專利名稱：吲哚咔唑生物堿及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新穎的吲哚咔唑生物堿類化合物，由海洋來源的馬杜拉放線菌Actinomadurasp.007發(fā)酵制備該吲哚咔唑生物堿類化合物的方法，以及該類化合物在制備細胞周期抑制劑、腫瘤細胞增殖抑制劑或抗腫瘤劑中的用途。
背景技術(shù)：
吲哚咔唑類生物堿星形孢菌素(staurosporine)自從鏈霉菌AM-2282產(chǎn)物中分離報道(S.Omura，Y.Iwai，A.Nalagawa，et al.，J.Antibiot.，1977，30，275；A.Furusaki，N.Hashiba，T.Matsumoto，et al.，J.Chem.Soc.Chem.Comm.，1978，800-801)以來陸續(xù)發(fā)現(xiàn)具有多種重要的生物活性，如抗菌、擴張血管、細胞毒活性以及抑制血小板凝集和抑制蛋白激酶C等。由于星形孢菌素苷元對其相關(guān)生物活性具有重要意義(D.Meksurriyen，G.A.Cordell，J.Nat.Prod.1988，51，884-892)，因而以星形孢菌素苷元為母體的吲哚咔唑生物堿類化合物作為重要的生物活性分子受到極大關(guān)注。
含有星形孢菌素苷元骨架的吲哚咔唑生物堿類化合物除了非苷類衍生物以外主要還有以Staurosporine、K-252a(H.Kase，K.Iwahashi，Y.Matsuda，J.Antibiot.，1986，39，1059-1065)和K-252d(T.Yasuzawa，T.Iida，M.Yoshida，et al.，J.Antibiot.，1986，39，1072-1078)為代表的三個類型的苷類化合物。這四大吲哚咔唑生物堿類化合物均已從自然界分離得到，而且數(shù)百個苷類衍生物也已被人工合成(金井文彥，網(wǎng)城 宣善，北村 雄志，等，WO01/004125，國際
公開日2001年1月18日；マイケル·イ一·ルイス，コラ·ネフ，ヅル·ロバ一ッ-ルイス，等，特開2003-113184)。但迄今尚未見有關(guān)糖環(huán)上并有雜環(huán)的天然星形孢菌素類似物的報道。另外，經(jīng)X-線單晶衍射分析(A.Furusaki，N.Hashiba，T.Matsumoto，et al.，J.Chem.Soc.Chem.Commun.，1978，800-801；N.Funato，H.Takayanagi，Y.Konda，et al.，Tetreahedron Lett.，1994，35，1251-1254)和核磁共振研究(P.D.Davis，C.H.Hill，W.A.Thomas，et al.，J.Chem.Soc.Chem.Commun.，1991，182-184)，已確定了星形孢菌素及其類似物的吡喃環(huán)在固態(tài)和溶液狀態(tài)中的構(gòu)型，即游離堿取椅式構(gòu)型，而4′-N被質(zhì)子化的鹽則取船式構(gòu)型(其中O-1′和C-4′為船頭和船尾)。但迄今尚未見吡喃環(huán)取C-2′和C-5′為船頭和船尾的船式構(gòu)型的化合物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一類新化學(xué)結(jié)構(gòu)的具有細胞周期抑制、腫瘤細胞增殖抑制等抗腫瘤活性的化合物，具體而言，是要提供一種在糖環(huán)3′和4′位并氧氮雜環(huán)、糖吡喃環(huán)取C-2′和C-5′為船頭和船尾的船式構(gòu)型的星形孢菌素類化合物。
本發(fā)明的目的還在于提供該類新化合物的制備方法。
本發(fā)明的另一目的在于提供該類新化合物在制備細胞周期抑制劑、細胞凋亡誘導(dǎo)劑、腫瘤細胞殺傷劑、腫瘤細胞增殖抑制劑或抗腫瘤劑中的用途。
本發(fā)明首次從自然界微生物發(fā)酵物中發(fā)現(xiàn)了一種新的吲哚咔唑生物堿類式I化合物 式I式I中，R1、R2、R4、R5、R6、R7均可為氫、羥基、烴氧基、酰氧基、氨基、酰氨基；R3和R8可為氫、烴基、羥基、?；?。
優(yōu)選的本發(fā)明化合物是R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7均為氫，R8為甲基的式I化合物。
本發(fā)明所提供化合物其最顯著的結(jié)構(gòu)特點在于在糖環(huán)3′和4′位并氧氮雜環(huán)、且吡喃環(huán)取C-2′和C-5′為船頭和船尾的船式構(gòu)型。
本發(fā)明式I化合物的制備方法是，通過發(fā)酵培養(yǎng)可生產(chǎn)吲哚咔唑生物堿類化合物的微生物，如放線菌007株，首先獲取含式I化合物的發(fā)酵產(chǎn)物，再利用相關(guān)專業(yè)技術(shù)人員熟知的分離純化技術(shù)，如液液萃取、柱層析、高效液相等，純化制備并獲得式I化合物。
本發(fā)明的實施例中列舉了利用放線菌007株制備優(yōu)選的本發(fā)明式I化合物的實例。
該放線菌007株由從青島近海海泥樣品中分離，并經(jīng)分類學(xué)研究鑒定為馬杜拉放線菌屬的一株微生物Actinomadura sp.007。該菌株已于2004年12月13日保藏在中國典型培養(yǎng)物保減中心(保減編號CCTCC M204076)。該馬杜拉放線菌Actinomadura sp.007 CCTCCM204076株具有如下微生物菌學(xué)特征(見表1)
表1 007菌株的微生物菌學(xué)特征

需要特別說明的是，經(jīng)發(fā)酵微生物制取本發(fā)明式I化合物的方法可采用其它任何能生產(chǎn)吲哚咔唑生物堿類化合物的微生物，只要能生產(chǎn)該類化合物的微生物均可用作產(chǎn)素菌用于制備式I化合物。
本發(fā)明采用麗絲胺羅丹明B(sulforhodamine B，SRB)法、四氮唑鹽(MTT)還原法和流式細胞術(shù)結(jié)合顯微鏡下檢測細胞形態(tài)特征的方法，測試評價了本發(fā)明式I化合物對小鼠乳腺癌tsFT210細胞、人肺癌A549細胞、人肝癌BEL-7402細胞、小鼠白血病P388細胞、人白血病HL60細胞的細胞增殖抑制、細胞周期抑制和細胞凋亡誘導(dǎo)以及對腫瘤細胞的直接殺傷等作用。實驗證實，式I化合物對腫瘤細胞可通過抑制細胞周期周轉(zhuǎn)、誘發(fā)癌細胞凋亡或直接的殺傷等方式，顯示抑制腫瘤細胞增殖的生物學(xué)活性，從而發(fā)揮其抗腫瘤作用，尤其對人肺癌A549細胞具有非常強的抗腫瘤活性。
本發(fā)明的式I化合物與藥物可接受的各種載體、賦形劑或輔料配伍，可制成作細胞周期抑制劑或腫瘤細胞殺傷劑等抗腫瘤藥物，用于腫瘤的治療。
本發(fā)明的式I化合物還可作為抑制細胞周期的低分子生物探針用于生命科學(xué)研究。當(dāng)把式I化合物作為細胞周期抑制劑用于生命科學(xué)研究時，可溶于甲醇或含水甲醇中，也可溶于二甲基亞砜的含水溶液中加以應(yīng)用。
具體實施例方式下面的實施例可以使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
在如下的實施例中所指的化合物I的化學(xué)結(jié)構(gòu)是式I化合物，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7為氫，R8為甲基，吡喃環(huán)取C-2′和C-5′為船頭和船尾的船式構(gòu)型 式I實施例1 化合物I的發(fā)酵生產(chǎn)及分離精制1發(fā)酵生產(chǎn)產(chǎn)素菌的發(fā)酵培養(yǎng) 按培養(yǎng)微生物的常規(guī)方法，取馬杜拉放線菌Actinomadura sp.007 CCTCC M204076適量，接種于高氏合成1號瓊脂固體斜面培養(yǎng)基上，在28攝氏度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天。
取斜面培養(yǎng)7天的馬杜拉放線菌Actinomadura sp.007 CCTCC M204076適量，接種到一個含100毫升種子培養(yǎng)液(培養(yǎng)基組成葡萄糖20.0克，K2HPO40.5克，MgSO40.5克，牛肉膏3.0克，玉米漿3.0克，酵母膏10.0克，淀粉10.0克，CaCO32.0克，人工海水1升，調(diào)pH7.0)的三角燒瓶中，在28℃、120轉(zhuǎn)/分鐘條件下?lián)u床培養(yǎng)48小時，獲種子培養(yǎng)液。取該種子培養(yǎng)液，按5％接種量分別接種于100個內(nèi)裝100毫升生產(chǎn)培養(yǎng)液(培養(yǎng)基組成同上)的三角燒瓶中，裝載于28℃、120轉(zhuǎn)/分鐘搖床上進行為期7天的生產(chǎn)發(fā)酵，獲得含有吲哚咔唑生物堿類目標化合物的發(fā)酵物。相同條件下發(fā)酵兩次，共獲發(fā)酵物約20升。
2含化合物I的菌體粗提物的制備將上述馬杜拉放線菌Actinomadura sp.007 CCTCC M204076的發(fā)酵物(約20升)抽濾，濾取菌體部分，用1.5升80％丙酮水溶液浸泡并在室溫下攪拌過夜提取，4000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，取上清液，減壓濃縮至不含丙酮，所得水層用等體積乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液減壓濃縮，得含化合物I的菌體粗浸膏(4.8克)。
3化合物I的分離精制取含化合物I的Actinomadura sp.007 CCTCC M204076的菌體粗浸膏(4.8克)，用氯仿-甲醇混合溶劑溶解后加20克200-300目硅膠H(青島海洋化工集團公司產(chǎn)品)拌樣，添加到裝填有50克青島海洋化工集團公司產(chǎn)薄層層析用硅膠H的玻璃減壓柱上，以氯仿→氯仿-甲醇混合液為洗脫劑，進行減壓柱層析。洗脫溶劑的極性通過提高氯仿中甲醇的用量來梯度遞增，每個洗脫流份兒分別接收150毫升，根據(jù)薄層層析和活性檢測結(jié)果，進行合并，得到含化合物I的活性組份Fr-3(520毫克，氯仿-甲醇98∶2→85∶15洗脫物)。將Fr-3同法上硅膠H減壓柱，以石油醚-丙酮混合液為洗脫劑，進行減壓柱層析，經(jīng)薄層層析和活性檢測，合并相關(guān)流份，得到用石油醚-丙酮(5∶5)洗脫的目標化合物部分，再經(jīng)SephadexLH-20柱層析分離(氯仿-甲醇5∶5洗脫)，得到含化合物I的目標組分Fr-3-6。將該組分Fr-3-6干法上反相硅膠RP-18減壓柱，用甲醇-水混合溶劑洗脫，經(jīng)HPLC檢測合并，得到化合物I粗品，再經(jīng)半制備HPLC(Capcell Pak C18柱，5μm，20×250mm；流動相40％乙腈-水，流速4毫升/分鐘，檢測波長288納米)純化制備，得化合物I純品(15毫克，保留時間15分鐘)。
化合物I淡黃色結(jié)晶(氯仿-甲醇)，mp 283.4-285.5℃，[α]D20+83.2(c 0.10，MeOH)，分子式C28H22N4O4。正離子TOF-MS m/z479[M+H]+；正離子HR-TOF-MS實測值479.1704，C28H23N4O4[M+H]+計算值479.1719。UVλmaxMeOHnm(ε)232(19613)，243(19020)，275(19720)，290(33212)，318(9936)，332(9636)。IR(KBr)νmaxcm-13377(NH)，2924，2935(CH2)，1739(惡唑酮C＝O)，1677(內(nèi)酰胺C＝O)，1589，1458，1399，1354，1321，1275，1228，1150，1133，1105，1030，774，751。1H及13CNMR數(shù)據(jù)見表2。
表2 化合物I在氘代DMSO中的600MHz1H和150MHz13C NMR數(shù)據(jù)


實施例2 化合物I的體外抗腫瘤活性測試1實驗樣品及實驗方法被測樣品溶液的配制 測試樣品為上述實施例1中分離精制的化合物I純品。精密稱取適量樣品，用甲醇配制成所需濃度的溶液，供測活性。
細胞系及細胞的繼代培養(yǎng) 采用人肺癌A549細胞、人肝癌BEL-7402細胞、人白血病HL60細胞、小鼠乳腺癌tsFT210細胞及小鼠白血病P388細胞等癌細胞系。各種細胞均用含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，在32℃(tsFT210和P388細胞)或在37℃(A549、HL60及BEL-7402細胞)于通入5％二氧化碳的培養(yǎng)箱中繼代培養(yǎng)。
細胞增殖抑制活性測試方法麗絲胺羅丹明B(SRB)法 取對數(shù)生長期的人肺癌A549細胞、人肝癌BEL-7402細胞或小鼠乳腺癌tsFT210細胞，用新鮮的RPMI-1640培養(yǎng)基配制成密度為每毫升2×105個細胞的細胞懸液，按每孔200微升接種于96孔板中，每孔加入2微升不同濃度的樣品或空白溶液，32℃下培養(yǎng)17小時(tsFT210細胞)或37℃下培養(yǎng)24小時(A549或BEL-7402細胞)。取藥物作用下培養(yǎng)后的細胞，首先在光學(xué)顯微鏡下觀察藥物處理引起的形態(tài)學(xué)變化，判斷有無細胞周期抑制，細胞凋亡或細胞壞死的形態(tài)學(xué)特征，繼而在4℃、3000轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，吸去上清。每孔細胞中加入20％三氯醋酸50微升，置于4℃固定1小時，用水沖洗5次并空氣干燥。每孔加入0.4％SRB的醋酸溶液50微升并在室溫靜置30分鐘。用1％醋酸水清洗4次，除去未結(jié)合的游離SRB染料。每孔加入150微升Tris緩沖液(10mmol/L，pH10.5)溶解蛋白結(jié)合染料并利用MD公司產(chǎn)SPECTRA MAX Plus型酶標儀測定每孔在520nm處的光密度(OD)值。在同一塊96孔板中樣品的每個濃度均設(shè)置三孔，另設(shè)三孔空白對照和無細胞調(diào)零孔(如果藥物有顏色要做相應(yīng)藥物濃度無細胞調(diào)零)。各孔OD值先做相應(yīng)無細胞調(diào)零，再取三孔平均OD值按IR％＝(OD空白對照-OD樣品)/OD空白對照×100％式計算每個濃度下的細胞增殖抑制率(IR％)。
四氮唑鹽(MTT)法 取對數(shù)生長期的人白血病HL60細胞和小鼠白血病P388細胞，將細胞密度調(diào)至每毫升2×105個細胞，按每孔200微升接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，于37℃通入5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時。每孔加樣品液或空白液各2微升，培養(yǎng)24小時后，每孔加MTT液(MTT的每毫升5毫克生理鹽水溶液)10微升，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，37℃、2000轉(zhuǎn)/分鐘離心8分鐘，吸去上清。每孔加入DMSO各100微升，在微量振蕩器上振蕩15分鐘，至結(jié)晶完全溶解后，利用MD公司產(chǎn)SPECTRA MAX Plus型酶標儀測定每孔在570nm處的吸光值(OD值)。在同一塊96孔板中樣品的每個濃度均設(shè)置三孔，另設(shè)三孔空白對照和無細胞調(diào)零孔(如果藥物有顏色要做相應(yīng)藥物濃度無細胞調(diào)零)。各孔OD值先做相應(yīng)無細胞調(diào)零，再取三孔平均OD值按IR％＝(OD空白對照-OD樣品)/OD空白對照×100％式計算每個濃度下的細胞增殖抑制率(IR％)。
流式細胞術(shù)取對數(shù)生長期的tsFT210細胞，用新鮮的RPMI-1640培養(yǎng)基配制成密度為每毫升2×105個細胞的細胞懸液，按每孔0.5毫升接種于24孔板中，每孔加入5微升不同濃度的樣品溶液，32℃下培養(yǎng)17小時。取藥物作用下培養(yǎng)后的細胞，首先在光學(xué)顯微鏡下觀察藥物處理引起的形態(tài)學(xué)變化，判斷有無細胞周期抑制，細胞凋亡或細胞壞死的形態(tài)學(xué)特征，必要時進行拍照。繼而將細胞分別從24孔板轉(zhuǎn)移至1.5毫升Eppendorf離心管中，4℃下3000轉(zhuǎn)/分離心3分鐘，吸去上清液，加0.5毫升磷酸緩沖溶液(PBS)震蕩洗滌一次，相同條件下離心收集細胞，加150微升碘化丙啶(PI)水溶液(在100毫升水中含5毫克PI、100毫克檸檬酸納和200毫克NP-40)，4℃下染色30分鐘后，加入150微升PBS稀釋，用流式細胞儀分析測定細胞中DNA的含量分布。細胞在細胞周期各時相中的分布利用庫爾特公司產(chǎn)計算機軟件WinCycle進行分析計算。
2實驗結(jié)果化合物I對癌細胞增殖的抑制活性在SRB法測試中，化合物I在21和2.1微摩爾的濃度下對小鼠乳腺癌tsFT210細胞增殖的抑制率分別為28.3％和21％。
在SRB法或MTT法測試中，不同濃度的化合物I對人肺癌A549細胞、人肝癌BEL-7402細胞、人白血病HL60細胞和小鼠白血病P388細胞的增殖抑制結(jié)果見表3。
表3 不同濃度的化合物I對癌細胞增殖的抑制率(％)

流式細胞術(shù)檢測分析結(jié)果tsFT210細胞經(jīng)化合物I處理17小時后測得的流式細胞術(shù)結(jié)果見表4。如表4所示，化合物I當(dāng)在每毫升10微克以上濃度時可將tsFT210細胞的細胞周期顯著阻滯在G2/M期，在每毫升100微克時還顯示了較弱的細胞凋亡誘導(dǎo)活性。
表4 tsFT210細胞經(jīng)化合物I處理17小時后在細胞周期各時相中的相對分布

注本表數(shù)據(jù)系將tsFT210細胞經(jīng)碘化丙啶染色后用流式細胞術(shù)分析測得結(jié)果。
形態(tài)學(xué)檢測結(jié)果在光學(xué)倒置顯微鏡下觀測到，經(jīng)高濃度的化合物I處理后，各種癌細胞呈不同程度的典型的壞死性細胞的形態(tài)學(xué)特征，表明化合物I在高濃度時對哺乳動物癌細胞具有一定的直接殺傷性細胞毒活性。
3結(jié)論化合物I對多種人癌細胞及哺乳動物癌細胞具有直接殺傷作用和對細胞增殖的抑制、對細胞周期的G2/M期抑制以及細胞凋亡誘導(dǎo)等抗腫瘤活性，尤其是對人肺癌A549細胞具有非常強的增殖抑制作用。這些結(jié)果表明化合物I可制成細胞周期抑制劑或腫瘤細胞殺傷劑等抗腫瘤藥物，用于腫瘤的治療，也可作為抑制細胞周期的低分子生物探針用于生命科學(xué)研究。
權(quán)利要求
1.式I化合物，其中，R1、R2、R4、R5、R6、R7為氫、羥基、烴氧基、酰氧基、氨基或酰氨基；R3和R8為氫、烴基、羥基或?；贿拎h(huán)取C-2′和C-5′為船頭和船尾的船式構(gòu)型。 式I
2.權(quán)利要求1所述的式I化合物，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7均為氫；R8為甲基。
3.權(quán)利要求1所述式I化合物的制備方法，其特征是發(fā)酵培養(yǎng)馬杜拉放線菌屬的吲哚咔唑生物堿類化合物的生產(chǎn)菌，獲取含有該類化合物的發(fā)酵物，再從該發(fā)酵物中分離純化并制備出式I化合物。
4.權(quán)利要求3所述式I化合物的制備方法，其中所述吲哚咔唑生物堿類化合物的生產(chǎn)菌是馬杜拉放線菌Actinomadura sp.007 CCTCC M204076。
5.權(quán)利要求1所述的式I化合物在制備細胞周期抑制劑、細胞凋亡誘導(dǎo)劑或腫瘤細胞殺傷劑中的用途。
6.權(quán)利要求1所述的式I化合物在制備腫瘤細胞增殖抑制劑中的用途。
7.權(quán)利要求1所述的式I化合物在制備抗腫瘤藥物中的用途。
8.馬杜拉放線菌Actinomadura sp.007，其保藏編號為CCTCC M204076。
9.權(quán)利要求8所述的菌株用于生產(chǎn)權(quán)利要求1所述的式I化合物的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及新穎的吲哚咔唑類生物堿及其制備方法和用途。本發(fā)明采用海洋來源的馬杜拉放線菌Actinomadura sp.007發(fā)酵制備新穎化學(xué)結(jié)構(gòu)的吲哚咔唑生物堿類化合物，并經(jīng)實驗證實可作為細胞周期抑制劑、腫瘤細胞增殖抑制劑或抗腫瘤劑。
文檔編號C12P17/18GK1683374SQ20051005143
公開日2005年10月19日 申請日期2005年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月7日
發(fā)明者崔承彬, 韓小賢, 顧謙群, 朱偉明, 劉紅兵 申請人:中國海洋大學(xué)