專利名稱:殺菌劑百菌清水解脫氯酶基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及殺菌劑百菌清水解脫氯酶基因,屬于應(yīng)用環(huán)境微生物領(lǐng)域,用于農(nóng)作物、 土壤、水體中殺菌劑百菌清殘留的去除,保護(hù)環(huán)境。
二背景技術(shù):
農(nóng)藥的使用雖然提高了農(nóng)業(yè)的生產(chǎn)效率及作物產(chǎn)量,但同時(shí)帶來嚴(yán)重的環(huán)境問題, 造成生態(tài)失衡農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)下降,并直接影響人民的身體健康。百菌清是四氯代苯腈殺菌 劑,在農(nóng)業(yè)和家庭防腐方面使用了 30多年,是美國第二大類殺菌劑,每年使用量在5 千萬頓以上。中國年產(chǎn)百菌清殺菌劑8000頓。百菌清對魚類,鳥類和水生無脊椎動物 高毒,在美國是被人為的潛在致癌物。隨著近些年來環(huán)境保護(hù)的呼聲越來越高,農(nóng)藥使 用帶來的環(huán)境問題日益引起人們的重視。百菌清在土壤中半衰期約6個(gè)月,是中等持久 性污染物。由于百菌清殺菌劑的大量使用,在蔬菜、地下水和土壤中殘留非常廣泛,造 成了嚴(yán)重的環(huán)境污染問題。隨著人類環(huán)保意識的增強(qiáng),百菌清污染的修復(fù)引起了人們的 廣泛關(guān)注。微生物修復(fù)農(nóng)藥污染的方法一種簡單、高效、廉價(jià)和無二次污染的方法,比 化學(xué)方法、物理方法修復(fù)農(nóng)藥污染具有很多優(yōu)勢。微生物在農(nóng)藥殘留的生物學(xué)解決途徑 中有著獨(dú)特的作用。微生物降解修復(fù)農(nóng)藥的本質(zhì)是微生物產(chǎn)生的酶對農(nóng)藥的降解作用, 從微生物中提取的降解酶系來消除農(nóng)藥殘留在國外己有成功的先例,降解酶的來源可以 通過從降解菌中提取,也可以采用基因工程手段構(gòu)建高效表達(dá)菌株來獲得。百菌清降解 基因的獲得在百菌清污染的修復(fù)領(lǐng)域有巨大的應(yīng)用潛力。同時(shí)可通過基因改造擴(kuò)大脫氯 酶的作用底物范圍,廣泛應(yīng)用于環(huán)境中含氯芳香烴類污染物的脫氯降解去毒,保護(hù)環(huán)境。
三、
發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題
本發(fā)明的目的是提供殺菌劑百菌清水解脫氯酶基因,屬于應(yīng)用環(huán)境微生物領(lǐng)域,用 于農(nóng)作物、土壤、水體中百菌清殘留的去除,保護(hù)環(huán)境。
技術(shù)方案
百菌清水解脫氯酶基因,其核苷酸序列為SEQIDNO.l。該基因全長(從起始密碼 子到終止密碼子)為1029 bp, G+C含量為58.60/。,編碼342個(gè)氨基酸,其氨基酸序列 為SEQIDN0.2。
水解脫氯酶基因片段與酶切好的pET-29a(+)進(jìn)行酶連獲得含百菌清水解脫氯酶基 因的PET-29a(+)重組質(zhì)粒。
酶連好的含百菌清水解脫氯酶基因的pET-29a(+)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌 BL21(DE3)獲得重組微生物BL21(DE3)。
上述百菌清水解脫氯酶基因可以在農(nóng)作物、土壤、水體的百菌清殘留去除方面得到 應(yīng)用。其所涉及的百菌清水解脫氯酶可以在農(nóng)作物、土壤、水體的百菌清殘留去除方面
3應(yīng)用。 有益效果
1. 用鳥槍法成功的從假單胞菌CTN-3 (尸w"ifomo"a;y sp. CTN-3,從百菌清污染土壤中 分離篩選獲得的百菌清降解菌株,其16SrDNA序列的genbank登錄號為FJ598329)中
克隆出百菌清水解脫氯酶基因。
2. 該基因全長(從起始密碼子到終止密碼子)為1029 bp, G+C含量為58.6M,編碼 342個(gè)氨基酸。
3. 通過PCR技術(shù)擴(kuò)增末端含Mfel和J^oI酶切位點(diǎn)的完整的百菌清水解脫氯酶基因片 段,將它連接到大腸桿菌高表達(dá)載體pET-29a(+)(購自Novegen公司)的iVAI和J^01 酶切位點(diǎn)上,轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21(DE3)(購自invitrogen公司),進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。
4. 本發(fā)明對百菌清水解脫氯酶基因表達(dá)的產(chǎn)物,做了酶活性測定,能高效的降解百菌 清,對20mg/L的百菌清在36h內(nèi)能完全降解。
5. 利用該基因構(gòu)建的工程菌株能高效表達(dá)百菌清水解脫氯酶(活性水解脫氯酶蛋白的 含量占細(xì)胞總蛋白含量的28%),生產(chǎn)的酶制劑可用于土壤、水體和農(nóng)作物殘留的百菌 清的去除。
四
圖1百菌清水解脫氯酶基因克隆的策略圖
圖2百菌清水解脫氯酶基因在BL21 (pET-29a(+))中高效表達(dá)實(shí)驗(yàn)方案圖
五具體實(shí)施例方式
1.百菌清水解脫氯酶基因的克隆
1.1細(xì)菌基因組總DNA的提取
假單胞菌CTN-3 (尸WMJomowfl;ysp.CTN-3,從百菌清污染土壤中分離篩選獲得的百 菌清降解菌株,其16S rDNA序列的genbank登錄號為FJ598329)大量培養(yǎng)后,采用 CTAB法提取高純度、大片段的假單胞菌CTN-3的基因組總DNA,溶于TE (pH8.0)中, 置于-2(TC保藏,具體方法參考F,奧斯伯等編的《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》。
L2pUC118(BflmHI)購買于寶生物工程(大連)有限公司。
1.3總DNA的酶切
假單胞菌尸WMcfo附omw sp. CTN-3總DNA采用Sa"3AI部分酶切。
1.4 DNA的回收
酶切后的總DNA通過電泳(TAE緩沖液)進(jìn)行純化,采用axygen biosciences(China) 回收試劑盒進(jìn)行回收,回收的DNA溶于10 mmol/L的Tris,Cl (pH8.0)中,置于-2(TC保藏。 1.5酶連
建立如下反應(yīng)體系
pUC118(5a附HI) 0.1嗎總DNA片段 0.1 pg
10x連接酶緩沖液 1 pi
T4DNA連接酶 0.5 pl
加雙蒸水至 10 pi 16'C溫育12小時(shí)。
1.6制備大腸桿菌DH5a高效感受態(tài)細(xì)胞
具體方法參照F.奧斯伯等編的《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》P22-23。 1.7轉(zhuǎn)化
取10 pl酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)化200 pl感受態(tài)細(xì)胞,具體方法參照F.奧斯伯等編的《精編分 子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》P23。涂布含有100mg/kg的百菌清農(nóng)藥(丙酮溶解成的5,000mg/L 的母液),100mg/kg氨芐青霉素的LB平板,培養(yǎng)24h候挑取有透明水解圈的菌落, 即是含百菌清水解脫氯酶基因的陽性克隆。 1.8基因核苷酸序列測定
上海英駿生物技術(shù)有限公司有限公司進(jìn)行序列測定,百菌清水解脫氯酶基因的核苷 酸序列為SEQIDNO.l,根據(jù)百菌清水解脫氯酶基因核苷酸序列所推到的342個(gè)氨基酸 序列為SEQIDN0.2。
2.百菌清水解脫氯酶基因在BL21(pET-29a(+))中的高效表達(dá) 2.1百菌清水解脫氯酶基因的PCR擴(kuò)增
以正向引物5,-GACATATGCCGCCTGGATGTTCCGG-3,和反向引物 5'-ATCTCGAGAGGCCTGGCTGCGAGAT -3,為引物,用PCR從假單胞菌iVwcfowoww sp. CTN-3中擴(kuò)增出百菌清水解脫氯酶基因片段。
擴(kuò)增體系
尸n'膨r加r酶(5U/ja1) 0.5 (xl
5 x PCR Buffer II (Mg2+Plus) 10 ^
dNTP Mixture(各2.5mM) 5 pl
模板DNA 10ng
引物1 (20pM) 1^1
引物2 (20pM) 1^1 滅菌蒸餾水 至 50nl PCR擴(kuò)增程序 a.95°C變性3min
b. 95。C變性1.5min, 53。C退火0.5 min, 72。C延伸1.5 min,進(jìn)行25個(gè)循環(huán)
c. 72。C延伸10min,冷卻到室溫。 2.2 PCR產(chǎn)物用MM和^ol雙酶切。
酶切體系
5廳I 1 pi
勘I 1 pi
DNA 51嗎
滅菌的蒸熘水加至 20^1 在37。C水浴中,反應(yīng)3h以上。 酶切產(chǎn)物進(jìn)行2%的瓊脂糖凝膠電泳切膠回收。 2.3 pET-29a(+)用M/d和屈ol雙酶切(參考2.2)。 2.4轉(zhuǎn)化和表達(dá)
2.2中的回收片段和2.3中酶切好的pET-29a(+)進(jìn)行酶連(參考1.5)。酶連好的含百 菌清水解脫氯酶基因的pET-29a(+)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌BL21(DE3)獲得重組微 生物BL21(DE3)。涂布含有100mg/kg百菌清、50 mg/kg卡那霉素和24 mg/kg IPTG的 平板,挑取有透明水解圈的陽性轉(zhuǎn)化子。 2.5驗(yàn)證陽性轉(zhuǎn)化子表達(dá)的酶對百菌清的降解功能
陽性轉(zhuǎn)化子在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD,0.6-0.8之間,加IPTG至濃度1 mM, 30°C 培養(yǎng)6h。在100 ml基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基(1.5 g K2HP04, 0.5 g KH2P04, 0.2 g MgS04.7H20, 1.0 g NaCl, 1.0 g(NH4)2SO4,1.0g每L)中加入20mg/L百菌清,1%接種量接入陽性轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)液,30°C 振蕩培養(yǎng)36h。
用6ml二氯甲烷分兩次全量提取4ml的培養(yǎng)液,用氣相色譜檢測降解效果,檢測 條件如下ECD檢測器,OV-225 (30mx250pmx0.25^im);進(jìn)樣口溫度,210° C;柱溫, 190°C; 檢測器溫度,250° C;氣體流速,N2 40mL/min。對20 mg/L百菌清能完全降 解。序列表
南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
殺菌劑百菌清水解脫氯酶基因 說明書 4
Patentln version 3.1 1
1029 DNA
Pseudomonas sp. CTN-3
百菌清水解脫氯酶基因 (l)..(腳)
<120> <130> <160> <170> <210> <211> <212> <213> <220> <221> <222> <223>
<400> 1
atgccgcctg gatgttccgg gctttgtagc tttgtaggat tgacgatgcc actcaagttt 60
tcgggcgtgc tctgcgccag cctcctgacc atcacccttt cggtagccgc gcatgcaacc 120
gaactcatct tggacttcaa caaggtgcag atgcgcagcc aacaactcgc acctggggtg 180
tacgcgcatc taccggcaga ctccgccgag ctgaatgcaa aaggcggtgt agcaggcacc 240
agcggtggct tgatcgtcgg gacacgtggc gcgatgctga tcgagaccat gcteaaccgt 300
cgccttttcg atcaggtcca agcactcgcc aaaaaggagg cattggggct gccgctgctg 360
tacgcagtca acaccagtta tcatggcgat cactcgtatg ggaacatgta cctgaaggcg 420
ccgacgcgtg tcatecaaag caccaaaacg cgtgattatg tcgatggtca cctcgccgac 480
gacaaggcat tcatggtgaa gaatttcggt gccgggcgcg gtgttgagca gatcacggca 540
aggacgggcg acatcctcgt gcctccggga ggtcgcgtga gcgtcgacct tggcggcaag 600
actgttgaga tcatcgactt cgggttcgca cagaccggcg gggacctgtt cgtctgggag 660
ccgcaatcea aagttatgtg gacaggcaac gcagtggtcg ccagcaagcc agctctacct 720
tggctgctcg atggcaagct ggtagagacg ttggcgacgc tacagaaagt ctacgatttt 780
ctaccgcctg atgccaccat cgtccctgga catggtgtac ccatggcccg cgaaggcctg 840
cgctggcatc tggactacct cgcagecgtg caagcaggcg tcaaggatgc tttggctcgc 900
aaactgagcc tcgaacagac agtgaccgaa ctcaagatgc cggagttccg cggctacgta 960
ctgttcgact gggttcatcc agatctcaac gtccccgctg cttacaagga tctegcagcc 1020
aggccttga 1029
<210> 2
<211> 342
<212> PRT
<213> Pseudomonas sp. CTN-3 <220>
<221>推測的百菌清水解脫氯酶的氨基酸序列
<222> (1)..(342)
<223>nsi J3S nsi sXi 3jy biv ns"[可v ds v s^i !b八v ul£) 1ba bjv
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雖〃9憲法能改
6 y69ss00i600s290 295 300
Glu Gin Thr Val Thr Glu Leu Lys Met Pro Glu Phe Arg Gly Tyr Val 305 310 315 320
Leu Phe Asp Trp Val His Pro Asp Leu Asn Val Pro Ala Ala Tyr Lys
325 330 335
Asp Leu Ala Ala Arg Pro 340
<210> 3 <211> 25 <212> DNA <213>人工合成 <220>
<221>百菌清水解脫氯酶基因的PCR擴(kuò)增正向引物 <222> (1)..(25) <223>
<400> 3
gacatatgcc gcctggatgt tccgg
<210> 4
<211> 25
<212> DNA <213>人工合成 <220>
<221>百菌清水解脫氯酶基因的PCR擴(kuò)增反向引物
<222> (1)..(25) <223>
<400> 4
atctcgagag gcctggctgc gagat
25
25
9
權(quán)利要求
1.百菌清水解脫氯酶基因,其核苷酸序列為SEQ ID NO.1。
2. 權(quán)利要求1所述的百菌清水解脫氯酶基因核苷酸序列所推導(dǎo)的百菌清水解脫氯酶蛋 白質(zhì),其氨基酸序列為SEQIDN0.2。
3. 含權(quán)利要求1所述百菌清水解脫氯酶基因的pET-29a(+)重組質(zhì)粒。
4. 含權(quán)利要求3所述的重組質(zhì)粒的重組微生物BL21(DE3)。
5. 權(quán)利要求1所述百菌清水解脫氯酶基因在土壤、水體和農(nóng)作物的百菌清殘留去除方 面的基因工程應(yīng)用。
6. 權(quán)利要求2所述百菌清水解脫氯酶蛋白質(zhì)在農(nóng)作物、土壤、水體的百菌清殘留去除 方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種殺菌劑百菌清水解脫氯酶基因,屬于應(yīng)用環(huán)境微生物領(lǐng)域。本發(fā)明提供了殺菌劑百菌清水解脫氯酶基因及其所推導(dǎo)的水解脫氯酶蛋白質(zhì)。該基因全長為1029bp,G+C含量為58.6%,編碼342個(gè)氨基酸,為新的脫氯酶基因資源。利用該基因構(gòu)建的工程菌株能高效表達(dá)百菌清水解脫氯酶,能在36h內(nèi)將20mg/L的百菌清完全降解,生產(chǎn)的酶制劑可用于土壤、水體和農(nóng)作物上的百菌清殘留的去除。
文檔編號C12N15/54GK101649324SQ20091003369
公開日2010年2月17日 申請日期2009年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月25日
發(fā)明者榮 李, 李順鵬, 斌 梁, 王光利, 蔣建東 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)