲基樹脂的例子，已由Bodanszky等在《Chem.Ind(London)38，1597-98(1966)》中作過報(bào)道，氯甲基化樹脂可從加州、Richmond的BioRad實(shí)驗(yàn)室買到，這種樹脂的制備方法由Stewart等人在《SolidphasePeptideSynthesis》(Freeman&amp;Co，SanFrancisco1969)，第一章，第1-6頁中作過報(bào)道，被保護(hù)的氨基酸可按Gisin在《HelvChemActa，56，1476(1973)》中所述的方法接于樹脂上，許多接合樹脂的、被保護(hù)的氨基酸可以買到，例如制備本發(fā)明中的多肽，其中羧基末端是蘇氨酸、叔丁氧酰基(Boc)保護(hù)的蘇氨酸接于化的、羥甲基化的苯乙酰胺甲基(PAM)樹脂是實(shí)驗(yàn)中所需要的，并且可以買到。當(dāng)α-氨基保護(hù)的氨基酸偶連于樹脂擔(dān)體后，保護(hù)基可用任何適宜的方法除去，如用三氟醋酸的二氯甲烷溶液，單一的三氟醋酸、或鹽酸二噁烷溶液。脫保護(hù)是0℃到室溫進(jìn)行的。其它用來除去特異的α-氨基保護(hù)基的解離試劑及條件均可使用。α-氨基保護(hù)基除去后，其它氨基保護(hù)的氨基酸依次以理想的順序連接。二者擇一，多氨基酸基團(tuán)也可以在與樹脂擔(dān)體氨基酸序列偶聯(lián)之前，先用溶液法進(jìn)行偶聯(lián)。引入多肽序列的每個(gè)氨基酸所用的α-氨基保護(hù)基，可以是該技術(shù)中已知的任何保護(hù)基，α-氨基保護(hù)基的類型有(1)酰基型保護(hù)基，如甲酰基、三氟乙酰基，鄰苯二甲酰基、甲苯磺酰基(tosyl)，苯磺?；?、硝基苯亞磺?；絹喕酋；?，鄰-硝基苯氧乙?；唉?氯丁?；?。(2)芳香氨基酯類保護(hù)基，如氧?；叭〈难貂；鐚?duì)氯氧?；?，對(duì)硝基基?；瑢?duì)溴氧?；瑢?duì)甲氧氧?；?，1-(對(duì)-聯(lián)苯基)-1-甲基乙氧酰基，α，α-二甲基-3，5-二甲氧基氧?；?，及二苯甲氧酰基。(3)脂肪氨基酯類保護(hù)基，如叔丁氧?；?Boc)，二異丙基甲氧?；?，異丙氧?；已貂；?，及烯丙氧?；?。(4)環(huán)烷氨基酯類保護(hù)基，如，環(huán)戊烷氧酰基，金剛烷氧?；碍h(huán)己烷氧?；?。(5)硫代氨基酯類保護(hù)基，如苯硫代?；?6)烷基類保護(hù)基，如三苯甲基(trityl)和基(7)三烴基硅烷類保護(hù)基，如三甲基硅烷。最常用的α-氨基保護(hù)基為叔丁氧?；?。選擇適宜的偶聯(lián)試劑也在該項(xiàng)技術(shù)范圍內(nèi)，當(dāng)其中所加氨基酸為谷酰胺，天門冬酰胺，或精氨酸時(shí)，特別適用的偶聯(lián)試劑是N，N′-二異丙基碳化二亞胺及1-羥基-苯并三唑。使用這些試劑可以防止腈和內(nèi)酰胺的形成。其它的偶聯(lián)試劑有(1)碳化二亞胺類(如N，N′-二環(huán)己烷基碳化二亞胺及N-Z基-N′-(ν-二甲胺基丙基碳化二亞胺);(2)氨基氰類，(如N，N-二基氨基氯;(3)酮亞胺類;(4)異噁唑鹽類(如N-乙基-5-苯基-異噁唑-3L磺酸鹽;(5)含1-4個(gè)氮的芳香單雜環(huán)酰胺，如咪唑烷類、吡唑烷類，及1，2，4-三唑烷，有用的特定雜環(huán)酰胺包括N，N′-羰基-二咪唑及N，N-羰基-二-1，2，4-三咪唑;(6)烷氧基化的乙炔類(如乙氧乙炔);(7)能與氨基酸的羧基端形成混合脫水物的試劑。(如乙基甲酰氯及異丁基甲酰氯)或偶聯(lián)氨基酸的對(duì)稱脫水物(如叔丁氧酰基-丙氨酸-O-丙氨酸-叔丁氧?；?(8)在一環(huán)氮上有一個(gè)羥基的含氮雜環(huán)化合物(如N-羥基苯鄰二甲酰亞胺，N-羥基琥珀酰亞胺及1-羥基苯并三唑)Kapoor在《J、Pharm.Sci，59，PP、1-27(1970)》中報(bào)道了其它活性試劑及其應(yīng)用。申請(qǐng)者建議使用對(duì)稱脫水物作為除精氨酸、天門冬酰胺及谷酰胺外其它所用氨基酸的偶聯(lián)試劑。每種被保護(hù)氨基酸或氨基酸序列，過量4倍加入固相反應(yīng)儀中，偶聯(lián)反應(yīng)在二甲基甲酰胺二氯甲烷(1∶1)或在單獨(dú)二甲基甲酰胺，或更好地在單獨(dú)二氯甲烷中進(jìn)行。偶聯(lián)反應(yīng)在固相反應(yīng)儀中與下一個(gè)氨基酸偶聯(lián)之前需重復(fù)進(jìn)行，以防不完全偶聯(lián)。合成每一步中偶聯(lián)反應(yīng)成功與否由茆三酮反應(yīng)檢查，E.Kaiser等在《Analyt，Biochem，34，595(1970)》中對(duì)此反應(yīng)進(jìn)行了論述。得到所需的氨基酸序列后，肽從樹脂上除去，這可以通過水解完成，如接有多肽的樹脂用甲硫醚、對(duì)甲苯酚和甲苯硫酚溶液在稀氫氟酸水溶液中進(jìn)行處理。正如在固相肽合成技術(shù)中所知，在鏈制備過程中，許多氨基酸具有需要保護(hù)的官能團(tuán)。適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基的使用與選擇是這項(xiàng)技術(shù)中所需的技巧，并且依賴于保護(hù)的氨基酸以及肽鏈中其它被保護(hù)氨基酸的存在。這種側(cè)鏈保護(hù)基的選擇非常關(guān)鍵，在于它必須在α-氨基端保護(hù)基裂解時(shí)，不會(huì)被同時(shí)裂解除去。例如賴氨酸適合的側(cè)鏈保護(hù)基是氧?；叭〈难貂；?，所說的取代可以是鹵素(如氯、溴、氟)及硝基。(如2-氯氧酰基，對(duì)硝基氧?；?，3，4-二氯氧?；妆交酋；?，叔戊氧?；岸惐籽貂；?、蘇氨酸和絲氨酸的醇羥基可以用乙酰基、苯甲?；?、叔丁基，三苯甲基、基，2，6-二氯基或氧酰基基團(tuán)保護(hù)。最適合的保護(hù)基為基。這些基團(tuán)可被這項(xiàng)技術(shù)中已知方法除去典型的脫保護(hù)基是在肽鏈合成后進(jìn)行，但也可在其它任何合適的時(shí)間脫去保護(hù)基。本發(fā)明肽衍生物的抗凝劑是根據(jù)病人情況，所治療的血栓形成的程度，以及所選擇的肽衍生物，為每天每公斤體重0.2-250mg。對(duì)于特定病人的適宜的劑量很容易決定。通常每日給藥1-4次每劑5mg-100mg。抗凝劑可以用來治療和預(yù)防多種血栓形成性疾病，特別是冠狀動(dòng)脈和腦靜脈疾病，在這個(gè)領(lǐng)域富于經(jīng)驗(yàn)者可以很容易地知道需抗凝劑治療的時(shí)機(jī)，這里所說的“患者”是指哺乳類動(dòng)物如靈長(zhǎng)目的，包括人、羊、牛、馬、豬、狗、貓、大鼠、小鼠。盡管一些肽衍生物可口服給藥，并能通過腸道而不被滅活，申請(qǐng)者更愿選擇非口服途徑給藥，例如，皮下、靜注、肌注或腹腔內(nèi)給藥，也可通過貯庫注射，埋植制劑，或粘膜給藥，如鼻、喉及支氣管粘膜，例如在氣霧劑中含有本發(fā)明的肽衍生物，其為噴霧或干粉形式。非腸道給藥時(shí)，以該化合物注射劑量的溶液或混懸液形式給藥，該注射劑是指該化合物與可滅菌液體(如水或/和油)的藥用載體及加或不加表面活性劑和其它藥用輔料組成的生理耐受稀釋液。可用于這些制劑中油例如石油、動(dòng)物、植物及合成油，如花生油、大豆油、及礦物油，通常，水，生理鹽水、葡萄糖溶液及有關(guān)的糖溶液。乙醇及二元醇類如丙二醇或聚乙烯醇是首選的液體載體，尤其用于注射液。這些化合物可以貯庫注射劑或埋植制劑的形式給藥，其可使活性成分緩慢釋放給藥?；钚猿煞挚梢詨喝胄⊥杌蛐A柱中，埋植于皮下或肌肉中，作為貯庫注射劑或埋植劑，埋植劑可以使用惰性材料，如可生物降解的聚合物或合成硅氧烷類例如DowCorning公司制造的硅橡膠，硅氧橡膠。實(shí)例本發(fā)明由下列非限定的實(shí)例詳述，實(shí)例1琥珀酰-酪氨酸-谷氨酸-脯氨酸-異亮氨酸-L-2-呱啶酸-谷氨酸-谷氨酸-丙氨酸-環(huán)己丙氨酸-D-谷氨酸-OH的制備。這個(gè)肽是通過固相法由0.5mmol的0.56mmol/g叔丁氧基-D-谷氨酸(氧?；?-Merefietd樹脂合成的。雙對(duì)稱脫水偶聯(lián)是用2.0mmolNα-叔丁氧酰-氨基酸(PeptidesLnternational)進(jìn)行的，除在叔丁氧-L-呱啶酸情況下為單偶聯(lián)。所用的側(cè)鏈保護(hù)基為谷氨酸(氧酰基)，酪氨酸(2-BrZ)。Nα-叔丁氧基末端保護(hù)用含50%三氟醋酸的二氯甲烷溶液脫除，樹脂用二氯甲烷洗三次，用含10%二異丙基乙胺的二氯甲烷溶液沖洗中和三次，用二氯甲烷洗三次。肽用含1.0g琥珀酐的二甲基甲酰胺溶液封端，用二甲基甲酰胺洗三次，用二氯甲烷洗三次，然后用游離氨檢查、封端反應(yīng)再反復(fù)二次，干燥樹脂。肽脫保護(hù)，用含5%苯甲醚的HF在0℃反應(yīng)45分鐘，使與樹脂脫離。于0℃真空除去HF，用30%乙腈水溶液從樹脂中提取肽，然后冷凍干燥。制備的肽用高壓液相純化，用50.8×150mm的18C-Beckman柱，流動(dòng)相為79ml/min流速的含有33-38%的乙腈的0.1%三氟醋酸水溶液。收集主要峰，冷凍干燥，在同一柱上用含34-35。5%乙腈的0.1%三氟醋酸溶液以80ml/min的流速進(jìn)一步梯度純化。收集主要峰，冷凍干燥得到104mg所需產(chǎn)品，制備高壓液相層析是在50.8×150mm的18C-Beckman柱上，用含有33-38%乙腈的0.1%三氟醋酸水溶液以79ml/min的流速梯度進(jìn)行的。收集主峰、冷凍干燥得到101mg所需產(chǎn)品(據(jù)最初樹脂取代計(jì)算，產(chǎn)率為58%，均勻性用HpLC和TLC檢測(cè)，HPLC型號(hào)為Vydac218TP54(250×4.6mm)18C柱，2ml/min，to＝1.9min，用含15-40%乙腈的0.1%三氟醋酸水溶液，以1%/min的線性梯度洗脫，洗脫時(shí)間為14.4min。氨基酸分析(6N鹽酸水解，24hr，106℃)Glu谷氨酸4.02(4);脯氨酸0.99(1);丙氨酸0.99(1);異亮氨酸0.95(1);酪氨酸0.97(1);L-2-呱啶酸1.08(1);ε275＝1490，肽含量為91.5%(重量比)。以同樣方法制備下列實(shí)例2-4的肽實(shí)例2琥珀酰-酪氨酸-谷氨酸-2-L-呱啶酸-異亮氨酸-脯氨酸-谷氨酸-谷氨酸-丙氨酸-環(huán)己丙氨酸-D-谷氨酸-OH。實(shí)例3琥珀酰-酪氨酸-谷氨酸-脯氨酸-異亮氨酸-L-2-氮雜環(huán)丁烷-2-羧酯-谷氨酸-谷氨酸-丙氨酸-環(huán)己丙氨酸-D-谷氨酸-OH。實(shí)例4琥珀酰-酪氨酸-谷氨酸-L-2-氮雜環(huán)丁烷-2-羧酯-異亮氨酸-脯氨酸-谷氨酸-谷氨酸-丙氨酸-環(huán)己丙氨酸-D-谷氨酸-OH。</tables></tables>權(quán)利要求1.下列分子式的肽衍生物，X-A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10-Y其中X為氫、一或二個(gè)含有1-6個(gè)碳原子的烷基，或是一或二個(gè)含2-10個(gè)碳原子的?；1為鍵或含有1-11個(gè)任何氨基酸基團(tuán)的肽段。A2為苯丙氨酸、取代苯丙氨酸，β-(2-和3-噻吩基)丙氨酸，β-(2-和3-呋喃基)丙氨酸，β-(2，3-和4-吡啶基)丙氨酸，β-(苯并噻吩-2-和3-)丙氨酸，β-(1-和2-萘基)丙氨酸，酪氨酸或色氨酸。A3為谷氨酸或天門冬氨酸A4為任意氨基酸或X1-X23中任一基團(tuán)。A5為異亮氨基酸、纈氨酸、亮氨酸、己氨酸或苯丙氨酸。A6為脯氨酸，羥脯氨酸，3，4-脫氫脯氨酸，四氫噁唑-4-羧酸酯，N-甲基甘氨酸，N-甲基-苯基甘氨酸，D-丙氨酸，或X1-X23中任一基團(tuán)A7任意氨基酸A8任意氨基酸A9親脂氨基酸，可以是酪氨酸，色氨酸，苯丙氨酸，亮氨酸，己氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，環(huán)己丙氨酸，及脯氨酸，或含有至少1個(gè)上述親脂氨基酸的二肽。A10一個(gè)鍵或是含有1-5個(gè)任意氨基酸基團(tuán)的肽段。Y一羧基末端基團(tuán)，其可以是OH，(C1-C6)烷氧基，氨基，單一或-二(C1-C4)烷基取代氨基X1-X23如下其中R7為H、烷基、鹵素、OH、NH-CO-(C1-C4)烷基，NH2，NR22R23，NH-CO-(CH2)mph，(CH2)m-Y，OCO-N(R15)2，O-烷基O-(CH2)m-F′，(C1-C4硫代烷基，或S-(CH2)m-F′；Y為ph′，噻吩基，呋喃基，環(huán)烷基，吡啶基，1-或2-Nap；ph′為苯基被(R13)p-任意取代，Nap為萘基被(R5)P一任意取代，F(xiàn)′為ph′或Nap;R6為烯丙基、鹵素基團(tuán)，-O-CO-N(R15)2,－(CH2)m-F′，(C1-C4)烷氧基，或S-(CH2)m-F′R9為(C1-C4)烷基，酮基或-(CH2)m-Ph′R10為鹵素基團(tuán)或Y′-R16，R11，R′11，R12和R′12；為H或(C1-C4)烷基；或R′11，R`12和R12，為H，R11為ph。R13為(C1-C4)烷基，(C1-C4)烷氧基，(C1-C4)硫代烷基，Cl，Br，F(xiàn)，CF3，OH，苯基，苯氧基，硫代苯基，或苯基甲基。R5為(C1-C4)烷基，(C1-C4)烷氧基，(C1-C4)硫代烷基，Cl，Br，F(xiàn)，GF3或OH。m為0-4P為1-3，只有當(dāng)R13或R5是Me，Meo，Cl，Br或F時(shí)P大于1。R14為H，(C1-C4)烷基，Ph，噻吩基，呋喃基，或吡啶基。R15為H或(C1-C4)烷基Y′為O或SR16為(C1-C4)烷基或(CH2)m-Ph′；或R16基團(tuán)結(jié)合形成一個(gè)五元或六元環(huán)，其中一個(gè)或數(shù)個(gè)C原子可被(C1-C4)烷基或二一(1-4C)烷基任意取。R17是H，(C1-C4)烷基，(C4-C8)環(huán)烷基或苯基。R14為H，(C1-C4)烷基，PH，(C1-C4)烷氧基或苯基。V為0-2，R19(C1-C4)烷基或(CH2)r一苯基。R20為H，烷基，-(CH2)m-Z(但當(dāng)Z未被基取代時(shí)則否)，二氫-Z-茚基，或全氫化-Z-茚基。R21為H，(C1-C4)烷基，或(CH2)r-GG為苯基，4-羥基-，或3，4-二羥基苯基，OH，1H-吲哚-3-，1H-咪唑-4-，NH2，SH，S-烷基，胍基，或CONH2R22為(C1-C4)烷基，芐基或苯乙基。R23為H，(C1-C4)烷基，芐基，或苯乙基。R6為H，(C1-C4)烷基，芐基，二苯甲基，堿金屬或堿土金屬鹽離子，-CH(R17)-O-COR16或(CH2)2SiMe3條件是A4和A6之一或二者必須從X1-X23中選擇，而且，A4和A6不能同時(shí)為脯氨酸。2.權(quán)利要求1中的肽衍生物，其中A2為苯丙氨酸，β-(2-或3-噻吩基)丙氨酸，或酪氨酸。3.權(quán)利要求1中的肽衍生物，其中A3為谷氨酸。4.權(quán)利要求1中的肽衍生物，其中A4為谷氨酸，丙氨酸或脯氨酸。5.權(quán)利要求1中的肽衍生物，其中A5為異亮氨酸。6.權(quán)利要求1中的肽衍生物，其中A6為脯氨酸。7.權(quán)利要求1中的肽衍生物，其中A7為谷氨酸或丙氨酸。8.權(quán)利要求1中的肽衍生物，其中A8為谷氨酸或天門冬氨酸。9.權(quán)利要求1中的肽衍生物，其中A9為酪氨酸-亮氨酸，丙氨酸-酪氨酸，或丙氨酸-環(huán)己丙氨酸。10.權(quán)利要求1中的肽衍生物，其中A10為谷酰胺，天門冬氨酸、脯氨酸，鍵，天門冬酰胺，天門冬氨酸-谷氨酸，谷氨酸，丙氨酸，D-賴氨酸，賴氨酸，D-天門冬氨酸，D-谷氨酸或鳥氨酸。11.權(quán)利要求1中的肽衍生物，其中X為H，乙?；蜱牾；?。12.權(quán)利要求1中的肽衍生物，其中Y為OH或NH2。13.權(quán)利要求1中的肽衍生物，其中A1為或一個(gè)鍵14.權(quán)利要求1中的肽衍生物，其中A1為15.權(quán)利要求1中的肽衍生物，其中A1為16.權(quán)利要求1中的肽衍生物，其為琥珀酰-酪-谷-脯-異亮-L-2-呱啶酸-谷-谷-丙-環(huán)己丙-D-谷-OH。17.權(quán)利要求1中的肽衍生物，其為琥珀酰-酪-谷-L-2-呱啶酸-異亮-脯-谷-谷-丙-環(huán)己丙D-谷-OH。18.權(quán)利要求1中的肽衍生物，其為琥珀酰-酪-谷-脯-異亮-L-氮雜環(huán)丁烷-2-羧酯-谷-谷-丙-環(huán)己丙-D-谷-OH。19.權(quán)利要求1中的肽衍生物，其為琥珀酰-酪-谷-L-氮雜環(huán)丁烷-2-羧酯-異亮-脯-谷-谷-丙-環(huán)己丙-D-谷-OH。20.權(quán)利要求1中的肽衍生物，其為琥珀酰-酪-谷-脯-異亮-脯-谷-谷-丙-環(huán)己丙-D-谷-OH。21.降低患者血凝的方法，其包括服給患者以權(quán)利要求1-20中的任何一個(gè)抗凝有效劑量的肽衍生物及藥用載體。22.通過固相連續(xù)法或保護(hù)合成法、基因克隆或綜合方法制備權(quán)利要求1-20的任何肽衍生物的方法。23.通過固相連續(xù)法或保護(hù)合成法制備權(quán)利要求1-20中任何肽衍生物的制備方法包括將權(quán)利要求1所定義的分子式A1的合適的被保護(hù)的氨基酸結(jié)合于活性樹脂擔(dān)體上，隨后將權(quán)利要求1中的A2-A10的其它α-氨基保護(hù)的氨基酸，結(jié)合于肽鏈的末端氨基酸，其已于同時(shí)除去氨基保護(hù)基，呈暴露狀態(tài)。24.根據(jù)權(quán)利要求22或23，制備權(quán)利要求1中的肽衍生物，其中A1為25.根據(jù)權(quán)利要求22或23制備權(quán)利要求1中的肽衍生物的方法其中A2為苯丙氨酸，β-(2-或3-噻吩基)丙氨酸，或酪氨酸。26.根據(jù)權(quán)利要求22或23制備權(quán)利要求1中的肽衍生物的方法，其中A3為谷氨酸。27.根據(jù)權(quán)利要求22或23制備權(quán)利要求1中肽衍生物的方法，其中A4為谷氨酸、丙氨酸、或脯氨酸。28.根據(jù)權(quán)利要求22或23制備權(quán)利要求1中肽衍生物的方法，其中A5為異亮氨酸。29.根據(jù)權(quán)利要求22或23制備權(quán)利要求1中肽衍生物的方法，其中A6為脯氨酸。30.根據(jù)權(quán)利要求22或23制備權(quán)利要求1中肽衍生物的方法，其中A7為谷氨酸，或丙氨酸。31.根據(jù)權(quán)利要求22或23制備權(quán)利要求1中肽衍生物的方法，其中A8為谷氨酸或天門冬氨酸。32.根據(jù)權(quán)利要求22或23制備權(quán)利要求1中肽衍生物的方法，其中A9為酪氨酸-亮氨酸、丙氨酸-酪氨酸或丙氨酸-環(huán)己丙氨酸。33.根據(jù)權(quán)利要求22或23制備權(quán)利要求1中肽衍生物的方法，其中A10為谷酰胺，天門冬氨酸、脯氨酸、鍵、天門冬酰胺，天門冬氨酸-谷氨酸谷氨酸、丙氨酸，D-賴氨酸，賴氨酸，D-天門冬氨酸，D-谷氨酸、或鳥氨酸。34.根據(jù)權(quán)利要求22或23制備權(quán)利要求1中肽衍生物的方法，此衍生物為琥珀酰-酪-谷-脯-異亮-L-2-呱啶酸-谷-谷-丙-環(huán)己丙-D-谷-OH。35.根據(jù)權(quán)利要求22或23制備權(quán)利要求1中肽衍生物的方法，此衍生物為琥珀酰-酪-谷-L-2-呱啶酸-異亮-脯-谷-谷-丙-環(huán)己丙-D-谷-OH。36.根據(jù)權(quán)利要求22或23制備權(quán)利要求1中肽衍生物的方法，此衍生物為琥珀酰-酪-谷-脯-異亮-L-2-氮雜環(huán)丁烷-2-羧酯-谷-谷-丙-環(huán)己丙-D-谷-OH37.根據(jù)權(quán)利要求22或23制備權(quán)利要求1中肽衍生物的方法，此衍生物為琥珀酰-酪-谷-L-2-氮雜環(huán)丁烷-2-羧酯-異亮-脯-谷-谷-丙-環(huán)己丙-D-谷-OH。38.根據(jù)權(quán)利要求22或23制備權(quán)利要求1中肽衍生物的方法，此衍生物為琥珀酰-酪-谷-脯-異亮-脯-谷-谷-丙-環(huán)己丙-D-谷-OH。全文摘要本發(fā)明涉及到肽衍生物，其為有效的抗凝劑。文檔編號(hào)C12P21/02GK1043134SQ8910909公開日1990年6月20日申請(qǐng)日期1989年12月6日優(yōu)先權(quán)日1988年12月7日發(fā)明者約翰·里奧納德·克斯登安斯基申請(qǐng)人:默里爾多藥物公司