專利名稱：可二次驗證堿基信息的dna測序方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明可二次驗證堿基信息的DNA測序方法涉及的是一種能夠原位清除延伸標(biāo)記物，能夠二次驗證同一個堿基位置的信息，同時保護(hù)引物延伸末端完整，通過逐步合成鑒定未知堿基DNA測序方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
被稱為第三大科學(xué)計劃的人類基因組計劃于20世紀(jì)80年代啟動，這個由多個國家參加的計劃的完成對人類認(rèn)識自身，提高健康水平，推動生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)、生物技術(shù)、制藥業(yè)、農(nóng)業(yè)等的發(fā)展具有極其重要的意義。2000年6月26日，人類基因組工作草圖由美國、英國、法國、德國、日本和中國科學(xué)家宣布基本完成，2002年2月又公布了“精細(xì)圖”。人類基因組計劃的實施期間，科學(xué)家還完成了大鼠、小鼠、水稻等物種的測序。眾多物種的基因組序列和大量的基因被識別，后基因組時代便是要對這些基因的結(jié)構(gòu)、功能、表達(dá)和分布進(jìn)行深入的研究，因此，急需高通量、大規(guī)模的分析手段和方法來解決這些需求。20世紀(jì)90年代建立起來的基因芯片技術(shù)和最近發(fā)展起來的第二代DNA測序技術(shù)是高通量研究基因的結(jié)構(gòu)和功能的兩種比較重要的技術(shù)，推動了功能基因組和系統(tǒng)生物學(xué)研究的發(fā)展。
目前用于最為廣泛應(yīng)用的測序技術(shù)是Sanger等(1977)發(fā)明的雙脫氧鏈末端終止法，Sanger法測序的原理就是利用一種DNA聚合酶來延伸結(jié)合在待定序列模板上的引物。直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測定由一套四個單獨的反應(yīng)構(gòu)成，每個反應(yīng)含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團(tuán)，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止。終止點由反應(yīng)中相應(yīng)的雙脫氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對濃度可以調(diào)整，使反應(yīng)得到一組長幾百至幾千堿基的鏈終止產(chǎn)物。它們具有共同的起始點，但終止在不同的的核苷酸上，可通過高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理后可用X-光膠片放射自顯影或非同位素標(biāo)記進(jìn)行檢測。最近幾年發(fā)展起來的高通量測序技術(shù)結(jié)合基因芯片技術(shù)，可以一次性對幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定，被科學(xué)家稱為下一代測序技術(shù)(next generation sequencing)，同時高通量測序技術(shù)使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全面的相關(guān)性分析成為可能，所以又被稱為深度測序(deep sequencing)。目前，高通量測序平臺的代表是羅氏公司(Roche)的454測序儀(Roch GS FLX sequencer)，Illumina公司的Solexa基因組分析儀(Illumina Genome Analyzer)和ABI的SOLiD測序儀(ABISOLiD sequencer)。Sanger測序法，454焦磷酸測序法和Solexa測序法其技術(shù)本質(zhì)都是合成測序，合成測序方法通過把大量被測的模板DNA片段進(jìn)行固定，并在固定化的DNA測序模板上雜交結(jié)合通用的DNA引物，分別控制4種堿基在DNA引物上的延伸。通過檢測延伸反應(yīng)過程或所延伸的堿基，實現(xiàn)高通量并行的DNA序列信息的檢測。在合成測序策略中，測序引物首先和待測序的DNA模板結(jié)合，然后依次加入4種脫氧核苷酸，引物以被測DNA片段為模板，在DNA聚合酶的催化下逐步延伸。此過程中，有多種方法可以用來確定引物是否發(fā)生延伸反應(yīng)，并根據(jù)所加入的相應(yīng)的脫氧核苷酸種類，確定DNA模板上的堿基信息。通過4種脫氧核苷酸循環(huán)加入，或者按照指定的順序加入，最終獲取所需要的核酸閱讀長度。Solid測序技術(shù)較為特別，它使用的連接測序法，用已知的寡聚核苷酸片段代替核苷酸，用DNA連接酶代替DNA聚合酶。Sanger法的優(yōu)勢在于可以分析未知的DNA序列，而且單向反應(yīng)的讀序能力較長，目前的技術(shù)可以達(dá)到1000bp以上，然后，在實際工作中，很多情況需要對已知序列的DNA片段進(jìn)行序列驗證或是對為數(shù)不多的位點進(jìn)行分析驗證，在這種情況下，較短序列的高通量測序方法更為適用。測序技術(shù)可以在多個領(lǐng)域進(jìn)行應(yīng)用，在分子診斷學(xué)方面，可以用于病原微生物的快速鑒定，遺傳病分子診斷(如SNPs，SNP等位頻率)，在法醫(yī)鑒定方面，如對線粒體D-Loop區(qū)的HVI和HVII高可變區(qū)進(jìn)行分析，在藥物基因組學(xué)方面，如瑞典Eurona Medical AB與Pyrosequencing公司合作對血管緊張轉(zhuǎn)換酶(ACE)的SNP進(jìn)行分析以及在農(nóng)業(yè)生物方面都有諸多應(yīng)用?？梢姕y序技術(shù)已經(jīng)越來越受到關(guān)注，無不預(yù)示著測序技術(shù)在不久的將來，不僅僅是只作為一種科學(xué)研究的工具，而且將向一個產(chǎn)業(yè)發(fā)展，將更好的為人類健康服務(wù)，更貼近人類的生活。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對上述不足之處提供一種可二次驗證堿基信息的DNA測序方法，該方法不僅實現(xiàn)了原位清除延伸標(biāo)記物的目的，而且還能夠二次驗證同一堿基位置的信息，降低測序中可能出現(xiàn)的錯誤率，并在硫代修飾保護(hù)堿基的基礎(chǔ)上測定下一個堿基信息，錯誤延伸的累積效應(yīng)不嚴(yán)重，序列的測定準(zhǔn)確，所進(jìn)行的步驟按照傳統(tǒng)的分子生物學(xué)方法進(jìn)行，能夠維持DNA模板和測序引物的量以保證足夠的延伸信號，沒有標(biāo)記物量的累積效應(yīng)，保證結(jié)果的易讀性和可靠性，不存在測序長度的限制。
可二次驗證堿基信息的DNA測序方法是采取以下技術(shù)方案實現(xiàn) 可二次驗證堿基信息的DNA測序方法，其特征在于DNA序列上一個堿基的信息的確定是通過兩次延伸測序步驟來實現(xiàn)的，該DNA測序過程如下 步驟1)3′端堿基硫代修飾的測序引物與被固定的待測DNA序列進(jìn)行雜交； 步驟2)加入第一次延伸反應(yīng)溶液，溶液成份包括1～10U/μL DNA聚合酶、四種用熒光標(biāo)記的核苷酸單體A、T、C、G和四種正常的核苷酸單體A、T、C、G，用熒光標(biāo)記的核苷酸單體和同種類正常核苷酸單體之間的分子數(shù)比例為1∶50～100，通過在上述測序引物上延伸四種核苷酸單體A、T、C、G中的一種、并通過熒光檢測到第一次延伸的堿基信息； 步驟3)將步驟2)中延伸上的用熒光標(biāo)記核苷酸單體通過生物酶切割方法進(jìn)行清除； 步驟4)加入第二次延伸反應(yīng)溶液，溶液成份包括1～10U/μL DNA聚合酶、四種用熒光標(biāo)記的可脫保護(hù)的硫代核苷酸單體A、T、C、G和四種未標(biāo)記熒光的可脫保護(hù)的硫代核苷酸單體A、T、C、G，用熒光標(biāo)記的可脫保護(hù)的硫代核苷酸單體和同種類未標(biāo)記熒光的可脫保護(hù)的硫代核苷酸單體之間的分子數(shù)比例為1∶50～100，通過在測序引物上延伸可脫保護(hù)的硫代核苷酸單體A、T、C、G中的一種，并通過熒光檢測到第二次延伸的同一位置的堿基信息； 步驟5)用化學(xué)試劑去除上述步驟4)中延伸上的用熒光標(biāo)記的可脫保護(hù)的硫代核苷酸單體上的可脫保護(hù)基團(tuán)，同時去除該硫代核苷酸單體上的熒光基團(tuán)； 循環(huán)上述步驟2)、3)、4)和5)所進(jìn)行的過程，直到確定待測DNA中的堿基序列信息。
在執(zhí)行上述的步驟4)之前，步驟2)和步驟3)被同時執(zhí)行1到10次。
所述的可二次驗證堿基信息是指待測DNA模板上某一個具體位置的堿基信息采用兩次檢測的方式獲得，第一次檢測得到該位置的堿基信息，第二次檢測則是進(jìn)一步驗證該堿基信息。
所述的固定的待測DNA模板是指待測定序列的DNA片段。
所述的步驟(2)中用熒光標(biāo)記的核苷酸單體上修飾有以下熒光化學(xué)基團(tuán)中的一種DAPI、Cy2、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、FITC、Alexa 488、Alexa 568、JOE、ROX、Rhodamine6G、Tetramethylrhodamine、Lissamine、Texas Red、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665；所述的核苷酸單體是脫氧核糖核苷酸、雙脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。
所述的步驟(4)中所用的熒光標(biāo)記的可脫保護(hù)的硫代核苷酸單體上修飾有以下熒光化學(xué)基團(tuán)中的一種DAPI、Cy2、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、FITC、Alexa 488、Alexa 568、JOE、ROX、Rhodamine 6G、Tetramethylrhodamine、Lissamine、Texas Red、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665； 所述的硫代核苷酸單體特征在于結(jié)構(gòu)為

其中，Y為嘌呤堿基基團(tuán)或者嘧啶堿基基團(tuán)，核糖或脫氧核糖基團(tuán)2′和3′位置上連接著R1和R2基團(tuán)，在一定條件下，R1或R2基團(tuán)可以被分解，形成羥基，R1基團(tuán)選自但不限于下列化學(xué)基團(tuán)之一



R2選自但不限于H、OH、羰基，以及與R1相同的基團(tuán)；R4，R5和R6分別是R4選用氫原子或烴基；R5選用氫原子或烴基；R6選用烴基、環(huán)烴基、鏈烯基、環(huán)烯基或芐基。
所述的用熒光標(biāo)記核苷酸單體或用熒光標(biāo)記的可脫保護(hù)的硫代核苷酸單體是單色的，即四種核苷酸單體均修飾著同一種類的熒光基團(tuán)；或者是不同種類的熒光，即四種核苷酸單體標(biāo)記不相同或者不完全相同的熒光基團(tuán)。
所述的待測DNA序列中的堿基信息是通過檢測是否有熒光標(biāo)記和熒光標(biāo)記的強度以及堿基互補原理來確定模板的序列信息，相同重復(fù)堿基的確定通過信號的線性遞增關(guān)系進(jìn)行確定。
所述步驟3)中的生物酶選用Lamda核酸外切酶、T7核酸外切酶、核酸外切酶I、核酸外切酶III、核酸外切酶T中的一種。
所述步驟5)中的化學(xué)試劑至少選用高碘酸鹽溶液、氨水、氫氧化鈉溶液、雙氧水、碘化鉀溶液、硫酸銅溶液、DABCYL溶液中的一種。
有益效果本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點 1、本發(fā)明的最大優(yōu)點是能夠極大程度地降低測序過程中的錯誤率。在DNA擴(kuò)增中通常所用的Taq DNA聚合酶擴(kuò)增堿基出錯率為10-5左右，Pfu DNA聚合酶的堿基出錯率為10-6，在合成測序中，假如所使用的DNA聚合酶的堿基出錯率為10-6，那么在測序過程中，某一個堿基的出錯率為1/106，再次測定這個堿基時，其出錯率為1/1012，結(jié)果的準(zhǔn)確率提高了6個數(shù)量級。
2、本發(fā)明可以降低DNA模板的需要量。目前的高通量測序方法通常在乳液單克隆擴(kuò)增之前都需要進(jìn)行DNA模板的PCR擴(kuò)增，以保證相同序列區(qū)域能夠有多個相同的克隆，隨著堿基識別準(zhǔn)確率的提高，我們可以減少克隆的需要量，甚至于不需要進(jìn)行乳液擴(kuò)增之前的PCR擴(kuò)增過程。
3、本發(fā)明與其他測序技術(shù)的一個明顯區(qū)別在于，本發(fā)明對同一個位置的堿基驗證不止可以進(jìn)行一次，圖1所示為本測序方法的示意圖，在未加入硫代修飾的核苷酸之前(步驟.4)，步驟.2和步驟.3可以進(jìn)行多次，正如有益效果第1條所述的那樣，這兩個步驟進(jìn)行次數(shù)越多，這個位置堿基出錯的可能性就越小，堿基出錯的可能性越小，意味著序列出錯的可能性越小，也就越有利于后續(xù)的生物學(xué)分析。如此方便的能對堿基進(jìn)行重復(fù)驗證的測序方法是當(dāng)前測序技術(shù)不曾擁有的。



以下將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
圖1是本發(fā)明可二次驗證堿基信息的DNA測序方法的示意圖。圖中有不同未知序列的DNA模板①，通用測序引物②，未經(jīng)修飾的核苷鍵③，硫代修飾的核苷鍵④，標(biāo)記基團(tuán)⑤，可切除的化學(xué)鍵⑥，可脫保護(hù)的基團(tuán)⑦和羥基⑧。
步驟.1將DNA測序模板固定在固相載體上，相同的序列形成一個簇，不同簇之間的DNA序列完全不同或不完全相同；雜交上3′端硫代修飾(④)的測序引物(②)； 步驟.2加入四種不同熒光標(biāo)記的雙脫氧核糖核苷酸(⑤)和DNA聚合酶，此時延伸步驟形成的是正常的核苷鍵(③)，由于雙脫氧核糖核苷酸沒有游離的羥基，因此，不能繼續(xù)延伸下一個堿基，經(jīng)過熒光掃描和數(shù)據(jù)分析，第一次得到這個位置的堿基信息，由圖中示意，從左到右，分別是T、G、C、A，由堿基互補配對原則，可知DNA模板上的堿基分別為A、C、G、T； 步驟.3加入外切酶，由于步驟.2中形成的正常核苷鍵可以被外切酶切割，因此，我們可以去除步驟.2中延伸上的熒光標(biāo)記的雙脫氧核糖核苷酸； 步驟.4加入四種熒光標(biāo)記的可脫保護(hù)的硫代核苷酸，這種硫代核苷酸上修飾有兩種基團(tuán)，一種是活化的保護(hù)基團(tuán)(⑦)，另一種是帶有可切割價鍵(⑥)的熒光基團(tuán)，熒光所對應(yīng)的核苷酸種類與步驟.2中的保持一致，當(dāng)這四種熒光標(biāo)記的可脫保護(hù)的硫代核苷酸被延伸上之后，通過熒光掃描數(shù)據(jù)分析，我們再次得到了這個堿基位置的信息，起到驗證和糾錯作用； 步驟.5加入化學(xué)剪切和活化試劑，將熒光基團(tuán)切割去除，并活化保護(hù)基團(tuán)(⑦)形成羥基(⑧)，使之能夠進(jìn)行再一次的延伸反應(yīng)； 步驟.6重復(fù)步驟.2的操作，但是會得到下一個堿基的信息，如圖中所示，由左到右，熒光信息依次代表為G、C、A、T，對應(yīng)的DNA模板堿基為C、G、T、A；
具體實施例方式 實施例1.可二次驗證堿基信息的DNA測序方法 可二次驗證堿基信息的DNA測序方法是通過兩次延伸測序步驟來實現(xiàn)的對DNA序列上一個堿基信息的確定，該DNA測序過程如下 步驟1)3′端堿基硫代修飾的測序引物與被固定的待測DNA序列進(jìn)行雜交； 步驟2)加入第一次延伸反應(yīng)溶液，溶液成份包括1～10U/μL DNA聚合酶、四種用熒光標(biāo)記的核苷酸單體A、T、C、G和四種正常的核苷酸單體A、T、C、G，用熒光標(biāo)記的核苷酸單體和同種類正常核苷酸單體之間的分子數(shù)比例為1∶50～100，通過在上述測序引物上延伸四種核苷酸單體A、T、C、G中的一種、并通過熒光檢測到第一次延伸的堿基信息； 步驟3)將步驟2)中延伸上的用熒光標(biāo)記核苷酸單體通過生物酶切割方法進(jìn)行清除； 步驟4)加入第二次延伸反應(yīng)溶液，溶液成份包括1～10U/μL DNA聚合酶、四種用熒光標(biāo)記的可脫保護(hù)的硫代核苷酸單體A、T、C、G和四種未標(biāo)記熒光的可脫保護(hù)的硫代核苷酸單體A、T、C、G，用熒光標(biāo)記的可脫保護(hù)的硫代核苷酸單體和同種類未標(biāo)記熒光的可脫保護(hù)的硫代核苷酸單體之間的分子數(shù)比例為1∶50～100，通過在測序引物上延伸可脫保護(hù)的硫代核苷酸單體A、T、C、G中的一種，并通過熒光檢測到第二次延伸的同一位置的堿基信息； 步驟5)用化學(xué)試劑去除上述步驟4)中延伸上的用熒光標(biāo)記的可脫保護(hù)的硫代核苷酸單體上的可脫保護(hù)基團(tuán)，同時去除該硫代核苷酸單體上的熒光基團(tuán)； 步驟6)循環(huán)上述步驟2)、3)、4)和5)所進(jìn)行的過程，直到確定待測DNA中的堿基序列信息。
在執(zhí)行上述的步驟4)之前，步驟2)和步驟3)可以被同時執(zhí)行1到10次。
所述的可二次驗證堿基信息是指待測DNA模板上某一個具體位置的堿基信息采用兩次檢測的方式獲得，第一次檢測得到該位置的堿基信息，第二次檢測則是進(jìn)一步驗證該堿基信息。
所述的固定的待測DNA模板是指待測定序列的DNA片段。
所述的步驟(2)中用熒光標(biāo)記的核苷酸單體上修飾有以下熒光化學(xué)基團(tuán)中的一種DAPI、Cy2、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、FITC、Alexa 488、Alexa 568、JOE、ROX、Rhodamine6G、Tetramethylrhodamine、Lissamine、Texas Red、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665；所述的核苷酸單體是脫氧核糖核苷酸、雙脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。
所述的步驟(4)中所用的熒光標(biāo)記的可脫保護(hù)的硫代核苷酸單體上修飾有以下熒光化學(xué)基團(tuán)中的一種DAPI、Cy2、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、FITC、Alexa 488、Alexa 568、JOE、ROX、Rhodamine 6G、Tetramethylrhodamine、Lissamine、Texas Red、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665；所述的硫代核苷酸單體特征在于結(jié)構(gòu)為

其中，Y為嘌呤堿基基團(tuán)或者嘧啶堿基基團(tuán)，核糖或脫氧核糖基團(tuán)2′和3′位置上連接著R1和R2基團(tuán)，在一定條件下，R1或R2基團(tuán)可以被分解，形成羥基，R1基團(tuán)選自但不限于下列化學(xué)基團(tuán)之一



R2選自但不限于H、OH、羰基，以及與R1相同的基團(tuán)；R4，R5和R6分別是R4選用氫原子或烴基；R5選用氫原子或烴基；R6選用烴基、環(huán)烴基、鏈烯基、環(huán)烯基或芐基。
所述的用熒光標(biāo)記核苷酸單體或用熒光標(biāo)記的可脫保護(hù)的硫代核苷酸單體是單色的，即四種核苷酸單體均修飾著同一種類的熒光基團(tuán)；或者是不同種類的熒光，即四種核苷酸單體標(biāo)記不相同或者不完全相同的熒光基團(tuán)。
所述的待測DNA序列中的堿基信息是通過檢測是否有熒光標(biāo)記和熒光標(biāo)記的強度以及堿基互補原理來確定模板的序列信息，相同重復(fù)堿基的確定通過信號的線性遞增關(guān)系進(jìn)行確定。
所述步驟3)中的生物酶選用Lamda核酸外切酶、T7核酸外切酶、核酸外切酶I、核酸外切酶III、核酸外切酶T中的一種。
所述步驟5)中的化學(xué)試劑選用高碘酸鹽溶液、氨水、氫氧化鈉溶液、雙氧水、碘化鉀溶液、硫酸銅溶液、DABCYL溶液中的一種或幾種。
實施例2具體的可二次驗證堿基信息的DNA測序方法實施方案 第一步將2μg人類基因組DNA用超聲波打斷，通過割膠純化的方法割取25bp～50bp的基因組片段范圍。取100ng已純化的DNA片段與100nM的公共連接引物，在T4連接酶的作用下進(jìn)行連接。連接好后的基因片段用公共引物進(jìn)行10個循環(huán)的PCR預(yù)擴(kuò)增，用純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物，并進(jìn)行濃度測定。
第二步將預(yù)擴(kuò)增后基因組DNA片段稀釋到1fM，與事先固定在醛基片上的配對引物雜交，然后在片進(jìn)行PCR擴(kuò)增，形成用于測序的微陣列芯片。
第三步將擴(kuò)增好后的基片用0.3M的氫氧化鈉溶液洗滌，使得基片上的PCR產(chǎn)物變性為單鏈，然后與2μM 3′端用硫代修飾的測序引物在42℃雜交30分鐘，洗滌后待用。
第四步基片上加上第一次延伸反應(yīng)溶液，其中包括1～10U/μL的Taq DNA聚合酶、2μM的ddNTP、20nM Cy3-ddCTP、20nM Cy5-ddGTP、20nM FITC-ddATP、20nM JOE-ddTTP，52℃反應(yīng)30秒鐘，用去離子水洗滌后，用CCD進(jìn)行拍照，獲得該位置的堿基信息。
第五步加入3U/μL的核酸外切酶III，37℃反應(yīng)30秒鐘，去除延伸上的堿基，并用去離子水進(jìn)行洗滌。
第六步基片上加上第二次延伸反應(yīng)溶液，其中包括2U/μL的Taq DNA聚合酶、2μM的2′位修飾

的硫代脫氧核糖核苷酸(即dNTP)、1nM用不同熒光修飾的、2′位同樣修飾著

的硫代脫氧核糖核苷酸，分別是Cy3-dCTP、Cy5-dGTP、FITC-dATP、JOE-dTTP，52℃反應(yīng)30秒鐘，用去離子水洗滌后，用CCD進(jìn)行拍照，再次獲得該位置的堿基信息。
第七步用0.1M的氫氧化鈉溶液與基片作用1分鐘，去除

基團(tuán)，活化出羥基，并使四種熒光發(fā)生淬滅。
第八步反復(fù)進(jìn)行第四、五、六、七步，直到全部獲得待測DNA模板的堿基信息。
第九步利用圖像分析軟件，由熒光與堿基類型已知的對應(yīng)關(guān)系，得到待測DNA模板的具體序列信息，由于同一個位置的堿基，測定了兩次，兩次堿基信息完全相同的位置，判定為準(zhǔn)確。兩次堿基信息不一致的位置，標(biāo)識為可疑。由于，待測DNA模板進(jìn)行了預(yù)擴(kuò)增，那么存在著相同序列的其他克隆，可疑位置的堿基信息與其他克隆相同位置的信息進(jìn)行比較，占90％以上的堿基信息被判定為準(zhǔn)確。
實施例3可二次驗證堿基信息的DNA測序方法測定人基因組p16外顯子1序列 設(shè)計一對針對人基因組p16外顯子1的PCR引物，其中一條引物5′端修飾著氨基。用PCR引物擴(kuò)增人樣本(血液、組織等)中的p16外顯子1序列片段，PCR產(chǎn)物純化后，通過點樣的辦法在醛基修飾的基片上形成陣列，洗去未結(jié)合的PCR產(chǎn)物，加入0.3M的氫氧化鈉溶液，用變性的辦法去除未固定的DNA鏈，得到單一的模板鏈，然后與2μM 3′端用硫代修飾的測序引物在42℃雜交30分鐘，洗滌后待用。進(jìn)行以下步驟 第一步基片上加上第一次延伸反應(yīng)溶液，其中包括2U/μL的Taq DNA聚合酶、2μM的ddNTP、20nM Cy3-ddCTP、20nM Cy5-ddGTP、20nM FITC-ddATP、20nM JOE-ddTTP，52℃反應(yīng)30秒鐘，用去離子水洗滌后，用CCD進(jìn)行拍照，獲得該位置的堿基信息。
第二步加入3U/μL的核酸外切酶III，37℃反應(yīng)30秒鐘，去除延伸上的堿基，并用去離子水進(jìn)行洗滌。
第三步基片上加上第二次延伸反應(yīng)溶液，其中包括5U/μL的Taq DNA聚合酶、2μM的2′位修飾

的硫代脫氧核糖核苷酸(即dNTP)、20nM用不同熒光修飾的、2′位同樣修飾著

的硫代脫氧核糖核苷酸，分別是Cy3-dCTP、Cy5-dGTP、FITC-dATP、JOE-dTTP，52℃反應(yīng)30秒鐘，用去離子水洗滌后，用CCD進(jìn)行拍照，再次獲得該位置的堿基信息。
第四步用0.01M的高碘酸鈉溶液與基片作用1分鐘，去除

基團(tuán)，活化出羥基，洗滌后，再加上0.01M的硫酸銅溶液使四種熒光發(fā)生淬滅。
第五步反復(fù)進(jìn)行第一步到第四步，直到全部獲得待測DNA模板的堿基信息。
第六步利用圖像分析軟件，由熒光與堿基類型已知的對應(yīng)關(guān)系，得到待測DNA模板的具體序列信息，由于同一個位置的堿基，測定了兩次，兩次堿基信息完全相同的位置，判定為準(zhǔn)確。兩次堿基信息不一致的位置，標(biāo)識為可疑。由于，待測DNA模板進(jìn)行了預(yù)擴(kuò)增，那么存在著相同序列的其他克隆，可疑位置的堿基信息與其他克隆相同位置的信息進(jìn)行比較，占90％以上的堿基信息被判定為準(zhǔn)確。
權(quán)利要求
1、一種可二次驗證堿基信息的DNA測序方法，其特征在于DNA序列上一個堿基的信息的確定是通過兩次延伸測序步驟來實現(xiàn)的，該DNA測序過程如下
步驟1)3′端堿基硫代修飾的測序引物與被固定的待測DNA序列進(jìn)行雜交；
步驟2)加入第一次延伸反應(yīng)溶液，溶液成份包括1～10U/μL DNA聚合酶、四種用熒光標(biāo)記的核苷酸單體A、T、C、G和四種正常的核苷酸單體A、T、C、G，用熒光標(biāo)記的核苷酸單體和同種類正常核苷酸單體之間的分子數(shù)比例為1∶50～100，通過在上述測序引物上延伸四種核苷酸單體A、T、C、G中的一種、并通過熒光檢測到第一次延伸的堿基信息；
步驟3)將步驟2)中延伸上的用熒光標(biāo)記核苷酸單體通過生物酶切割方法進(jìn)行清除；
步驟4)加入第二次延伸反應(yīng)溶液，溶液成份包括1～10U/μL DNA聚合酶、四種用熒光標(biāo)記的可脫保護(hù)的硫代核苷酸單體A、T、C、G和四種未標(biāo)記熒光的可脫保護(hù)的硫代核苷酸單體A、T、C、G，用熒光標(biāo)記的可脫保護(hù)的硫代核苷酸單體和同種類未標(biāo)記熒光的可脫保護(hù)的硫代核苷酸單體之間的分子數(shù)比例為1∶50～100，通過在測序引物上延伸可脫保護(hù)的硫代核苷酸單體A、T、C、G中的一種，并通過熒光檢測到第二次延伸的同一位置的堿基信息；
步驟5)用化學(xué)試劑去除上述步驟4)中延伸上的用熒光標(biāo)記的可脫保護(hù)的硫代核苷酸單體上的可脫保護(hù)基團(tuán)，同時去除該硫代核苷酸單體上的熒光基團(tuán)；
循環(huán)上述步驟2)、3)、4)和5)所進(jìn)行的過程，直到確定待測DNA中的堿基序列信息。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的可二次驗證堿基信息的DNA測序方法，其特征在于所述的可二次驗證堿基信息是指待測DNA模板上某一個具體位置的堿基信息采用兩次檢測的方式獲得，第一次檢測得到該位置的堿基信息，第二次檢測則是進(jìn)一步驗證該堿基信息。
3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的可二次驗證堿基信息的DNA測序方法，其特征在于所述的固定的待測DNA模板是指待測定序列的DNA片段。
4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的可二次驗證堿基信息的DNA測序方法，其特征在于所述的步驟(2)中用熒光標(biāo)記的核苷酸單體上修飾有以下熒光化學(xué)基團(tuán)中的一種DAPI、Cy2、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、FITC、Alexa 488、Alexa 568、JOE、ROX、Rhodamine 6G、Tetramethylrhodamine、Lissamine、Texas Red、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665；所述的核苷酸單體是脫氧核糖核苷酸、雙脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。
5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的可二次驗證堿基信息的DNA測序方法，其特征在于所述的步驟(4)中所用的熒光標(biāo)記的可脫保護(hù)的硫代核苷酸單體上修飾有以下熒光化學(xué)基團(tuán)中的一種DAPI、Cy2、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、FITC、Alexa 488、Alexa 568、JOE、ROX、Rhodamine 6G、Tetramethylrhodamine、Lissamine、Texas Red、BODIPY 630/650、BODIPY650/665；所述的硫代核苷酸單體特征在于結(jié)構(gòu)為
其中，Y為嘌呤堿基基團(tuán)或者嘧啶堿基基團(tuán)，核糖或脫氧核糖基團(tuán)2′和3′位置上連接著R1和R2基團(tuán)，在一定條件下，R1或R2基團(tuán)可以被分解，形成羥基，R1基團(tuán)選自但不限于下列化學(xué)基團(tuán)之一
R2選自但不限于H、OH、羰基，以及與R1相同的基團(tuán)；R4，R5和R6分別是R4選用氫原子或烴基；R5選用氫原子或烴基；R6選用烴基、環(huán)烴基、鏈烯基、環(huán)烯基或芐基。
6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的可二次驗證堿基信息的DNA測序方法，其特征在于所述的用熒光標(biāo)記核苷酸單體或用熒光標(biāo)記的可脫保護(hù)的硫代核苷酸單體是單色的，即四種核苷酸單體均修飾著同一種類的熒光基團(tuán)；或者是不同種類的熒光，即四種核苷酸單體標(biāo)記不相同或者不完全相同的熒光基團(tuán)。
7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的可二次驗證堿基信息的DNA測序方法，其特征在于在執(zhí)行權(quán)利要求1所述的步驟4)之前，步驟2)和步驟3)被同時執(zhí)行1到10次。
8、根據(jù)權(quán)利要求1所述的可二次驗證堿基信息的DNA測序方法，其特征在于所述的待測DNA序列中的堿基信息是通過檢測是否有熒光標(biāo)記和熒光標(biāo)記的強度以及堿基互補原理來確定模板的序列信息，相同重復(fù)堿基的確定通過信號的線性遞增關(guān)系進(jìn)行確定。
9、根據(jù)權(quán)利要求1所述的可二次驗證堿基信息的DNA測序方法，其特征在于所述步驟3)中的生物酶選用Lamda核酸外切酶、T7核酸外切酶、核酸外切酶I、核酸外切酶III、核酸外切酶T中的一種。
10、根據(jù)權(quán)利要求1所述的可二次驗證堿基信息的DNA測序方法，其特征在于所述步驟5)中的化學(xué)試劑至少選用高碘酸鹽溶液、氨水、氫氧化鈉溶液、雙氧水、碘化鉀溶液、硫酸銅溶液、DABCYL溶液中的一種。
全文摘要
本發(fā)明可二次驗證堿基信息的DNA測序方法涉及的是一種能夠原位清除延伸標(biāo)記物，能夠二次驗證同一個堿基位置的信息，逐個堿基鑒定未知DNA序列。該技術(shù)過程如下1)3′端硫代修飾的測序引物與被固定的待測DNA序列進(jìn)行雜交；2)加入第一次延伸反應(yīng)溶液，延伸四種熒光標(biāo)記的核苷酸單體，通過檢測得到堿基信息；3)將2)中延伸上的核苷酸單體用酶進(jìn)行切割清除；4)加入第二次延伸反應(yīng)溶液，延伸熒光標(biāo)記的可脫保護(hù)的硫代核苷酸單體，通過檢測再次得到堿基信息；5)用化學(xué)試劑去除4)中延伸上的硫代核苷酸單體上的可脫保護(hù)基團(tuán)和熒光基團(tuán)；循環(huán)上述2)、3)、4)和5)所進(jìn)行的過程，直到確定待測DNA中的堿基序列信息。
文檔編號C12Q1/68GK101575639SQ200910033400
公開日2009年11月11日 申請日期2009年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月19日
發(fā)明者陸祖宏, 羅俊峰, 白云飛, 肖鵬峰, 華 呂 申請人:無錫艾吉因生物信息技術(shù)有限公司