專利名稱：一種肝素黃桿菌肝素酶Ⅰ的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種肝素酶I的制備方法，尤其涉及一種由氯化鈣全程保護(hù)之下的 SP-Sepharose FF層析分離制備肝素酶I的方法。
背景技術(shù)：
肝素酶是指一類能夠特異性裂解肝素和類肝素主鏈糖苷鍵的酶，最初是從肝素黃 桿菌中發(fā)現(xiàn)并分離出來的，其后，又陸續(xù)在一些微生物和動物組織中發(fā)現(xiàn)存在肝素酶。肝 素酶的應(yīng)用十分廣泛，如清除血液中殘存肝素、防止凝血、生產(chǎn)低分子肝素、研究肝素的結(jié) 構(gòu)。目前有學(xué)術(shù)論文報道的肝素酶大約有10多種，得到較為細(xì)致研究的只有來自肝素黃桿 菌的3種酶，分別是肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III。肝素酶I是一種分子量大約43kd的 單體蛋白質(zhì)，其等電點為9.0，是這3種酶中裂解肝素能力最強的酶，其應(yīng)用和研究也最為 廣泛。肝素酶I的純化工作有許多研究報道，但因肝素酶是一種很容易失活的酶，已報 道的純化工藝中大都存在活性損失很大、收率低等缺點。Yang等人(J Biol Chem, 1985, 260(3) 1849-1857)用羥基磷灰石吸附/洗脫處理、QAE-葡聚糖柱層析、等電聚焦、凝膠過 濾等四步純化，首先制得純肝素酶I，活性收率大約Daniel等人(J Bio Chem, 1992, 267(34) =24347-24355)用羥基磷灰石吸附/洗脫處理、QAE-葡聚糖凝膠層析、羥基磷灰石 HPLC、Mono-SFPLC、GPC-HPLC等五步純化，最終獲得純的肝素酶I，活性回收率10. 8% ；馬小 來等人(食品與藥品，2005，32 (5) 446-450)使用羥基磷灰石吸附/解吸、DEAE-S印harose 柱層析、CM-Cellose柱層析等三步純化法，純化得到肝素酶I，活性收率13. 4% ；Xiaolai Ma 等人(J Chrom B, 2006,843 (2) :209_215)通過硫酸銨沉淀、octyl-s印harose 柱層析、 CM-650柱層析、SP-650柱層析、s印hadex G-100柱層析等五步純化法獲得純化的肝素酶I， 收率達(dá)到17. 8%，為所見的肝素酶I最高純化收率。在前述最高純化收率的工藝(J Chrom B, 2006,843 (2) =209-215)中，首次提 出氯化鈣在酶液中的存在對肝素酶I具有保護(hù)作用，并應(yīng)用于純化步驟中。但仔細(xì)考察 該純化工藝，其實氯化鈣的保護(hù)作用并沒有在所有步驟中得到體現(xiàn)。在硫酸銨沉淀和 octyl-sepharose柱層析兩步需要使用大量硫酸銨，而鈣離子與硫酸根離子結(jié)合形成沉淀 導(dǎo)致系統(tǒng)中鈣離子濃度遠(yuǎn)低于設(shè)計值。這導(dǎo)致肝素酶I不能得到氯化鈣的有效保護(hù)。從報 道的純化表也可以看出，octyl-sepharose柱層析步驟肝素酶的收率嚴(yán)重低于其它步驟。為了提高肝素酶I的純化收率及比活，本發(fā)明建立了一種全新的純化制備工藝， 使肝素酶I在純化過程中始終處于氯化鈣的保護(hù)之下，從而獲得高達(dá)30%的純酶活性收 率，制備的肝素酶I比活高達(dá)223IU/mg，與現(xiàn)有最高技術(shù)相比，比活增加了兩倍多，純化收 率增加將近一倍。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種肝素酶I的制備方法，該方法能夠大大提高肝素酶I的純酶活性收率。本發(fā)明包括下述順序的步驟(1)肝素酶的發(fā)酵制備將肝素黃桿菌從平板或斜面上刮取兩環(huán)菌接到50ml種子培養(yǎng)基中，23°C， 150rpm，培養(yǎng)1天。然后按5%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，23°C，150rpm，培養(yǎng)2-3天。菌液 10000rpm，4°C離心15-30分鐘，收集沉淀，懸浮在100ml、50mMTris_HCl①緩沖液中，冰浴超 聲1小時(150ff,5s,5s)。4°C，lOOOOrpm，離心30min,向其中滴加0. 5g/ml的魚精蛋白8ml, 攪拌，4°C，lOOOOrpm,離心30min，上清即為粗酶液。(2)粗酶的SP柱分離將步驟⑴所得粗酶液上一根用10-50mM的Tris-HCl 平衡過的SP柱，以同樣緩 沖液平衡3個柱體積，然后以緩沖液中氯化鈉線形梯度0-0. 5M洗脫，收集0. 25M-0. 3M氯化 鈉濃度的肝素酶洗脫峰若干管。(3) SP柱精純化將步驟⑵所得肝素酶透析后上一根用10-50mM的Tris_HCl 平衡過的SP柱，以 同樣緩沖液平衡3個柱體積，然后以同樣濃度的Tris-HCl 緩沖液洗脫，收集活性較高的洗 脫峰若干管。(4) SP柱終純化將步驟(3)所得肝素酶透析后上一根用10-25mM的Tris_HCl 平衡過的SP柱，以 同樣緩沖液平衡3個柱體積，然后以緩沖液中含氯化鈉0-0. 5M線形梯度洗脫，收集氯化鈉 濃度為0. 33-0. 44M的肝素酶活性峰的洗脫液若干管，合并、對洗脫液進(jìn)行透析，以截留分 子量10kd的超濾離心管濃縮，冷凍保藏。(5)肝素酶活性測定在5ml石英比色皿中加入在30°C預(yù)熱過的2. 5ml肝素濃度 為 lmg/ml 的 Tris-HCl (50mM，含 CaCl2 10mM, pH7. 0)緩沖液，移取 5-20 u 1 酶液，搖勻后 在232nm測定吸光值，讀取每分鐘的變化量。根據(jù)摩爾消光系數(shù)計算單位時間產(chǎn)生的雙鍵 的摩爾數(shù)，并由此計算酶液的單位活性(IU/ml)。(6)蛋白質(zhì)測定向5ml考馬斯亮藍(lán)溶液中加蛋白0. 1ml，搖勻，測定A595，根據(jù)標(biāo) 準(zhǔn)曲線換算蛋白濃度步驟⑴所述的種子培養(yǎng)基的組成為牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，酵母粉0.5%， NaCl 為 0. 5%, pH7. 0。步驟(1)所述的發(fā)酵培養(yǎng)基組成(g/L)為肝素8，K2HP042. 5，NaH2P042. 5，NH4C1 2. 0，MgCl2 0. 5，組氨酸 0. 5，甲硫氨酸 0. 5，微量元素(NaMo03，CuCl2，F(xiàn)eCl2，CoCl2，MnCl2， CaCl2，lXl(T4M)。步驟(1)、(2)、(3)、(4)所述Tris-HCl ①緩沖液含 lOmM CaCl2、pH6. 5-8. 0，優(yōu)選 pH 范圍為7. 0-7. 5。步驟(3)所述Tris-HCl②緩沖液含氯化鈉5_75mM、含肝素0. 01-0. 5%，氯化鈉含 量的優(yōu)選范圍為25-45mM，肝素含量的優(yōu)選范圍為0. 1-0. 2%，肝素的種類優(yōu)選為高純度肝
o本發(fā)明所述制備方法中，所有純化步驟都保證了保護(hù)劑CaCl2的存在，極大地保持 了肝素酶I的穩(wěn)定。本發(fā)明所制備的肝素酶I比活高達(dá)223IU/mg，每升發(fā)酵液可最終得到30IU的純化肝素酶，純化工藝活性收率達(dá)高到30%，與已有報道的最高值相比，比活增加 了兩倍多，收率增加了將近一倍。本發(fā)明所述制備方法，還具有工藝簡單、產(chǎn)品單次制備量 大、試劑成本低的特點，可用以工業(yè)大規(guī)模制備高純度肝素酶I。
具體實施例方式下面結(jié)合實例對本發(fā)明所述內(nèi)容作進(jìn)一步闡述。實施例一肝素酶的發(fā)酵制備從肝素黃桿菌平板或斜面上刮取兩環(huán)菌接到50ml種子培養(yǎng) 基(牛肉膏 0. 5%，蛋白胨 1%，酵母粉0. 5%，NaCl 0. 5%,pH 7.0)中，23°C，150rpm，培養(yǎng) 1 天。然后按接入1L發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基組成(g/L)肝素8，K2HP04 2. 5,NaH2P04 2.5， NH4C1 2. 0，MgCl2 0. 5，組氨酸 0. 5，甲硫氨酸 0. 5，微量元素(NaMo03，CuCl2，F(xiàn)eCl2，CoCl2， MnCl2, CaCl2，lXl(T4M)。23°C，150rpm，培養(yǎng) 2 天。菌液 lOOOOrpm，4°C 離心 20 分鐘，收集 沉淀，懸浮在100ml、50mM Tris-HCl (pH7. 5，含CaCl2 10mM)緩沖液中，冰浴超聲1小時 (150W, 5s，5s)。4°C，lOOOOrpm,離心 30min，向其中滴加 8ml 魚精蛋白(0. 5g/ml)，攪拌，4°C， lOOOOrpm,離心30min，上清即為粗酶液。將肝素黃桿菌超聲破碎液上一根50mM Tris-HCl (含10mM CaCl2, pH7. 5)平衡 過的SP柱(2. 5 X 30cm)，以同樣緩沖液平衡200ml，然后以同樣緩沖液中氯化鈉線形梯度 o-o. 5M洗脫200ml，收集0. 25M-0. 3M氯化鈉濃度的肝素酶洗脫峰若干管。合并透析后上一 根 50mM Tris-HCl (含 10mM CaCl2，pH7. 5)平衡過的 SP 柱(1. 5X40cm)，以同樣緩沖液平 衡100ml，然后以含氯化鈉45mM、含肝素0. 2%的同樣濃度的Tris-HCl 緩沖液洗脫300ml， 收集活性較高的洗脫峰各管。透析后上一根25mM Tris-HCl (含10mM CaCl2, pH7. 5)平 衡過的SP柱(1. 5 X 40cm)，以同樣緩沖液平衡100ml，然后以同樣緩沖液中含氯化鈉0-0. 5M 線形梯度洗脫100ml，收集氯化鈉濃度為0. 33-0. 44M洗脫液的幾管，合并，對洗脫液進(jìn)行透 析，以截留分子量10kd的超濾離心管濃縮，冷凍保藏。利用上述的肝素酶活性測定方法對所制得的肝素酶I進(jìn)行測定，得到肝素酶I的 活性為220IU/mg，純化活性收率為29. 5%。實施例二重復(fù)實施例一中肝素酶的發(fā)酵制備的步驟。將肝素黃桿菌超聲破碎液上一根10mM Tris-HCl (含10mM CaCl2, pH7. 0)平衡 過的SP柱(2. 5 X 30cm)，以同樣緩沖液平衡200ml，然后以同樣緩沖液中氯化鈉線形梯度 0-0. 5M洗脫200ml，收集0. 25M-0. 3M氯化鈉濃度的肝素酶洗脫峰若干管。合并透析后上一 根 10mM Tris-HCl (含 10mM CaCl2，pH7. 0)平衡過的 SP 柱(1. 5X40cm)，以同樣緩沖液平 衡100ml，然后以含氯化鈉25mM、含肝素0. 1 %的同樣濃度的Tris-HCl 緩沖液洗脫300ml， 收集活性較高的洗脫峰各管。透析后上一根10mM Tris-HCl (含10mM CaCl2, pH7. 0)平 衡過的SP柱(1. 5 X 40cm)，以同樣緩沖液平衡100ml，然后以同樣緩沖液中含氯化鈉0-0. 5M 線形梯度洗脫100ml，收集氯化鈉濃度為0. 33-0. 44M洗脫液的幾管，合并，對洗脫液進(jìn)行透 析，以截留分子量10kd的超濾離心管濃縮，冷凍保藏。利用上述的肝素酶活性測定方法對所制得的肝素酶I進(jìn)行測定，得到肝素酶I的 活性為225IU/mg，純化活性收率為30. 1%。
實施例三重復(fù)實施例一中肝素酶的發(fā)酵制備的步驟。將肝素黃桿菌超聲破碎液上一根30mM Tris-HCl@ (含IOmM CaCl2, pH6. 5)平衡 過的SP柱(2. 5 X 30cm)，以同樣緩沖液平衡200ml，然后以同樣緩沖液中氯化鈉線形梯度 0-0. 5M洗脫200ml，收集0. 25M-0. 3M氯化鈉濃度的肝素酶洗脫峰若干管。合并透析后上一 根30mM Tris-HCl@ (含IOmM CaCl2, pH6. 5)平衡過的SP柱(1. 5 X 40cm)，以同樣緩沖液平衡 IOOml，然后以含氯化鈉35mM、含肝素0. 15 %的同樣濃度的Tris-HCl 緩沖液洗脫300ml，收 集活性較高的洗脫峰各管。透析后上一根20mM Tris-HCl@ (含IOmM CaCl2, pH6. 5)平衡 過的SP柱(1. 5 X 40cm)，以同樣緩沖液平衡100ml，然后以同樣緩沖液中含氯化鈉0-0. 5M 線形梯度洗脫100ml，收集氯化鈉濃度為0. 33-0. 44M洗脫液的幾管，合并，對洗脫液進(jìn)行透 析，以截留分子量IOkd的超濾離心管濃縮，冷凍保藏。利用上述的肝素酶活性測定方法對所制得的肝素酶I進(jìn)行測定，得到肝素酶I的 活性為227IU/mg，純化活性收率為30. 8%。實施例四重復(fù)實施例一中肝素酶的發(fā)酵制備的步驟。將肝素黃桿菌超聲破碎液上一根20mM Tris_HCl@ (含IOmM CaCl2, pH8. 0)平衡 過的SP柱(2. 5 X 30cm)，以同樣緩沖液平衡200ml，然后以同樣緩沖液中氯化鈉線形梯度 0-0. 5M洗脫200ml，收集0. 25M-0. 3M氯化鈉濃度的肝素酶洗脫峰若干管。合并透析后上一 根20mM Tris-HCl@ (含IOmM CaCl2,8. 0)平衡過的SP柱(1. 5X40cm)，以同樣緩沖液平衡 100ml，然后以含氯化鈉30mM、含肝素0. 的同樣濃度的Tris-HCl②緩沖液洗脫300ml，收 集活性較高的洗脫峰各管。透析后上一根15mM Tris-HCl@ (含IOmM CaCl2, pH8. 0)平衡 過的SP柱(1. 5 X 40cm)，以同樣緩沖液平衡100ml，然后以同樣緩沖液中含氯化鈉0-0. 5M 線形梯度洗脫100ml，收集氯化鈉濃度為0. 33-0. 44M洗脫液的幾管，合并，對洗脫液進(jìn)行透 析，以截留分子量IOkd的超濾離心管濃縮，冷凍保藏。利用上述的肝素酶活性測定方法對所制得的肝素酶I進(jìn)行測定，得到肝素酶I的 活性為225IU/mg，純化活性收率為31. 3%。實施例五重復(fù)實施例一中肝素酶的發(fā)酵制備的步驟。將肝素黃桿菌超聲破碎液上一根15mM Tris_HCl@ (含IOmM CaCl2,pH7)平衡過的 SP柱(2. 5 X 30cm)，以同樣緩沖液平衡200ml，然后以同樣緩沖液中氯化鈉線形梯度0-0. 5M 洗脫200ml，收集0. 25M-0. 3M氯化鈉濃度的肝素酶洗脫峰若干管。合并透析后上一根15mM Tris-HCl@ (含 IOmM CaCl2, pH7)平衡過的 SP 柱(1. 5 X 40cm)，以同樣緩沖液平衡 100ml, 然后以含氯化鈉40mM、含肝素0. 的同樣濃度的Tris-HCl@緩沖液洗脫300ml，收集活性 較高的洗脫峰各管。透析后上一根25mM Tris-HCl @ (含IOmM CaCl2, pH7)平衡過的SP柱 (1. 5 X 40cm)，以同樣緩沖液平衡100ml，然后以同樣緩沖液中含氯化鈉0-0. 5M線形梯度洗 脫100ml，收集氯化鈉濃度為0. 33-0. 44M洗脫液的幾管，合并，對洗脫液進(jìn)行透析，以截留 分子量IOkd的超濾離心管濃縮，冷凍保藏。利用上述的肝素酶活性測定方法對所制得的肝素酶I進(jìn)行測定，得到肝素酶I的 活性為226IU/mg，純化活性收率為30. 2%。
實施例六重復(fù)實施例一中肝素酶的發(fā)酵制備的步驟。將肝素黃桿菌超聲破碎液上一根45mM Tris_HCl@ (含IOmM CaCl2, pH7. 8)平衡 過的SP柱(2. 5 X 30cm)，以同樣緩沖液平衡200ml，然后以同樣緩沖液中氯化鈉線形梯度 0-0. 5M洗脫200ml，收集0. 25M-0. 3M氯化鈉濃度的肝素酶洗脫峰若干管。合并透析后上一 根 45mM Tris-HCl@ (含 IOmM CaCl2,pH7. 8)平衡過的 SP 柱(1. 5X40cm)，以同樣緩沖液平 衡100ml，然后以含氯化鈉30mM、含肝素0. 2%的同樣濃度的Tris-HCl 緩沖液洗脫300ml， 收集活性較高的洗脫峰各管。透析后上一根15mM Tris-HCl@ (含IOmM CaCl2, pH7. 8)平 衡過的SP柱(1. 5 X 40cm)，以同樣緩沖液平衡100ml，然后以同樣緩沖液中含氯化鈉0-0. 5M 線形梯度洗脫100ml，收集氯化鈉濃度為0. 33-0. 44M洗脫液的幾管，合并，對洗脫液進(jìn)行透 析，以截留分子量IOkd的超濾離心管濃縮，冷凍保藏。利用上述的肝素酶活性測定方法對所制得的肝素酶I進(jìn)行測定，得到肝素酶I的 活性為224IU/mg，純化活性收率為30. 5%。
權(quán)利要求
一種肝素黃桿菌肝素酶I的制備方法，其特征在于所述方法包括下述順序步驟，a、將肝素黃桿菌接到50ml種子培養(yǎng)基中，23℃，150rpm，培養(yǎng)1天；b、按5％接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，23℃，150rpm，培養(yǎng)2-3天，4℃，10000rpm，離心15-30分鐘，收集沉淀；c、沉淀懸浮在100ml、50mM的含CaCl2的Tris-HCl①緩沖溶液中，冰浴超聲1小時，4℃，10000rpm，離心30min，滴加0.5g/ml的魚精蛋白8ml，攪拌，4℃，10000rpm，離心30min，取上清液；d、上一根用含CaCl2的Tris-HCl①緩沖液平衡過的SP柱，以同樣的緩沖液平衡3個柱體積，以含CaCl2的Tris-HCl①緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-0.5M洗脫，收集洗脫液若干管；f、洗脫液透析后上一根用含CaCl2的Tris-HCl①緩沖液平衡過的SP柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，以同樣濃度的含氯化鈉、肝素Tris-HCl②緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-0.5M洗脫，收集洗脫液若干管；g、洗脫液透析后上一根用含CaCl2的Tris-HCl①緩沖液平衡過的SP柱，以同樣緩沖液平衡3個柱體積，含CaCl2的Tris-HCl①緩沖液中含氯化鈉線形梯度0-0.5M洗脫，收集洗脫液若干管，洗脫液合并、透析，以截留分子量10kd的超濾離心管濃縮，冷凍保藏。
2.如權(quán)利要求1所述的肝素黃桿菌肝素酶I的制備方法，其特征在于步驟a中所述 種子培養(yǎng)基的組成為牛肉膏0. 5%、蛋白胨1%、酵母粉0. 5%,NaCl為0. 5%,pH7. 0。
3.如權(quán)利要求1所述的肝素黃桿菌肝素酶I的制備方法，其特征在于步驟b中所述 發(fā)酵培養(yǎng)基組成為肝素8，K2HP04 2. 5，NaH2P04 2. 5，NH4C1 2. 0，MgCl2 0. 5，組氨酸0. 5，甲硫 氨酸 0. 5，微量元素 NaMo03、CuCl2、FeCl2、CoCl2、MnCl2、CaCl2 共 1 X 1(T4M，單位為 g/L。
4.如權(quán)利要求1所述的肝素黃桿菌肝素酶I的制備方法，其特征在于所述Tris-HCl 緩沖液含 10mM CaCl2、pH6. 5-8. 0。
5.如權(quán)利要求1所述的肝素黃桿菌肝素酶I的制備方法，其特征在于所述Tris-HCl 緩沖液含氯化鈉5-75mM、含肝素0. 01-0. 5%，肝素的種類為高純度肝素。
6.如權(quán)利要求1所述的肝素黃桿菌肝素酶I的制備方法，其特征在于步驟d中所述 收集洗脫液進(jìn)一步為收集0. 25M-0. 3M氯化鈉濃度的肝素酶洗脫峰。
7.如權(quán)利要求1所述的肝素黃桿菌肝素酶I的制備方法，其特征在于步驟d、f中所 述 Tris-HCl ①、Tris-HCl 緩沖液濃度為 10_50mM。
8.如權(quán)利要求1所述的肝素黃桿菌肝素酶I的制備方法，其特征在于步驟中g(shù)所述 Tris-HCl ①、Tris-HCl 緩沖液濃度為 10_25mM。
9.如權(quán)利要求1所述的肝素黃桿菌肝素酶I的制備方法，其特征在于步驟f、g中所 述收集洗脫液進(jìn)一步為收集0. 33M-0. 44M氯化鈉濃度的肝素酶洗脫峰。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種肝素酶I的制備方法，以肝素黃桿菌為原料，將肝素黃桿菌接到種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)、再接到發(fā)酵培養(yǎng)基、離心收集沉淀、沉淀超聲破碎、再離心而得到肝素黃桿菌肝素酶I的粗酶液，通過對粗酶液進(jìn)行三次SP-Sepharose FF層析純化得到高純度的肝素黃桿菌肝素酶I。其中三次SP-Sepharose FF層析純化都由氯化鈣全程保護(hù)，大大增加了純酶活性收率。本發(fā)明具有工藝簡單、容易放大、產(chǎn)品單次制備量大、試劑成本低等特點，制備的肝素酶I比活高達(dá)223IU/mg，純酶活性收率高達(dá)30％，與現(xiàn)有最新方法相比，比活增加了兩倍多，純化收率增加將近一倍。
文檔編號C12R1/20GK101886067SQ200910039360
公開日2010年11月17日 申請日期2009年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月11日
發(fā)明者李坦, 李鋰, 馬小來 申請人:深圳市海普瑞藥業(yè)股份有限公司