專利名稱：檢測酪絲亮肽抗肝癌效果的方法及所用試劑盒與基因芯片的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種檢測藥物抗癌效果的方法以及制劑，特別是涉及一種分子水平檢測酪絲亮肽抗肝癌效果的方法及所用試劑盒與基因芯片。
背景技術：
原發(fā)性肝癌是人類最常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居世界主要癌癥的第八位，死亡率高，在惡性腫瘤死亡率中僅次于胃癌、食道癌而居第三位。中國是原發(fā)性肝癌的高發(fā)國家，發(fā)病率和死亡率均居世界之首，死亡率在各種癌癥中占第二位，每年約有11萬人死于肝癌，約占全世界肝癌死亡數的45％左右。肝癌的治療目前仍以手術、放療及化療作為主要手段，但肝癌早期發(fā)現困難，手術切除率低，因而尋找有效的治療藥物是提高肝癌生存率的關鍵。
酪絲亮肽(Tyrosyl-seryl-leucine，YSL)，是一種三肽化合物，其化學結構組成為L-酪氨酰-L-絲氨酰-L-亮氨酸，分子式為C18H27N306，分子量為381.42，分子結構式如下所示 動物實驗結果顯示，酪絲亮肽顯示出一定的抑制腫瘤細胞生長的作用。該藥在劑量為40～80μg/kg時，可使腹水型肝癌H22小鼠生命延長率達60％～90％。經四次重復實驗結果穩(wěn)定。在體外實驗中酪絲亮肽顯示出對人肝癌BEL-7402細胞增殖的抑制作用，最佳抑瘤率可達36.29％。在裸鼠移植瘤實驗中，給藥劑量為160～320μg/kg時，酪絲亮肽可以顯著抑制人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤的生長，經五次重復實驗，抑瘤率達40～50％。
酪絲亮肽在臨床實驗中也顯示出良好的藥效，能夠明顯延長肝癌病人的生存時間。但在臨床研究中也發(fā)現，酪絲亮肽的抗肝癌作用在不同病人的個體之間存在差異，即不同的個體對酪絲亮肽的敏感度存在差異。有些病人在給予酪絲亮肽治療后，腫瘤生長發(fā)生了明顯抑制；而有些病人在注射酪絲亮肽后腫瘤生長未受到明顯影響。
抗癌治療是一個長期的過程，在治療過程中需要經常性的評價藥物對病人的治療效果。如果某種藥物在治療過程中對該病人確實能起效，則提示可以繼續(xù)施用該藥物進行治療。如果該病人對此種藥物不敏感，則應該盡快停止預定治療方案，減少藥物毒副作用，并改用其他方案繼續(xù)治療?，F階段，一種抗癌藥物是否對病人能發(fā)揮作用的評判往往是通過觀察施用藥物后病人腫瘤的形態(tài)變化。但從施用藥物到腫瘤形態(tài)發(fā)生變化往往需要較長的一段時間，在這段時間內，該藥物對該病人是否能起療效則無法預知。酪絲亮肽作為一種抗肝癌的新藥，同樣也面臨這樣的問題。
線粒體是細胞內的能量合成場所，線粒體內膜上，主要包括由氧化還原酶復合體組成的呼吸鏈，ATP合成酶以及腺苷轉運體。呼吸鏈由70多種多肽組成，按氧化還原電勢的高低，可以分為四個復合體。分別為復合體I(NADH脫氫酶)、II(琥珀酸脫氫酶)、III(細胞色素還原酶)、IV(細胞色素氧化酶)。電子經呼吸鏈最終傳遞給氧，并在傳遞的過程中形成跨膜質子梯度，作為高能磷酸化合物形成的動力，在ATP合成酶的作用下ADP經磷酸化生成ATP，供給細胞代謝所需的能量。NDUFA2，NDUFA10和NDUFS1是復合體I(NADH脫氫酶)的組成部分，SUCLG1是復合體II(琥珀酸脫氫酶)的組成成分，這些基因的表達水平下降會引起細胞呼吸鏈功能的受損，從而影響細胞線粒體的功能。
Calreticulin是內質網中的一種鈣結合蛋白，對于細胞內鈣穩(wěn)態(tài)的調節(jié)以及鈣信號的傳遞有重要作用。Calreticulin過表達可增加Ca2+流通過內質網，減少線粒體Ca2+及膜的勢能，使兩種細胞器間Ca2+更新的增加。
PI3K途徑是細胞內一條重要的信號傳導通路，在凋亡、衰老、增殖等細胞生命活動中起重要作用。PTEN及AKT是此通路上起相反作用的兩個制衡因素。PTEN功能的增強可抑制PI3K通路的細胞增殖信號傳遞，這將使其下游的AKT不被激活。
PTEN是位于人類10q23染色體上的腫瘤抑制基因，PTEN去磷酸化活化后，具有蛋白及脂質磷酸酶的雙重作用。PTEN的蛋白磷酸酶作用能去掉酪氨酸上的磷酸，此作用與許多癌蛋白功能相反，而且可能因此與許多癌蛋白作用于共同的底物，發(fā)揮抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用。AKT則在多種細胞活動中發(fā)揮重要作用，AKT激酶被磷酸化活化后可通過磷酸化調節(jié)許多靶點，各種激酶、轉錄因子及其它調節(jié)分子。其中包括使促進凋亡靶基因(如Bad等)磷酸化，從而直接延長細胞生存時間。AKT還可影響細胞周期某些因子而推動細胞周期的進展。
在PTEN抑制PI3K活性而致AKT不被激活時，通路下游的p21、p27將被激活阻抑細胞周期，抗細胞增殖。p21和p27屬于對CYC-CDK(細胞周期素-細胞周期素依賴激酶)復合物起抑制作用的Cip/Kip蛋白(p21、p27、p57)家族。p27為PTEN激活后抑制細胞周期演進的靶位點。激酶磷酸化抑制因子可取消其作用而促進細胞周期的進展。p21幾乎可與每一種CYC-CDK復合物結合，使Rb蛋白和p53蛋白不能磷酸化而抑制細胞進入S期。p21還能抑制PCNA與DNA多聚酶的結合，從而抑制DNA復制的延伸過程，造成細胞周期阻抑，使腫瘤細胞走向凋亡。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的就是為了解決以上問題，提供一種在分子水平快速檢測酪絲亮肽抗肝癌效果的方法，以及所用的試劑或基因芯片。
為實現上述目的，本發(fā)明采用了以下技術方案本發(fā)明公開了一種檢測酪絲亮肽抗肝癌效果的方法，所述方法包括步驟在酪絲亮肽作用后的生物材料中，檢測基因NDUFA2、NDUFA10、NDUFS1、SUCLG1、Calreticulin、PTEN、Akt1、Akt2、P21或P27表達水平的變化情況；當檢測結果為在酪絲亮肽作用后，基因NDUFA2、NDUFA10、NDUFS1、SUCLG1、Akt1、Akt2的表達水平下降，基因Calreticulin、PTEN、P21、P27的表達水平上升，則表明酪絲亮肽對該生物材料具有抗肝癌的效果。
具體的，所述在酪絲亮肽作用后的生物材料中，檢測基因NDUFA2、NDUFA10、NDUFS1、SUCLG1、Calreticulin、PTEN、Akt1、Akt2、P21或P27表達水平的變化情況，是指，采用反轉錄PCR 的方法檢測所述生物材料中該十個基因的mRNA在酪絲亮肽作用前后的表達變化情況，當在酪絲亮肽作用后，基因NDUFA2、NDUFA10、NDUFS1、SUCLG1、Akt1、Akt2的mRNA表達水平下降，基因Calreticulin、PTEN、P21、P27的mRNA表達水平上升，則表明酪絲亮肽對該生物材料具有抗肝癌的效果。
或者具體的，所述在酪絲亮肽作用后的生物材料中，檢測基因NDUFA2、NDUFA10、NDUFS1、SUCLG1、Calreticulin、PTEN、Akt1、Akt2、P21或P27表達水平的變化情況，是指，采用基因芯片的方法，檢測所述生物材料中該十個基因的cDNA在酪絲亮肽作用前后的表達變化情況，當在酪絲亮肽作用后，基因NDUFA2、NDUFA10、NDUFS1、SUCLG1、Akt1、Akt2的cDNA表達水平下降，基因Calreticulin、PTEN、P21、P27的cDNA表達水平上升，則表明酪絲亮肽對該生物材料具有抗肝癌的效果。
所述基因NDUFA2的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.23中第74～373位堿基所示的序列，該SEQ ID No.23中第74～373位范圍內的堿基為該基因的開放閱讀框(ORF)所在區(qū)域。
所述基因NDUFA10的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.24中第81～1148位堿基所示的序列；該SEQ ID No.24中第81～1148位范圍內的堿基為該基因的開放閱讀框(ORF)所在區(qū)域。
所述基因NDUFS1的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.25中第128～2311位堿基所示的序列；該SEQ ID No.25中第128～2311位范圍內的堿基為該基因的開放閱讀框(ORF)所在區(qū)域。
所述基因SUCLG1的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.26中第32～1033位堿基所示的序列；該SEQ ID No.26中第32～1033位范圍內的堿基為該基因的開放閱讀框(ORF)所在區(qū)域。
所述基因Calreticulin的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.27中第69～1322位堿基所示的序列；該SEQ ID No.27中第69～1322位范圍內的堿基為該基因的開放閱讀框(ORF)所在區(qū)域。
所述基因PTEN的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.28中第1032～2243位堿基所示的序列；該SEQ ID No.28中第1032～2243位范圍內的堿基為該基因的開放閱讀框(ORF)所在區(qū)域。
所述基因Akt1的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.29中第555～1997位堿基所示的序列；該SEQ ID No.29中第555～1997位范圍內的堿基為該基因的開放閱讀框(ORF)所在區(qū)域。
所述基因Akt2的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.30中第204～1649位堿基所示的序列；該SEQ ID No.30中第204～1649位范圍內的堿基為該基因的開放閱讀框(ORF)所在區(qū)域。
所述基因P21的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.31中第95～589位堿基所示的序列；該SEQ ID No.31中第95～589位范圍內的堿基為該基因的開放閱讀框(ORF)所在區(qū)域。
所述基因P27的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.32中第466～1062位堿基所示的序列。該SEQ ID No.32中第466～1062位范圍內的堿基為該基因的開放閱讀框(ORF)所在區(qū)域。
本發(fā)明還公開了一種用于檢測酪絲亮肽作用效果的試劑盒，所述試劑盒中含有在反轉錄PCR方法中分別檢測基因NDUFA2、NDUFA10、NDUFS1、SUCLG1、Calreticulin、PTEN、Akt1、Akt2、P21、P27的mRNA表達水平的引物序列。
優(yōu)選的，所述檢測基因NDUFA2的引物序列如序列表中SEQ ID No.1和2所示；所述檢測基因NDUFA10的引物序列如序列表中SEQ ID No.3和4所示；所述檢測基因NDUFS1的引物序列如序列表中SEQ ID No.5和6所示；所述檢測基因SUCLG1的引物序列如序列表中SEQ ID No.7和8所示；所述檢測基因Calreticulin的引物序列如序列表中SEQ ID No.9和10所示；所述檢測基因PTEN的引物序列如序列表中SEQ ID No.11和12所示；所述檢測基因Akt1的引物序列如序列表中SEQ ID No.13和14所示；所述檢測基因Akt2的引物序列如序列表中SEQ ID No.15和16所示；所述檢測基因P21的引物序列如序列表中SEQ ID No.17和18所示；所述檢測基因P27的引物序列如序列表中SEQ ID No.19和20所示。
所述試劑盒中進一步含有參照基因GAPDH的反轉錄PCR的引物序列，該引物序列如序列表中SEQ ID No.21和22所示。
本發(fā)明還公開了一種用于檢測酪絲亮肽作用效果的基因芯片，在所述基因芯片的固相載體上固定有能分別與基因NDUFA2、NDUFA10、NDUFS1、SUCLG1、Calreticulin、PTEN、Akt1、Akt2、P21、P27的cDNA序列雜交的核酸序列。
由于采用了以上的方案，使本發(fā)明具有的有益效果在于本發(fā)明的方法提供了一種在分子水平快速檢測酪絲亮肽抗肝癌效果的途徑，通過檢測在施用酪絲亮肽前后，十個基因(NDUFA2、NDUFA10、NDUFS1、SUCLG1、Calreticulin、PTEN、Akt1、Akt2、P21、P27)表達水平的變化情況，從而能較快了解酪絲亮肽對該個體的作用效果，這種從分子水平檢測出結果的時間大大短于從個體表型上表現出治療效果的時間。從而該方法能夠為肝癌病人在施用酪絲亮肽相關藥物的過程中，提供了確切的用藥效果的參考，使服用該藥物無效的病人可以及早停止服用該藥物，節(jié)約了費用并將大大減少了服用藥物的毒副作用。
本發(fā)明的試劑盒以及基因芯片，可應用于本發(fā)明的方法中，從分子水平快速檢測酪絲亮肽的抗肝癌效果。


圖1是RT-PCR法檢測酪絲亮肽對人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤組織細胞中線粒體呼吸鏈相關基因NDUFA2，NDUFA10、NDUFS1和SUCLG1 mRNA表達的影響的電泳結果圖。
圖2顯示PT-PCR法檢測酪絲亮肽對人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤組織細胞中線粒體呼吸鏈相關基因NDUFA2，NDUFA10、NDUFS1和SUCLG1mRNA表達的影響的統(tǒng)計圖同生理鹽水組比較，酪絲亮肽組上述4種呼吸線粒體呼吸鏈相關基因mRNA表達均不同程度下降，具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
圖3是RT-PCR法檢測酪絲亮肽對人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤組織細胞中鈣穩(wěn)肽調節(jié)基因Calreticulin mRNA表達的影響的電泳結果圖。
圖4顯示酪絲亮肽對人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤組織細胞中鈣穩(wěn)肽調節(jié)基因Calreticulin mRNA表達的影響的統(tǒng)計圖同生理鹽水組比較，酪絲亮肽組Calreticulin基因mRNA表達明顯升高，具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
圖5是RT-PCR法檢測酪絲亮肽對人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤組織細胞中PTENmRNA表達的影響的電泳結果圖。
圖6是RT-PCR法檢測酪絲亮肽對人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤組織細胞中AKT1、AKT2mRNA表達的影響的電泳結果圖。
圖7是PT-PCR法檢測酪絲亮肽對人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤組織細胞中P21、P27mRNA表達的影響的電泳結果圖。
圖8顯示160μg/kg/d酪絲亮肽對人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤腫瘤增殖相關基因PTEN、AKT1、AKT2、P21、P27 mRNA表達的影響的統(tǒng)計圖酪絲亮肽能夠增加裸鼠移植瘤細胞中抑癌基因PTEN、P21、P27的mRNA表達，抑制癌基因AKT1、AKT2的表達，酪絲亮肽組上述基因表達結果數據同各自相應生理鹽水組數據比較，具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
圖9為YSL抗人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤實驗電鏡結果，其中a為生理鹽水組生長良好的肝癌細胞(×7500)；b為YSL組(160μg/kg/d)凋亡細胞(×7500)；c為YSL組(160μg/kg/d)肝癌細胞線粒體腫脹、內質網擴張顯著，線粒體和內質網池中可見鈣過載(×12450)；d為.YSL組(160μg/kg/d)線粒體內質網性空泡化(×12450)。
具體實施例方式
下面通過具體的實施例并結合附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述。
人肝癌BEL7402細胞由中國陳瑞銘等建立于1975年，各種特征與臨床人肝細胞肝癌相似，保留了腫瘤的惡性特征，裸鼠人肝癌BEL7402移植瘤保存了人癌原有結構、功能，生長穩(wěn)定。
下列實施例或實驗例中未注明具體條件的實驗方法，涉及常規(guī)分子生物技術的方法，該等技術在所屬領域中廣泛已知，通常按照常規(guī)條件如Molecular CloningALaboratory Manual，第3版，1-3卷，Sambrook等人編輯，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，2001中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實驗例1YSL抗人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤實驗裸鼠人肝癌模型的制備，可參見文獻(韓銳.抗癌藥物研究與實驗技術[M].第一版.北京北京醫(yī)科大學中國協(xié)和醫(yī)科大學聯合出版社.1997，4299)。
荷人肝癌BEL-7402裸鼠購自中國醫(yī)學科學院腫瘤研究所物中心。于獨立換氣的無特定病原體的層流柜中飼養(yǎng)，所用飼料、墊料、飲用水均為無菌處理，嚴格按照NIH標準(安全操作號A3873-1)進行。
在本發(fā)明中，選取腫瘤直徑大于1cm，生長狀態(tài)良好的荷人肝癌BEL-7402裸鼠，無菌條件下將新鮮的瘤組織切成2～4mm3的小塊，置于RPMI1640培養(yǎng)液中，在裸鼠腹部外側皮下剪一小口，用無鉤眼科鑷子將瘤塊移植于皮下。將已接種腫瘤的裸鼠，隨機分為生理鹽水組(0.2ml只-1d-1)、YSL不同劑量組(320μgkg-1d-1、160μgkg-1d-1、80μgkg-1d-1)，各組藥物分別溶于0.2ml生理鹽水中，于腫瘤接種后次日，經腹腔注射，每日一次，連續(xù)給藥60天。
實施例1反轉錄PCR(RT-PCR)法檢測YSL對BEL-7402裸鼠移植瘤細胞中線粒體呼吸鏈相關基因NDUFA2、NDUFA10、NDUFS1、SUCLG1，鈣穩(wěn)態(tài)調節(jié)蛋白基因Calreticulin，以及基因PTEN、Akt1/2、p27、p21的mRNA表達的影響具體步驟如下(1)樣本制備在YSL抗人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤實驗中，從生理鹽水組和酪絲亮肽160μg/kg/d劑量組中，每組隨機抽取5只荷瘤裸鼠，頸椎脫臼處死后，用無RNA酶的眼科剪剝離腫瘤組織，選取腫瘤生長情況良好，無明顯壞死、破潰、質地較硬的部位，剪成約50mg的小塊，錫紙包好后，立即放入液氮中凍存?zhèn)溆谩?br> (2)總RNA提取1)組織勻漿從液氮中取出凍存腫瘤組織冰上稱取50～100mg，每份組織加入1mlTRIZOL(Invitrogen，Inc.USA.)冰上勻漿，15～30℃靜置5min。
2)RNA分離以每1mlTRIZOL加入0.2ml的比例加入氯仿，劇烈震蕩15s，15～30℃靜置2～3min，4℃下12,000g離心15min，吸取上層水相至新管。
3)RNA沉淀RNA水相中，以每1mlTRIZOL加入0.5ml的比例加入異丙醇，15～30℃靜置10min，4℃下12,000g離心10min，棄上清。
4)RNA洗滌沉淀按每1mlTRIZOL加入1ml的比例加入75％乙醇，劇烈震蕩，4℃下7,500g離心5min，棄上清。
5)RNA復溶沉淀空氣干燥5～10min，溶于30μl去RNA酶水，55～60℃水浴10min。除用于RNA濃度及純度鑒定的樣本，其余都凍存于-80℃冰箱。
6)RNA定量分析紫外分光光度計檢測A325、A280、A260、A230以確定RNA的純度和含量，A260/A280值在1.8～2.0之間。公式RNA量(μg/ml)＝A260/0.025×稀釋倍數。
(3)RT-PCR50μl反應體積中5×/AMVTf1緩沖液10μl，AMV逆轉錄酶1μl，Tf1 DNA聚合酶1μl，dNTP1μl，Mg2+2μl，上下游引物各50pmol，總RNA 1μg。逆轉錄條件為48℃逆轉錄45min，94℃ AMV逆轉錄酶滅活/RNA/cDNA引物變性2min，PCR引物及擴增條件見下表1。并且每只裸鼠的總RNA分別進行這十個基因的RT-PCR檢測，并對所得的結果進行統(tǒng)計學處理。
表1


(4)PCR產物的鑒定1.5％瓊脂糖凝膠電泳PCR產物，以100bp DNAMarker為分子量標記，80V恒壓電泳40min，在紫外燈下觀察照相。
(5)數據處理采用Scion Image軟件讀取光密度值及灰度值。以GAPDH作為內參照，以靶基因灰度/GAPDH灰度比值作為mRNA的相對表達豐度，采用方差分析法統(tǒng)計各組數據。
(6)實驗結果1)RT-PCR結果顯示，同生理鹽水組相比，酪絲亮肽組(160μg/kg/d)裸鼠移植瘤細胞NDUFA2、NDUFA10，NDUFS1，SUCLG1基因的mRNA表達水平均不同程度下降。(圖1，圖2)2)以GAPDH作為內參照，以靶基因/GAPDH灰度比值作為mRNA的相對表達豐度。結果顯示，酪絲亮肽能夠增加人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤細胞中Calreticulin的mRNA表達。(見圖3，圖4)3)酪絲亮肽能構促進人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤組織中抑癌基因PTEN、P21、P27的mRNA的表達，抑制癌基因AKT的mRNA的表達。(圖5至圖8)實施例2用于檢測酪絲亮肽作用效果的試劑盒該試劑盒具有一盒體，盒體內包括分別盛裝有SEQ ID No.1～22的固態(tài)干粉引物的密封容器。
該試劑盒內還可以含有分別盛裝有下述物質的密封容器DEPC處理的滅菌雙蒸水、2.5mmol/L dNTP、15mmol/L氯化鎂、10×PCR緩沖液、AMV反轉錄酶、RNA酶抑制劑、Taq DNA聚合酶。
其中，10×PCR緩沖液的配制(100ml體積)如下DEPC處理的滅菌雙蒸水70mL三羥甲基氨基甲烷(Tris) 0.158g氯化鉀 0.373g曲拉通X-100 0.1mL鹽酸調PH至9.0DEPC處理的滅菌雙蒸水加至100mL該試劑盒在使用時，可先將固態(tài)干粉引物加滅菌雙蒸水按濃度為10pmol/μL配成溶液，然后按照下述比例配成反應體系(25μL體系)DEPC處理的滅菌雙蒸水13μL
2.5mmol/L dNTP 2.5μL10pmol/μL RT-PCR引物 1.5μL15mmol/L氯化鎂 2μL10XPCR緩沖液 2.5μLAMV反轉錄酶0.2μLRNA酶抑制劑0.3μL，Taq DNA聚合酶 1μL提取的樣品RNA 2μL該試劑盒可用于實施例1中的實驗過程。
實施例3用基因芯片的方法檢測YSL對BEL-7402裸鼠移植瘤細胞中線粒體呼吸鏈相關基因NDUFA2、NDUFA10、NDUFS1、SUCLG1，鈣穩(wěn)態(tài)調節(jié)蛋白基因Calreticulin，以及基因PTEN、Akt1/2、p27、p21的mRNA表達的影響將實施例1中抽提得到的生理鹽水組荷瘤裸鼠的總RNA，利用表1中NDUFA2、NDUFA10、NDUFS1、SUCLG1、Calreticulin、PTEN、Akt1/2、p27、p21的引物以及反應條件分別進行RT-PCR，得到該十個基因的cDNA序列。將得到的該十個基因的cDNA序列按常規(guī)的點樣法在玻片載體上點樣制備基因芯片。另外，該基因芯片上還點有GAPDH的cDNA序列作為陽性參照基因，空白點作為陰性參照點。
制備得到的基因芯片用于下面實驗。
1標本在YSL抗人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤實驗中，隨機抽取生理鹽水組人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤標本1份，酪絲亮肽組(160μg/kg/d)人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤標本2份。
2總RNA的抽提及雙鏈cDNA的合成TRIZOL法抽提每份腫瘤組織標本中的總RNA，用RNeasy mini kit純化，分光光度計檢測RNA的純度和濃度。以純化后的總RNA為模板，分別用SupercriptII RT、E.coliDNA連結酶及E.coli DNA聚合酶逆轉錄合成cDNA的第一鏈和第二鏈。
3 cRNA的合成、標記及片段化以cDNA為模板，用T7 RNA聚合酶體外轉錄合成生物素標記的cRNA，再用RNeasy minikit純化，分光光度計檢測cRNA的純度和濃度。得到的cRNA樣本在片段化緩沖液中分裂為長50～100核苷酸的片段。
4 Test芯片雜交測試為檢測每個樣本cRNA的質量及雜交系統(tǒng)的穩(wěn)定性，正式芯片雜交前，先用Test芯片進行雜交測試實驗。片段化的cRNA加入雜交液，混勻，和Test基因芯片在45℃雜交16小時后，根據芯片類型選擇相應的洗脫和染色程序。最后用基因芯片掃描儀掃描。結果顯示背景信號符合實驗要求，標準對照基因表達符合要求，芯片質量及雜交體系合格，樣本質量合格(3’/5’＜3)，故可繼續(xù)實驗。
5芯片雜交片段化的cRNA加入雜交液，混勻，和基因芯片在45℃雜交16小時后，進行洗脫和染色程序。最后用基因芯片掃描儀掃描。
6芯片結果數據分析用Microarray Suite 5.0軟件對數據進行綜合分析比較，酪絲亮肽組(160μg/kg/d)人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤的基因表達與生理鹽水組比較，差異有無顯著性用one-sideWilcoxon’s signed rank test進行檢驗，p＜0.0025為基因表達上調有顯著性；p＞0.9975為基因表達下調有顯著性。
結果如下所示，且所示結果與用RT-PCR方法得到的結果一致

實驗例2在YSL抗人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤實驗中，在給藥結束后次日，逐只剖取腫瘤，稱量、記錄瘤重，并檢查腫瘤有無壞死感染等情況。用游標卡尺測量腫瘤的3個互相垂直的直徑，代入下式計算V＝(1/6)πABC。V為腫瘤體積，A、B、C為瘤體的3個直徑。計算腫瘤抑制率(％)＝(對照組平均瘤重-實驗組平均瘤重)/對照組平均瘤重×100％。
結果如下，在YSL給藥劑量為80μg/kg/d～320μg/kg/d時，腫瘤抑制率分別為21.66％、41.34％和34.78％，與生理鹽水組比較均有顯著性差異(P＜0.05)(表2)。
表2 YSL對裸鼠人肝癌BEL-7402移植瘤的抑制作用

*與生理鹽水比較，P＜0.05同時，選取腫瘤生長情況良好，無明顯壞死、破潰、質地較硬部位剪取1-2mm3的瘤塊立即浸泡于盛有2.5％戊二醛中，JEOL-100CX型透射電鏡下觀察腫瘤細胞超微結構改變。
結果為，YSL可引起腫瘤細胞的染色質溶解，細胞出現壞死和凋亡。線粒體腫脹，溶解，內質網擴張，多見擴張的內質網中有散在的鈣顆粒，提示有鈣過載現象發(fā)生。(見圖9)
序列表<110>一泰醫(yī)藥研究(深圳)有限公司<120>檢測酪絲亮肽抗肝癌效果的方法及所用試劑盒與基因芯片<130>CY0510517<160>32<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
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1.一種檢測酪絲亮肽抗肝癌效果的方法，所述方法包括步驟在酪絲亮肽作用后的生物材料中，檢測基因NDUFA2、NDUFA10、NDUFS1、SUCLG1、Calreticulin、PTEN、Akt1、Akt2、P21或P27表達水平的變化情況；當檢測結果為在酪絲亮肽作用后，基因NDUFA2、NDUFA10、NDUFS1、SUCLG1、Akt1、Akt2的表達水平下降，基因Calreticulin、PTEN、P21、P27的表達水平上升，則表明酪絲亮肽對該生物材料具有抗肝癌的效果。
2.根據權利要求1所述的一種檢測酪絲亮肽抗肝癌效果的方法，其特征在于，所述在酪絲亮肽作用后的生物材料中，檢測基因NDUFA2、NDUFA10、NDUFS1、SUCLG1、Calreticulin、PTEN、Akt1、Akt2、P21或P27表達水平的變化情況，是指，采用反轉錄PCR的方法檢測所述生物材料中該十個基因的mRNA在酪絲亮肽作用前后的表達變化情況，當在酪絲亮肽作用后，基因NDUFA2、NDUFA10、NDUFS1、SUCLG1、Akt1、Akt2的mRNA表達水平下降，基因Calreticulin、PTEN、P21、P27的mRNA表達水平上升，則表明酪絲亮肽對該生物材料具有抗肝癌的效果。
3.根據權利要求1所述的一種檢測酪絲亮肽抗肝癌效果的方法，其特征在于，所述在酪絲亮肽作用后的生物材料中，檢測基因NDUFA2、NDUFA10、NDUFS1、SUCLG1、Calreticulin、PTEN、Akt1、Akt2、P21或P27表達水平的變化情況，是指，采用基因芯片的方法，檢測所述生物材料中該十個基因的cDNA在酪絲亮肽作用前后的表達變化情況，當在酪絲亮肽作用后，基因NDUFA2、NDUFA10、NDUFS1、SUCLG1、Akt1、Akt2的cDNA表達水平下降，基因Calreticulin、PTEN、P21、P27的cDNA表達水平上升，則表明酪絲亮肽對該生物材料具有抗肝癌的效果；
4.根據權利要求1～3任一所述的一種檢測酪絲亮肽抗肝癌效果的方法，其特征在于，所述基因NDUFA2的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.23中第74～373位堿基所示的序列；所述基因NDUFA10的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.24中第81～1148位堿基所示的序列；所述基因NDUFS1的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.25中第128～2311位堿基所示的序列；所述基因SUCLG1的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.26中第32～1033位堿基所示的序列；所述基因Calreticulin的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.27中第69～1322位堿基所示的序列；所述基因PTEN的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.28中第1032～2243位堿基所示的序列；所述基因Akt1的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.29中第555～1997位堿基所示的序列；所述基因Akt2的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.30中第204～1649位堿基所示的序列；所述基因P21的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.31中第95～589位堿基所示的序列；所述基因P27的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.32中第466～1062位堿基所示的序列。
5.一種用于檢測酪絲亮肽作用效果的試劑盒，其特征在于所述試劑盒中含有在反轉錄PCR方法中分別檢測基因NDUFA2、NDUFA10、NDUFS1、SUCLG1、Calreticulin、PTEN、Akt1、Akt2、P21、P27的mRNA表達水平的引物序列。
6.根據權利要求5所述的一種用于檢測酪絲亮肽作用效果的試劑盒，其特征在于所述檢測基因NDUFA2的引物序列如序列表中SEQ ID No.1和2所示；所述檢測基因NDUFA10的引物序列如序列表中SEQ ID No.3和4所示；所述檢測基因NDUFS1的引物序列如序列表中SEQ ID No.5和6所示；所述檢測基因SUCLG1的引物序列如序列表中SEQ ID No.7和8所示；所述檢測基因Calreticulin的引物序列如序列表中SEQ ID No.9和10所示；所述檢測基因PTEN的引物序列如序列表中SEQ ID No.11和12所示；所述檢測基因Akt1的引物序列如序列表中SEQ ID No.13和14所示；所述檢測基因Akt2的引物序列如序列表中SEQ ID No.15和16所示；所述檢測基因P21的引物序列如序列表中SEQ ID No.17和18所示；所述檢測基因P27的引物序列如序列表中SEQ ID No.19和20所示。
7.根據權利要求5或6所述的一種用于檢測酪絲亮肽作用效果的試劑盒，其特征在于所述試劑盒中進一步含有參照基因GAPDH的反轉錄PCR的引物序列，該引物序列如序列表中SEQ ID No.21和22所示。
8.一種用于檢測酪絲亮肽作用效果的基因芯片，其特征在于在所述基因芯片的固相載體上固定有能分別與基因NDUFA2、NDUFA10、NDUFS1、SUCLG1、Calreticulin、PTEN、Akt1、Akt2、P21、P27的cDNA序列雜交的核酸序列。
9.根據權利要求8所述的一種用于檢測酪絲亮肽作用效果的基因芯片，其特征在于所述基因NDUFA2的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.23中第74～373位堿基所示的序列；所述基因NDUFA10的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.24中第81～1148位堿基所示的序列；所述基因NDUFS1的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.25中第128～2311位堿基所示的序列；所述基因SUCLG1的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.26中第32～1033位堿基所示的序列；所述基因Calreticulin的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.27中第69～1322位堿基所示的序列；所述基因PTEN的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.28中第1032～2243位堿基所示的序列；所述基因Akt1的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.29中第555～1997位堿基所示的序列；所述基因Akt2的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.30中第204～1649位堿基所示的序列；所述基因P21的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.31中第95～589位堿基所示的序列；所述基因P27的cDNA序列包括序列表SEQ ID No.32中第466～1062位堿基所示的序列。
全文摘要
本發(fā)明公開一種檢測酪絲亮肽抗肝癌效果的方法，包括步驟在酪絲亮肽作用后的生物材料中，檢測基因NDUFA2、NDUFA10、NDUFS1、SUCLG1、Calreticulin、PTEN、Akt1、Akt2、P21以及P27表達水平的變化情況；當檢測結果為在酪絲亮肽作用后，基因NDUFA2、NDUFA10、NDUFS1、SUCLG1、Akt1、Akt2的表達水平下降，而基因Calreticulin、PTEN、P21、P27的表達水平上升，則表明酪絲亮肽對該生物材料具有抗肝癌的效果。本發(fā)明還公開了用于所述方法的試劑盒與基因芯片。本發(fā)明的方法提供了一種在分子水平快速檢測酪絲亮肽抗肝癌效果的途徑。
文檔編號C12N15/11GK1837374SQ200510021939
公開日2006年9月27日 申請日期2005年10月20日 優(yōu)先權日2005年10月20日
發(fā)明者姚智, 陸融 申請人:一泰醫(yī)藥研究(深圳)有限公司