一種制備螺旋霉素堿產(chǎn)生菌生二素灰色鏈霉菌孢子的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種制備螺旋霉素堿產(chǎn)生菌生二素灰色鏈霉菌孢 子的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 孢子制備是發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中不可缺少的一個環(huán)節(jié)，孢子質(zhì)量的好壞將直接影響到發(fā)酵 生產(chǎn)的成功與否。國內(nèi)螺旋霉素堿發(fā)酵生產(chǎn)所用的生二素灰色鏈霉菌是經(jīng)過誘變得到的， 一般得不到孢子，靠斜面?zhèn)鞔?，菌絲保藏。螺旋霉素SPM的合成基因部分為質(zhì)?；颍|(zhì)粒 基因容易丟失。因此，螺旋霉素SPM生產(chǎn)菌種不太穩(wěn)定，性能容易衰退。菌種生產(chǎn)能力的保 持是菌種選育和抗生素生產(chǎn)中最重要的問題。眾所周知，在不斷地重復(fù)培養(yǎng)過程中會導(dǎo)致 菌種生產(chǎn)能力下降，而菌絲冷凍保藏，保藏期較短，不得不在生產(chǎn)中頻繁更換菌種批號，增 加傳代次數(shù)，造成生產(chǎn)的不穩(wěn)定，同時也加大了菌種制備的工作量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種制備螺旋霉素堿產(chǎn)生菌生二素灰色鏈霉菌孢子的方法，以 有效提高生產(chǎn)批次的產(chǎn)量、減少菌種傳代次數(shù)、防止菌種退化、提高菌種保藏期限。
[0004] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案： 一種制備螺旋霉素堿產(chǎn)生菌生二素灰色鏈霉菌孢子的方法，包括以下步驟： a. 平板培養(yǎng)基的制備：采用玉米淀粉4%、淀粉酶0. 03%、黃豆餅粉1%、氯化鈉0. 4%、七 水硫酸鎂〇. 05%、碳酸鈣0. 5%、瓊脂1%、余量為蒸餾水的質(zhì)量百分比例配制平板培養(yǎng)基，將 平板培養(yǎng)基經(jīng)過滅菌倒入培養(yǎng)皿中； b. 菌懸液的制備：取預(yù)先選定的優(yōu)質(zhì)冷凍管作為出發(fā)菌株，接種到種子搖瓶中，在搖床 上培養(yǎng)40~48小時，在無菌條件下，吸取種子液放到裝有玻璃珠的三角瓶中，手振蕩5~10分 鐘，然后過濾于另一三角瓶即成菌懸液； c. 單菌落孢子的培養(yǎng)：將菌懸液按10倍的濃度梯度稀釋至10 2、10 3、10 4,將三個濃度 的菌懸液分別加入到步驟a得到的不同培養(yǎng)皿的平板培養(yǎng)基上，在溫度為27±0. 5°C、濕度 為40%~50%條件下培養(yǎng)18~20天； d. 斜面培養(yǎng)基的制備：采用玉米淀粉4%、淀粉酶0. 03%、黃豆餅粉1%、氯化鈉0. 4%、七 水硫酸鎂〇. 05%、碳酸鈣0. 5%、瓊脂1%、余量為蒸餾水的比例配制斜面培養(yǎng)基，將斜面培養(yǎng) 基分裝到試管中，經(jīng)滅菌后擺斜面； e. 單菌落孢子斜面的制備：選擇步驟c制得的規(guī)則、豐滿的單菌落孢子，用滅過菌的接 種鏟輕輕刮下孢子，均勻涂在步驟d得到的空白斜面上，每個單菌落只傳一支斜面，傳好后 塞緊棉塞用無菌濾紙包扎，在溫度為27±0. 5°C、濕度為40%~50%條件下培養(yǎng)18~20天； f. 搖瓶初篩和搖瓶復(fù)篩：取培養(yǎng)成熟的步驟e中的孢子斜面試管，進(jìn)行單菌落孢子的 搖瓶初篩和搖瓶復(fù)篩，選出生產(chǎn)能力強(qiáng)的單菌落孢子斜面； g. 孢子斜面保藏。
[0005]平板培養(yǎng)基和斜面培養(yǎng)基配制過程中用85°C水浴15分鐘，滅菌時在0.IMPa、 121°C的條件下滅菌30分鐘，滅菌結(jié)束后保壓降溫。
[0006] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于發(fā)明了全新的培養(yǎng)基配方，使螺旋霉素堿產(chǎn)生菌在這種培養(yǎng)基 上能夠產(chǎn)生孢子，為實(shí)現(xiàn)孢子保藏菌種提供了基本來源。與原有的舊培養(yǎng)基相比，有以下優(yōu) 占. 2.新舊配方比較： a. 本發(fā)明新的制備方法可以產(chǎn)生孢子，而舊培養(yǎng)基只能產(chǎn)生菌絲； b. 本發(fā)明獲得的成熟孢子斜面置1~7°C冰箱中保存可達(dá)一個月之久待用；而現(xiàn)有成 熟的菌絲斜面置1~7°C冰箱中保存兩周即退化，為防止待用菌絲斜面退化，必須盡快傳代 維持菌絲活力； c. 本發(fā)明獲得的孢子斜面可制作牛奶管進(jìn)行菌種保藏，一般至少可保存6年；而現(xiàn)有 的菌絲斜面不宜制作牛奶管，一般采用冷凍管保藏，保存時間為2~3年； d. 在時間上，無論是斜面待用保存還是菌種保藏，本發(fā)明得到的孢子斜面均比現(xiàn)有的 菌絲斜面有優(yōu)勢，利用孢子保藏菌種，可減少菌種在復(fù)壯選育過程中和制備過程中的傳代 次數(shù)，防止菌種退化，延長了菌種保藏時間，達(dá)到了提高工作效率和增產(chǎn)降耗的目的。
【具體實(shí)施方式】
[0007] 實(shí)施例1 一種制備螺旋霉素堿產(chǎn)生菌生二素灰色鏈霉菌孢子的方法，包括以下步驟： a. 平板培養(yǎng)基的制備： (1) 按照玉米淀粉4%、淀粉酶0. 03%、黃豆冰粉1%、氯化鈉0. 4%、七水硫酸鎂0. 05%、碳 酸鈣0. 5%、瓊脂1%、余量為蒸餾水的比例配制平板培養(yǎng)基； (2) 將上面的平板培養(yǎng)基用85°C水浴15分鐘，然后一邊搖勻一邊分裝于規(guī)格為500ml 三角瓶內(nèi)，每瓶裝200ml;在0.lMPa、121°C的條件下滅菌30分鐘，滅菌結(jié)束后保壓降溫； (3) 將滅菌后的平板分離培養(yǎng)基趁熱搖勻，待冷卻至60°C左右一邊搖勻一邊分別倒入 直徑為90mm的滅菌培養(yǎng)皿中，每只培養(yǎng)皿大約25ml平板培養(yǎng)基；倒好的培養(yǎng)皿放平加蓋， 待平板培養(yǎng)基冷卻凝固后置37°C恒溫箱培養(yǎng)48h，經(jīng)無菌檢查合格后備用； b. 菌懸液的制備： 取一支預(yù)先選定的優(yōu)質(zhì)冷凍管（內(nèi)裝有生二素灰色鏈霉菌菌絲體）作為出發(fā)菌株，接種 到種子搖瓶中，在搖床上培養(yǎng)44小時，在無菌條件下，吸取10ml種子液放到裝有玻璃珠的 三角瓶中，手振蕩8分鐘，然后過濾于另一三角瓶即成菌懸液； c. 單菌落孢子的培養(yǎng)： (1)用滅菌移液管吸取步驟b的菌懸液，按10倍的濃度梯度稀釋至10 2、10 3、10 4,分 別吸取以上三個濃度的菌懸液加到步驟a不同培養(yǎng)皿的平板培養(yǎng)基上，每個平板培養(yǎng)基加 入0. 1~0. 3ml，然后滅菌接種耙涂布均勻，接種好的培養(yǎng)皿加蓋，正面向上集中用無菌濾紙 包扎； (2)將無菌濾紙包扎好的培養(yǎng)皿正面向上水平放置在恒溫培養(yǎng)室或生化培養(yǎng)箱內(nèi)，在 溫度為27±0. 5°C、相對濕度為40%~50%條件下培養(yǎng)，1天后將培養(yǎng)皿翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)，培養(yǎng)周期 18~20 天； d. 斜面培養(yǎng)基的制備： (1) 按照玉米淀粉4%、淀粉酶0. 03%、黃豆冰粉1%、氯化鈉0. 4%、七水硫酸鎂0. 05%、碳 酸鈣0. 5%、瓊脂1%、余量為蒸餾水的比例配制斜面培養(yǎng)基； (2) 將上面的斜面培養(yǎng)基85°(：水浴15分鐘，然后一邊搖勻一邊分裝于規(guī)格為30*200臟 試管中，每管裝量20ml，塞緊棉塞，用一層牛皮紙包扎； (3) 在0.lMPa、121°C的條件下滅菌30分鐘，滅菌結(jié)束后保壓降溫； (4) 將滅菌后的斜面培養(yǎng)基趁熱搖勻，待冷卻至60°C左右擺成斜面，冷卻凝固后置 37°C恒溫箱培養(yǎng)48h，經(jīng)無菌檢查合格后備用； e. 單菌落孢子斜面的制備： 取步驟c培養(yǎng)好平板單菌落，選擇豐滿、規(guī)則的單菌落，用滅過菌的接種鏟輕輕刮下孢 子，均勻涂在步驟d的空白斜面上，每個單菌落只傳1支斜面，傳好后塞緊棉塞用無菌濾紙 包扎，在溫度為27±0. 5°C、濕度為40%~50%條件下培養(yǎng)18~20天。
[0008] f.搖瓶初篩和搖瓶復(fù)篩： 取步驟e培養(yǎng)成熟的孢子斜面試管，在無菌條件下，用滅過菌的接種鏟將每支成熟斜 面分別挖塊約lcm2大小至搖瓶內(nèi)進(jìn)行單菌落孢子的搖瓶初篩和搖瓶復(fù)篩，選出生產(chǎn)能力強(qiáng) 的單菌落孢子斜面。
[0009] g?孢子斜面保藏。
[0010] 上述制得的孢子斜面制作牛奶管進(jìn)行菌種保藏，將保藏不同時間的牛奶管考察， 結(jié)果見下表：
對照實(shí)施例： 現(xiàn)有的菌絲斜面制備方法： 與實(shí)施例1的不同之處在于：平板培養(yǎng)基和斜面培養(yǎng)基的質(zhì)量百分比配方為：玉米淀 粉4%、蛋白胨0. 5%、黃豆餅粉2%、氯化鈉0. 2%、玉米漿0. 5%、碳酸鈣0. 5%、瓊脂1. 8~2. 0%、 余量為水。步驟f?選出生產(chǎn)能力強(qiáng)的單菌落菌絲斜面后，用甘油作保護(hù)劑將培養(yǎng)成熟的種 子液制作冷凍管于-18~_25°C的冰柜中冷凍保藏。
[0011] 對照實(shí)施例選取三支成熟的菌絲斜面（1#斜面、2#斜面、3#斜面）時間進(jìn)行考察， 每支三個平行，結(jié)果如下表：
由以上兩表可看出，菌絲斜面隨保存時間的延長退化非常迅速，若要維持菌絲活力，就 要及時傳代或進(jìn)行制種保藏，而冷凍管保藏時間僅有2~3年時間。本發(fā)明得到的是孢子斜 面，制作成牛奶管后退化不明顯，至少可保存6年，孢子斜面可以減少傳代次數(shù)，延長菌種 保藏時間，達(dá)到了提高工作效率和增產(chǎn)降耗的目的。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種制備螺旋霉素堿產(chǎn)生菌生二素灰色鏈霉菌孢子的方法，其特征在于，包括以下 步驟： a. 平板培養(yǎng)基的制備：采用玉米淀粉4±0. 54%、淀粉酶0. 03 ±0. 005%、黃豆餅 粉1 ± 0. 05%、氯化鈉0. 4 ± 0. 05%、七水硫酸鎂0. 05 ± 0. 005%、碳酸鈣0. 5 ± 0. 05%、瓊脂 1±〇. 5%、余量為蒸餾水的比例配制平板培養(yǎng)基，將平板培養(yǎng)基經(jīng)過滅菌倒入培養(yǎng)皿中； b. 菌懸液的制備：取預(yù)先選定的裝有菌絲體的優(yōu)質(zhì)冷凍管作為出發(fā)菌株，接種到種 子搖瓶中，在搖床上培養(yǎng)40~48小時，在無菌條件下，吸取種子液放到裝有玻璃珠的三角瓶 中，手振蕩5~10分鐘，然后過濾于另一三角瓶即成菌懸液； c. 單菌落孢子的培養(yǎng)：將菌懸液按10倍的濃度梯度稀釋至10 2、10 3、10 4,將三個濃度 的菌懸液分別加入到步驟a得到的不同培養(yǎng)皿的平板培養(yǎng)基上，在溫度為27±0. 5°C、濕度 為40%~50%條件下培養(yǎng)18~20天； d. 斜面培養(yǎng)基的制備：采用玉米淀粉4%、淀粉酶0. 03%、黃豆餅粉1%、氯化鈉0. 4%、七 水硫酸鎂〇. 05%、碳酸鈣0. 5%、瓊脂1%、余量為蒸餾水的比例配制斜面培養(yǎng)基，將斜面培養(yǎng) 基分裝到試管中，經(jīng)滅菌后擺斜面； e. 單菌落孢子斜面的制備：選擇步驟c制得的規(guī)則、豐滿的單菌落孢子，用滅過菌的接 種鏟輕輕刮下孢子，均勻涂在步驟d得到的空白斜面上，每個單菌落只傳一支斜面，傳好后 塞緊棉塞用無菌濾紙包扎，在溫度為27±0. 5°C、濕度為40%~50%條件下培養(yǎng)18~20天； f. 搖瓶初篩和搖瓶復(fù)篩：取培養(yǎng)成熟的步驟e中的孢子斜面試管，進(jìn)行單菌落孢子的 搖瓶初篩和搖瓶復(fù)篩，選出生產(chǎn)能力強(qiáng)的單菌落孢子斜面； g. 孢子斜面保藏。2. 如權(quán)利要求1所述的制備螺旋霉素堿產(chǎn)生菌生二素灰色鏈霉菌孢子的方法，其特征 在于：平板培養(yǎng)基和斜面培養(yǎng)基配制過程中用85°C水浴15分鐘，滅菌時在0. lMPa、121°C的 條件下滅菌30分鐘，滅菌結(jié)束后保壓降溫。
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種制備螺旋霉素堿產(chǎn)生菌生二素灰色鏈霉菌孢子的方法。該方法中平板培養(yǎng)基的制備為：采用玉米淀粉4%、淀粉酶0.03%、黃豆餅粉1%、氯化鈉0.4%、七水硫酸鎂0.05%、碳酸鈣0.5%、瓊脂1%、余量為蒸餾水的比例配制平板培養(yǎng)基，將平板培養(yǎng)基經(jīng)過滅菌倒入培養(yǎng)皿中。本發(fā)明新的制備方法可以產(chǎn)生孢子，獲得的孢子斜面可制作牛奶管進(jìn)行菌種保藏，一般至少可保存6年。
【IPC分類】C12N3/00, C12R1/545
【公開號】CN105062948
【申請?zhí)枴緾N201510459519
【發(fā)明人】劉守強(qiáng), 馮匯, 朱曉莉, 趙抗洪, 劉儉國, 翟明禮, 孟新梅, 劉麗杰, 王雪潔, 薛娟, 陳雙, 王蕊, 周晨曦, 李慧
【申請人】天方藥業(yè)有限公司
【公開日】2015年11月18日
【申請日】2015年7月31日