專利名稱：：重組鼠骨髓瘤細(xì)胞及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種重組鼠骨髓瘤細(xì)胞及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：哺乳動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模發(fā)酵是確?？贵w藥物能夠批量生產(chǎn)供應(yīng)臨床使用的基礎(chǔ)，也是現(xiàn)代生物制藥領(lǐng)域中最為關(guān)鍵的技術(shù)。美國食品藥品管理局在2000年1月-2004年12月批準(zhǔn)上市的31種生物技術(shù)藥物中，約70%為哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的重組蛋白。目前國際上主要用CHO、SP2/0、NSO等三種細(xì)胞系生產(chǎn)重組蛋白治療藥物。例如治療淋巴瘤的Rituximab，治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的Infliximab,和預(yù)防急性器官排斥的Daclizumab分別是用CH0，NS0和SP2/0表達(dá)的。目前我國批準(zhǔn)上市的由哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)得到的藥物產(chǎn)品很少，只有促紅細(xì)胞生成素(EP0)、CH0基因工程乙肝疫苗、以及最近批準(zhǔn)上市的治療性抗體藥物益賽普(有效成分相當(dāng)于美國食品藥品管理局批準(zhǔn)的Enbrel)和泰欣生(有效成分相當(dāng)于美國食品藥品管理局批準(zhǔn)的Erbitux)等少數(shù)幾種生物技術(shù)藥物。主要是由于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的技術(shù)復(fù)雜和控制要求高，而這已成為我國生物技術(shù)藥物產(chǎn)業(yè)化最難跨越的"門檻"。目前研發(fā)主要集中在CHO細(xì)胞上，而關(guān)于NSO細(xì)胞的研究很少。NS0細(xì)胞是小鼠衆(zhòng)細(xì)胞瘤細(xì)胞，與CHO細(xì)胞最大的區(qū)別在于NSO細(xì)胞不需要基因擴(kuò)增的過程就可以得到高表達(dá)細(xì)胞株。這一特點(diǎn)不但可以節(jié)約6個(gè)月的工程細(xì)胞株開發(fā)時(shí)間，而且可以大大簡化藥物申報(bào)時(shí)對(duì)細(xì)胞株穩(wěn)定性的鑒定工作。NSO細(xì)胞是懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞，不需要從貼壁到懸浮的馴化過程，這也是其相對(duì)于CHO細(xì)胞的優(yōu)勢之一。因此，加強(qiáng)對(duì)NS0細(xì)胞的研究，從而實(shí)現(xiàn)用NSO細(xì)胞株大規(guī)模生產(chǎn)藥物產(chǎn)品，將會(huì)對(duì)生物技術(shù)藥物產(chǎn)業(yè)化產(chǎn)生重要意義。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，L一谷氨酰胺是很重要的，脫掉氨基后，可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來源，參與蛋白質(zhì)的合成與核酸代謝。由于NSO細(xì)胞中谷氨酰胺合成酶的活性低，所以需要在培養(yǎng)基中提供外源谷氨酰胺才能生長。但L一谷氨酰胺在溶液中不穩(wěn)定，在高溫下會(huì)分解成吡咯烷酮和羧酸，使得培養(yǎng)基的pH值難以控制，而培養(yǎng)基酸堿度的微小變化都將引起細(xì)胞存活率的下降；另外還有一些毒降解產(chǎn)物如NH"會(huì)不可逆轉(zhuǎn)地?fù)p壞細(xì)胞壁。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種谷氨酰胺合成酶編碼基因的表達(dá)盒。3本發(fā)明所提供的谷氨酰胺合成酶編碼基因的表達(dá)盒，由上游至下游依次為序列表中序列1所示的CMV啟動(dòng)子序列、谷氨酰胺合成酶的編碼基因序列、序列表中序列2所示的SV40增強(qiáng)子序列。上述表達(dá)盒中，所述谷氨酰胺合成酶的編碼基因的核苷酸序列具體可如序列表中序列3所示。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種能在無谷氨酰胺培養(yǎng)基中生長的重組鼠骨髓瘤細(xì)胞。本發(fā)明所提供的重組鼠骨髓瘤細(xì)胞，是將上述任一所述表達(dá)盒導(dǎo)入鼠骨髓瘤細(xì)胞中得到的。所述鼠骨髓瘤細(xì)胞具體可為鼠骨髓瘤細(xì)胞NSO。所述重組鼠骨髓瘤細(xì)胞具體可為鼠骨髓瘤細(xì)胞NSONS0-GS1，其保藏號(hào)為CGMCCNo.2128。該細(xì)胞株已于2007年08月06日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號(hào)為CGMCCNo.2128。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培養(yǎng)上述能在無谷氨酰胺培養(yǎng)基中生長的重組鼠骨髓瘤細(xì)胞的方法。本發(fā)明所提供的培養(yǎng)能在無谷氨酰胺培養(yǎng)基中生長的重組鼠骨髓瘤細(xì)胞的方法，是將所述重組鼠骨髓瘤細(xì)胞接種于含8-10%(體積百分含量)血清、pH值為7.4-7.6的、無谷氨酰胺的RPMI1640培養(yǎng)基，在37士0.5。C條件下培養(yǎng)。能在無谷氨酰胺培養(yǎng)基中生長的重組鼠骨髓瘤細(xì)胞在生產(chǎn)外源蛋白中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的能在無谷氨酰胺培養(yǎng)基中生長的重組鼠骨髓瘤細(xì)胞，在無谷氨酰胺培養(yǎng)基中的培養(yǎng)效率高，細(xì)胞密度可達(dá)106個(gè)/ml,培養(yǎng)得到的NS0細(xì)胞能表達(dá)目的外源蛋白，且表達(dá)能力強(qiáng)，可達(dá)12-18pg/cell/24h。用本發(fā)明的能在無谷氨酰胺培養(yǎng)基中生長的重組鼠骨髓瘤細(xì)胞表達(dá)外源蛋白，既能保證細(xì)胞培養(yǎng)效率和表達(dá)效率，又可減輕谷氨酰胺的分解給細(xì)胞帶來的傷害，進(jìn)而提高生物制品成品率和利潤率。同時(shí)本發(fā)明的細(xì)胞制備方法，又節(jié)省了成本。這種能在無谷氨酰胺培養(yǎng)基中生長的重組鼠骨髓瘤細(xì)胞及其制備方法在生物制藥領(lǐng)域?qū)?huì)有廣闊的應(yīng)用前景。圖1為載體PCI-CSP的圖譜。圖2為載體PCI-GS-CSP的圖譜。圖3為載體PCI-gpt的圖譜。具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明均為常規(guī)方法。4下述實(shí)施例中所用的試劑如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、制備可在無谷氨酰胺培養(yǎng)基中生長的重組鼠骨髓瘤細(xì)胞一、構(gòu)建谷氨酰胺表達(dá)載體PCI-GS-CSP:PCI-CSP質(zhì)粒的構(gòu)建所述PCI-CSP是在pCI-neo(PromegaCat.ttE1841)基礎(chǔ)上構(gòu)建的。具體步驟如下以pCI-neo為模板，PCR擴(kuò)增CMVEnhancer/promoter序列，5，禾n3，端分別帶有BglII和Xbal-Xhol位點(diǎn)(Fl)(引物序列為GGCTCGACAGATCTTCAATATTGGCCATTAGCCATATTATTCA、CTCGAGTCTAGAGATCTGACGGTTCACTAAACGAGCTCT)，擴(kuò)增得到的CMVEnhancer/promot,er序列如序列表中序列1所示；以pCI-neo為模板，PCR擴(kuò)增SV40latepolyA至SV40enhancer/earlypromoter序列，5，和3，端分別帶有Xbal-Xhol和Hindlll-Sail位點(diǎn)(F2)(弓I物序列為CAGATCTCTAGACTCGAGCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGG、GTCGACAAGCTTTTTGCAAAAGCCTAGGCCT)，擴(kuò)增得到的SV40latepolyA至SV40enhancer/earlypromoter序列如序列表中序列2所示；利用以上Fl和F2片段為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將兩個(gè)片段連接成一個(gè)片段(F3)(引物序列為GGCTCGACAGATCTTCAATATTGGCCATTAGCCATATTATTCA、GATATTTTATTGTCGACAAGCTTTTTGCAAAAGCCTAGGCCT)。隨后利用兩條互補(bǔ)弓|物褪火方法合成syntheticpoly(A)序列，5，和3'端分別帶有Hindlll-Sall和BamHI位點(diǎn)(F4);兩條互補(bǔ)引物為混和后，煮沸5分鐘，自然降溫至室溫。以F3和F4片段為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增(引物序列為GGCTCGACAGATCTTCAATATTGGCCATTAGCCATATTATTCA，GGATCCCACACAAAAAACCAACACACAGATG),將兩個(gè)片段連接成一個(gè)片段(F5)。用BglII和BamHI酶切F5片段，連接到BglII和BamHI酶切后的pCI-neo載體上，完成PCI-CSP構(gòu)建。物理圖譜見圖1。從離體的人外周血巾分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增人谷氨酰胺合成酶基因(GS)，擴(kuò)增引物為PCI-glu-U:5AGATCTGCTAGCATGACCACCTCAGCAAGTTCCCA3PCI-glu-L:5TCATGTCTGCTCGAGTCAATTTTTGTACTGGAAGGGCTCAT3將該谷氨酰胺合成酶基因片段以Xbal/Xhol酶切，純化后克隆進(jìn)PCI-CSP質(zhì)粒的Xbal/XhoI酶切位點(diǎn)，得到重組質(zhì)粒表達(dá)載體PCI-GS-CSP。物理圖譜見圖2。重組質(zhì)粒PCI-GS-CSP中含有人谷氨酰胺合成酶基因，其核苷酸序列如序列表中序列3所示。二、電轉(zhuǎn)NS0細(xì)胞大量提取質(zhì)粒，用BglII、HindIII雙酶切重組質(zhì)粒PCI-GS-CSP，然后再用BamHI繼續(xù)酶切，得到3.lkb、2.0kb、0.5kb片段，乙醇沉淀，將3.lkb的含谷氨酰胺合成酶基因的片段電轉(zhuǎn)入鼠骨髓瘤細(xì)胞NSO細(xì)胞(TheEuropeanCollectionofAnimalCellCulture,ECACC)。電轉(zhuǎn)條件為將107個(gè)細(xì)胞置于0.4cm電轉(zhuǎn)杯，3uFD,1500瓦電壓。三、電轉(zhuǎn)后NSO細(xì)胞的培養(yǎng)及保存電轉(zhuǎn)后細(xì)胞重懸于20mlpH7.4、含終濃度10%(體積百分含量)胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基(表l〉，然后將細(xì)胞懸液種入兩塊96孔板，在37。C，培養(yǎng)24小時(shí)后，吸出培養(yǎng)基，加入pH7.4、含終濃度1(F。胎牛血清的無谷氨酰胺RPMI1640培養(yǎng)基，200ul/孔，培養(yǎng)4周后，挑選5株在該無谷氨酰胺培養(yǎng)液中生長快的克隆，移至24孔板，繼續(xù)用該無谷氨酰胺培養(yǎng)液培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)于五個(gè)10cm培養(yǎng)皿，擴(kuò)增達(dá)5xl07個(gè)細(xì)胞時(shí)，將其中的一株(名稱為NS0-GS1)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，其保藏編號(hào)為CGMCCNo.2128，保藏日期是2007年8月6曰。將鼠骨髓瘤細(xì)胞NS0-GS1CGMCCNo.2128置于含終濃度10%胎牛血清無谷氨酰胺RPMI1640培養(yǎng)基(pH為7.4)中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37°C，5%CO"每72小時(shí)傳代培養(yǎng)一次。三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，培養(yǎng)細(xì)胞密度高達(dá)(1±0.2)xl(f個(gè)/ml。表1RPMI1640培養(yǎng)基的組成序號(hào)化合物名稱含量(mg/L)序號(hào)化合物名稱含量(mg/U1L-精氨酸鹽酸鹽240.0021硝酸鈣69.502L-天門冬酰胺-水物56.8022硫酸鎂48,803L-天門冬氨酸20.0023磷酸二氫鈉677.004L-半胱氨酸鹽酸鹽-水物72.9024氯化鉀概005L-谷氨酸20.0025氯化鈉6000.006甘氨酸10.0026葡萄糖2000.。07L-組氨酸鹽酸鹽-水物20.3027谷胱甘肽1.008L-羥脯氨酸20.0028酚紅5.006<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實(shí)施例2、用鼠骨髓瘤細(xì)胞NS0-GS1CGMCCNo.2128表達(dá)人TNF-alpha可溶性受體將編碼人TNF-alpha二型受體胞外段的cDNA序列與編碼人免疫球蛋白IgGlFc段的cDNA序列通過PCR構(gòu)建成重組基因(TNFR-Fc)(序列表中序列4所示)；將TNFR-Fc插入到有選擇性標(biāo)記(鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，gpt)和基因表達(dá)調(diào)控區(qū)(CMV啟動(dòng)子，終止子)的表達(dá)載體pCI-gpt的Xbal和Xhol位點(diǎn)，得到該重組蛋白表達(dá)載體pCI-gpt-TNFR-Fc。用限制性內(nèi)切酶Fspl將pCI-gpt-TNFR-Fc線性化，用電轉(zhuǎn)染的方法將其導(dǎo)入到NSO-GSl(CGMCCNo.2128)細(xì)胞中。用霉酚酸酯(Mycophenolate)在含黃嘌呤(Xanthine)的培養(yǎng)基中篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。將轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞在含終濃度10%(體積百分含量)胎牛血清的、pH值為7.4的無谷氨酰胺RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)三天，用ELISA鑒定TNFR-Fc的分泌，ELISA板上包被goatantihuIgG(H+L)(KPL公司，貨號(hào)01-10-06)，一抗為轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞上清，二抗為HRP-goatanti-HuIgG(r)(KPL公司，貨號(hào)074-1002)。三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明細(xì)胞密度可達(dá)(1±0.2)xl()6個(gè)/m1,目的外源蛋白的表達(dá)量可達(dá)12-18pg/cell/24h。pCI-gpt的構(gòu)建步驟用限制性內(nèi)切酶HindIII和Xhol酶切序列表中序列5所示的gptDNA片段，連接到HindlII和SalI酶切后的pCI-CSP載體上，得到重組載體PCI-gpt。〈110〉中國科學(xué)院生物物理研究所〈120〉重組鼠骨髓瘤細(xì)胞及其應(yīng)用〈160>5<210>1<211〉750<212〉腿<213〉人工序列<220>〈223〉<400>1tcaatattggttggccattgaatatgaccggtcsttsgttgcctggctgaagt33cgccaccacttggcacggtaaatgggcagtacatccaatgggcgtcaatgggagtcgatcgcccgagcagagctccc3ttsgcc3C3tacgttgtccatgttggccstsgcccatccgcccsacgatagggacttgt3C3tcs3gcccgcctggctacgtattagggatagcggtttgttttggcccccgttgacgtttagtgaa七3tt3ttC3t3tCt3t3tC33ttgsttsttatatggagtt3cccccgccctccattgacgtgt3tc3tststtatgccc3tcatcgctatttgactcscggcsaatgggcccgtcagatctggttatatataatatgtacgactagttatccgcgttacasttgscgtc3tcaatgggtggccaagtccggtacatgacctaccatggtggggatttccaacgggactttggtaggcgtggcataaatcaatttatattgt33tsgt33ttaacttacggataatgacgtgagtatttacccccctattgttacgggsctatgcggttttagtctccaccCC3333tgtCtacggtgggaatattggct3gctcstgtcccwttscgggtsaatggcccatgttcccatggtasactgc3cgtc33tgattcctacttgggcagt3C3cccsttgscgtgtaacaactgggtctatat3750601201802403〇0360420480540600660720<210〉2〈211〉1252〈212〉DNA〈213〉人工序列<220〉〈223〉〈■〉2cagacatgatsatgctttatgggsggttttttgtgswttttaasgcsaggatgagtttgtgtgatgctaasttgcattct3333CCtCtg3C333CC3Cttgcttt3ttattttatgttacaaatgtggaactagaatgtgtsaccatttcaggttcagat33gctgcaggggsgstgttaaggstcga60120180240tccgggctggcctgaatggcacgcgcagcgccttcctttcttsgggttccggttcacgta3cgttctttstattcttttgggtattttctaccatggcctctccccagcagcccct33cttggctgactaccsg33gt3gcgtsst3gcgg33tgg3cgctg3ccgct3ctcgccacgttgatttagtgcgtgggccatcatagtggactatttatasggMtttascgcccttscgcsttggaatgtgtcasagcatgcccgcccstcc3tttttttt3tgsggaggctasgaggcccggccctgtagcacttgccagccgccggctttttt3cggc3Cgccctgatagcttgttccaagsttttgccggwbtttsscctgtgcggt3ctgsaagagggtcagttagg3tCtC33tt3tgcsaagcatcgcccctasctttatgcagatttttggaggcaccgatcgcggcgcatt33gccctagcgcccccgtcaagctcgaccccaacggtttttcstttcggccttttcacaccgaacttggttagtgtggaasggtcagcaaccgcatctcaattccgcccagtggccgaggcccctaggctttCCttCCC33CgcgcggcgggccgctcctttctctaaatcggccctttgacC3CtC33CCCattggttaaacgctt3C33tcatscgcggaggt3ccttcttccccsggctaggtgtggaataigtc3gc33tccgcccattgcctcggcctagttgcgcsgtgtggtggttcgctttcttcggggctcccttt3gggtg3tgttggsgtcctatctcggtcttcctgatgctctgcgca_gcg5ggcgga3accccsgcaggagtccccsggccdtsgtcccctccgccccactgagctstttt30036042048054060066072078084090096010201080114012001252<210〉3〈211〉1122〈212〉DNA〈213〉人工序列<220〉〈223〉〈400〉3atgaccacctcctcagggtgcgctgcaagaS3tttcgstgcctgctgccsgttttcaagtatggacatgggggacagatgtattactgtgcgggcctgctcsgtgggaatgcccgtttca3sgccc3ttcstgcgggaggcsccsgtsccsctggsttccgccagcat3Ccgcccctctgctcs3tgai33agaaagtccacccggaccctgctctsgtsctgtttcgggstgagcaaccaggcaccccttgtgtgggagctgtatgctggttcagattggtcttgcatcgctgggaactgagaatggtctacatccgtgc3tgas3cctcgcsttccccgccaactgcgaccggcgatgaCC3Ctt333tggccatgtatggacagtgagtttscsgtctccccttccgtgcctgcagsggcacccctggtggttggcctaccttgtgaatgtgtgtgasgaatggtgcagaagtacatcctstgstcccC33C3tC33Cgactgttggcccccttttcggcccttccsgaaaggcatcaatctggatcgcccaagtgtggagggttccaaaggsccctaaccaatttgatttggcatggtccaacggcttatg.gcaggggcggggactagactttggagggctgccatagaggaggccaaagggsggccgacttttctggtgacagaagtac3aaa3ttagcaggtgtaatggtactggtggaagagttacagtgacatacasgctggtggcacacctgtcccagggccacatcgtggaatgccgaggttgggagatcstgat3gc33cccascttcsgttgagsaacttggacaatgcctggtgtagcagggttacttccctcatccgcatgtccctgagaaggactggcctgagtgggtatctcgtggttatgtgaataaacggat3taccctcatgccagggtccaggcccsttscC3tgcctgcctctctgggtgctttgatcctcaccsaggccccgacgtctacastcgtagctgsagatcgtcacgtgtctt60120180240300360420480540600660720780840900960102010801122〈210〉4〈211〉1488〈212〉DNA<213〉人工序列9〈220〉〈223〉<400〉43tggcgcccgcacgccttgccggctcsgagagcacatacaagctctgaccaggcccggctcgcssgtgcctgcaagccctCCCC3CC3g3acgtccacgttccacacgatttcctgctccccagttggaggaactcctgg3tctcccggsgtcsagttcsgaggagcagttggctgaatgccatcccgggt3tcccsgcgaccscgcctcC3C33CC3CttcgccgtctgccgcccsggtaatactatgaaagtcttctgcccagctctgaggtggsaacggtactgcgcgcccgggcttgtgccccgggtctgtaacgtcccccscccgCCC33C3C3Ccaatgggcccggggsccgtccccctgsggtactggtacgttctccs33gcatgagctgacacatcgccgtccgtgctggaggtggcagcaggccgcgctgggcatttacaccagacagcttaccaagsccgsactgggtttcaagcctgcgctgsgcaagcggcgtggccgscgttctccggtggccatcgsgtstggccgcagccsactC3gcccccc3agtcttcctccacatgcgtgggacggcgtggtaccgtgtgcssgtgcasgcaaagggcagcaagaaccsgggagtgggsgctccgacggcggggaacgtcgsgcctctccgccgtcggacccctscgccccagatgtgcttcggacaccgcccgagtgctactcgggaaccaggsggggt3gaccaggasaacacgacttcctgggaatgccsggggcsgccag33ccc3gctgaagggs3ctcac3C3tttCCCCCC33gtggtcgacggaggtgcstagtcsgcgtccgtctccs3C3ccccgagaacgtcagcctgaagcaatgggctccttcttccttctcatgctctgtctccggtggagctctgcggagcccgggcagcaaatgtgtgtgsctctgagctgtggagaaccgcatgccggctgtgctgs33C3tccatccscggacaagcatggatacscttsccgcactgctccgcactggcgagcccaccgtgtgsgccscgaatgccaagactc3ccgtcctssgccctccccscsggtgt3cctgcctggt3gccgg3g33tct3csgc33ccgtgatgcaggctgcggcggagcscatgcctcgccgggcctgtgsggscctcccgctgtctgcacctgccgcgccgctgagacgtggtgtatttgcsggtgcagtctgcccsgccagtgaagcacctcccttcgctcttcccagcscctcaccctcatgagsccctgsgasagccgcgggcaccaggacagccccc3tccaccctgccccsaaggcttcgctcaccgtgtgagggtctg60120180240300360420480540600660720780840900960102〇10801140120012601320138014401488〈210〉5〈211〉459〈212〉DNA<213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉5atgagcgaaasatacatcgtcacctgggacatgttgcagatccatgcacgtaaactcgca60agccgactgatgccttctgaacaatggaaaggcattattgccgtaagccgtggcggtctg120gtaccgggtgcgttactggcgcgtgaactgggtattcgtcatgtcgataccgtttgtatt180tccagctscgatcacgacaaccagcgcgagcttsaagtgctgaaacgcgcagssggcgst240ggcgaaggcttcatcgttattg3tgacctggtggataccggtggtsctgcggttgcgatt300cgtgaaatgtatccaaaagcgcactttgtcaccatcttcgcaaaaccggctggtcgtccg360ctggttgatgactatgttgttgatatcccgcaagatacctggattgaacagccgtgggst420atgggcgtcgtattcgtcccgccaatctccggtcgctaa459權(quán)利要求1、谷氨酰胺合成酶編碼基因的表達(dá)盒，由上游至下游依次為序列表中序列1所示的CMV啟動(dòng)子序列、谷氨酰胺合成酶的編碼基因序列、序列表中序列2所示的SV40增強(qiáng)子序列。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)盒，其特征在于所述谷氨酰胺合成酶的編碼基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示。3、一種重組鼠骨髓瘤細(xì)胞，是將權(quán)利要求1或2所述的表達(dá)盒導(dǎo)入鼠骨髓瘤細(xì)胞中得到的。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組鼠骨髓瘤細(xì)胞，其特征在于所述鼠骨髓瘤細(xì)胞為鼠骨髓瘤細(xì)胞NSO。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組鼠骨髓瘤細(xì)胞，其特征在于所述重組鼠骨髓瘤細(xì)胞為鼠骨髓瘤細(xì)胞NSONS0-GS1，其保藏號(hào)為CGMCCNo.2128。6、一種培養(yǎng)權(quán)利要求3-5中任一所述重組鼠骨髓瘤細(xì)胞的方法，是將所述重組鼠骨髓瘤細(xì)胞接種于含8-10%(體積百分含量)血清、pH值為7.4-7.6無谷氨酰胺的RPMI1640培養(yǎng)基，在37±0.5。C條件下培養(yǎng)。7、權(quán)利要求3-5中任一所述重組鼠骨髓瘤細(xì)胞在生產(chǎn)外源蛋白中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種重組鼠骨髓瘤細(xì)胞及其應(yīng)用。該重組鼠骨髓瘤細(xì)胞是NSO-GS1，其保藏號(hào)為CGMCCNo.2128。本發(fā)明的能在無谷氨酰胺培養(yǎng)基中生長的鼠骨髓瘤細(xì)胞NSO，在無谷氨酰胺培養(yǎng)基中的培養(yǎng)效率高，細(xì)胞密度可達(dá)10⁶個(gè)/ml，培養(yǎng)得到的NSO細(xì)胞能表達(dá)目的外源蛋白，且表達(dá)能力強(qiáng)，可達(dá)12-18pg/cell/24h。用本發(fā)明的能在無谷氨酰胺培養(yǎng)基中生長的鼠骨髓瘤細(xì)胞NSO表達(dá)外源蛋白，既能保證細(xì)胞培養(yǎng)效率和表達(dá)效率，又可減輕谷氨酰胺的分解給細(xì)胞帶來的傷害，進(jìn)而提高生物制品成品率和利潤率。同時(shí)本發(fā)明的細(xì)胞制備方法，又節(jié)省了成本。這種能在無谷氨酰胺培養(yǎng)基中生長的鼠骨髓瘤細(xì)胞NSO及其制備方法在生物制藥領(lǐng)域?qū)?huì)有廣闊的應(yīng)用前景。文檔編號(hào)C12N15/85GK101613716SQ200910090070公開日2009年12月30日申請(qǐng)日期2009年7月27日優(yōu)先權(quán)日2009年7月27日發(fā)明者捷唐,朱衛(wèi)彬,娜李,賈俊英申請(qǐng)人:中國科學(xué)院生物物理研究所