專利名稱:異戊酰螺旋霉素i基因工程菌株的構(gòu)建的制作方法
技術領域:
本發(fā)明涉及基因工程技術在改造抗生素組分中的應用。
背景技術:
異戊酰螺旋霉素I是本研究室利用基因工程技術構(gòu)建的必特螺旋霉素(原名為生技霉素)產(chǎn)生菌所產(chǎn)生的一個組分[“生技霉素的制造方法”,專利號ZL97104440.6]、[“必特螺旋霉素高產(chǎn)菌株的獲得”,專利號ZL 02148771.5]。必特螺旋霉素目前即將完成第III期臨床實驗。實驗結(jié)果表明,在治療呼吸道感染等疾病方面,顯示了較好的臨床療效和安全性。
除異戊酰螺旋霉素I組分外,必特螺旋霉素成品中還包含異戊酰II和III組分,同時還含有少量4”丁酰基、丙酰基、乙酰基的衍生物及少量的螺旋霉素I、II、III(總含量應不超過5%)。目前現(xiàn)行的必特螺旋霉素成品質(zhì)量標準中,規(guī)定其含有9個組分,4”?;菪顾乜偤繛?0%,其中異戊酰螺旋霉素(I、II、III)3個組分的總含量為65%。而在必特螺旋霉素發(fā)酵液中還存在較大比例的螺旋霉素I、II、III,尤其II和III組分相對較多。必特螺旋霉素發(fā)酵液中的螺旋霉素主要依賴化學提取工藝將其清除。因此,抗生素發(fā)酵產(chǎn)品的多組分問題,給藥品質(zhì)量標準的制定以及發(fā)酵工藝和提取過程監(jiān)控,經(jīng)常帶來很大的困難和挑戰(zhàn)。所以,在不影響生物學活性的前提下,獲得單一組分生產(chǎn)菌種,已成為抗生素研究和生產(chǎn)面臨的重要課題。
必特螺旋霉素是以螺旋霉素為母核,利用基因工程技術在其4”位-羥基進行異戊?;a(chǎn)生的。而螺旋霉素產(chǎn)生菌通常產(chǎn)生SPI、II、III三個組分,即內(nèi)酯環(huán)3位分別為羥基(SP I)、乙酰基(SP II)和丙?;?SP III),結(jié)構(gòu)式如圖A所示。SP I、SP II、SP III三個組分的生物學活性基本一致。螺旋霉素產(chǎn)生菌產(chǎn)生SPI、II、III三個組分的生化機理,是由3-O-?;D(zhuǎn)移酶催化內(nèi)酯環(huán)3-O-羥基所致。本研究室曾在獲得螺旋霉素3-O-酰基轉(zhuǎn)移酶基因序列(專利申請?zhí)?00610087230.1,SEQ ID No.1)基礎上,通過基因阻斷技術,獲得了主要產(chǎn)生螺旋霉素組分I的菌種。但是,僅僅產(chǎn)生異戊酰螺旋霉素I為主組分的菌種,迄今尚未見到相關報道。
螺旋霉素結(jié)構(gòu)本發(fā)明的目的在于,借鑒上述成果,在必特螺旋霉素產(chǎn)生菌中通過破壞編碼3-O-酰基轉(zhuǎn)移酶基因,以獲得產(chǎn)生異戊酰螺旋霉素I為主組分的基因工程菌。
發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)已經(jīng)獲得的3-O-?;D(zhuǎn)移酶基因及其兩翼序列,在3-O-?;D(zhuǎn)移酶基因序列中可以破壞該基因的任意區(qū)段設計1個引物,并插入4個任意設計的酶切位點,經(jīng)PCR獲得兩個1.0kb左右的同源臂,酶切后將兩個同源臂互連,另外兩側(cè)與能轉(zhuǎn)入必特螺旋霉素產(chǎn)生菌的載體相連接,以必特螺旋霉素產(chǎn)生菌(ZL02148771.5,菌種保藏號CGMCC No.0304)總DNA為模板,經(jīng)PCR分別擴增兩個與3-O-?;D(zhuǎn)移酶基因同源片段,并以相應酶切位點插入具有選擇性標記的鏈霉菌/大腸桿菌穿羧質(zhì)粒載體,也可在兩個同源基因中插入和使用質(zhì)粒不同的選擇性標記片段,構(gòu)建重組質(zhì)粒。將所構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入必特螺旋霉素基因工程菌,以質(zhì)粒上攜帶的選擇性標記篩選轉(zhuǎn)化子,根據(jù)轉(zhuǎn)化子展現(xiàn)的選擇性標記差異和PCR驗證,獲取因同源基因雙交換而使3-O-?;D(zhuǎn)移酶基因破壞的基因工程菌,稱之為BT3-O-ATΔ變株。該基因工程菌在一定條件下,經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)和產(chǎn)物的初步化學提取以及HPLC檢測其發(fā)酵產(chǎn)物,證明本發(fā)明提供了產(chǎn)生異戊酰螺旋霉素I為主組分的基因工程菌。
發(fā)明效果本發(fā)明利用基因工程技術將原必特螺旋霉素基因工程菌中的3-O酰基轉(zhuǎn)移酶基因?qū)嵤┢茐?,獲得了只產(chǎn)生異戊酰螺旋霉素組分I的菌種。該菌種的獲得,,使得必特螺旋霉素類抗生素發(fā)酵液中的多組分狀況獲得明顯單一化,這將有助于簡化生產(chǎn)過程發(fā)酵工藝的調(diào)控,實現(xiàn)提取過程的優(yōu)化,提高收率,降低能耗和生產(chǎn)成本,為推進必特螺旋霉素類抗生素的產(chǎn)業(yè)化創(chuàng)造良好條件。
圖1.用于3-O-酰基轉(zhuǎn)移酶基因破壞的重組質(zhì)粒pKCL1-4的構(gòu)建及同源雙交換其中Apramycin(阿普霉素抗性標記);GTG和TGA表示3-O-?;D(zhuǎn)移酶基因閱讀框的起始和終止密碼子;a,b,c,d為PCR反應所設計的引物。
圖2.染色體基因組PCR產(chǎn)物電泳(確證3-O-酰基轉(zhuǎn)移酶基因的破壞)其中1.基因工程菌BT3-O-ATΔ變株;2.必特螺旋霉素產(chǎn)生菌原株;3.DNA分子量標記III。
圖3.基因工程菌BT3-O-ATΔ變株發(fā)酵產(chǎn)物HPLC的檢測其中A.必特螺旋霉素提取品(對照);B.必特螺旋霉素產(chǎn)生菌原株;C.基因工程菌BT3-O-ATΔ變株。
I-異戊酰螺旋霉素I;II-異戊酰螺旋霉素II;III-異戊酰螺旋霉素III;SI-螺旋霉素I;SII-螺旋霉素II;SIII-螺旋霉素III;縱坐標-HPLC分析中紫外吸收百分比(abs);橫坐標-分鐘(min)。
實施方案以下實施例僅為幫助本領域技術人員進一步理解本發(fā)明,但不以任何方式限制本發(fā)明。
<實施例1>重組載體pKCL1-4的構(gòu)建根據(jù)本研究室已經(jīng)獲得的3-O-?;D(zhuǎn)移酶基因及其兩翼序列[NCBIDQ642742]設計兩對引物,并插入相應的酶切位點(引物在染色體上的相對位置如圖1所示)L1上游引物(a)GCGAAGCTTTGCCCTGGCAATTGCAGTGTCAGHindIII下游引物(b)GCGTCTAGAGCCGAACGTGACGATGTGCAGCGXbaIL2上游引物(c)GTCTCTAGACAGTGGTCCTTCGCCTTCTATCTXbaI下游引物(d)GACGGATCCTCGTCGCGCAGCAGGTCGTTGAGBamHI進行常規(guī)PCR擴增,獲得與3-O-酰基轉(zhuǎn)移酶基因兩個部分同源的片段(左臂L1,1.0kb;右臂L2,1.0kb)。L1兩端攜帶HindIII和XbaI酶切位點,L2兩端攜帶XbaI和BamHI位點。將L1、L2片段和溫敏型鏈霉菌/大腸桿菌穿梭質(zhì)粒pKC1139(攜帶阿普霉素-Apramycin,Am抗性標記)以相應的酶切位點進行連接,獲得重組載體pKCL1-4(構(gòu)建過程見圖1)。
<實施例2>必特螺旋霉素3-O-?;D(zhuǎn)移酶基因破壞的基因工程菌株構(gòu)建必特螺旋霉素產(chǎn)生菌在斜面培養(yǎng)基[王以光等,生物工程學報,1992年8(1)1-14]上28℃培養(yǎng)7-10天,按照文獻[D.A.Hopwood等Geneticmanipulation of Streptomyces,A Laboratory Manual,Norwich;JohnInnesFoundation UK,1985]描述的方法制備原生質(zhì)體,將pKCL1-4通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法,導入必特螺旋霉素產(chǎn)生菌中,以Am抗性作為選擇性標記獲得轉(zhuǎn)化子;經(jīng)無抗性平板在37℃條件下培養(yǎng)傳代、單菌落分離,獲得了Am敏感菌株(稱為BT3-O-ATΔ變株)。
提取變株和原株基因組DNA為模板,以引物a和d配對,進行PCR擴增和產(chǎn)物的電泳鑒定。由于必特螺旋霉素原株中的3-O-酰基轉(zhuǎn)移酶基因組與載體攜帶的L1和L2片段發(fā)生了同源雙交換,使BT3-O-ATΔ變株中3-O-?;D(zhuǎn)移酶基因在閱讀框架內(nèi)刪除了612bp的序列,因此,BT3-O-ATΔ變株PCR產(chǎn)物約為2.0kb,比原株(約2.6kb)小0.6kb(結(jié)果見圖2),表明必特螺旋霉素原株中3-O-?;D(zhuǎn)移酶基因的部分序列已被刪除和破壞。所獲得的變株即為必特螺旋霉素3-O-?;D(zhuǎn)移酶基因破壞的基因工程菌株。
<實施例3>必特螺旋霉素3-O-酰基轉(zhuǎn)移酶基因破壞的基因工程菌株發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC檢測BT3-O-ATΔ變株的發(fā)酵培養(yǎng)及產(chǎn)物初步提取按照文獻[王以光等,生物工程學報,1992年8(1)1-14]進行。發(fā)酵液初步提取液揮發(fā)干后,以少量甲醇溶解,采用島津LC-10ATvp液相色譜議,二級管陣列檢測器,色譜柱為KromasilC184.5*150mm,流動相為甲醇/1%磷酸二氫鈉溶液(53/47),流速為1mL/min。以必特螺旋霉素純品為對照,以必特螺旋霉素主要組分的保留時間為標準[姜威等中國抗生素雜志.2002,27(7)387-391],取5ul發(fā)酵液,經(jīng)初步提取的樣品進行HPLC檢測。發(fā)酵主要產(chǎn)物所占比例的HPLC定量分析結(jié)果見圖4和表1。
表1 BT3-O-ATΔ變株發(fā)酵主要產(chǎn)物的HPLC檢測
HPLC分析結(jié)果表明,原株發(fā)酵產(chǎn)生異戊酰螺旋霉素I為3.29%,螺旋霉素II和III所占總組分比例約為40.15%;本發(fā)明獲得的BT3-O-ATΔ變株不產(chǎn)生螺旋霉素II、III和異戊酰螺旋霉素II、III。BT3-O-ATΔ變株所產(chǎn)生的異戊酰螺旋霉素I占總組分的比例約為23.47%;螺旋霉素I占總組分的比例為32.39%。這一結(jié)果充分證明,必特螺旋霉素原株中3-O-?;D(zhuǎn)移酶基因已經(jīng)完全破壞。本發(fā)明獲得了4”位?;菪顾刂幸援a(chǎn)生異戊酰螺旋霉素I為主組份的基因工程菌。
權利要求
1.異戊酰螺旋霉素I基因工程菌株的構(gòu)建,其特征是在必特螺旋霉素產(chǎn)生菌中通過破壞編碼3-O-?;D(zhuǎn)移酶基因,以獲得產(chǎn)生異戊酰螺旋霉素I為主組分的基因工程菌。
2.如權利要求1所述的構(gòu)建方法,其特征是以3-O-?;D(zhuǎn)移酶基因序列為模板,在3-O-?;D(zhuǎn)移酶基因序列中可以破壞該基因的任意區(qū)段設計4個引物,并插入4個任意設計的酶切位點,經(jīng)PCR獲得兩個1.0kb左右的同源臂,酶切后將兩個同源臂互連,另外兩側(cè)與能轉(zhuǎn)入必特螺旋霉素產(chǎn)生菌的載體相連接,獲得重組載體,并轉(zhuǎn)入必特螺旋霉素產(chǎn)生菌,以載體上的選擇性標記挑取轉(zhuǎn)化子,通過篩選抗性標記和PCR驗證,獲得3-O-?;D(zhuǎn)移酶基因被破壞的變株,經(jīng)發(fā)酵及對產(chǎn)物提取后HPLC分析,證明所獲變株為主要產(chǎn)生異戊酰螺旋霉素組分I的菌種。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程技術在改造抗生素組分中的應用,具體來講,是對必特螺旋霉素產(chǎn)生菌中參與產(chǎn)生組分II和III相關的3-O-?;D(zhuǎn)移酶基因?qū)嵤┳钄嗪推茐?,通過同源基因雙交換獲得產(chǎn)生4″位異戊酰螺旋霉素I為主組份的基因工程菌,該菌株的獲得十分有利于今后生產(chǎn)工藝的簡化、生產(chǎn)成本的降低和質(zhì)量標準的制定與控制。
文檔編號C12P19/62GK101054553SQ20071009050
公開日2007年10月17日 申請日期2007年4月9日 優(yōu)先權日2007年4月9日
發(fā)明者武臨專, 王以光, 馬春燕, 赫衛(wèi)清, 周紅霞 申請人:中國醫(yī)學科學院醫(yī)藥生物技術研究所