專利名稱：一種獲得螺旋霉素單一組分菌種的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程技術在改造抗生素組分中的應用。
背景技術：
螺旋霉素(spiramycin)是一個16元環(huán)大環(huán)內酯類抗生素，通常含有I、II、III三個組分，它們在結構上的差異在于16元內酯環(huán)3位羥基上取代基的不同，分別為羥基(SP I)、乙?；?SP II)和丙?；?SP III)，結構式如圖A所示。SP I、SP II、SP III在生物學活性方面沒有什麼差別。
螺旋霉素在體內對許多細菌感染性疾病有良好的效果，尤其是在口服后吸收迅速，其在組織和細胞中的濃度比血漿中往往高出10倍以上。細胞內高濃度的特點使這類抗生素具有良好的體內活性。同時，這類藥物的安全性好，還對巨噬細胞系統(tǒng)和淋巴因子的產(chǎn)生具有促進作用，因而具有潛在的免疫調節(jié)作用[Desnottes JF等，Pathological Biology 1990，38(4)281-5；Li SY等，Int J Immunopharmacol 1986，8(6)657-64]。螺旋霉素的衍生物乙酰螺旋霉素已在臨床應用三十多年，取得了良好的社會效益和經(jīng)濟效益。
為了進一步提高螺旋霉素的體內活性，本實驗室曾以螺旋霉素為母核，利用基因工程技術對其結構中碳霉糖4”-羥基進行改造，獲得了以4”異戊酰螺旋霉素為主成分的新抗生素，曾被命名為生技霉素，后改名為必特螺旋霉素。生技霉素的制造方法獲得了中國專利[ZL97104440.6]；必特螺旋霉素高產(chǎn)菌株獲得中國專利[ZL 02148771.5]；必特螺旋霉素藥物組合物在抗感染性疾病中的應用也獲得中國專利[ZL 200310122420.9]。必特螺旋霉素的臨床試驗目前已經(jīng)進入III期研究階段。
由于參與微生物次級代謝酶底物特異性要求的非專一性，許多由微生物發(fā)酵產(chǎn)生的抗生素均為多組分。如慶大霉素C是由C1a、C1、C2、C2a等組成；乙酰螺旋霉素為4個組分，即單、雙乙酰螺旋霉素II和III。必特螺旋霉素是由螺旋霉素衍生的，螺旋霉素的母核上已有3個組分，4”位異戊?；怯僧愇祯；D移酶介導的，由于該酶的非特異性，導致必特螺旋霉素的組分十分復雜，即除了異戊酰螺旋霉素I、II、III以外，還有少量4”丁酰基、丙?；鸵阴；难苌铩Ｄ壳氨靥芈菪顾氐馁|量標準確定其含有9個組分，4”?；菪顾乜偤繛?0％，其中異戊酰螺旋霉素(I、II、III)3個組分的總含量為65％?？股匕l(fā)酵產(chǎn)品的多組分問題給藥品質量標準的制定以及生產(chǎn)過程的質量控制帶來了很大的困難和挑戰(zhàn)。同一抗生素由于生產(chǎn)菌種、發(fā)酵條件和提取工藝的不同，常常也會導致質量控制與分析的更加復雜化。所以，在不影響生物學活性的前提下獲得單一組分生產(chǎn)菌種，乃是抗生素研究和生產(chǎn)面臨的重要課題。目前，獲得抗生素產(chǎn)生菌單一組分的有效方法所見報導不多。江蘇微生物所經(jīng)過多年的努力利用誘變技術，獲得了產(chǎn)生單一組分的慶大霉素Cla菌種[趙敏等中國抗生素雜志1995，6478]；沈陽藥科大學熊宗貴等通過誘變及添加前體的方法，獲得了產(chǎn)生麥迪霉素A組分為主的菌種。然而，采用誘變技術獲得單一組分菌種的方法存在一定的機遇性，并且篩選工作量大，輔之以添加前體的方法，需要額外化學合成小分子前體，又增加了生產(chǎn)成本。
國外生產(chǎn)螺旋霉素的菌種為S.ambofaciens，該菌種產(chǎn)生的螺旋霉素組分I含量較高。我國螺旋霉素產(chǎn)生菌為S.spiramyceticus，產(chǎn)生組分I很少。因此，《藥典》中規(guī)定的乙酰螺旋霉素質量標準僅為II和III組分。從生物合成途徑研究可知，螺旋霉素II、III組分中3位乙?；虮；窃?6元環(huán)的普拉特諾內酯(platenolide)形成后，由3-O-?；D移酶(3-O-AT)催化產(chǎn)生的，如果在該產(chǎn)生菌中破壞其編碼基因，就不再能產(chǎn)生3-O-AT酶，從而不能產(chǎn)生II和III組分，由此，即可獲得主要產(chǎn)生螺旋霉素單組分I的菌種。
本發(fā)明目的在于，利用基因工程技術定向改造菌種染色體，以獲得主要產(chǎn)生單組分I的螺旋霉素產(chǎn)生菌。

發(fā)明內容
本發(fā)明根據(jù)16元環(huán)大環(huán)內酯抗生素生物合成基因同源性，參照碳霉素和麥迪霉素生物合成3-O-AT酶基因的相似性，設計了簡并性PCR引物，從螺旋霉素產(chǎn)生菌基因組擴增出了與之同源的DNA片段。進一步采用SON-PCR(single oligonucleotide nested PCR)技術，分別擴增獲得了其側翼的上下游序列，在獲得的3457bp DNA片段中，1594-2820nt為編碼螺旋霉素3-O-?；D移酶基因(L3-O-AT)。繼而在L3-O-AT基因兩測設計引物并插入合適的酶切位點，通過PCR獲得兩個與螺旋霉素產(chǎn)生菌基因組同源的基因片段(L1和L2)，并與溫敏型載體(pKC1139，攜帶阿泊拉霉素Am抗性標記)重組，獲得重組載體pKCL1-2。將pKCL1-2導入螺旋霉素產(chǎn)生菌，以Am抗性作為選擇性標記獲得轉化子，經(jīng)篩選及PCR鑒定，獲得Am敏感菌株。表明在螺旋霉素產(chǎn)生菌基因組L1和L2基因片段發(fā)生了雙交換，而且該菌株的L3-O-AT基因已被破壞，稱為L3-O-ATΔ。L3-O-ATΔ菌株經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)并對其產(chǎn)物提取后，HPLC和UV檢測證明，其基本只產(chǎn)生螺旋霉素組分I。
發(fā)明效果本發(fā)明利用基因工程技術對我國螺旋霉素產(chǎn)生菌的基因組進行改造，對其中參與產(chǎn)生組分II和III相關的3-OH酰化酶基因實施了破壞，獲得了主要產(chǎn)生螺旋霉素組分I的菌種。使用這樣的菌種，不僅能夠減少螺旋霉素及其衍生物的組分，而且可以簡化生產(chǎn)工藝、降低生產(chǎn)成本，同時，也更便于進行質量標準的制定和控制。


圖1重組載體pKCL1-2的構建；圖2螺旋霉素產(chǎn)生菌阻斷變株(L3-O-ATΔ)基因組PCR產(chǎn)物鑒定其中1-以螺旋霉素產(chǎn)生菌原株DNA為模板的PCR產(chǎn)物；2、3-以螺旋霉素產(chǎn)生菌阻斷變株(L3-O-ATΔ)為模板的PCR產(chǎn)物；M-DNA III。
圖3同源基因雙交換示意圖；圖4螺旋霉素產(chǎn)生菌阻斷變株(L3-O-ATΔ)發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC分析，其中圖4-A為螺旋霉素標準品；保留時間(RT)4.509為螺旋霉素組分I；5.352為螺旋霉素組分II；8.529為螺旋霉素組分III；圖4-B為螺旋霉素產(chǎn)生菌阻斷變株產(chǎn)物；(RT)4.514為螺旋霉素組分I；5.332為螺旋霉素組分II；8.580為螺旋霉素組分III。
具體實施例方式以下實施例僅為幫助本領域技術人員進一步理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
實施例1重組載體pKCL1-2的構建根據(jù)本實驗室完成和提交的基因數(shù)據(jù)庫信息DQ642742(SEQ ID No.1)，在SEQ ID No.1的1594-2820bp(3-OH?；富?的兩側或任意可以破壞該基因的區(qū)段設計以下4個引物，并插入4個任意設計的酶切位點，引物及酶切位點設計可不限于此例的描述。
1.AGTGTCTAGACGGCGCGCGGCACGGGGTTGAACTCXbaI(SEQ ID No.2)2.GACAAGCTTTGGATTCTCGCTCCTCTTTCGGGATGG HindIII(SEQ ID No.3)3.GACAAGCTTTGAGCGTGGCAGACCAGACCGCTCT HindIII(SEQ ID No.4)4.AGTGGAATTCCACCAGGGCAAGGTCGGCGTGCTCTG EcoRI(SEQ ID No.5)以螺旋霉素產(chǎn)生菌(中國微生物菌種保藏委員會藥學微生物菌種保藏中心編號CPHCC200108，該中心負責保藏并可向公眾提供相關菌種)總DNA為模板，以引物1、2和引物3、4分別PCR，獲得兩個同源臂L1(1.0kb)和L2(1.5kb)，酶切后L1和L2以及與可以轉入螺旋霉素產(chǎn)生菌的載體，如pKC1139(英國，John Innes Centre，Norwich Research Park，Colney Norwich R4 7UH)分別連接，獲得重組載體pKCL1-2(圖1)。(SEQ ID No.1)gtaactcgcg gcgagcagca gcgtgcaggt gcagaagcgg gagctgctgc gcaaactcaa 60ggaagcgcgg tccaccaagc agaccccctc gtcgtgaagg cctccacctg aggggaccgg 120ctgcgtatgg gctttcgtac gcagccggtt ccccctcccc gaggtccaca ggtccgagcg 180tccacaggtc cgggctgcgg gaacgccggc ccccggaata cgggctccga agtgccggaa 240ctcggagagc gggcccacga agcatcagca gtcggccgtc cgttggtgtg cgcggaacag 300cgcggtctac tccgggaccg tgaggtcctt gacccgatcg gcgggccgca cccccgcgcc 360gcgcacgaac tgggcgtgtc cgcggcgcag cacctttcgc gcggcctcgc ctatcgtcat 420ctggccggtg tcgaagacct gctgggtgaa ccgctgatag gcggtgcgct cacgccaggg 480cacgggcggc ttgcgatggg gggtcaccat caatgtctgg gtatcggcgc gcggcacggg 540gttgaactcc tgtcgcgaga aggccagccc tttctcaaac gcgtaccacg gctcccactg 600ggcgttgaag agatttccgc cccaggctcc ggtccgcttt cccacatact cgcgctgaag 660cagggacacg ccctggcgca tccggtccgg acccaactcc aggcaacgtc tcagtatctt 720ggtgccggag acaaggggca gattgccaac caaccggacc ggctgccctg gcaattgcag 780
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實施例3阻斷變株發(fā)酵產(chǎn)物的分析鑒定阻斷變株的發(fā)酵培養(yǎng)及產(chǎn)物的提取按照文獻[王以光等，生物工程學報，1992年8(1)1-14]進行，經(jīng)提取的產(chǎn)物溶于甲醇后，用島津LC-10Avp高效液相色譜儀，SPD-M10Avp二極管陳列檢測器，CLASS-VP工作臺，采用Kromasil C18柱，4.6×150mm；流動相甲醇/1％磷酸二氫鈉(53/47)；流速1ml/min進行分析(圖4)。由圖可見，螺旋霉素產(chǎn)生菌原株主要產(chǎn)生螺旋霉素II和III，螺旋霉素組分I產(chǎn)量很少(約9.5％)；而3-OH酰化酶基因阻斷變株(L3-O-ATΔ)主要產(chǎn)生螺旋霉素組分I(約72％)。結果表明，本發(fā)明確實獲得了主要產(chǎn)生螺旋霉素組分I的菌種。
序列表<110>中國醫(yī)學科學院醫(yī)藥生物技術研究所<120>一種獲得螺旋霉素單一組分菌種的方法<160>1<210>1<211>3457<212>DNA<213>螺旋鏈霉菌(Streptomyces spiramyceticus F21)<220>
<221>CDS<222>(1594)...(2820)<223>
<400>1gtaactcgcg gcgagcagca gcgtgcaggt gcagaagcgg gagctgctgc gcaaactcaa60ggaagcgcgg tccaccaagc agaccccctc gtcgtgaagg cctccacctg aggggaccgg120ctgcgtatgg gctttcgtac gcagccggtt ccccctcccc gaggtccaca ggtccgagcg180tccacaggtc cgggctgcgg gaacgccggc ccccggaata cgggctccga agtgccggaa240ctcggagagc gggcccacga agcatcagca gtcggccgtc cgttggtgtg cgcggaacag300cgcggtctac tccgggaccg tgaggtcctt gacccgatcg gcgggccgca cccccgcgcc360gcgcacgaac tgggcgtgtc cgcggcgcag cacctttcgc gcggcctcgc ctatcgtcat420ctggccggtg tcgaagacct gctgggtgaa ccgctgatag gcggtgcgct cacgccaggg480cacgggcggc ttgcgatggg gggtcaccat caatgtctgg gtatcggcgc gcggcacggg540gttgaactcc tgtcgcgaga aggccagccc tttctcaaac gcgtaccacg gctcccactg600ggcgttgaag agatttccgc cccaggctcc ggtccgcttt cccacatact cgcgctgaag660cagggacacg ccctggcgca tccggtccgg acccaactcc aggcaacgtc tcagtatctt720ggtgccggag acaaggggca gattgccaac caaccggacc ggctgccctg gcaattgcag780tgtcagaaag tcctcgttca ccaccgtgac atcgggcagc gattcggcgg ccagccgacg840ggcccattgg gtgtcgattt ccaccgtgag taagggactt ccggtcgatg cgagcgcttt900ggtcacccgg ccggatcccg cgcctatctc gacggtcaga aggtcattcg gcgagccggg960
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1.一種獲得螺旋霉素單一組分菌種的方法，其特征是通過阻斷螺旋霉素產(chǎn)生菌中參與產(chǎn)生組分II和III相關的3-OH?；富颍瑥亩@得主要產(chǎn)生螺旋霉素組分I的菌種。
2.如權利要求1所述的方法，其特征是以SEQ ID No1序列為模板，在3-OH?；富虻膬蓚然蛉我饪梢云茐脑摶虻膮^(qū)段設計4個引物，并插入4個任意設計的酶切位點，經(jīng)PCR獲得兩個1.0kb左右的同源臂，酶切后將兩個同源臂互連，另外兩側與能轉入螺旋霉素產(chǎn)生菌的載體相連接，獲得重組載體，并轉入螺旋霉素產(chǎn)生菌，以載體上的選擇性標記挑取轉化子，通過篩選抗性標記和PCR驗證，獲得3-OH?；富虮黄茐牡霓D化子，經(jīng)發(fā)酵及對產(chǎn)物提取后HPLC分析，證明該轉化子為主要產(chǎn)生螺旋霉素組分I的菌種。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程技術在改造抗生素組分中的應用，主要是對螺旋霉素產(chǎn)生菌中參與產(chǎn)生組分II和III相關的3－OH?；富驅嵤┝似茐?，從而獲得只產(chǎn)生螺旋霉素組分I的菌種，使用這樣的阻斷變株，不僅能夠減少螺旋霉素及其衍生物的組分，而且可以簡化生產(chǎn)工藝、降低生產(chǎn)成本，同時，也更便于進行質量標準的制定和控制。
文檔編號C12N1/15GK1884485SQ200610087230
公開日2006年12月27日 申請日期2006年6月13日 優(yōu)先權日2006年6月13日
發(fā)明者王以光, 武臨專, 馬春燕, 戴劍漉, 李京艷 申請人:中國醫(yī)學科學院醫(yī)藥生物技術研究所