專利名稱：：酪蛋白激酶脅迫相關(guān)多肽及其用于植物的方法酪蛋白激酶脅，關(guān)多肽及其用于植物的方法相關(guān)申請(qǐng)的交互參考本申請(qǐng)為要求于2004年11月17日遞交的美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?0/卯4，588優(yōu)先權(quán)的國(guó)際申請(qǐng)，是遞交于2001年4月6日的美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?9/828,313的繼續(xù)申請(qǐng)，后者要求于2000年4月7日遞交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)系列號(hào)60/196,001的優(yōu)先權(quán)。美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?0/904,588也是遞交于2002年11月12曰的美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?0/292,408的繼續(xù)申請(qǐng)，要求于2001年11月9日遞交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)系列號(hào)60/346,096的優(yōu)先權(quán)。所述申請(qǐng)的完整內(nèi)容在此處引用作為參考.發(fā)明背景發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明主要涉及編碼植物中非生物脅迫反應(yīng)和非生物脅迫耐受性相關(guān)多肽的核酸序列.具體而言，本發(fā)明涉及編碼賦予植物旱、冷和/或鹽耐受性的多肽的核酸序列.
背景技術(shù)：
：非生物環(huán)境脅迫如旱脅迫、鹽脅迫、熱脅迫和冷脅迫，是植物生長(zhǎng)和生產(chǎn)力的主要限制因素。由這些脅迫所導(dǎo)致的主要農(nóng)作物如大豆、稻、玉米、棉花和小麥的作物損失和作物產(chǎn)量損失具有重要的經(jīng)濟(jì)和政治意義，造成了許多不發(fā)達(dá)國(guó)家的糧食短缺。植物在其生活周期中一般都會(huì)面臨環(huán)境水含量減少的情況。大多數(shù)植物進(jìn)化產(chǎn)生了保護(hù)自己免受這些干旱情況影響的策略。然而，如果干旱情況的嚴(yán)重程度過(guò)高、持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，對(duì)大部分作物植物的發(fā)育、生長(zhǎng)和產(chǎn)量都會(huì)產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。持續(xù)暴露于千旱會(huì)引發(fā)植物新陳代謝的顯著變化，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡和隨即的產(chǎn)量損失。研發(fā)脅迫耐受性植物是可能解決或緩和至少部分這些問(wèn)題的策略。然而，常規(guī)采用植物育種產(chǎn)生對(duì)這些脅迫具有耐受性的新植物物種的策略相對(duì)緩'艮，而且需要特定的耐受性物種與所需物種進(jìn)行雜交。脅迫耐受性的胚質(zhì)資源有限，以及遠(yuǎn)親植物物種間的雜交不相容性給常規(guī)育種帶來(lái)了巨大問(wèn)題。此外，在抗早和/或抗鹽的模型植物中導(dǎo)致旱、冷和鹽耐受性的細(xì)胞過(guò)程性質(zhì)復(fù)雜，包括細(xì)胞適應(yīng)的多重機(jī)制和無(wú)數(shù)代謝路徑。這一脅迫耐受性多元性不僅使耐受性育種多以失敗告終，還限制了利用生物技術(shù)方法對(duì)脅迫耐受性植物進(jìn)行遺傳工程操作的能力。旱脅迫、熱脅迫、冷脅迫和鹽脅迫具有植物生長(zhǎng)的重要共同要素，即水的可得性。如上所述，大多數(shù)植物進(jìn)化產(chǎn)生了保護(hù)自身免受干旱環(huán)境影響的策略；然而，如果干早情況的嚴(yán)重程度過(guò)高、持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，對(duì)大部分作物植物的發(fā)育、生長(zhǎng)和產(chǎn)量都會(huì)產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。此外，大多數(shù)作物植物易受土壤中較高鹽濃度的影響.由于某些土壤的高鹽M會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞可攝取水量的減少，高鹽濃度對(duì)植物的影響與干旱對(duì)植物的影響具有類似之處.此外，在冰凍溫度下，植物細(xì)胞由于起始于質(zhì)外體的結(jié)冰從共質(zhì)體中吸取水而丟失水分。植物對(duì)這些脅迫中每一種均具有共同的分子應(yīng)答機(jī)制，而蛋白激酶如M白激酶在這些分子機(jī)制中發(fā)揮重M用，蛋白激酶形成一個(gè)^*^7^;*家^員催化ATP中磷^團(tuán)向乾多肽上絲氨酸、蘇氛酸和酪氨酸JL^酸側(cè)鏈的可逆轉(zhuǎn)運(yùn)，蛋白激酶為植物中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程的基礎(chǔ)元件，已有人報(bào)道其在細(xì)胞(以及植物)應(yīng)答環(huán)境刺激的信號(hào)感知和轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，具體而言，S^白激酶I蛋白質(zhì)為含有高度保守的中央激酶結(jié)構(gòu)域的單體絲氨^/蘇氦酸類蛋白激酶。該家族成員具有多變的N-末端和C-末端延伸。N-末端區(qū)域負(fù)責(zé)底物識(shí)別，而C-末端延伸對(duì)于激酶與底物的相互作用至關(guān)重要.C-末端延伸對(duì)通過(guò)自磷酸化介導(dǎo)的調(diào)節(jié)也起重要作用(Gross和Anderson,1998CellSignal10:699-711;Graves和Roach,1995，JBiolChem270:21689-21694)。盡管已經(jīng)表征了涉及植物中脅迫應(yīng)答和水利用效率的某些基因，對(duì)產(chǎn)生脅迫耐受性和水利用效率的植物基因的表征和克隆仍然相當(dāng)欠缺和破碎。例如，一些研究提示，某些植物中旱脅迫和鹽脅迫可能是疊加基因效應(yīng)所致，而另一些研究則認(rèn)為植物營(yíng)養(yǎng)組織中的特定基因在滲透性脅迫時(shí)發(fā)生了轉(zhuǎn)錄活化。雖然一般認(rèn)為脅迫誘導(dǎo)蛋白在耐受性中發(fā)揮一定作用，仍然缺乏直接證據(jù)，許多脅迫應(yīng)答基因的功能仍為未知。所有陸生光合作用生物中，都存在C02吸收和7jc丟失之間的基本生理化學(xué)強(qiáng)制性平衡(Taiz和Zeiger1991PlantPhysiology,Benjamin/CummingsPublishingCo,94頁(yè))。C02必須處于水溶液中，C02固定酶如核酮糖二磷酸縮化酶-加氧酶(Rubisco，核酮糖-l，5-二磷酸羧化酶/加氧酶)和PEPC(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶)才能發(fā)揮作用。由于C02擴(kuò)散需要濕潤(rùn)的細(xì)JJ&^面，當(dāng)濕度低于100%時(shí)將會(huì)不可^地發(fā)生蒸發(fā)(Taiz和Zeiger1991PlantPhysiology,Benjamin/CummingsPublishingCo257頁(yè))。植物具有多種生理機(jī)制減少水分丟失(例如蠟角質(zhì)層、氣孔關(guān)閉、葉毛、下陷氣孔窩)。由于這些屏障對(duì)于水和C02的流出并無(wú)差別，這些保^#施也能增強(qiáng)對(duì)C02攝取的耐受性(Kramer1983WaterRelationsofPlants,AcademicPress305頁(yè))，光合作用性0!02攝取對(duì)于光合自養(yǎng)植物的植物生長(zhǎng)和生物量累積是絕對(duì)必要的。水利用效率(WUE)是估計(jì)水消耗和C02攝取/生長(zhǎng)之間平衡時(shí)常用的^t(Kramer1983WaterRelationsofPlants,AcademicPress405頁(yè))，可以通過(guò)多種方法定義和計(jì)算WUE.—種方法是計(jì)算整個(gè)植物干重與該植物一生中消耗水分重量的比值(Chu等人1992Oecologia89:580),另一方法是測(cè)量更短時(shí)間間隔內(nèi)的生物量累積和水分利用(Mian等人1998CropSci.38:390).通常只測(cè)量植物中的局限部分，例如僅測(cè)量地上部生長(zhǎng)量和水利用(Nienhuis等人1994AmerJBot81:943).也可定義WUE為一片葉子或其部分中C02攝取與水蒸汽丟失的比值，通常在很短時(shí)期內(nèi)(秒/分鐘)測(cè)量(Kramer1983WaterRelationsofPlants,AcademicPress406頁(yè))。利用同位素比質(zhì)謙儀測(cè)量的植物組織中固定的13C/12C比，也可用于估計(jì)使用C3光合的植物中的WUE(Martin等人1999CropSci.1775)。WUE的提高對(duì)生長(zhǎng)和水消耗效率的相對(duì)改善具有提示意義，但其本身并不能描述這兩個(gè)過(guò)程中何者(或兩者都)發(fā)生了改變。選擇改良作物的性狀時(shí)，由于水利用減少但生長(zhǎng)無(wú)改變導(dǎo)致的WUE提高，在7^A^費(fèi)昂貴的灌溉農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中具有特別優(yōu)點(diǎn)。主要由生長(zhǎng)增加而無(wú)相應(yīng)水利用上升而導(dǎo)致的WUE提高，則可應(yīng)用于所有的農(nóng)業(yè)體系。在許多供水不受限的農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中，即偵是以水利用增加為代價(jià)(即WUE不改變)的生長(zhǎng)增加也能提高產(chǎn)量。因此，需要能同時(shí)提高WUE和生物量累積的新方法來(lái)提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力。由于WUE整合了涉及初級(jí)代謝和水利用的許多生理學(xué)過(guò)程，其通常是受到環(huán)境相互作用具有廣泛基因型的高度多基因性狀，(Richards等人2002CropSci42:111)。由于這種種原因，常規(guī)育種項(xiàng)目中鮮有選擇WUE改變的嘗試獲得成功。因此，需要鑒定在脅迫耐受性植物和水利用有效植物中表達(dá)的基因，新產(chǎn)i的脅迫耐受性植物將真務(wù)多種優(yōu)勢(shì)，例如通過(guò)如降低植物物種的水需求而擴(kuò)大作物的可培育范圍。其他有利優(yōu)勢(shì)包括對(duì)倒伏的耐受性，即風(fēng)、雨、蟲害或病害引起的苗或莖彎折.發(fā)明概述本發(fā)明部分實(shí)現(xiàn)了鑒定新的獨(dú)特酪蛋白激酶的需求，所述激酶在過(guò)量表達(dá)時(shí)使植物具有脅迫耐受性。本發(fā)明描迷了對(duì)調(diào)節(jié)植物對(duì)環(huán)境脅迫應(yīng)答具有重要作用的新型酪蛋白激酶脅^目關(guān)多肽(CKSRP)及CKSRP編碼核酸.更具體而言，這些CKSRP編碼核酸在植物中的過(guò)量表達(dá)，導(dǎo)致該植物對(duì)環(huán)境脅迫的耐受性增加.因此，本發(fā)明包括分離的含有CKSRP編碼核酸的植物細(xì)胞，其中該核酸序列在植物細(xì)胞中的表達(dá)導(dǎo)致其對(duì)環(huán)境脅迫的耐受性相對(duì)于該植物細(xì)胞野生型品種增加。優(yōu)選該CKSRP來(lái)自小立碗蘚(iV^conK'frd/fl/wtews)、酉良酒酵母(iSfl"Aflfv考ces1"柳/siV^)或歐洲油菜(5r鵬/ca"a/ms)。即此處所述的為小立碗蘚酪蛋白激酶-4(PpCK-4或EST289)、小立碗蘚酪蛋白激酶-1(PpCK-l或EST194)、小立碗蘚酪蛋白激酶-2(PpCK-2或EST263)、小立碗蘚蛋白激酶-4(PpPK-4或EST142)、(ScCK-l或ORF760)、歐洲油菜酪蛋白激酶-l(BnCK-l)、歐洲油菜酪蛋白激酶-2(BnCK-2)。歐洲油菜酪蛋白激酶-3(BnCK-3)、歐洲油菜酪蛋白激酶-4(BnCK-4)和歐洲油菜酪蛋白激酶-5(BnCK-5)。本發(fā)明某些實(shí)施方案中提供的CKSRP及其編碼核酸見于小立宛蘚OP/y;wwiM>e/te)、酵母(SflCcA"iv附j(luò)Y^s)或蕓莒(5rfl5s/cfl)屬成員。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，核酸及多肽來(lái)自小立碗蘚或歐洲油菜植物或釀酒酵母。本發(fā)明中的環(huán)境脅迫可為鹽、旱、溫度、金屬、化學(xué)物、病原體和氧化脅迫或其組合。在優(yōu)選實(shí)施方案中，環(huán)境脅迫選自干旱、高鹽和低溫中的一種或幾種.本發(fā)明還提供了CKSRP編碼核酸轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的種子，其中所述植物為對(duì)環(huán)境脅迫耐受性相對(duì)于該植物野生型品種增強(qiáng)的真實(shí)遺傳，本發(fā)明還提供了下述任意轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或種子產(chǎn)生的農(nóng)產(chǎn)品，;^發(fā)明3i提供了下迷分離的CKSRP.4^發(fā)明還^^供了分離的CKSRP編碼核酸，其中CKSRP編碼核酸編碼下迷的CKSRP。本發(fā)明還提供了分離的含有下述CKSRP編碼核酸的重組表達(dá)栽體，的野生型品種增強(qiáng)，本發(fā)明還提供了含有栽體的宿主細(xì)胞和含有該宿主細(xì)胞的植物.本發(fā)明還提供了產(chǎn)生含CKSRP編碼核酸的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中品種增強(qiáng)，包括(a)利用含有CKSRP編碼核酸的表達(dá)栽^化植物細(xì)胞，以及(b)從該植物細(xì)胞中產(chǎn)生對(duì)環(huán)境脅迫的耐受性相對(duì)于該植物野生型品種增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物。優(yōu)選實(shí)施方案中的CKSRP和CKSRP編碼核酸如下所述，本發(fā)明還提供了鑒定新CKSRP的方法，包括(a)引^t下述CKSRP或其片段的特異性抗體應(yīng)答；(b)利用該抗體篩選可能的CKSRP材料，其中抗體與材料的特異性結(jié)合提示可能存在新的CKSRP;以及(c)從結(jié)合材料中鑒定相對(duì)于已知CKSRP的新CKSRP?；蛘吲c下述核酸探針雜交可用于鑒定新CKSRP核酸。本發(fā)明也提供了修飾植物脅迫耐受性的方法，包括修飾如下述CKSRP核酸在植物中的表達(dá)?？蓪?shí)施本發(fā)明提供的方法來(lái)增強(qiáng)或降低脅迫耐受性。優(yōu)選通過(guò)提高CKSRP核酸的表達(dá)增強(qiáng)植物的脅迫耐受性。附圖簡(jiǎn)述圖1顯示過(guò)量表達(dá)PpCK-l的轉(zhuǎn)基因植物以及野生型擬南芥04ra6iVfo/w&)林系的干旱脅迫測(cè)試結(jié)果。轉(zhuǎn)基因林系呈現(xiàn)耐受性表型。顯示了個(gè)體轉(zhuǎn)J沐系.圖2顯示過(guò)量表達(dá)PpCK-l的轉(zhuǎn)基因植物以及野生型擬南芥抹系的冰凍脅迫測(cè)試結(jié)果，轉(zhuǎn)基因物種呈現(xiàn)耐受性表型.顯示了個(gè)體轉(zhuǎn)化株系。圖3顯示過(guò)量表達(dá)PpCK-2的轉(zhuǎn)基因植物以及野生型擬南芥抹系的干旱脅迫測(cè)試結(jié)果.轉(zhuǎn)基因物種呈現(xiàn)耐受性表型.顯示了個(gè)體轉(zhuǎn)化株系.圖4的圖表說(shuō)明了公開的小立碗蘚和釀酒酵母S^白激酶與其他已知酪蛋白激酶的相對(duì)同源性。困5顯示五種公開的小立碗蘚和釀酒酵母酪蛋白激酶的M酸序列與其他已知酪蛋白激酶的氨基酸序列的比對(duì)(按出現(xiàn)順序分別為SEQIDNOS10、47-48、6、4、2、49-52、8和53).陰影表示在每一序列中均保守的氨基酸^Jo以及那些在某些或所有序列中相同或相似的氨基酸殘基。圖6的圖表說(shuō)明了五種公開的小立碗蘚和釀酒酵母酪蛋白激酶與公開的歐洲油菜、亞麻籽、小麥、大麥、向日葵和大豆酪蛋白激酶的相對(duì)同源性.圖7顯示五種公開的小立碗蘚和釀酒酵母酪蛋白激酶的M酸序列與7>開的歐洲油菜、亞;^f、小麥、大麥、向日葵和大豆s^白激酶的ltj^酸序列的比對(duì)。基因ID和SEQIDNO的對(duì)應(yīng)性見表A。該圖也提示了基于比對(duì)序列的酪蛋白激酶I的一致序列。陰影提示在每一序列中均保守的氨基酸殘基，以及那些在某些或所有序列中相同或相似的氨基酸殘基。圖8:在組成型啟動(dòng)子控制下擬南芥中過(guò)量表達(dá)PpPK-4、PpCK-4、PpCK-2或PpCK-l。測(cè)定轉(zhuǎn)基因林系的相對(duì)水利用效率(WUE)、干重(DW)和植物水利用(E)(與對(duì)照的％差別)。發(fā)明詳述參考以下本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述和此處包括的實(shí)施例，有助于理解本發(fā)明。然而，在公開和描述本化合物、組合物和方法前，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明并不僅限于特定核酸、特定多肽、特定細(xì)胞類型、特定宿主細(xì)胞、特定條件或特定方法等，因?yàn)檫@些顯然會(huì)發(fā)生變化；對(duì)其多種修飾和改變對(duì)于本領(lǐng)域技^A員而言顯而易見。還應(yīng)當(dāng)理解此處所用的術(shù)語(yǔ)僅為描述特定實(shí)施方案而不意在限制。具體而言，命名JL^酸序列為多肽"膝蛋白激酶脅迫相關(guān)多肽"(CKSRP),并不限制那些序列的功能性。本發(fā)明描述了對(duì)調(diào)節(jié)植物應(yīng)答環(huán)境脅迫有重要作用的新型CSKRP和CSKRP編碼核酸。更具體而言，這些CSKRP編碼核M植物中的過(guò)量表達(dá)會(huì)導(dǎo)致該植物對(duì)環(huán)境脅迫的耐受性增強(qiáng)。該CKSRP屬的代表成員包括但不僅限于PpCK-l、PpCK-2、PpCK-4、PpPK-4、ScCK-l、BnCK-l、BnCK-2、BnCK-3、BnCK4和BnCK-5。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該屬的所有成員均為生物活性的膝蛋白激酶.因此，本發(fā)明包括CKSRP多核苷酸和多肽序列，及其在提高植物對(duì)環(huán)境脅迫耐受性中的用途.在一個(gè)實(shí)施方案中，CKSRP序列來(lái)自植物，優(yōu)選為小立碗蘚植物或蕓荅植物，更優(yōu)選為小立碗蘚植物或歐洲油菜植物.在另一個(gè)實(shí)施方案中，CKSRP序列包括PpCK-l(SEQIDNOS:3和4)、PpCK國(guó)2(SEQIDNOS:5和6)、PpCK畫4(SEQIDNOS:l和2)、PpPK-4(SEQIDNOS:7和8)、ScCK-l(SEQIDNOS:9和10)、BnCK-l(SEQIDNOS:ll和12)、BnCK-2(SEQIDNOS:13和14)、BnCK隱3(SEQIDNOS:15和16)、BnCK-4(SEQIDNOS:17和18)，以及BnCK-5(SEQIDNOS:19和20)。公開的小立碗蘚CKSRP序列和公開的釀酒酵母CKSRP序列與已知的酪蛋白激酶具有顯著百分比的同一性，如表1所示。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>本發(fā)明提供了由CKSRP編碼核酸轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中該核野生型品種增強(qiáng)，本發(fā)明還lt供含有此處所迷植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因植物部分和轉(zhuǎn)基因植物，植物部分包括但不僅限于莖、根、胚珠、雄遂、葉、胚芽、分生組織區(qū)、愈傷組織、配子體、孢子體、花粉、小孢子等.在某一實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因植物為雄性可育，也提供了由CKSRP編碼核酸轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的植物種子，其中種子含有CKSRP編碼核酸且其中該植物為對(duì)環(huán)境脅迫的耐受性相對(duì)于該植物細(xì)胞野生型品種增強(qiáng)的真實(shí)遺傳.本發(fā)明還提供了由表達(dá)CKSRP的轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的種子，其中種子含有CKSRP編碼核酸且其中該植物為對(duì)環(huán)境脅迫的耐受性相對(duì)于該植物細(xì)胞野生型品種增強(qiáng)的真實(shí)遺傳。本發(fā)明也提供了下述任意轉(zhuǎn)基因植物、植物部分及植物種子產(chǎn)生的農(nóng)產(chǎn)品。農(nóng)產(chǎn)品包括但不僅限于植物提取物、蛋白質(zhì)、氛基酸、碳水化合物、脂肪、油、聚合物、維生素等。此處所用的術(shù)語(yǔ)"品種"是指同一物種內(nèi)具有恒定特征從而將其與該物種中的一般形式或其他可能存在的品種區(qū)分開的一組植物。雖然具有至少一種獨(dú)特性狀，品種的特征亦在于品種內(nèi)個(gè)體間存在一些差異，所述差異主要是基于連續(xù)傳代子代中性狀的孟德爾分離。若"品種"為某一性狀的遺傳純合子，以至于其自交產(chǎn)生的子代中不出現(xiàn)可觀量該性狀的獨(dú)立分離，則該"品種，，為該性狀的"真實(shí)遺傳".在本發(fā)明中，該性狀由導(dǎo)入植物品種內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)DNA序列的轉(zhuǎn)基因表達(dá)而產(chǎn)生，本發(fā)明首次描述了小立碗蘚CKSRP，PpCK-l、PpCK-2、PpCk4和PpPK-4;釀酒酵母CKSRPScCK-l;和歐洲油菜CKSRP，BnCK-l、BnCK-2、BnCK-3、BnCK-4和BnCK-5可用于增強(qiáng)植物對(duì)環(huán)境脅迫的耐受性。此處所用的術(shù)語(yǔ)多肽是指含有至少4個(gè)由肽鍵相連的4y^酸鏈。該鏈可為線性、分支、環(huán)狀或其組合.因此，本發(fā)明提供了選自PpCK-l、PpCK-2、PpCK畫4、PpPK-4、ScCK-l、BnCK-l、BnCK-2、BnCK-3、BnCK-4和BnCK-5及其同源物的分離CKSRP.在優(yōu)選實(shí)施方案中，CKSRP選自1)SEQIDNO:4定義的小立碗蘚絲白激酶-l(PpCK-l)多肽；SEQEDNO:6定義的小立碗蘚SH^白激酶-2(PpCK-2)多肽；SEQIDNO:l定義的小立碗蘚酪蛋白激酶-4(PpCK-4)多肽；SEQIDNO:8定義的小立碗蘚蛋白激酶4(PpPK4)多肽；SEQIDNO:IO定義的釀酒酵母酪蛋白激酶-1(ScCK-l)多肽；SEQIDNO:12定義的歐洲油菜妙白激酶-1(BnCK-l)多肽；SEQIDNO:14定義的歐洲油菜酪蛋白激酶-2(BnCK-2)多肽；SEQIDNO:16定義的歐洲油菜SS^白激酶-3(BnCK-3)多肽；SEQIDNO:18定義的歐洲油菜酪蛋白激酶-4(BnCK-4)多肽；SEQH)NO:20定義的歐洲油茱S^白激酶-5(BnCK-5)多肽；及其同源物和直系同源物。M酸序列的同源物和直系同源物定義如下，本發(fā)明的CKSRP優(yōu)選由重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。例如，將編碼多肽的核酸分子克隆A^達(dá)栽體(如下述)，將該表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞(如下述)，并使CKSRP在宿主細(xì)胞中表達(dá)。可以利用標(biāo)準(zhǔn)多肽純化技術(shù)，經(jīng)合適的純化步驟將CKSRP從細(xì)胞中分離出來(lái)。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"重組多核苷酸"是指經(jīng)遺傳工程改變、重排或修^飾的多核苷酸。其實(shí)例包括任何克隆的多核普酸，以及與異源序列相連的多核苷酸。術(shù)語(yǔ)"重組，，并非指自然發(fā)生事件導(dǎo)致的多核苷酸改變，如自發(fā)突變。除了重組表達(dá)外，可以利用標(biāo)準(zhǔn)肽合成技術(shù)化學(xué)合成CKSRP或其肽。此外，可利用如抗-CKSRP抗體從細(xì)胞(如小立碗蘚、釀酒酵母或歐洲油菜細(xì)胞)中分離出天然的CKSRP，所述抗體可利用CKSRP或其片段通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)產(chǎn)生。此處所用的術(shù)語(yǔ)"環(huán)境脅迫"，是指涉及鹽、千旱、溫度、金屬、化學(xué)物、病原體和氧化脅迫或其組合的次佳條件。在優(yōu)選實(shí)施方案中，環(huán)境脅迫可選自鹽、干旱或溫度或其組合中的一種或多種；更具體而言，可選自高鹽、低水含量或低溫中的一種或多種。也應(yīng)當(dāng)理解用于該說(shuō)明書a利要求書中的"一個(gè)，，或"一種"，可依據(jù)使用語(yǔ)境不同表示一種或多種.因此，"一個(gè)細(xì)胞"可表示至少使用一個(gè)細(xì)胞。對(duì)于也用于此處的術(shù)語(yǔ)"水利用效率"，是指植物生產(chǎn)出的有機(jī)物質(zhì)量除以植物在生產(chǎn)時(shí)所利用的水量，即相對(duì)于植物用水的植物千重。也用于此處的術(shù)語(yǔ)"核酸"和"多核苷酸"，是指線性或分支、單鏈或雙鏈的RNA或DNA或其雜交。該術(shù)語(yǔ)也包括RNA/DNA雜交物，這些術(shù)語(yǔ)也包括位于基因編碼區(qū)3，和5，端的非翻譯序列編碼區(qū)5，端上游至少約1000個(gè)核苷酸序列以及該基因編碼區(qū)3，端下游至少約200個(gè)核苷酸序列.不常見M如肌苷、5-甲基胞嘧啶、6-甲基腺嗜呤、次黃噪呤等也可用于反義、dsRNA和核酶配對(duì)，例如，含有尿嗜咬和胸腺嘧啶C-5丙炔類似物的多核苷酸能以高親和力結(jié)合RNA，是基因表達(dá)的潛在反義抑制物.也可進(jìn)行其他修飾，如對(duì)磷酸二酯主干或RNA核糖基團(tuán)的2，-羥基進(jìn)行修飾反義多核苷酸和核酶可完全由核糖核苷酸組成，也可含有混合的核糖核苷酸a氧核糖核苷酸.可通過(guò)包括基因組制備、cDNA制備、體外合成、RT-PCR以及體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄等任意方法生產(chǎn)本發(fā)明的多核苷酸。"分離的"核酸分子為基本與該核酸天然來(lái)源中存在的其他核酸分子(即編碼其他多肽的序列)分離的核酸分子。優(yōu)選地，"分離"核酸中不含有某些在天然存在的復(fù)制子中與該核酸天然側(cè)接的序列(即位于核酸5，端和3，端的序列)。例如，克隆的核酸為分離的。在多個(gè)實(shí)施方案中，分離的CKSRP核酸分子可含有少于約5kb、4kb、3kb、2kb、lkb、0.5kb或O.lkb在獲取該核酸的細(xì)胞(如小立碗蘚細(xì)胞、釀酒酵母細(xì)胞或歐洲油菜細(xì)胞)基因組DNA中與該核酸分子天然側(cè)接的核苷酸序列.若核酸已由人工干預(yù)改變，或置于并非其天然位置的基因座或位點(diǎn)，或若通it^桿菌感染法將其導(dǎo)入細(xì)胞，則該核酸也為分離的。此外，"分離的"核酸分子如cDNA分子，可不含有其天然伴有的某些其他細(xì)胞材料，或通過(guò)重組技術(shù)生產(chǎn)時(shí)的培養(yǎng)基，或化學(xué)合成時(shí)的化學(xué)前體或其他化學(xué)物.具體而言，排除在"分離的核酸分子"定義之外的包括天然存在的染色體(如染色體擴(kuò)散)、人工染色體文庫(kù)、基因組文庫(kù)和作為體外核酸制備物或轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞制備物形式的cDNA文庫(kù)，其中宿主細(xì)胞為體外異源性制備物或作為單個(gè)集落的異源種一板。同樣具體排除在外的為上述文庫(kù)，其中某一特定核酸僅占據(jù)小于5%的插入栽體分子的核酸數(shù)目.其他M排除的為全細(xì)胞基因組DNA或全細(xì)胞RNA制備物(包括機(jī)械剪切或酶消化的全細(xì)胞制備物)，另外W排除的是作為體外制備物或由電泳分離的異源混合物，其中本發(fā)明核酸尚未進(jìn)一步從電泳介質(zhì)中與異源核酸分離(如通過(guò)從瓊脂糖凝膠或尼龍印跡的異源條帶中切下單個(gè)條帶來(lái)進(jìn)一步分離)的全細(xì)胞制備物，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)及此處提供的序列信息，可以分離本發(fā)明的核酸分子，如具有核苷酸序列SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19或其部分的核酸分子。例如，可以利用此處公開的序列之一的全部或一部分，將小立碗蘚CKSRPcDNA從小立碗蘚文庫(kù)中分離出來(lái)。此外，對(duì)含有SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17和SEQIDNO:19中某一序列的全部或一部分的核酸分子而言，利用基于該序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物、通過(guò)聚合,式反應(yīng)能夠分離之。例如，可以從植物細(xì)胞中分離mRNA(如通過(guò)Chirgwin等人，1979，Biochemistry18:5294-5299的硫氰酸IM^取方法)，并且可利用逆轉(zhuǎn)錄酶制備cDNA(如可獲自Gibco/BRL、Bethesda、MD的MoloneyMLV逆轉(zhuǎn)錄酶；或可獲自SeikagakuAmerica,Inc.,St.Petersburg,FL的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶)?？苫赟EQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17和SEQIDNO:19所示的核苷酸序列之一設(shè)計(jì)合成用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的寡核苷酸引物。以cDNA或基因組DNA為模板，利用合適JW苷酸引物，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增技^T增本發(fā)明的核酸分子.將如此擴(kuò)增的核酸分子克隆入合適的栽體，并以DNA序列分析表征.此外，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)合成技術(shù)如利用自動(dòng)DNA合成儀，能制備對(duì)應(yīng)CKSRP核苷酸序列的寡核苷酸.在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明中分離的核酸分子包含SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17或SEQIDNO:19所示的核苷酸序列之一。這些cDNA可能含有編碼CKSRP的序列(即"編碼區(qū)")，以及5，非翻譯序列和3，非翻譯序列.或者本發(fā)明的核酸分子可僅含有SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19中任意序列的編碼區(qū)，或含有分離自基因組DNA的全基因組片段。本發(fā)明也包括編碼此處所述CKSRP的CKSRP編碼核酸。優(yōu)選的CKSRP編碼核酸為編碼選自PpCK-l(SEQIDNO:4)、PpCK-2(SEQIDNO:6)、PpCK-4(SEQIDNO:2)、PpPK4(SEQIDNO:8)、ScCK畫l(SEQIDNO:IO)、BnCK國(guó)l(SEQIDNO:12)、BnCK醫(yī)2(SEQIDNO:")、BnCK-3(SEQIDNO:16)、BnCK-4(SEQIDNO:18)和BnCK-5(SEQIDNO:20)的CKSRP的編碼核酸。此外，本發(fā)明的核酸分子可含有SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17及SEQIDNO:19中某一序列編碼區(qū)的一部分，例如可用作探針或引物的片段或者編碼CKSRP生物活性部分的片段。通過(guò)小立碗蘚、釀酒酵母或歐洲油菜的CKSRP基因克隆確定的核苷酸序列，可用于產(chǎn)生探針和引物，用于鑒定和/或克隆其他細(xì)胞類型和生物的CKRSP同源物以及其他蘚類和相關(guān)物種中CKSRP同源物。編碼區(qū)的部分也可編碼CKSRP的生物活性片段.此處所用的術(shù)語(yǔ)CKRSP的"生物活性部分"，指包含CKSRP中參與調(diào)節(jié)植物脅迫耐受性的某一部分如結(jié)構(gòu)^/部分，更優(yōu)選為旱耐受性或鹽耐受性。在本發(fā)明中，對(duì)脅迫耐受性的調(diào)節(jié)是指含CKRSP表達(dá)盒(或表達(dá)栽強(qiáng)或減少至少10%。定量脅迫耐受性的方法至少可見下文實(shí)施例7.在優(yōu)選實(shí)施方案中，CKSRP的生物活性部分增強(qiáng)了植物對(duì)環(huán)境脅迫的耐受性.CKSRP的生物活性部分包含含有M酸序列的肽，其中所述氨基酸序列來(lái)自CKSRP絲,列如SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:IO、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20，或來(lái)自與CKSRP相同多肽的A^酸序列，其中所含氨基酸少于全長(zhǎng)CKSRP或?yàn)榕cCKSRP相同的全長(zhǎng)多肽,且具有至少一種CKSRP活性.一般而言，生物活性部分(如長(zhǎng)度為如5、10、15、20、30、35、36、37、38、39、40、50、100或更多氛基酸的肽)含有具有CKSRP活性的至少一種結(jié)構(gòu)域或基序.此外，通過(guò)重組技術(shù)可制備缺失多肽其他區(qū)域的其他生物活性部分，并評(píng)估此處描述的一種或多種活性.優(yōu)選地，CKSRP生物活性部分包含一個(gè)或多個(gè)選擇的具有生物活性的結(jié)構(gòu)^/基序或其部分，如圖5和7所示的保守的中央激酶結(jié)構(gòu)域.在優(yōu)選實(shí)施方案中，保守的中央激酶結(jié)構(gòu)域包括4個(gè)保守區(qū)，其中第一區(qū)自位點(diǎn)l的甘氨酸殘基開始，且位點(diǎn)3為甘氨酸，位點(diǎn)5為苯丙氨酸殘基；第二區(qū)位于第一區(qū)下游，自位點(diǎn)l的纈氨酸殘基開始，位點(diǎn)4為賴氨酸、位點(diǎn)6為谷氨酸殘基、位點(diǎn)14為谷氨酰胺殘基、位點(diǎn)15為亮氨酸殘基、位點(diǎn)18為谷氨酸泉基、位點(diǎn)22為酪氨酸殘基、位點(diǎn)32為脯氨酸殘基、位點(diǎn)38為甘氨酸殘基、位點(diǎn)44為天冬酰胺殘基、位點(diǎn)50和51為亮氨酸殘基、位點(diǎn)52為甘氨酸殘基、位點(diǎn)53為脯氨酸^、位點(diǎn)55為亮氨酸殘基、位點(diǎn)58為亮氨酸殘基、位點(diǎn)59為苯丙氨酸殘基、位點(diǎn)62為半胱氨酸殘基、位點(diǎn)66為苯丙氨酸殘基、位點(diǎn)69為賴氨酸殘基、位點(diǎn)70為蘇氨酸殘基、位點(diǎn)77為谷氨酰胺殘基、位點(diǎn)79為異亮氨酸殘基、位點(diǎn)86為組氨酸^、位點(diǎn)93為精氨酸殘基、位點(diǎn)94為天4^氨酸^J^、位點(diǎn)96為賴氨酸^、位點(diǎn)97為脯氨酸^A、位點(diǎn)99為天冬,殘基、位點(diǎn)100為苯丙氨酸殘基、以及位點(diǎn)101為亮氨酸殘基；第三區(qū)位于笫二區(qū)下游，自位點(diǎn)l的天冬氨酸殘基開始，位點(diǎn)5為丙氨酸殘基、位點(diǎn)6賴氨酸瓶基、位點(diǎn)8酪氨酸殘基、位點(diǎn)10天冬氨酸殘基、位點(diǎn)13蘇氨酸殘基、位點(diǎn)16組氨酸殘基、位點(diǎn)17異亮氨酸殘基、位點(diǎn)18脯氨酸^t^、位點(diǎn)19酪氨酸殘基、位點(diǎn)20精氨酸殘基、位點(diǎn)23賴氨酸^*、位點(diǎn)27甘氨酸戎基、位點(diǎn)28蘇氨酸殘基、位點(diǎn)29丙氨酸戎基、位點(diǎn)30精氨酸^li、位點(diǎn)31酪氨酸g、位點(diǎn)33絲氨酸^l&、位點(diǎn)35天冬跣胺瓶基、位點(diǎn)37組氨酸殘基、位點(diǎn)39甘氨酸殘基、位點(diǎn)41谷氨酸殘基、位點(diǎn)43絲氨酸M、位點(diǎn)44精氨酸粉l、位點(diǎn)45的精氨酸殘基、位點(diǎn)46天冬氨酸殘基、位點(diǎn)47天冬氨酸殘基、位點(diǎn)49谷氨酸殘基、位點(diǎn)52甘氨酸^Ul-、位點(diǎn)57酪氨酸殘基、位點(diǎn)58苯丙氨酸殘基、位點(diǎn)63亮氨酸殘基、位點(diǎn)64脯氨酸^t^、位點(diǎn)65色氨酸殘基、位點(diǎn)66^Mfe^殘基、位點(diǎn)67甘氨酸殘基；而第四區(qū)位于笫三區(qū)下游，自位點(diǎn)1的脯氨酸殘基開始，位點(diǎn)12為精氨酸殘基、位點(diǎn)14亮氨酸殘基、位點(diǎn)16苯丙氨酸殘基、位點(diǎn)20脯氨酸殘基、位點(diǎn)21天冬氨酸殘基、位點(diǎn)22酪氨酸殘基、位點(diǎn)41天冬氨酸殘基、位點(diǎn)45天冬氨酸殘基，以及位點(diǎn)46為色氨酸殘基，本發(fā)明也提供CKSRP嵌合或融合多肽。此處所用的CKSRP"嵌合多肽，，或"融合多肽"包含有效連接于非CKSRP的CKSRP。CKSRP是指具有對(duì)應(yīng)于CKSRP的M酸序列的多肽，而非CKSRP是指具有的氛基酸序列對(duì)應(yīng)于基本不同于CKSRP的多肽(如不同于CKSRP且來(lái)自相同或不同生物的多肽)的多肽。在融合多肽中，術(shù)語(yǔ)"有效連接"是指CKSRP與非CKSRP彼此融合，從而使兩個(gè)序列都能實(shí)現(xiàn)所用序列的預(yù)期功能。非CKSRP可融合于CKSRP的N-末端或C-末端。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，融合多肽為GST-CKSRP融合多肽，其中CKSRP序列融合至GST序列的C-末端。此類融合多肽有助于重組CKSRP的純化。在另一個(gè)實(shí)施方案中，融合多肽為在其N-末端^^有異源信號(hào)序列的CKSRP。在某些宿主細(xì)胞(如哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞)中，通過(guò)使用異源信號(hào)序列能提高CKSRP的表達(dá)和/或分泌，優(yōu)選通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明的CKSRP嵌合或融合多肽。例如，根據(jù)常規(guī)技術(shù)將編碼不同多肽序列的DNA片段按閱讀框架連接在一起，如利用平頭或錯(cuò)開末端進(jìn)行連接，限制性酶消化以提^適的末端，必要時(shí)補(bǔ)足祐性末端，堿性磷酸酶處理以避免不必要的結(jié)合和酶連接。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可通過(guò)常規(guī)技術(shù)包括自動(dòng)DNA合成儀合成融合基因.或者利用錨定引物實(shí)施基因片段的PCR擴(kuò)增，所述錨定引物能在兩個(gè)連續(xù)基因片段間產(chǎn)生互補(bǔ)突出端，從而可l^退火并再擴(kuò)增以產(chǎn)生嵌合基因序列(見如CurrentProtocolsinMolecularBiology,Ausubel等人編輯.JohnWiley和Sons:1992)。此外，可購(gòu)買得到多種編碼融^p分(如GST多肽)的表達(dá)栽體?？蓪KSRP編碼核^隆入此類表達(dá)栽體，而使融合部分按閱讀框架連接于CKSRP,除了此處描述的CKSRP的片段和融合多肽之外，本發(fā)明還包括植物中天然CKSRP和CKSRP編碼核酸的同源物和類似物.此處定義"同源物"為分別具有相似或"相同"核苷酸或M酸序列的兩個(gè)核酸或多肽。同源物包括此處l^定義的CKSRP等位基因變體、直系同源物、旁系同源物、激動(dòng)劑和拮抗劑.術(shù)語(yǔ)"同源物"還包括由于遺傳密碼簡(jiǎn)并而不同于SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17以及SEQIDNO:19(及其部分)所示核苷酸序列之一的核酸分子，因此與SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17或SEQIDNO:19所示核苷酸序列編碼相同的CKSRP。例如，SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17或SEQIDNO:19的同源物描述于SEQIDNO:54、SEQIDNO:56、SEQIDNO:58、SEQIDNO:60、SEQIDNO:62、SEQIDNO:64、SEQIDNO:66、SEQIDNO:68、SEQIDNO:70、SEQIDNO:72、SEQIDNO:74和SEQIDNO:76。此處所用的"天然存在的，，CKSRP,是指天然存在的CKSRP**,列。優(yōu)選天然存在的CKSRP含有選自SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:IO、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18和SEQIDNO:20的^J^,列.CKSRP的激動(dòng)劑可保留與CKSRP的生物活性iW^目同或CKSRP的生物活性的某一亞型.CKSRP的拮抗劑能夠抑制CKSRP天然存在形式的一種或多種活性.例如，CKSRP拮抗劑能竟?fàn)幮越Y(jié)合于包括CKSRP在內(nèi)的細(xì)胞膜成分代謝^l^應(yīng)的下游或上游成員，或結(jié)合于介導(dǎo)化合物跨此類膜轉(zhuǎn)運(yùn)的CKSRP，從而阻斷轉(zhuǎn)位的發(fā)生?；趯?duì)應(yīng)CKSRPcDNA的天然等位基因變體和同源物、直系同源物、旁系同源物的核酸分子與此處所述的小立碗蘚、釀酒酵母或歐洲油菜CKSRP核酸的同一性，可以使用CKSRPcDNA或其部分作為雜交探針，在嚴(yán)格雜交條件下根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)雜交技術(shù)分離這些核酸分子。在備選的實(shí)施方案中，可通過(guò)篩選CKSRP突變體如平截突變體組合文庫(kù)中CKSRP激動(dòng)劑或拮抗劑活性，鑒定CKSRP同源物。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)核酸水平的組合誘變產(chǎn)生CKSRP變體的多樣性文庫(kù)，該文庫(kù)由多樣性基因文庫(kù)編碼。可通過(guò)如將合成的寡核苷酸混合物酶連接入基因序列而產(chǎn)生CKSRP變體的多樣性文庫(kù)，從而使?jié)撛贑KSRP序列的簡(jiǎn)并組能以個(gè)體多JI^達(dá)，或以一組含有CKSRP序列組的更大的融合多肽(如噬菌體展示)形式表達(dá)。有多種方法可用于從簡(jiǎn)并寡核苷酸序列中產(chǎn)生潛在的CKSRP同源物?？稍谧詣?dòng)DNA分析儀中實(shí)施簡(jiǎn)并基因序列的化學(xué)合成，然后將合成基因連接入合適的表達(dá)載體。使用簡(jiǎn)并基因使得在同一混合物內(nèi)能提供所有編碼所需潛在CKSRP序列組的序列。合成簡(jiǎn)并寡核苷酸的方法為本領(lǐng)域^^(見如Narang，S.A.，1983，Tetrahedron39:3;Itakura等人，1984，An肌.Rev.Bioche肌53:323;Itakura等人，1984，Science198:1056;Ike等人，1983，NucleicAcidRes.11:477)。此外，CKSRP編碼區(qū)片段文庫(kù)可用于產(chǎn)生CKSRP片段的多樣性群體以用于篩選及l(fā)^選擇CKSRP同源物。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)在每分子僅發(fā)生約一次缺刻的務(wù)泮下用核酶處理CKSRP編碼序列的雙鏈PCR片段、變性雙鏈DNA、復(fù)性DNA以形成雙鏈DNA(其可包括來(lái)自不同缺刻產(chǎn)物的正義/反義對(duì))、利用Sl核酶處理從重新形成的二聚體中除去單鏈部分，并將產(chǎn)生的片段文庫(kù)連接A^達(dá)栽體，來(lái)產(chǎn)生編碼序列片段的文庫(kù).通過(guò)這一方法可以得到編碼CKSRP中不同大小的N-末端、C-末端以及內(nèi)部片段的表iiJ:庫(kù)。若干用于篩選通過(guò)點(diǎn)突變或平截產(chǎn)生的組合文庫(kù)基因產(chǎn)物的技術(shù)，以及用于篩選cDNA文庫(kù)中具有選定性質(zhì)的基因產(chǎn)物的技術(shù)為本領(lǐng)域公知。此類技術(shù)適用于快速篩選通過(guò)組^l"變CKSRP同源物產(chǎn)生的基因文庫(kù).使用最為廣泛的可適用于高通量分析的篩選大型基因文庫(kù)的技術(shù)，一般包括將基因文庫(kù)克隆入可復(fù)制的表達(dá)栽體、利用產(chǎn)生的栽體文庫(kù)轉(zhuǎn)化合適細(xì)表iiia^^基因。循環(huán)集成誘變(Recursiveensemblemutagenesis,REM)為提高文庫(kù)中功能性突變體頻率的新技術(shù)，可與篩選測(cè)定聯(lián)合使用以鑒定CKSRP同源物(Arkin和Yourvan，1992，PNAS89:7811-7815;Delgrave等人1993，PolypeptideEngineering6(3):327-331).在另一實(shí)施方案中，可通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法運(yùn)用基于細(xì)胞的測(cè)定分析多樣性CKSRP文庫(kù).本發(fā)明還提供了鑒定新CKSRP的方法，包括(a)引起對(duì)此處所述的CKSRP或其片段的特異性抗體應(yīng)答；(b)利用該抗體篩選假定的CKSRP材料，其中抗體與材料的特異性結(jié)合提示可能存在新的CKSRP;以及(c)對(duì)照已知CKSRP分析結(jié)合材料，以確定其為新的CKSRP。如上所述，本發(fā)明包括CKSRP及其同源物。為確定兩個(gè)M酸序列之間的序列同一性百分比(例如序列SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:IO、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18和SEQIDNO:20之一及其突變型)，以可供最佳比較的方式比對(duì)序列(如可向某一多肽序列中引入空檔以達(dá)到與另一多肽或核酸的最佳比對(duì))。然后比較對(duì)應(yīng)M酸位點(diǎn)上的氨基酸殘基。當(dāng)一個(gè)序列(如序列SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:IO、SEQIDNO:12、SEQlDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18和SEQIDNO:20之一)中某一位點(diǎn)上的氨基酸戎基與另一序列(如序列SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:IO、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18或SEQIDNO:20的突變型)中相應(yīng)位點(diǎn)的氨基酸^J^相同，則這兩個(gè)分子在該位點(diǎn)上是一致的.在兩個(gè)核酸序列間可進(jìn)行同類比較。兩序列間的序列同一性百分比為兩序列共有相同位點(diǎn)數(shù)目的函數(shù)(即序列同一性百分比=相同位點(diǎn)數(shù)目/總位點(diǎn)數(shù)xl00)。優(yōu)選本發(fā)明中分離的氨基酸同源物與核心酪蛋白激酶結(jié)構(gòu)域的同一性至少為約50-60%，優(yōu)選至少約60-70%，更優(yōu)選至少約70-75%、75-80%、80-85%、85-90%或卯-95%，最優(yōu)選至少約96%、97%、98%、99%或更大，其中核心酪蛋白激酶結(jié)構(gòu)域含有SEQIDNO:2的殘基2-304、SEQIDNO:4的絲77-368、SEQIDNO:6的殘基2-294、SEQIDNO:8的絲77-368、SEQIDNO:10的殘基77-336、SEQIDNO:12的殘基1-296、SEQIDNO:14的殘基1-296、SEQIDNO:16的殘基5-300、SEQIDNO:18的絲1-295，或SEQIDNO:20的殘基25-327所示的M酸序列.在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明分離的氨基酸同源物由SEQIDNO:l中4至912位核苷酸、SEQIDNO:3中229至1104位核苷酸、SEQIDNO:5中4至882位核苷酸、SEQIDNO:7中229至1104位核苷酸、SEQIDNO:9中229至1008位核苷酸、SEQIDNO:ll中1至888位核苷酸、SEQIDNO:13中1至888位核苷酸、SEQIDNO:15中13至卯0位核普酸、SEQIDNO:17中1至885位核苷酸，或SEQIDNO:19中73至981位核苷酸定義的核酸編碼。酪蛋白激酶I蛋白質(zhì)家族的成員具有多變的N-末端和C-末端延伸。N-末端負(fù)責(zé)底物識(shí)別而C-末端區(qū)域?qū)εc底物的相互作用有重要作用，對(duì)于介導(dǎo)通過(guò)自磷酸化實(shí)現(xiàn)的調(diào)節(jié)也很重要(Gross和Anderson,CellSignal199810:699-711;Graves和Roach,JBiolChem1995270:21689-21694)。Orf760M紗列(SEQIDNO:10)含有兩個(gè)在其他酪蛋白激酶I蛋白質(zhì)中沒有的插入，跨越位點(diǎn)37至53的17個(gè)氨基酸以及跨越位點(diǎn)165至180的16個(gè)氨基酸。這些新插入的存在對(duì)于過(guò)量表達(dá)Orf760的轉(zhuǎn)基因系的功能和隨后的表型可能很重要。酪蛋白激酶I蛋白質(zhì)通過(guò)自磷酸化C-末端絲氨酸和蘇氨酸殘基調(diào)節(jié)自身活性(Graves和RoachJBiolChem1995270:21689-21694).圖5中的比對(duì)表明在同一性比對(duì)約525個(gè)M酸之后，發(fā)現(xiàn)C-末端區(qū)域存在于Orf760、EST263和EST289中，而在EST142和EST194則缺失，然而，與Orf760、EST263和EST289不同，如圖5比對(duì)所示，EST142和EST194均含有約72個(gè)氨基酸的N-末端區(qū)域。這些N-末端和C-末端區(qū)域存在與否定義了至少六類作用于脅迫應(yīng)答的酪蛋白激酶I蛋白質(zhì)。N-末端區(qū)域，或C-末端區(qū)域，或核心激酶結(jié)構(gòu)域，或核心激酶結(jié)構(gòu)域與不同或同源的N-末端和/或C-末端延伸區(qū)域的組合或定點(diǎn)誘變可用于改變一致的自磷酸化位點(diǎn)，以產(chǎn)生更好的農(nóng)藝表型.例如，嵌合或融合多肽可含有與圖5所示的^核心激酶結(jié)構(gòu)域融合，或與圖5所示的任何C-末端結(jié)構(gòu)域融合，或與圖5所示任何多肽的核心激酶結(jié)構(gòu)域和C-末端結(jié)構(gòu)域融合的EST1421-72位殘基(SEQIDNO:8的N-末端區(qū)域).在另一實(shí)施方案中，EST289的295-473位g(SEQIDNO:6的C-末端區(qū)域)可與圖5所示的任意多肽的核心激酶結(jié)構(gòu)域，或圖5所示的任意N-末端結(jié)構(gòu)域，或圖5所示的任意多肽的核心激酶和N-末端結(jié)構(gòu)域組合，以產(chǎn)生賦予更好農(nóng)藝表型的嵌合或融合多肽。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明包括的分離的氨基酸同源物與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18或SEQIDNO:20所示的全M酸序列間的同一性，至少為約50-60%,優(yōu)選至少約60-70%，更優(yōu)選至少約70-75%、75-80%、80-85%、85-卯％或卯-95%，最優(yōu)選至少為約96%、97%、98%、99%或更高。例如，SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20JL^酸序列的同源物描述于SEQIDNO:55、SEQIDNO:57、SEQIDNO:59、SEQIDNO:61、SEQIDNO:63、SEQIDNO:65、SEQIDNO:67、SEQIDNO:69、SEQIDNO:71、SEQIDNO:73、SEQIDNO:75和SEQIDNO:77。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明包括的分離的氨基酸同源物與SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19所示核酸序列編碼的全氨基酸序列，或與如SEQIDNO:54、SEQIDNO:56、SEQH)NO:58、SEQIDNO:60、SEQIDNO:62、SEQIDNO:64、SEQIDNO:66、SEQIDNO:68、SEQIDNO:70、SEQIDNO:72、SEQIDNO:74或SEQIDNO:76所示的其同源物間的同一性，至少為約50-60%,優(yōu)選至少約60-70%，更優(yōu)選至少約70-75%、75-80%、80-85%、85-90%或卯-95%,最優(yōu)選至少為約96%、97%、98%、99%或更高.在其他實(shí)施方案中，CKSRP氨基酸同源物與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQEDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQEDNO:18、SEQIDNO:20的序列同一性，或與SEQIDNO:55、SEQIDNO:57、SEQH)NO:59、SEQIDNO:61、SEQIDNO:63、SEQIDNO:65、SEQIDNO:67、SEQIDNO:69、SEQIDNO:71、SEQIDNO:73、SEQIDNO:75和SEQIDNO:77所述的SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQH)NO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20M酸序列同源物的序列同一性，至少為15個(gè)連續(xù)氣基酸殘基，更優(yōu)選至少為25個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基，最優(yōu)選為至少35個(gè)連續(xù)氨基酸殘基。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明中分離的核酸同源物包含的核苷酸序列，與SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17或SEQIDNO:19所示核酸序列，或與>^有至少60個(gè)其連續(xù)核苷酸的部分間的同一性至少為40-60%，優(yōu)選至少為約60-70%，更優(yōu)選至少約70-75%、75-80%、80-85%、85-90%或90-95%，甚至更優(yōu)選至少約95%、96%、97%、98%、99%或更高.優(yōu)選的核苷酸序列比軟長(zhǎng)度為至少75個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少100個(gè)核苷酸，而最優(yōu)選為編碼區(qū)全長(zhǎng)。甚至更優(yōu)選核酸同源物編碼的蛋白質(zhì)與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQH)NO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18或SEQIDNO:20在圖5和圖7所示的中央激酶結(jié)構(gòu)域同源.還優(yōu)選本發(fā)明分離的核酸同源物編碼的CKSRP或其部分與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18或SEQIDNO:20M酸序列的同一性至少為70y。，且作為植物應(yīng)答環(huán)境脅迫的調(diào)節(jié)物作用。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸同源物在植物中的過(guò)量表達(dá)增強(qiáng)了該植物對(duì)環(huán)境脅迫的耐受性.在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸同源物編碼作為胳蛋白激酶作用的CKSRP。在本發(fā)明中，利用VectorNTI6.0(PC)軟件包(InforMax，7600WisconsinAve.，Bethesda，MD20814)確定兩個(gè)核酸或多肽序列間的序列同一性百分比。使用空位開放罰分15和空位拓展罰分6.66確定兩核酸之間的同一性百分比。使用空位開放罰分10和空位拓展罰分0.1確定兩個(gè)多肽間的同一性百分比。所有其他參數(shù)均設(shè)置為默認(rèn)設(shè)置。為進(jìn)行多重比對(duì)(聚類W運(yùn)算法則)，blosum62矩陣的空位開放罰分為10，而空位拓展罰分為0.05。應(yīng)當(dāng)注意當(dāng)確定DNA序列和RNA序列間的序列同一性時(shí)，胸本發(fā)明另一方面提供了分離的核酸，其包含的多核苷酸在嚴(yán)4M^件下與SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17或SEQIDNO:19的多核苷酸雜交。更具體而言，本發(fā)明中分離的核酸分子長(zhǎng)度為至少15個(gè)核苷酸，并在嚴(yán)格務(wù)降下與^^有SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17或SEQIDNO:19所示核苷酸序列的核酸分子雜交。在其他實(shí)施方案中，核酸長(zhǎng)度至少為30、50、100、250或更多個(gè)核苷酸。優(yōu)選本發(fā)明中分離的核酸同源物包括在高度嚴(yán)^^ff下與SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17或SEQIDNO:19所示核苷酸序列雜交的核苷酸序列，且作為植物中脅迫耐受性調(diào)節(jié)物作用.在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，分離核酸同源物在植物中的過(guò)量表達(dá)增強(qiáng)了植物對(duì)環(huán)境脅迫的耐受性.在甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，分離核酸同源物編碼作用如膝蛋白激酶的CKSRP。此處所用的涉及DNA與DNA印跡雜交的術(shù)語(yǔ)"嚴(yán)M件"，是指在60oC下，10xDenhart雜交溶液、6xSSC、0.5%SDS和100ng/ml變性鮭精DNA中雜交過(guò)夜。依次在3xSSC/0.1%SDS，隨后在lxSSC/0.1%SDS，最后在0.1xSSC/0.iy。SDS中于62。C下洗滌印跡，每次30分鐘。在優(yōu)選的實(shí)施方案中短語(yǔ)"高度嚴(yán)*件"也用于此處，是指在6xSSC溶液、65。C下雜交過(guò)夜.在另一實(shí)施方案中，"高度嚴(yán)格條件"是指在65。C下，10xDenhart雜交溶液、6xSSC、0.5%SDS和100pg/ml變性鮭精DNA中雜交過(guò)夜.依次在3xSSC/0.1%SDS，隨后在lxSSC/0.1。/。SDS，最后在0.1xSSC/0.1%SDS中于65。C洗滌印跡，每次30分鐘。核酸雜交的方法見于Meinkoth和Wahl，1984，Anal.Biochem.138:267-284;CurrentProtocolsinMolecularBiology,第2章，Ausubel等人編輯，GreenePublishingandWiley-Interscience，NewYork,1995;以及Tijssen，1993，LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology:HybridizationwithNucleicAcidProbes，第I部分，第2章，Elsevier,NewYork,1993。優(yōu)選本發(fā)明中分離的核酸分子對(duì)應(yīng)于天然存在的核酸分子，其在嚴(yán)格或高度嚴(yán);^ff下與SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17或SEQIDNO:19序列雜交。此處所用的"天然存在"的核酸分子，是指具有天然存在核苷酸序列(如編碼天然多肽)的RNA或DNA分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，該核酸編碼天然存在的小立碗蘚CKSRP、釀酒酵母CKSRP或歐洲油菜CKSRP。利用上述方法和其他本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能分離CKSRP的同源物，其包bSEQBDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:IO、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20所示的絲紗列.此類同源物說(shuō)明見如SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52、SEQIDNO:53、SEQIDNO:55、SEQIDNO:57、SEQIDNO:59、SEQIDNO:61、SEQIDNO:63、SEQIDNO:65、SEQIDNO:67、SEQIDNO:69、SEQIDNO:71、SEQIDNO:73、SEQIDNO:75和SEQIDNO:77.表A為基因ID與序列表中SEQIDNO的對(duì)照。<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>這些同源物的一種亞型為等位基因變體.此處所用的術(shù)語(yǔ)"等位基因變體"是指含有導(dǎo)致CKSRP**酸序列改變且存在于自然種群中(如植物物種或品種)的多態(tài)性的核苷酸序列.此類天然等位基因變體一般會(huì)造成1-5%的CKSRP核酸差異。通過(guò)在多種不同植物中測(cè)序目標(biāo)核酸的序列能鑒定等位基因變體，利用雜交探針可容易地鑒定那些植物中相同的CKSRP基因座.任意及所有由天然等位變異造成且不改變CKSRP功能活性的此類CKSRP的核酸變體及產(chǎn)生的狄酸多態(tài)性或變異性，均包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。此外，編碼相同或其他物種CKSRP的核酸分子如CKSRP類似物、直系同源物和旁系同源物，均在本發(fā)明范圍內(nèi)。此處所用的術(shù)語(yǔ)"類似物"，是指具有相同或相似功能，但在非相關(guān)生物中獨(dú)立進(jìn)化而來(lái)的兩個(gè)核酸，此處所用的術(shù)語(yǔ)"直系同源物"是指來(lái)自不同物種<&#>據(jù)物種形成由共同祖先基因進(jìn)化而來(lái)的兩個(gè)核酸。通常直系同源物編碼具有相同或相似功能的多肽。也用于此處的術(shù)語(yǔ)"旁系同源物"是指通過(guò)基因組內(nèi)重復(fù)而相關(guān)的兩個(gè)核酸。旁系同源物通常具有不同的功能，但這些功能可能相關(guān)(Tatusov，R丄.等人，1997，Science278(5338):631-637)。天然CKSRP的類似物、直系同源物和旁系同源物可由于翻譯后修飾、M酸序列不同或兩者，而與天然CKSRP不同。翻譯后修飾包括多肽的體內(nèi)和體外化學(xué)衍生作用，如乙跣化、羧化、磷酸化或糖基化，且此類修飾發(fā)生于多肽合成或加工時(shí)或用分離的修飾酶處理后。具體而言，本發(fā)明的直系同源物一般與天然存在CKSRPM酸序列的所有或部分的序列同一性至少為80-85%、更優(yōu)逸85-90%或卯-95%、最優(yōu)選95%、96%、97%、98%或甚至99%或100%，且具有類似于CKSRP的功能。優(yōu)選本發(fā)明的CKSRP直系同源物作用如植物中環(huán)境脅迫應(yīng)答的調(diào)節(jié)物和/或作用如酪蛋白激酶，更優(yōu)選CKSRP直系同源物增強(qiáng)了植物的脅迫耐受性。在一個(gè)實(shí)施方案中，CKSRP直系同代謝的能力.除了種群中可能存在的天然存在的CKSRP序列變體外，技術(shù)人員還知道可通過(guò)突變將改變導(dǎo)入SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17或SEQIDNO:19的核苷酸序列中，從而改變編碼CKSRP的A^,列而不影響CKSRP的功能活性，例如，可在SEQIDNO:l、SEQH)NO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17或SEQIDNO:19序列中實(shí)施核苷酸置換而引發(fā)"非必需，，氨基酸殘基處的氛基酸置換，"非必需"M酸殘基為可從CKSRP的野生型序列中改變卻不會(huì)影響所述CKSRP活性的氨基酸殘基，而"必需"氨基酸^為CKSRP活性所必需。然而，其他氨基酸殘基(如在那些具CKRSP活性的結(jié)構(gòu)域中非保守或僅半保守的M酸殘基)可能對(duì)活性并非必需，因此可能可以改變而不會(huì)影響CKSRP活性.因此，本發(fā)明的另一方面涉及編碼CKSRP的核酸分子，其含有對(duì)CKSRP活性非必需的氛基酸殘基改變。此類CKSRP的M酸序列不同于在SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:IO、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18或SEQIDNO:20中含有的序列，但仍保留了至少一種此處所述的CKSRP活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，分離的核酸分子包含編碼多肽的核苷酸序列，其中多肽中含有的^^酸序列與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:IO、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18或SEQIDNO:20之一的絲,列的中央蛋白激酶區(qū)至少約50%的同一性。優(yōu)選由該核酸分子編碼的多肽與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:IO、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18或SEQIDNO:20之一的JLfc酸序列的中央蛋白激酶區(qū)至少約50-60%的同一性，更優(yōu)選與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18或SEQEDNO:20之一的M酸序列的中央蛋白激酶區(qū)至少約60-70%的同一性，甚至更優(yōu)選與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQID]VO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18或SEQIDNO:20之一的絲妙列的中央蛋白激酶區(qū)至少約70-75%、75-80%、80-85%、85-90%或90-95%的同一性，最優(yōu)選與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQH)NO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18或SEQIDNO:20之一的絲紗列的中央蛋白激酶區(qū)至少約96%、97%、98%或99%的同一性。在另一實(shí)施方案中，核酸分子編碼的多肽與SEQH)NO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18或SEQIDNO:20之一的絲紗列至少約50-60%的同一性，更優(yōu)選與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18200580046694.1說(shuō)明書第28/79頁(yè)或SEQIDNO:20之一的Jl^酸序列至少約60-70%的同一性，甚至更優(yōu)選與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18或SEQIDNO:20之一的絲酸序列至少約70-75%、75-80%、80-85%、85-卯％或90-95%的同一性，最優(yōu)選與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18或SEQIDNO:20之一的^Jl,列至少約96%、97%、98%或99%的同一性。本發(fā)明優(yōu)選的CKSRP同源物優(yōu)選參與植物的脅迫耐受性應(yīng)答，或更具體而言參與植物中涉^J^迫耐受性應(yīng)答的多肽的轉(zhuǎn)錄，和/或作用如酪蛋白激酶。分別向SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17或SEQIDNO:19的核苷酸序列之一引入一個(gè)或多個(gè)核普酸置換、添加或缺失，從而向編碼多肽中引入一個(gè)或多個(gè)MM換、添加或缺失，能產(chǎn)生分離的核酸分子，所迷核酸分子編碼的CKSRP與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQD)NO:18、SEQIDNO:20中某一多M列具有序列同一性?？赏ㄟ^(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如定點(diǎn)誘變和PCR介導(dǎo)誘變，向SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:S、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17或SEQIDNO:19序列之一引入突變.優(yōu)i^fr—個(gè)或多個(gè)預(yù)測(cè)非必需的氨基酸殘基處進(jìn)行保守性M酸置換。"保守性氨基酸置換，，即用具有相似側(cè)鏈的氨基酸^J^^R^氨基酸殘基。本領(lǐng)域已經(jīng)定義了具有相似側(cè)鏈的氨基酸瓶基家族。這些家族包括具不帶電極性側(cè)鏈(如甘氨酸、天冬跣胺、谷胺酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、^分支側(cè)鏈(如蘇氨酸、纈氨酸、異、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(如天冬氨酸、^酸)、亮氨酸)以及芳香側(cè)鏈(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。因此，優(yōu)選以同一側(cè)鏈家族中的另一M酸^^取代CKSRP中的預(yù)測(cè)非必需氨基酸殘基?；蛘咴诹硪粚?shí)施方案中，可通過(guò)如飽和誘變向全長(zhǎng)或部分的CKSRP編碼序列中隨機(jī)引入突變，篩選所產(chǎn)生突變體中此處所述的CKSRP活性，以鑒定保留CKSRP活性的突變體。誘變SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17或SEQIDNO:19的序列之一后，可重組表達(dá)編碼多肽并通過(guò)如實(shí)施例7所述分析表達(dá)該多肽植物的脅迫耐受性確定該多肽的活性。此外可產(chǎn)生最優(yōu)化的CKSRP核酸。優(yōu)選最優(yōu)化的CKSRP核酸編碼的CKSRP與磷酸基團(tuán)結(jié)合，和/或調(diào)節(jié)植物對(duì)環(huán)境脅迫的耐受性，更優(yōu)選當(dāng)其在植物中過(guò)量表達(dá)時(shí)增強(qiáng)植物對(duì)環(huán)境脅迫的耐受性，此處所用的術(shù)語(yǔ)"最優(yōu)化的，，是指經(jīng)遺傳工程操作以提高其在給定植物或動(dòng)物中表達(dá)的核酸.為提供植物最優(yōu)化的CKSRP核酸，可修飾該基因的DNA序列以使其l)含有高表達(dá)的植物基因優(yōu)選的密碼子；2)核苷酸4S^成中A+T的含量與植物中廣泛存在者一致；3)形成植物起始序列；或4)消除導(dǎo)致RNA不穩(wěn)定、不恰當(dāng)B苷化、降解和終止的序列，或那些形成二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)卡或RNA剪切位點(diǎn)的序列。利用一J&植物或特定植物中密碼子使用的頻率分布，能增加CKSRP核酸的表達(dá).最優(yōu)化植物中核M達(dá)的方法可見于EPA0359472;EPA0385962;PCT申請(qǐng)?zhí)朩O91/16432;美國(guó)專利號(hào)5，380，831;美國(guó)專利號(hào)5,436^91;Perlack等、1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:3324-3328;以及Murray等人，1989，NucleicAcidsRes.17:477-498.此處所用的"優(yōu)選密碼子使用頻率"，是指特定宿主細(xì)胞所表現(xiàn)出來(lái)的指定確定氨基酸的核苷酸密碼子的使用偏好.將基因中密碼子出現(xiàn)的次數(shù)除以基因中指定同一氨基酸的所有密碼子的總出現(xiàn)次數(shù)，可確定該基因中該密碼子的使用頻率。與之類似，通過(guò)平均化優(yōu)選密碼子在大量宿主細(xì)胞表達(dá)基因中的使用頻率，能計(jì)算出宿主細(xì)胞中優(yōu)選密碼子使用頻率。優(yōu)選該分析限于宿主細(xì)胞高度表達(dá)的基因。合成基因中優(yōu)選密碼子使用頻率與宿主細(xì)胞所用頻率的百分比偏差計(jì)算如下首先通it^取所有密碼子的平均偏差，確定單個(gè)密碼子使用頻率與宿主細(xì)胞使用頻率間的百分比偏差。如此處定義，該計(jì)算包括特殊密碼子(即ATG和TGG)。一般而言，通過(guò)等式計(jì)算最佳基因的密碼子使用與宿主細(xì)胞的務(wù)體平均偏差lA-n-lZXn-YnXn乘以100Z，其中Xn-宿主細(xì)胞中密碼子n的使用頻率；Yn4成基因中密碼子n的使用頻率；n代表指定一種氨基酸的密碼子；密碼子總數(shù)為Z,密碼子使用頻率的總體偏差A(yù)，對(duì)所有氨基酸而言優(yōu)選小于約25%，更優(yōu)選小于約10%.因此，可以最優(yōu)化CKSRP核酸使其密碼子使用的分布頻率相對(duì)于那些高度表^物基因的偏差優(yōu)選不大于25%，更優(yōu)選不大于10%。此外，應(yīng)當(dāng)考慮筒并的第三威基的G+C含量百分比(單子葉植物在此位點(diǎn)處似乎更偏好G+C,而雙子葉植物則不)。狄現(xiàn)XCG(其中X為A、T、C或G)核苷酸為雙子葉植物最不優(yōu)選的密碼子，而單子葉和雙子葉植物都不使用XTA密碼子。本發(fā)明的最優(yōu)化CKSRP核酸也優(yōu)選具有與所選宿主植物非常接近的CG和TA雙聯(lián)體避免指數(shù)(doubletavoidanceindices)(例如小立碗蘚、歐洲油菜、大豆(((vciVie挑似)或稻(Oi^fl更優(yōu)選這些指數(shù)與宿主間的偏差不大于約10-15%。除了編碼上述CKSRP的核酸分子外，本發(fā)明的另一方面涉及分離的與其反義的核酸分子.反義多核苷酸能通過(guò)特異性結(jié)合于靶多核苷酸并干擾把多核苷酸的轉(zhuǎn)錄、剪切、轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯和/或穩(wěn)定性，抑制靶多核苷酸的基因表達(dá)?，F(xiàn)有技術(shù)已描述了將反義多核普酸把定于染色體DNA、初級(jí)RNA轉(zhuǎn)錄物或加工后mRNA的方法.優(yōu)選的靶區(qū)域包括剪切位點(diǎn)、翻譯起始密碼子、翻譯終止密碼子以及開放閱讀框內(nèi)的其他序列.本發(fā)明中的術(shù)語(yǔ)"反義"，是指含有與db^或部分基因、初級(jí)轉(zhuǎn)錄物或加工后mRNA的互補(bǔ)性足以千擾內(nèi)源性基因表達(dá)的多核普酸的核酸。"互補(bǔ)"多核苷酸為那些能根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)Watson-Crick互補(bǔ)法則進(jìn)行堿基配對(duì)的多核苷酸，具體而言，嘌呤與嘧咬進(jìn)行堿基配對(duì)以形成鳥噪呤配對(duì)胞嘧啶(G:C)和腺嘌呤配對(duì)DNA中胸腺嘧咬(A:T),或腺噪呤配對(duì)RNA中尿嘧啶(A:U)的組合。應(yīng)當(dāng)理解兩個(gè)多核苷酸即使彼此不完全互補(bǔ)也可相互雜交，只要彼此間有至少一個(gè)區(qū)域基本互補(bǔ)。術(shù)語(yǔ)"反義核酸，，包括單鏈RNA以及能轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生反義RNA的雙鏈DNA表達(dá)盒。"活性，，反義核酸為能與初級(jí)轉(zhuǎn)錄物或編碼多肽的mRNA選擇性雜交的反義RNA分子，所述多肽與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:IO、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18或SEQIDNO:20的多肽具有至少80%的序列同一性。反義核酸可與整個(gè)CKSRP編碼鏈互補(bǔ)，或僅與其部分互補(bǔ)。在一個(gè)實(shí)施方案中，反義核酸分子與編碼CKSRP核苷酸序列編碼鏈的"編碼區(qū)"反義。術(shù)語(yǔ)"編碼區(qū)"指含有能翻譯為氨基酸戎基的密碼子的核苷酸序列區(qū)域。在另一實(shí)施方案中，反義核酸分子與編碼CKSRP核苷酸序列編碼鏈的"非編碼區(qū)，，反義。術(shù)語(yǔ)"非編碼區(qū)"指與編碼區(qū)側(cè)接而不會(huì)被翻譯為絲酸的5，和3，序列(即所謂的5，和3，非翻譯區(qū)).反義核酸分子可與CKSRPmRNA的整個(gè)編碼區(qū)互補(bǔ)，但更優(yōu)選為僅與CKSRPmRNA的編碼或非編碼區(qū)部分反義的寡核苷酸。例如，反義寡核苷酸可互補(bǔ)于CKSRPmRNA翻#^始位點(diǎn)周圍的區(qū)域，反義寡核苷酸的長(zhǎng)度可為如約5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個(gè)核苷酸，一般而言，本發(fā)明的反義分子含有RNA,其與SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17或SEQIDNO:19,或編碼SEQH)NO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18或SEQIDNO:20多肽的多核苷酸的至少14個(gè)連續(xù)核苷酸具有60-100%的序列同一性。優(yōu)選的序列同一性為至少70%，更優(yōu)選至少75%、80%、85%、90%、95%或98%，最優(yōu)選99%,利用本領(lǐng)域已知的操作使用化學(xué)合成和酶連接反應(yīng)可構(gòu)建本發(fā)明的反義核酸。例如，可利用天然存在的核苷酸或經(jīng)多種修飾的核苷酸化學(xué)合成反義核酸(如反義寡核苷酸)，設(shè)計(jì)所述修飾核苷酸以提高分子的生物穩(wěn)定性或提高反義與正義核酸之間形成二聚體的物理穩(wěn)定性，例如可4吏用硫代磷酸酯衍生物和吖咬取代的核苷酸。可用于產(chǎn)生反義核酸的經(jīng)修飾核苷酸的實(shí)例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-硪尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-巰尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氫尿嗜啶、/3-D-半乳糖苷Q核苷OS-D-galactosylqueosine)、肌苷、N6-異戊烯基腺嘌呤，1-甲基鳥噪呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鳥噪呤、2-甲基腺噤呤、2-甲基鳥噪呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺苷、7-甲基鳥噤呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲IL^氨甲基-2^克尿嘧啶、0-D-甘露糖Q核苷(j8-D-maimosylqueosine)、5，-甲氧基羧甲M嘧啶、5-甲Hi^嘧啶、2-甲A^代-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧吱-5-氣乙酸(v)、wybutoxosine、^^嘧咬、Q核苷、2~^1胞嘧啶、5-甲基-2^L^嘧啶、2-硫尿嘧咬、4-M嘧啶、5-甲*^嘧啶、尿嘧咬-5-氣乙酸甲酯、尿嘧玟-5-氧乙酸(v)、5-甲基-24泉嘧啶、3-(3^J^3-N-2省丙基)尿嘧咬、(acp3)w和2，6-二氨基噪呤，或者可利用表達(dá)栽體生物產(chǎn)生反義核酸，所^達(dá)栽體中以反義方向亞克隆入核酸(即由插入核酸轉(zhuǎn)錄的RNA與目標(biāo)把核酸間為反義方向，見下文進(jìn)一步詳述)。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的反義核酸分子為O"異頭核酸分子.c^異頭核酸分子與互補(bǔ)RNA形成特定的雙鏈雜交物，其中與通常^-單位不同的是鏈彼此平行(Gaultier等人，1987，NucleicAdds.Re&15:6625-6641),反義核酸分子也可含有2，-鄰甲l^糖核苷酸(Inoue等人1987，NucleicAcidsRes.15:6131-6148)或嵌合RNA-DNA類似物(Inoue等人，1987，F(xiàn)EBSLett.215:327-330)。一般向細(xì)胞逸用或原位產(chǎn)生本發(fā)明的反義核酸分子，以使其能雜交或結(jié)合于編碼CKSRP的細(xì)胞mRNA和/或基因組DNA，從而通過(guò)如抑制轉(zhuǎn)錄和/或翻譯抑制多肽的表達(dá)。雜交可為通過(guò)常規(guī)核苷酸互補(bǔ)形成穩(wěn)定的二聚體，或如當(dāng)反義核酸分子結(jié)合于DNA二聚體時(shí)通過(guò)雙螺旋大溝內(nèi)的特異性相互作用而形成。可以通過(guò)如將反義核酸分子連接于結(jié)合細(xì)M面受體或抗原的肽或抗體來(lái)修飾反義分子，從而使其可特異性結(jié)合于所選擇細(xì)胞表面表達(dá)的受體或抗原。也可利用此處所述的載體將反義核酸分子輸送至細(xì)胞。為達(dá)到細(xì)胞內(nèi)反義分子的足夠濃度，優(yōu)選反義核酸分子處于強(qiáng)原核、病毒或真核(包括植物)啟動(dòng)子控制下的栽體構(gòu)建體。除了反義多核苷酸外，核酶、正義多核苷酸或雙鏈RNA(dsRNA)可用于減少CKSRP多肽的表達(dá)。此處所用的術(shù)語(yǔ)"核酶，，是指基于RNA的催化酶，其具有核酶活性能裂解含有與其互補(bǔ)區(qū)的單鏈核酸如mRNA.核酶(例如Haselhoff和Gerlach，1988，Nature334:585-591描述的錘頭核酶)可用于催化性裂解CKSRPmRNA轉(zhuǎn)錄物,從而抑制CKSRPmRNA的翻譯?？苫诖颂幩龅腃KSRPcDNA的核,列(即SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17或SEQIDNO:19),或基于構(gòu)建本發(fā)明教導(dǎo)方法分離的異源性序列，設(shè)計(jì)對(duì)該CKSRP編碼的核酸具有特異性的核酶.例如，可構(gòu)建四膜蟲(refrfl^y附幼a)L-19IVSRNA的衍生物，其中活性位點(diǎn)的核苷酸序列與CKSRP編碼mRNA中將裂解的核苷酸序列互補(bǔ)。見如Cech等人的美國(guó)專利號(hào)4,987,071和5,116,742?；蛘?，可利用CKSRPmRNA從RNA分子集合中選擇具有特異性核酶活性的催化性RNA。見如Bartel，D.和Szostal^J.W.，1993，Science261:1411-1418,在優(yōu)選實(shí)施方案中，核酶含有具有至少7、8、9、10、12、14、16、18或20個(gè)核苷酸、更優(yōu)選為7或8個(gè)核苷酸的部分，其與靶RNA的部分間互補(bǔ)性為100%.制備核酶的方法為^域技^A員所公知.見如美國(guó)專利號(hào)6,025,167;5,773,260和5，496，698。此處所用的術(shù)語(yǔ)"dsRNA"是指包含兩條RNA鏈的RNA雜化物.dsRNA可為線性或環(huán)狀結(jié)構(gòu).在優(yōu)選實(shí)施方案中，dsRNA特異于多核苷酸，所述多核苷酸編碼SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:IO、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18或SEQIDNO:20中的多肽，或與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18或SEQIDNO:20多肽之一在中央蛋白激酶結(jié)構(gòu)域具有至少80%序列同一性的多肽。雜交RNA可基本上或完全互補(bǔ)。"基本互補(bǔ)"是指當(dāng)如上述用BLAST程序最佳比對(duì)兩個(gè)雜交RNA時(shí)，雜交部分至少95%互補(bǔ)。優(yōu)選的dsRNA長(zhǎng)度至少為100M對(duì)。一般而言，雜交RNA的長(zhǎng)度相同而不具有突出的5，或3，末端且沒有空位.然而，^^發(fā)明方法可使用5，或3，突出端多達(dá)100個(gè)核苷酸的dsRNA。dsRNA可^^有核糖核苷酸、核糖核苷酸類似物如2，-0-甲基核糖基殘基或其組合。見如美國(guó)專利號(hào)4，130，641和4，024，222。dsRNA多核糖肌苷酸多核糖胞嘧咬核苷酸描述于美國(guó)專利號(hào)4,283,393。生產(chǎn)和使用dsDNA的方法為^5域公知。一種方法包括在體內(nèi)或在體外單個(gè)反應(yīng)混合物中同時(shí)轉(zhuǎn)錄兩條互補(bǔ)DNA鏈。見如美國(guó)專利號(hào)5,795,715。在一個(gè)實(shí)施方案中，可直接通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)化方法向植物或植物細(xì)胞中導(dǎo)入dsRNA?；蛘咄ㄟ^(guò)轉(zhuǎn)錄兩條互補(bǔ)RNA在植物細(xì)胞中表達(dá)dsRNA.抑制內(nèi)源基因表達(dá)的其他方法如三螺旋形成(Moser等人，1987，Science238:645-650，和Cooney等人1988，Science241:456459)和共抑制(NapoU等人19卯，ThePlantCell2:279-289)為本領(lǐng)域所公知。部分和全長(zhǎng)cDNA已被用于內(nèi)源性植物基因的共抑制.見如美國(guó)專利號(hào)4,801,340、5,034,323、5，231，020和5，283，184;VanderKroll等人1外0，ThePlantCell2:291-299;Smith等人1990，Mol.Gen.Genetics224:477481;和Napoli等人19卯，ThePlantCell2:279-289.對(duì)于正義抑制而言，引入正義多核苷酸會(huì)阻斷相應(yīng)耗基因的轉(zhuǎn)錄.正義多核苷酸與^i物基因或RNA間具有至少65°/。的序列同一性。優(yōu)選同一性百分比為至少80%、90%、95%或更多，引入的正義多核苷酸相對(duì)于把基因或轉(zhuǎn)錄物并不必為全長(zhǎng)，優(yōu)選的正義多核苷酸與SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17或SEQIDNO:19中至少IOO個(gè)連續(xù)氨基酸具有至少65%的序列同一性。同一性區(qū)域可包含內(nèi)含子和/或外顯子以及非翻譯區(qū)。引入的正義多核苷酸可瞬時(shí)存在于植物細(xì)胞中，或穩(wěn)定^入植物染色體或染色體外復(fù)制子?；蛘咄ㄟ^(guò)乾定與CKSRP核苷酸序列的調(diào)節(jié)區(qū)(如CKSRP啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子)互補(bǔ)的核苷酸序列形成可阻斷靶細(xì)胞中CKSRP基因轉(zhuǎn)錄的三螺旋結(jié)構(gòu)，來(lái)抑制CKSRP基因的表達(dá)。主要見Helene，C.，1991，AnticancerDrugDes.6(6):569-84;Helene，C.等人，1992,Ann.N.Y.Acad.ScL660:27-36;以及Maher，L丄，1992，Bioassays14(12):807-15。除上述CKSRP核酸和多肽外，本發(fā)明還涉及這些連接于部分的核酸和多肽.這些部分包括但不僅限于，檢測(cè)部分、雜交部分、純化部分、運(yùn)輸部分、反應(yīng)部分、結(jié)^P分等。與部分相連的一類典型核酸為探針和引物。探針和引物一般包括^分離的寡核苷酸。該寡核苷酸一般包含可在嚴(yán)*件下與至少約12、優(yōu)選約25、更優(yōu)選約40、50或75個(gè)連續(xù)核苷酸雜交的核苷酸序列區(qū)；所述連續(xù)核苷酸來(lái)自SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17或SEQH)NO:19所列序列之一的正義鏈；或SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQD)NO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17或SEQIDNO:19所列序列之一的反義序列；或其天然突變體。基于SEQH)NO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQH)NO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17或SEQIDNO:19核苷酸序列的引物可用于PCR反應(yīng)克隆CKSRP同源物，基于CKSRP核苷酸序列的探針可用于檢測(cè)編碼相同或基本相同多肽的轉(zhuǎn)錄物或基因組序列。在優(yōu)選實(shí)施方案中，探針還包含連接于其上的標(biāo)記基團(tuán)，例如標(biāo)記基團(tuán)可為放射性同位素、熒光化合物、酶或酶輔因子。此類探針可用作基因組標(biāo)記測(cè)試試劑盒的部分，通過(guò)如測(cè)量細(xì)胞樣品中CKSRP編碼核酸的水平，如檢測(cè)CKSRPmRNA水平或確定基因組CKSRP基因是否已突變或缺失，來(lái)鑒定表達(dá)CKSRP的細(xì)胞.具體而言，確定基因轉(zhuǎn)錄物水平(可用于翻譯為基因產(chǎn)物的mRNA量的指標(biāo))的有用方法，是實(shí)施Northern印跡(參考見如Ausubel等人，1988，CurrentProtocolsinMolecularBiology,Wiley:NewYork)。來(lái)自Northern印跡的信息至少部分說(shuō)明了轉(zhuǎn)化基因的轉(zhuǎn)錄水平?？赏ㄟ^(guò)均為本領(lǐng)域4^P的若干方法從細(xì)胞、組織或器官制備總細(xì)胞RNA，如Bormaim,E.R.等人，1992，Mol.Microbiol.6:317-326所述。為評(píng)估是否存在翻譯自該mRNA的多肽或其相對(duì)量，可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如Western印跡。這些技術(shù)為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員^p(見如Ausubel等人，1988，CurrentProtocolsinMolecularBiology,Wiley:NewYork).本發(fā)明還提供了分離的含有上述CKSRP核酸的重組表達(dá)載體，其中該栽體在宿主細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)導(dǎo)致其對(duì)環(huán)境脅迫的耐受性相對(duì)于該宿主細(xì)胞的野生型增強(qiáng).此處所用的術(shù)語(yǔ)"載體"，指能夠轉(zhuǎn)運(yùn)另一與之相連的核酸的核酸分子。一類栽體為"質(zhì)粒"，是指可以連入額外DNA片段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一種載體為病毒栽體，其中額外的DNA片段可連接于病毒基因組.某些栽體能在其導(dǎo)入的宿主細(xì)胞中自發(fā)復(fù)制(如具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體以及游離型哺乳動(dòng)物栽體).其他栽體(如非游離型哺乳動(dòng)物載體)在導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)整合入宿主細(xì)胞基因組，因而隨宿主基因組復(fù)制，此夕卜，某些栽體能指導(dǎo)與其有效連接的基因的表達(dá).此處稱這種載體為"表達(dá)栽體"。一般而言，可用于重組DNA技術(shù)的表達(dá)栽體通常為質(zhì)粒形式。在本說(shuō)明中，"質(zhì)粒，，和"栽體"可互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是最常用的栽體形式.然而，本發(fā)明旨在包括能發(fā)揮相同作用的此類其他形式的表達(dá)栽體，如病毒栽體(如復(fù)制缺陷的逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺病毒相關(guān)病毒)。本發(fā)明的重組表達(dá)栽體中含有以適于在宿主細(xì)胞中表達(dá)的形式存在的本發(fā)明的核酸，即該重組表達(dá)載體包含一個(gè)或多個(gè)基于用于表達(dá)的宿主細(xì)胞選擇的、與待表達(dá)核酸序列有效連接的調(diào)控序列。此處所用的關(guān)于重組表達(dá)栽體的"有效連接"，是指目標(biāo)核苷,列連接于調(diào)控序列的方式使該核苷酸序列得以表達(dá)(例如在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯體系，或在導(dǎo)入載體的宿主細(xì)胞內(nèi))。術(shù)語(yǔ)"調(diào)控序列，，包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子以及其他表達(dá)調(diào)控元件(例如多聚腺苷酸化信號(hào))。此類調(diào)控序列描述于如Goeddel，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego，CA(1990)，以及Gruber和Crosby述于MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology,Glick和Thompson編輯,第7章，89-108，CRCPress:BocaRaton，F(xiàn)lorida,包括其中的參考文獻(xiàn)。調(diào)控序列包括那些指導(dǎo)核苷酸序列在多種宿主細(xì)胞內(nèi)組成型表達(dá)的序列，以及那些僅在某些宿主細(xì)胞或某些M下指導(dǎo)核苷,列表達(dá)的序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道表達(dá)載體的設(shè)計(jì)取決于如待轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的選擇、所需的多Jl^達(dá)水平等?？蓪⒈景l(fā)明表達(dá)栽體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，從而產(chǎn)生由此處所述核酸編碼的多肽或肽，包括融合多肽或肽(如CKSRP、CKSRP的突變型、融合多肽等)?？稍O(shè)計(jì)本發(fā)明的重組表達(dá)栽體用于在原核或真核細(xì)胞中表達(dá)CKSRP,例如，CKSRP基因可表達(dá)于細(xì)菌細(xì)胞如谷氨酸棒桿菌(Cg/Mto加i'c"附)、昆蟲細(xì)胞(利用桿狀病毒表達(dá)栽體)、酵母以及其他真菌細(xì)胞(見Romanos，M.A.等人，1992，F(xiàn)oreigngeneexpressioninyeast:areview,Yeast8:423-488;vandenHondel，C.A.M丄J.等人，1991，Heterologousgeneexpressioninfilamentousfungi(MoreGeneManipulationsinFungi,J.W.Bennet和L丄.Lasure編輯,396-428頁(yè)AcademicPress:SanDiego中)；以及vandenHondel，C.A.M.J.J.&Punt，P.J.，1991,Genetransfersystemsandvectordevelopmentforfilamentousfungi(AppliedMolecularGeneticsofFungi,Peberdy，J.F.等人編輯，1-28頁(yè)，CambridgeUniversityPress:Cambridge中))、藻類(Falciatore等人，1999，MarineBiotechnology1(3):239-251)、以下類型的纖毛蟲全毛亞綱(HoIotrichia)、緣毛亞綱(Peritrichia)、旋唇亞綱(Spirotrichia)、吸管亞綱(Suctoria)、四膜蟲(Tetrahymena)、草履蟲(Paramecium)、豆形蟲(Colpidium)、瞬膜蟲(Glaucoma)、匙口蟲(Platyophrya)、Potomacus、假康纖蟲(Pseudocohnilembus)、'游"f卜蟲(Euplotes)、Engelmaniella以及棘尾蟲(Stylonychia)，特別是如PCT申請(qǐng)?zhí)朩O98/01572所述的轉(zhuǎn)化方法形成的帶載體的浮萍棘尾蟲CS，0^w^cMife附"fle)屬，以及多細(xì)胞植物細(xì)胞(見Schmid仁R.和Willmitzer，L，1988，Highefficiency々^fl"m'i/挑fume/adews-mediatedtransformationofJra6/i/0/is&^ta/i'awaleafandcotyledonexplants，PlantCellRep.583-586;PlantMolecularBiologyandBiotechnology,CPress,BocaRaton，F(xiàn)lorida,第6〃章，S.71-119(1993);F.RWhite,B.Jenes等人,TechniquesforGeneTransfer(TransgenicPlants,第1巻，EngineeringandUtilization,Kung和R.Wu編輯,128-43,AcademicPress:1993;Potrykus，1991，Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMolec.Biol.42:205-225及其中引用的參考文獻(xiàn))，或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。合適的宿主細(xì)胞進(jìn)一步i寸論于Goeddel的GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress:SanDiego，CA(19卯)中?；蛘呖稍隗w外轉(zhuǎn)錄和翻譯重組表達(dá)栽體，例如使用T7啟動(dòng)子調(diào)控序列及T7聚合酶。最常利用含有能指導(dǎo)融合或非融合多^達(dá)的組成型或誘導(dǎo)性啟動(dòng)子的栽體，實(shí)現(xiàn)多肽在原核生物中的表達(dá)。融合栽體向其中編碼的多肽添加了若干氨基酸，通常加在重組多肽的4^末端，但也可加在其C-末端或融合于多肽的合適區(qū)域。此類融合栽體一般具有三個(gè)功能l)提高重組多肽的表達(dá)；2)提高重組多肽的溶解性；以及3)作為親和純化的配體協(xié)助重組多肽的純化。通常在融合表達(dá)栽體中，向融^P分和重組多肽的連接處引入蛋白水解裂解位點(diǎn)，以在純化融合多肽后將重組多肽與融^p分分離，此類酶及其關(guān)聯(lián)識(shí)別序列包括Xa因子、凝血酶和腸激酶.""^融合表達(dá)載體包括分別將谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移斷GST)、麥芽糖E結(jié)合多肽或多肽A融合于靶重組多肽的pGEX(PharmaciaBiotechInc;Smith,D.B.和Johnson,K.S.，1988，Gene67:31>40)、pMAL(NewEnglandBiolabs，Beverly,MA)和pRIT5(Pharmacia,Piscataway，NJ).在一個(gè)實(shí)施方案中，將CKSRP的編碼序列克隆入pGEX表達(dá)栽體以產(chǎn)生編碼融合多肽的載體，從N-末端至C-末端包含GST-凝血酶裂解位點(diǎn)-X多肽。可以利用谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂，通過(guò)親和層析法純化融合多肽?？梢酝ㄟ^(guò)凝血酶裂解融合多肽回收與GST去融合的重組CKSRP。合適的誘導(dǎo)型非融合大腸桿菌(Eco/i)表達(dá)栽體的實(shí)例包括，pTrc(Amann等人，1988，Gene69:301陽(yáng)315)和pETlid(Studier等人，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego，California(19卯)60-89)。pTrc栽體上把基因的表達(dá)取決于由雜交trp-lac融合啟動(dòng)子起始的宿主RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄。pETlld栽體上乾基因的表達(dá)取決于由T7gnl0-lac融合啟動(dòng)子起始的共表達(dá)病毒RNA聚合酶(T7gnl)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。該病毒聚合酶由宿主株BL21(DE3)或HMS174(DE3)提供，來(lái)自含有l(wèi)acUV5啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)控下的T7gnl基因的常駐7原噬菌體。最大化重組多Jl^達(dá)的策fl^t—是在蛋白水解裂解重組多肽能力受損的宿主細(xì)菌中表達(dá)多肽(Gottesman，S.，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego,California(1990)119-128)。另一策略在于改變插入表達(dá)栽體的核酸序列從而使每一氨基酸使用的單個(gè)密碼子均為選用于表達(dá)的細(xì)菌如谷氨酸棒桿菌中優(yōu)選使用者(Wada等人1992，NucleicAcidsRes.20:2111-2118)。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)DNA合成技術(shù)，能夠如此改變本發(fā)明的核酸序列.在另一實(shí)施方案中，CKSRP表達(dá)栽體為酵母表達(dá)栽體.在釀酒酵母中表達(dá)的栽體實(shí)例包括pY印Secl(Baldari等人，1987，EMBOJ.6:229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz，l訴2，Cell30:933-943)、pJRY88(Schultz等Aj1987，Gene54:113-123)以及pYES2(InvitrogenCorporation,SanDiego，CA),適用于其他真菌(如絲狀真菌)的用于構(gòu)建栽體的栽體及方法，包^f述于vandenHondel，C.A.M.J丄&Punt，P丄，1991，"Genetransfersystemsandvectordevelopmentforfilamentousfungi",在AppliedMolecularGeneticsofFungi,J.F.Peberdy等人編輯，1-28頁(yè)，CambridgeUniversityPress:Cambridge中的那些，或者，可利用桿狀病毒表達(dá)栽體在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的CKSRP,可用于在培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞(如Sf9細(xì)胞)中表達(dá)多肽的桿狀病毒栽體包括pAc系列(Smith等人，1983，Mol.CellBiol.3:2156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers,1989，Virology170:31-39)。在另一實(shí)施方案中，利用哺乳動(dòng)物表達(dá)栽體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的CKSRP核酸。哺乳動(dòng)物表達(dá)栽體的實(shí)例包括pCDM8(Seed,B.，1987，Nature329:840)和pMT2PC(Kaufman等人，1987，EMBOJ.6:187-195)。當(dāng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，通常由病毒調(diào)控元件調(diào)控表達(dá)栽體。例如，常用的啟動(dòng)子來(lái)自多瘤病毒、腺病毒2、巨細(xì)胞病毒和猿猴病毒40。其他對(duì)原核和真核細(xì)胞均適用的表達(dá)系統(tǒng)，可見Sambrook，J.，F(xiàn)ritsh，E.F.和Maniatis，T.MolecularCloning:ALaboratoryManual.最新版，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，1989的第16和17章。在另一實(shí)施方案中，重組哺乳動(dòng)物表達(dá)栽體能指導(dǎo)核酸優(yōu)選在某一特定細(xì)胞類型中的表達(dá)(例如使用組織特異性調(diào)控元件表達(dá)核酸)。組織特異性調(diào)控元件為本領(lǐng)域公知.合適組織特異性啟動(dòng)子的非限制性實(shí)例包括，白蛋白啟動(dòng)子(肝特異；Pinkert等人，1987，GenesDev.1:268-277)、淋巴特異性啟動(dòng)子(Calame和Eaton,1988，Adv.ImmimoL43:235-275)，特別是T細(xì)胞受體啟動(dòng)子(Winoto和Ba附more，1989，EMBOJ.8:729-733)和免疫球蛋白啟動(dòng)子(Banerji等人1983，Cell33:729-740;Queen和Baltimore,1983，Cell33:741-748)、神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子(如神經(jīng)絲啟動(dòng)子；Byrne和Ruddle,1989，PNAS86:5473-5477)、艦特異性啟動(dòng)子(Edlund等人1985，Science230:912-916),以及乳腺特異性啟動(dòng)子(如乳清啟動(dòng)子；美國(guó)專利號(hào)4,873,316和歐洲申請(qǐng)出版號(hào)264,166)。也包括發(fā)育調(diào)節(jié)啟動(dòng)子，如鼠hox啟動(dòng)子(Kessel和Gmss，1990，Science249:374-379)和胎多肽啟動(dòng)子(Campes和Tilghman,1989，GenesDev.3:537-546)。為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，已知根據(jù)所用的表達(dá)栽體和轉(zhuǎn)染技術(shù)，僅有小部分細(xì)胞可將外源DNA整合入其基因組.為了鑒定和選擇這些^體，一般將編碼可選擇標(biāo)記(如對(duì)抗生素或除草劑的抗性)的基因與目標(biāo)基因一起引入宿主細(xì)胞。優(yōu)選的可選擇標(biāo)記包括那些帶有對(duì)藥物如G418、潮霉素和甲氛蝶吟抗性的標(biāo)記，或植物中那些帶有對(duì)除草劑如草甘膦、草銨膦或咪唑啉酮抗性的標(biāo)記.可以編碼CKSRP的同一栽體將編碼可選擇標(biāo)記的核酸分子引入宿主細(xì)胞，或可使用分開的栽體引入?？赏ㄟ^(guò)如除草劑選擇鑒定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染導(dǎo)入核酸分子的細(xì)胞(例如參入選擇標(biāo)記基因的細(xì)胞能夠存活，而其他細(xì)胞死亡)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，CKSRP表達(dá)于植物和植物細(xì)胞中如單細(xì)胞植物細(xì)胞(如藻類)(見Falciatore等人,1999，MarineBiotechnology1(3):239-251及其參考文獻(xiàn))，以及高等植物細(xì)胞(如種子植物如農(nóng)作物)?？赏ㄟ^(guò)任意方法將CKSRP"導(dǎo)入"植物細(xì)胞中，包括轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)、電穿孔、粒子轟擊、農(nóng)桿菌感染法等.本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的轉(zhuǎn)化方法之一是將開花植物浸入農(nóng)桿菌04gf^fl""iVO溶液中，所述農(nóng)桿菌中含有CKSRP核酸，然后育種轉(zhuǎn)化配子.轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞(包括植物細(xì)胞)的其他合適方法可見于Sambrook等人(MolecularCloning:ALaboratoryManual.最新^ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor，NY,1989)及其他實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)如MethodsinMolecularBiology,1995，44巻，々iv6acter/ii加protocols,Gartland和Davey編輯,HumanaPress,Totowa，NewJersey.由于生物和非生物脅迫耐受性為多種植物期望真?zhèn)涞男再|(zhì)，如玉米、小麥、黑麥、燕麥、黑小麥、稻、大麥、大豆、花生、棉花、油菜籽和油菜、木薯、胡椒、向日葵和萬(wàn)壽菊、茄科植物如馬鈴薯、煙草、茄子和番茄、野豌豆某種、豌豆、苜蓿、灌生植物(咖啡、可可、茶)、柳某種、樹(油棕櫚、椰子樹)、多年生草和牧草作物，這些作物植物也為本發(fā)明另一實(shí)施方案中優(yōu)選的基因工程^t物。牧草作物包括但不僅限于小麥草(Wheatgrass)、鹋草(Canarygrass)、雀麥(Bromegrass)、披堿草(WildryeGrass)、藍(lán)草(Bluegrass)，鴨茅草(Orchardgrass)、苜蓿、Salfoin、百l^l(BirdsfootTrefoil)、雜三葉(AlsikeClover)、紅三葉(RedClover)和甜三葉草(SweetClover),在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，通#桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移將CKSRP轉(zhuǎn)染入植物?？衫萌鏕V3101(pMP卯)(Koncz和Schdl，1986，Mol.Gen-Genet.204:383-396)或LBA4404(Clontech)根瘤農(nóng)桿菌(^gra6"cte"n挑加附e/fld柳s)菌抹實(shí)施農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物轉(zhuǎn)化?？赏ㄟ^(guò)標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)化和再生技術(shù)實(shí)施轉(zhuǎn)化(Deblaere等人，1994，Nucl.Acids.Res.13:4777-4788;Gelvin,StantonB.和Schilperoort，RobertA，PlantMolecularBiologyManual,第2版-Dordrecht:KluwerAcademicPubl.，1995.-inSect.,RingbucZentraleSignatur:BT11-PISBN0-7923-2731-4;GHck，BernardR.;Thompson,JohnE.，MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology,BocaRaton:CRCPress,1993360S.，ISBN0-8493-5164-2)。例如通過(guò)子葉或下胚軸轉(zhuǎn)化來(lái)轉(zhuǎn)化油菜籽(Moloney等人，1989，PlantCellReport8:238畫242;DeBlock等人，1989，PlantPhysiol.91:694-701)。農(nóng)桿菌和植物選擇中的抗生素應(yīng)用取決于用于轉(zhuǎn)化的二元栽體和農(nóng)桿菌菌株.通常利用卡那霉素為可選擇植物標(biāo)記來(lái)進(jìn)行油菜#^擇。利用如Mlynarova等人，1994，PlantCellReport13:282-285所述的技術(shù)可實(shí)施;Mf菌介導(dǎo)向亞麻的基因轉(zhuǎn)移，此外，可利用如歐洲專利號(hào)0424047、美國(guó)專利號(hào)5，322，783、歐洲專利號(hào)0397687、美國(guó)專利號(hào)5，376，543,或美國(guó)專利號(hào)5，169，770所述的技術(shù)轉(zhuǎn)化大豆.通過(guò)顆粒轟擊、聚乙二醇介導(dǎo)DNA攝取、或通過(guò)碳化硅纖維技術(shù)可轉(zhuǎn)化玉米(見如Freeling和Walbot"Themaizehandbook"SpringerVerlag:NewYork(1993)ISBN3-540-97826-7).玉米轉(zhuǎn)化的具體實(shí)例見于美國(guó)專利號(hào)5，990387，而小麥轉(zhuǎn)化的具體實(shí)例見于PCT申請(qǐng)?zhí)朩O93/07256.根據(jù)本發(fā)明，如導(dǎo)入的CKSRP參入非染色體的自發(fā)性復(fù)制子或整合入植物染色體中，則可穩(wěn)定保留在植物細(xì)胞中.或者導(dǎo)入的CKSRP存在于染色體外非復(fù)制性栽體上，可能為瞬時(shí)表達(dá)或具有瞬時(shí)活性.在一個(gè)實(shí)施方案中，可產(chǎn)生CKSRPM入染色體的同源重組微生物，制^^有至少一部分導(dǎo)入缺失、添加或置換的CKSRP基因的栽體，從而改變(如功能性破壞)CKSRP基因。優(yōu)選的CKSRP基因?yàn)樾×⑼胩\、歐洲油菜、大豆或稻CKSRP基因，但也可為來(lái)自相關(guān)植物或甚至是來(lái)源于哺乳動(dòng)物、酵母或昆蟲的同源物。在一個(gè)實(shí)施方案中，i更計(jì)栽體使在同源重組時(shí)內(nèi)源性CKSRP基因受到功能性破壞(即不再編碼功能性多肽；也稱為敲除栽體)?；蛘呖稍O(shè)計(jì)載體以使同源重組后內(nèi)源性CKSRP基因被突變或受到其他改變，但仍然能編碼功能性多肽(例如改變上游調(diào)控區(qū)域從而改變內(nèi)源性CKSRP的表達(dá))。為通過(guò)同源重組產(chǎn)生點(diǎn)突變，可將DNA-RNA雜化物用于所謂嵌合修復(fù)術(shù)的技術(shù)(Cole-Strauss等人，1999，NucleicAcidsResearch27(5):1323-1330，以及Kmiec，1999，GeneTherapyAmericanScientist87(3):240-247)。小立碗蘚的同源重組方法也為本領(lǐng)域公知并考慮用于此處。而在同源重組栽體中，CKSRP基因的改變部分在其5，和3，末端側(cè)接CKSRP基因的另一核酸分子，從而使栽體攜帶的外源性CKSRP基因與內(nèi)源性CKSRP基因間能在微生物或植物中發(fā)生同源重組。額外的側(cè)翼CKSRP核酸分子具有足夠長(zhǎng)度以與內(nèi)源性基因進(jìn)行成功的同源重組.一般而言，載體中含有數(shù)百對(duì)^對(duì)甚至數(shù)千>^對(duì)的側(cè)翼DNA(5，和3，末端均有)(見如Thomas,K.R.和Capecchi，M.R.，1987，Cell51:503中同源重組栽體的描述或Str鄰p等/s1998，PNAS，95(8):4368-4373中基于cDNA的小立碗蘚重組)。將栽體導(dǎo)入微生物或植物細(xì)胞中(例如通過(guò)聚乙二醇介導(dǎo)DNA)，通過(guò)本領(lǐng)域已知的技術(shù)選擇其中導(dǎo)入的CKSRP基因與內(nèi)源性CKSRP基因發(fā)生同源重組的細(xì)胞.在另一實(shí)施方案中，產(chǎn)生含有能調(diào)節(jié)導(dǎo)入基因表達(dá)的選擇系統(tǒng)的重組微生物.例如，將CKSRP基因引入栽體并置于lac操縱子的調(diào)控之下，能使該CKSRP基因僅在IPTG存在時(shí)進(jìn)行表達(dá)。此類調(diào)控體系為本領(lǐng)域不管是位于染色體外的非復(fù)制栽體中,還是位于染色體務(wù)^的栽體中，CKSRP多核苷酸都優(yōu)選位于植物表達(dá)盒內(nèi).植物表達(dá)盒優(yōu)選含有的能驅(qū)動(dòng)基因在植物細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)控序列，該序列為有效連接因而每一序列均可實(shí)現(xiàn)其自身功能，例如通過(guò)多B苷酸化信號(hào)終止轉(zhuǎn)錄.有效的多**苷酸化信號(hào)為那些來(lái)自根瘤農(nóng)桿菌t-DNA的信號(hào)，如基因3，Ti-質(zhì)粒pTiACH5的章魚堿合酶(Gielen等人，1984，EMBOJ.3:835)或其功能性等效物，但所有其他在植物中具有功能活性的終止子也適用.由于植物基因表達(dá)經(jīng)常不僅限于轉(zhuǎn)錄水平，植物表達(dá)盒中優(yōu)選含有其他有效連接的序列如翻譯增強(qiáng)子，如含有煙草花葉病毒中5，非翻譯先導(dǎo)序列的能增強(qiáng)每RNA的多肽產(chǎn)率的過(guò)驅(qū)動(dòng)序列(GalHe等人，1987，Nucl.AddsResearch15:8693-8711)。植物表達(dá)載體的實(shí)例詳述于Becker,D.，Kemper,E.，Schell，J.和Masterson，R.，1992，Newplantbinaryvectorswithselectablemarkerslocatedproximaltotheleftborder,PlantMol.Biol.20:1195-1197;以及Bevan，M.W.，1984，Binary/4g"o6flcteW"挑vectorsforplanttransformation,Nucl.Acid.Res.12:8711-8721;VectorsforGeneTransferinHigherPlants:于TransgenicPlants,第1巻，EngineeringandUtilization,Kung和R.Wu編輯，AcademicPress,1993，S.15-38中植物基因表達(dá)應(yīng)當(dāng)有效連接于合適的啟動(dòng)子，從而M因表達(dá)具有時(shí)序性、細(xì)胞特異性或組織特異性。可用于本發(fā)明表達(dá)盒的啟動(dòng)子包括能夠起始植物細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的任意啟動(dòng)子。此類啟動(dòng)子包括但不僅限于，可獲自植物、植物病毒以及含有能在植物中表達(dá)的基因的細(xì)菌(如農(nóng)桿菌和根瘤菌(及始06/M附))的啟動(dòng)子《啟動(dòng)子可為組成型、誘導(dǎo)型、發(fā)育階段優(yōu)選、細(xì)胞類型優(yōu)選、組織優(yōu)選或器官優(yōu)選。組成型啟動(dòng)子在大部分情況下均有活性。組成型啟動(dòng)子的實(shí)例包括CaMV19S和35S啟動(dòng)子(Odell等人，1985，Nature313:810-812)、sXCaMV35S啟動(dòng)子(Kay等人，1987，Science236:1299-1302),以及S印1啟動(dòng)子、稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(McElroy等、l外0，PlantCell2:163-171)、擬南芥肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、泛酰啟動(dòng)子(Christensen等Aj1989，PlantMolec.Biol.18:675-689)、pEmu(Last等人，1991，Theor.Appl.Genet.81:581-588)、玄參花葉病毒35S啟動(dòng)子、Smas啟動(dòng)子(Velten等人1984，EMBOJ3:2723-2730)、GRP1-8啟動(dòng)子、肉桂醇脫氫酶啟動(dòng)子(美國(guó)專利號(hào)5,683,439)、農(nóng)桿菌T-DNA啟動(dòng)子(如甘露堿合酶、胭脂磁^合酶和章魚堿合酶)、二磷酸核酮糖羧化酶小亞基(ssuRUBISCO)啟動(dòng)子等。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子優(yōu)選在某些環(huán)境條件下具有活性，如有或無(wú)某一營(yíng)養(yǎng)素或代謝物、熱或冷、光、病原體攻擊、乏氧條件等。例如油菜的hsp80啟動(dòng)子由熱休克誘導(dǎo)；PPDK啟動(dòng)子由光誘導(dǎo)；煙草、擬南芥和玉米的PR-1啟動(dòng)子由病原體感染誘導(dǎo)；而Adhl啟動(dòng)子由低氧和冷脅迫誘導(dǎo)。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可有助于植物基因表達(dá)(綜述見Gatz，1997，Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.48:89-108)。化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子尤其適用于需要以時(shí)間特異性方式進(jìn)行基因表達(dá)時(shí)。此類啟動(dòng)子的實(shí)例為#酸誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(PCT申請(qǐng)?zhí)朩O95/19443)、四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Gatz等人，1992，PlantJ.2:397-404)以及乙醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(PCT申請(qǐng)?zhí)朩O93/21334)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子為脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。在本發(fā)明中脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子優(yōu)選在下述一種或多種脅迫下具有活性涉及鹽、旱、溫度、金屬、化學(xué)物、病原體和氧化脅迫的次佳條件。脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括但不僅限于，Cor78(Chak等人2000，PIanta210:875-883;Hovath等人，1993，PlantPhysiol.103:1047-1053)、Corl5a(Artus等人，1996，PNAS93(23):13404-09)、Rci2A(Medina等人，2001，PlantPhysiol.125:1655-66;Nylander等人，2001,PlantMol.Biol.45:341-52;Navarre和Goffeau，2000，EMBOJ.19:2515-24;Capel等人，1997，PlantPhysiol,115:569-76)、Rd22(Xiong等人，2001，PlantCell13:2063~83;Abe等人，1997，PlantCell9:1859-68;Iwasaki等人，1995，Mol.Gen.Genet.247:391-8)、cDet6(Lang和Palve，1992，PlantMol.Biol.20:951-62)、ADH1(Hoeren等人，1998，Genetics149:479-90)、KATl(Nakamura等人，1995，PlantPhysiol.109:371-4)、KST1(MtiUer-R6ber等人，1995，EMBO14:2409-16)、Rhal(Terryn等人1993，PlantCell5:1761-9;Terryn等人1992，F(xiàn)EBSLett.299(3):287-90)、ARSK1(Atkinson等人1997，GenBank登錄號(hào)L22302,以及PCT申請(qǐng)?zhí)朩O97/20057)、PtxA(Plesch等人GenBank登錄號(hào)X67427)、SbHRGP3(Ahn等人,1996，PlantCell8:1477-卯)、GH3(Liu等人，1994，PlantCell6:645-57)、病原體誘導(dǎo)型PRPl-基因啟動(dòng)子(Ward等人，1993，Plant.Mol.Biol.22:361-366)、番茄熱誘導(dǎo)型hsp80-啟動(dòng)子(美國(guó)專利號(hào)5187267)、馬鈴薯冷誘導(dǎo)型Of淀粉酶啟動(dòng)子(PCT申請(qǐng)?zhí)朩O96/12814),或創(chuàng)傷i秀導(dǎo)型pinll啟動(dòng)子(歐洲專利號(hào)375091)。其他旱、冷和鹽誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的實(shí)例，如RD29A啟動(dòng)子，見Yamaguchi-Shinozalei等人，1993，Mol.Gen.Genet.236:331-340。發(fā)育階段優(yōu)選的啟動(dòng)子優(yōu)選表達(dá)于發(fā)育的某些階段。組織和器官優(yōu)選啟動(dòng)子包括那些優(yōu)選在某些組織或器官中表達(dá)的啟動(dòng)子，如葉、根、種子或木質(zhì)部。組織優(yōu)選和器官優(yōu)選型啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不僅限于果實(shí)優(yōu)選型、胚珠優(yōu)選型、雄性組織優(yōu)選型、種子優(yōu)選型、^優(yōu)選型、塊莖優(yōu)選型、主莖優(yōu)選型、果皮優(yōu)選型、以及葉優(yōu)選型、柱頭優(yōu)選型、花粉優(yōu)選型、花藥優(yōu)選型、花瓣優(yōu)選型、萼片優(yōu)選型、花梗優(yōu)選型、長(zhǎng)角果優(yōu)選型、莖優(yōu)選型、根優(yōu)選型啟動(dòng)子等。種子優(yōu)選型啟動(dòng)子優(yōu)選在種子發(fā)育和/或萌發(fā)時(shí)表達(dá).例如，種子優(yōu)選型啟動(dòng)子可為胚胎優(yōu)選型、胚乳優(yōu)選型以及種皮優(yōu)選型，見Thompson等人1989，BioEssays10:108。種子優(yōu)選型啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不僅限于纖維素合酶(celA)、Ciml、y玉米醇溶蛋白、球蛋白-1、玉米19kD玉米醇溶蛋白(cZ19Bl)等。其他合適的組織優(yōu)選型或器官優(yōu)選型啟動(dòng)子包括油菜籽的油菜籽蛋白基因啟動(dòng)子(美國(guó)專利號(hào)5,608,152)、蠶豆(Viciafaba)USP啟動(dòng)子(Baeimilein等人1991，Mol.Gen.Genet.225(3):459-67)、擬南芥油體蛋白啟動(dòng)子(PCT申請(qǐng)?zhí)朩O98/45461)，菜豆(尸Aas卯/"sv"/g"f的菜豆蛋白啟動(dòng)子(美國(guó)專利號(hào)5，504，200)、油菜Bce4啟動(dòng)子(PCT申請(qǐng)?zhí)朩O91/13980)，或豆球蛋白B4啟動(dòng)子(LeB4;Baeumlein等人，1992，PlantJournal,2(2):233-9),以及能在單子葉植物如玉米、大麥、小麥、黑麥、稻等中進(jìn)行種子特異性表達(dá)。已知的合適啟動(dòng)子為大麥lpt2或lptl基因啟動(dòng)子(PCT申請(qǐng)?zhí)朩O95/15389和PCT申請(qǐng)?zhí)朩O95/23230),或如PCT申請(qǐng)?zhí)朩O99/16890所i^(大麥大麥醇溶蛋白基因啟動(dòng)子、稻谷蛋白基因、稻^素基因、稻谷醇溶蛋白基因、小麥麥醇溶蛋白基因、小麥谷蛋白基因、燕麥谷蛋白基因、高粱kasirin基因和黑麥棵麥醇溶蛋白基因)，其他可用于本發(fā)明表達(dá)盒的啟動(dòng)子包括但不僅限于，主要葉綠素a/b結(jié)合蛋白啟動(dòng)子、組蛋白啟動(dòng)子、Ap3啟動(dòng)子、^-大豆球蛋白(/J-conglysin)啟動(dòng)子、油菜籽蛋白啟動(dòng)子、大豆血凝素啟動(dòng)子、玉米15kD玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子、22kD玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子、27kD玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子、g-玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子、蠟質(zhì)、萎縮l、萎縮2和青銅色啟動(dòng)子、Zml3啟動(dòng)子(美國(guó)專利號(hào)5,086,169)、玉米多聚半乳糖醛酸酶啟動(dòng)子(PG)(美國(guó)專利號(hào)5，412，085和5，545，546)和SGB6啟動(dòng)子(美國(guó)專利號(hào)5，470，359)，以及合成或其他天然啟動(dòng)子。利用外源DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域及應(yīng)答元件(即非植物來(lái)源的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域)，能更靈活地調(diào)控植物中外源基因表達(dá)。此類外源DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的實(shí)例為L(zhǎng)exADNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Brent和Ptashne，1985，Cell43:729-736)。本發(fā)明還提供了含有以反義方向克隆入表達(dá)栽體的本發(fā)明CKSRPDNA分子的重組表達(dá)栽體。即DNA分子有效連接于調(diào)控序列，使與CKSRPmRNA反義的RNA分子得以表i^(通過(guò)DNA分子的轉(zhuǎn)錄).可選擇有效連接于反義方向克隆入的核酸分子的調(diào)控序列，指導(dǎo)多種細(xì)胞類型中反義RNA分子的連續(xù)表達(dá)。例如，可選擇病毒啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子或調(diào)控序列，以指導(dǎo)反義RNA的組成型、組織特異性或細(xì)胞類型特異性表達(dá).反:ML達(dá)栽體的形式可為重組質(zhì)粒、嗛?；驕p毒病毒，其中反義核酸在高效調(diào)控區(qū)的調(diào)控下產(chǎn)生.通過(guò)導(dǎo)入栽體的細(xì)胞類型能確定調(diào)控區(qū)域的活性.有關(guān)利用反義基因調(diào)節(jié)基因表達(dá)的討論，見Weintraub，H.等人，1986，AntisenseRNAasamoleculartoolforgeneticanalysis,Reviews-TrendsinGenetics,Vol.1(1)，和Mol等人，1990，F(xiàn)EBSLetters268:427430。本發(fā)明的另一方法涉及導(dǎo)入本發(fā)明重組表達(dá)栽體的宿主細(xì)胞.此處術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞"和"重組宿主細(xì)胞，，可交互使用。應(yīng)當(dāng)理解此類術(shù)語(yǔ)不僅指特定的個(gè)體細(xì)胞，也指此類細(xì)胞的子代或潛在子代。由于連續(xù)傳代中可發(fā)生因突變或環(huán)境影響而導(dǎo)致的某些修飾，此類子代實(shí)際上可能與親代細(xì)胞不同，但仍然包括在此處所用術(shù)語(yǔ)的范圍內(nèi)。宿主細(xì)胞可為任何原核或真核細(xì)胞。例如CKSRP可在細(xì)菌細(xì)胞如谷氨酸棒桿菌、昆蟲細(xì)胞、真菌細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如中國(guó)倉(cāng)鼠卵母細(xì)胞(CHO)或COS細(xì)胞)，藻類、纖毛蟲、植物細(xì)胞、真菌或其他微生物如谷氨酸棒桿菌中表達(dá)。其他合適的宿主細(xì)胞為4^領(lǐng)域技術(shù)人員所z^,本發(fā)明的宿主細(xì)胞如培養(yǎng)中的原核或真核細(xì)胞，可用于產(chǎn)生(即表達(dá))CKSRP。因此，本發(fā)明還提供利用本發(fā)明宿主細(xì)胞生產(chǎn)CKSRP的方法。在某一實(shí)施方案中，該方法包括在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞(其中已經(jīng)導(dǎo)入了編碼CKSRP的重組表達(dá)載體，或其中已經(jīng)導(dǎo)入了編碼野生型或改變的CKSRP基因)，直至產(chǎn)生CKSRP。在另一實(shí)施方案中，該方法還包括從培養(yǎng)基或宿主細(xì)胞中分離CKSRP。本發(fā)明的另一方面涉及分離的CKSRP及其生物活性部分。"分離的"或"純化的"多肽或其生物活性部分中不含有某些細(xì)胞材料(當(dāng)用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生時(shí))，或化學(xué)前體或其他化學(xué)物(當(dāng)化學(xué)合成時(shí))。表述"基本不含有細(xì)胞材料"包括CKSRP的制備，其中多肽從其天然或重組產(chǎn)生細(xì)胞的某些細(xì)胞成分中分離出來(lái).在某一實(shí)施方案中，表述"基本不含有細(xì)胞材料"包括含有少于約30%(干重)的非CKSRP材料(此處也稱為"雜質(zhì)多肽")的CKSRP制備物，更優(yōu)選少于約20%的非CKSRP材料，更優(yōu)選少于約10%的非CKSRP材料，最優(yōu)選少于約5%的非CKSRP材料.當(dāng)CKSRP或其生物活性部分為重組產(chǎn)生時(shí)，也優(yōu)選其基本不含培養(yǎng)基，即培養(yǎng)基占多肽制備物量少于約20%，更優(yōu)選少于約10%，最優(yōu)選少于約5%.表述"基本不含化學(xué)前體或其他化學(xué)物"包括CKSRP制備物，其中多肽與涉及多肽合成的化學(xué)前體或其他化學(xué)物分離。在某一實(shí)施方案中，表述"基本不含化學(xué)前體或其他化學(xué)物"包括CKSRP制備物，其中含有少于約30%(千重)的化學(xué)前體或非CKSRP化學(xué)物，更優(yōu)選少于約20%化學(xué)前體或非CKSRP化學(xué)物，更優(yōu)選少于約10%化學(xué)前體或非CKSRP化學(xué)物，而最優(yōu)逸少于約5%化學(xué)前體或非CKSRP化學(xué)物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，分離的多肽或其生物活性部分中沒有來(lái)自與CKSRP同一來(lái)源生物的雜質(zhì)多肽。一般而言，此類多肽為通過(guò)重組表達(dá)所產(chǎn)生，例如在除小立碗蘚或歐洲油菜以外的植物或微生物如谷氨酸棒桿菌、纖毛蟲、藻類或真菌中表達(dá)小立碗蘚或歐洲油菜CKSRP。此處所述的核酸分子、多肽、多肽同源物、融合多肽、引物、栽體以及宿主細(xì)胞可用于以下一種或多種方法鑒定小立碗蘚、釀酒酵母或歐洲油菜;M目關(guān)生物；對(duì)與小立碗蘚、釀酒酵母或歐洲油菜相關(guān)的生物進(jìn)行基因組作圖；鑒定和定位小立碗蘚、釀酒酵母或歐洲油菜的目標(biāo)序列；進(jìn)化研究；確定功能必需的CKSRP區(qū)域；調(diào)節(jié)CKSRP活性；調(diào)節(jié)一種或多種細(xì)胞功能的代謝；調(diào)節(jié)一種或多種化合物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)；調(diào)節(jié)脅迫抗性；以及調(diào)節(jié)CKSRP核酸的表達(dá)。在這些方法的一個(gè)實(shí)施方案中，CKSRP作用如有活性的鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。在這些方法的另一實(shí)施方案中，CKSRP作用如鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。蘚類小立碗蘚與其他蘚類相關(guān)，如能在無(wú)光下生長(zhǎng)的角齒蘚(Omtofitow/wwp"Mws)。如角齒蘚和小立碗蘚的蘚類在DNA序列和多肽水平上具有高度的序列同一性，因而可利用來(lái)自其他蘚類或生物的探針對(duì)DNA分子進(jìn)行外源性篩選，從而確保得到適于在第三種物種中異源篩選或功能性注釋和預(yù)測(cè)基因功能的一致序列.因此，鑒定此類功能的能力具有顯著意義，例如預(yù)測(cè)酵的底物特異性.此外，這些核酸分子能作為蘚類基因組或相關(guān)生物基因組作圖的參考點(diǎn)。本發(fā)明的CKSRP核酸分子具有多種用途.最重要的是本發(fā)明的核酸和M酸序列可用于轉(zhuǎn)化植物，從而誘導(dǎo)出對(duì)脅迫如旱、高鹽和冷的耐受性。因而本發(fā)明提供了由CKSRP核酸轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物，其中該核M列在植物中的表達(dá)使其對(duì)環(huán)境脅迫的耐受性相對(duì)于該植物野生型品種增強(qiáng).該轉(zhuǎn)基因植物可為單子葉或雙子葉植物.本發(fā)明還提供轉(zhuǎn)基因植物可選自如玉米、小麥、黑麥、燕麥、黑小麥、稻、大麥、大豆、花生、棉花、油菜籽和油菜、木薯、胡椒、向日葵、萬(wàn)壽菊、茄科植物、馬鈴薯、煙草、茄子、番茄、野^JJfe種、豌豆、苜蓿、咖啡、可可、茶、柳某種、油棕櫚、椰子樹、禾草和牧草作物.因此，本發(fā)明提供了產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的方法。具體而言，本發(fā)明描述了利用小立碗蘚的PpCk-l、PpCK-2、PpCK-4和PpPK-4;釀酒酵母的ScCK-l;以及歐洲油菜的BnCK-l、BnCK-2、BnCK-3、BnCK-4和BnCK-5的表達(dá)，來(lái)產(chǎn)生抗旱、抗鹽和/或抗冷植物，此處證明將該策略用于擬南芥、油菜籽/油菜、大豆、玉米和小麥，但其應(yīng)用不僅限于這些植物。因此，本發(fā)明提供了含有CKSRP的轉(zhuǎn)基因植物，所述CKSRP如SEQIDNO:4定義的PpCK-l、SEQIDNO:6定義的PpCK-2、SEQIDNO:2定義的PpCK-4、SEQIDNO:8定義的PpPK-4、SEQIDNO:IO定義的ScCK-l、SEQIDNO:12定義的BnCK-l、SEQIDNO:14定義的BnCK-2、SEQIDNO:16定義的BnCK-3、SEQIDNO:18定義的BnCK-4，和SEQIDNO:20定義的BnCK-5，其中該植物對(duì)選自干旱、高鹽或低溫或高溫中一種或多種的環(huán)境脅迫的耐受性增強(qiáng)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該環(huán)境脅迫為干旱或低溫。含有CKSRP編碼核酸的植物(其中核酸在該植物中表達(dá)使其相對(duì)環(huán)境脅迫的耐受性對(duì)于該植物野生型品種增強(qiáng))包括:(a)向植物細(xì)胞中導(dǎo)入含有CKSRP核酸的表達(dá)載體，且(b)AMi物細(xì)胞中產(chǎn)生相對(duì)于該植物野生型品種對(duì)環(huán)境脅迫耐受性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物.植物細(xì)胞包括但不僅限于，原生質(zhì)體、配子產(chǎn)生細(xì)胞以及能再生為整個(gè)植物的細(xì)胞.此處所用的術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)基因"，指>^有至少一種重組多肽的全部或部分的任意植物、植物細(xì)胞、愈傷組織、植物組織或植物部分，在許多情況下，全部或部分重組多肽穩(wěn)定整合于染色體或穩(wěn)定的染色體外元件，可連續(xù)傳代.在優(yōu)選實(shí)施方案中，CKSRP核酸編碼含有SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:IO、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18或SEQIDNO:20多肽的蛋白質(zhì)，本發(fā)明也提供了調(diào)控植物對(duì)環(huán)^J^迫耐受性的方法，包^節(jié)CKSRP編碼核酸在植物中的表達(dá).通過(guò)分別提高或減少CKSRP的表達(dá)，能增強(qiáng)或降低植物對(duì)環(huán)境脅迫的耐受性，優(yōu)選通過(guò)提高CKSRP的表達(dá)增強(qiáng)植物對(duì)環(huán)境脅迫的耐受性.可通it^領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意方法修飾CKSRP的表達(dá).這些提高CKSRP表達(dá)的方法可用于轉(zhuǎn)基因或非轉(zhuǎn)基因植物中.當(dāng)植物為轉(zhuǎn)基因時(shí)，可用含有任意上述CKSRP編碼核酸的栽體轉(zhuǎn)化該植物，或如可用指導(dǎo)天然CKSRP在植物中表達(dá)的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化該植物。本發(fā)明提供此類啟動(dòng)子可為組織優(yōu)選型、發(fā)育調(diào)節(jié)型、脅迫誘導(dǎo)型或其組合.或者非轉(zhuǎn)基因植物中可含有由引入天然啟動(dòng)子修飾的天然CKSRP表達(dá)。SEQIDNO:4定義的PpCK-l、SEQIDNO:6定義的PpCK-2、SEQIDNO:2定義的PpCK-4、SEQIDNO:8定義的PpPK-4、SEQIDNO:10定義的ScCK-l、SEQIDNO:12定義的BnCK-l、SEQIDNO:14定義的BnCK-2、SEQIDNO:16定義的BnCK誦3、SEQIDNO:18定義的BnCK-4或SEQIDNO:20定義的BnCK-5在^tt物中的表達(dá)可以但不僅限于通過(guò)以下實(shí)例之一實(shí)現(xiàn)(a)組成型啟動(dòng)子、(b)脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、(c)化學(xué)物誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，以及(d)帶有如鋅指來(lái)源的轉(zhuǎn)錄因子的設(shè)計(jì)的啟動(dòng)子過(guò)量表達(dá)(Greisman和Pabo，1997，Science275:657)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，利用如Greisman和Pabo，1997，Science275:657所述、SangamoBiosciences,Inc.生產(chǎn)的鋅指來(lái)源的轉(zhuǎn)錄因子(ZFP)調(diào)節(jié)CKSRP的轉(zhuǎn)錄.ZFP既含有DNA識(shí)別結(jié)構(gòu)域，也含有能導(dǎo)致^酸如CKSRP核酸活化或受抑的功能性結(jié)構(gòu)域，因此，能產(chǎn)生特異性識(shí)別上述CKSRP啟動(dòng)子的活化型或抑制型ZFP，并用于提高或降低CKSRP在植物中的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)植物的脅迫耐受性。本發(fā)明也包括對(duì)**物中SEQIDNO:4定義的PpCK-l、SEQIDNO:6定義的PpCK-2、SEQIDNO:2定義的PpCK4、SEQIDNO:8定義的PpPK-4、SEQIDNO:IO定義的ScCK-l、SEQIDNO:12定義的BnCK-l、SEQIDNO:14定義的BnCK-2、SEQIDNO:16定義的BnCK-3、SEQIDNO:18定義的BnCK4和SEQIDNO:20定義的BnCK-5的同源物的鑒定，以及對(duì)該同源物啟動(dòng)子的鑒定.本發(fā)明也提供了相對(duì)于宿主細(xì)胞野生型品種提高目標(biāo)基因在該宿主細(xì)胞中表達(dá)的方法，其中該目標(biāo)基因在應(yīng)答CKSRP時(shí)轉(zhuǎn)錄，包括(a)用含有CKSRP編碼核酸的表達(dá)栽體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，和(b)在宿主細(xì)胞中表達(dá)CKSRP,從而提高應(yīng)答CKSRP轉(zhuǎn)錄的基因相對(duì)于該宿主細(xì)胞野生型品種的表達(dá).除了將CKSRP核酸序列導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因植物外，這些序列也可用于鑒定小立碗蘚、歐洲油菜、釀酒酵母或其近緣生物.它們也可用于鑒定在微生物混合種群中是否存在小立碗蘚、歐洲油菜、釀酒酵母或其近緣.本發(fā)明提供了若千小立碗蘚、歐洲油菜以及釀酒酵母基因的核酸序列；通過(guò)在嚴(yán)4^件下對(duì)單一或混合微生物種群培養(yǎng)物的基因組DNA提取物使用跨小立碗蘚、歐洲油菜或釀酒酵母基因中某一該生物特有區(qū)域的探針，可以確定是否存在該生物。此外，本發(fā)明的核酸和多肽分子可用作基因組特定區(qū)域的標(biāo)記。這不僅可用于基因組作圖，也可用于小立碗蘚、歐洲油菜或釀酒酵母多肽的功能研究。例如，為鑒定基因組中與特定小立碗蘚DNA結(jié)合多肽結(jié)合的區(qū)域，可以消化小立碗蘚基因組，并將其片段與DNA結(jié)合多肽孵育。那些結(jié)合多肽的片段還可用本發(fā)明的核酸分子作探針檢測(cè)，優(yōu)選探針帶有容易檢測(cè)的標(biāo)記。此類核酸分子與基因組片段的結(jié)^該片段得以在小立碗蘚的基因組圖上定位，且使用不同的酶多次實(shí)施可有助于快速確定與多肽結(jié)合的核酸序列。此外，本發(fā)明的核酸分子可能與相關(guān)物種序列足夠一致足以作為構(gòu)建相關(guān)蘚類基因組圖的標(biāo)記，本發(fā)明的CKSRP核酸分子也可用于進(jìn)化和多肽結(jié)構(gòu)研究。很多原核和真核細(xì)胞利用有本發(fā)明分子參與的代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程；通過(guò)將本發(fā)明的核可以評(píng)價(jià)這些生物間的進(jìn)化相關(guān)性.與之類似，此類對(duì)比能夠評(píng)價(jià)序列中哪些為保守區(qū)域而哪些不是，從而有助于確定多肽中那些對(duì)該酶行使功能極為關(guān)鍵的區(qū)域。此類確定對(duì)于多肽改造研究^L^價(jià)值，可能提示什么樣的多肽能夠耐受誘變且不喪失其功能.對(duì)本發(fā)明的CKSRP核酸分子加工可能會(huì)產(chǎn)生與野生型CKSRP具有功能性差異的CKSRP,這些多肽的有效性或活性可能有所提高，在細(xì)胞中的數(shù)量可能多于正常，或有效性或活性可能降低.對(duì)本發(fā)明CKSRP的改變可以通過(guò)多種機(jī)制直接影響脅迫應(yīng)答和/或脅迫耐受性。在表達(dá)CKSRP的植物中，轉(zhuǎn)運(yùn)增加能改善植物組織和器官中鹽和/或溶質(zhì)分區(qū)，提高從細(xì)胞中運(yùn)出離子分子的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分子的數(shù)目或活性，有可能會(huì)影響細(xì)胞的鹽耐受性。通過(guò)將被#^微生物或植物在次合適的條件下生長(zhǎng)，然后分析植物的生長(zhǎng)特征和/或代謝，能夠評(píng)價(jià)植物、谷氨酸棒桿菌、真菌、藻類或纖毛蟲中遺傳修飾對(duì)脅迫耐受性的影響.此類分析技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，包括干重、濕重、多肽合成、碳7]C化合物合成、脂質(zhì)合成、蒸發(fā)蒸騰作用速率、全植物和/或作物產(chǎn)量、開花、繁殖、結(jié)實(shí)、根生長(zhǎng)、呼吸速率、光合作用速率等(LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology,17巻中的ApplicationsofHPLCinBiochemistry;Rehm等人，1993Biotechnology,第3巻第III章Productrecoveryandpurification,469-714頁(yè)，VCH:Weinheim;Belter,P.A.等人，1988，Bioseparations:downstreamprocessingforbiotechnology,JohnWileyandSons;Kennedy,J.F.和Cabral，J.M.S.,1992，Recoveryprocessesforbiologicalmaterials,JohnWileyandSons;Ulmann，sEncyclopediaofIndustrialChemistry,B3巻第11章，1曙27頁(yè)，VCH:Wdnheim中的Shaeiwitz，J.A.和Henry,J.D.，1988，Biochemicalseparations;以及Dechow，F(xiàn)丄，1989，Separationandpurificationtechniquesinbiotechnology,NoyesPublications).例如，可以利用標(biāo)準(zhǔn)方法構(gòu)建含有此處公開核酸或其片段的酵母表達(dá)栽體，并將其轉(zhuǎn)化至釀酒酵母中.然后測(cè)定產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞對(duì)旱、鹽和溫^迫的耐受性的消失或改變.與之類似，可以利用標(biāo)準(zhǔn)方法，構(gòu)建含有此處公開核酸或其片段的植物表達(dá)栽體，并將其轉(zhuǎn)化入合適的植物細(xì)胞如擬南芥、大豆、油菜、玉米、小麥、蒺藜苜蓿(Me必cflg0friiwc"ft/to)中，然后可檢測(cè)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和/或由此衍生的植物對(duì)旱、鹽和溫JU沐迫的耐受性的下降或改變。對(duì)本發(fā)明一種或幾種CKSRP基因的改造也可產(chǎn)生活性改變的CKSRP，間接影響藻類、植物、纖毛蟲或真菌或其他微生物如谷氨酸棒桿菌的脅迫應(yīng)答和/或脅迫耐受性。例如，代謝的正常生物化學(xué)過(guò)程會(huì)產(chǎn)生一系列產(chǎn)物(如過(guò)氣化氫和其他活性氧種類)，活躍干擾同一代謝過(guò)程.例如，過(guò)氧亞辨酸已知能夠賄化酪氨酸的側(cè)鏈，由此使一些在活性位點(diǎn)含有酪氨酸的酶失活(Groves，J.T.，1999，Curr.Opin.Chem.Biol.3(2):226-235).雖然這些產(chǎn)物通常是分泌的，可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行遺傳^it以使其轉(zhuǎn)運(yùn)出的產(chǎn)物多于一般野生型細(xì)胞。最佳化涉及特定分子如鹽分子外運(yùn)的一種或多種本發(fā)明CKSRP的活性，有可能會(huì)改善細(xì)胞的脅迫耐受性。此外，此處公開的序列或其片段可用于在多種生物的基因組中產(chǎn)生敲除突變，如細(xì)菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母細(xì)胞和植物細(xì)胞(Girke，T.，1998,ThePlantJournal15:39-48)。然后評(píng)價(jià)產(chǎn)生的敲除細(xì)胞耐受多種脅迫情況的能力、對(duì)多種脅迫情況的應(yīng)答以及對(duì)突變表型和/或基因型的影響。其他基因失活的方法，見美國(guó)專利號(hào)6，004，804"非嵌合突變?cè)泽w"，以及Puttaraju等人，1999，Spliceosome誦mediatedRNA加附-splicingasatoolforgenetherapy,NatureBiotechnology17:246-252。前述可產(chǎn)生脅迫耐受性增強(qiáng)的CKSRP誘變策略并無(wú)限制性；對(duì)這些策略的改變對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見。利用此類策略，輔以此處/〉開的機(jī)制，可利用本發(fā)明的核酸和多肽分子產(chǎn)生表達(dá)突變CKSRP核酸和多肽分子從而改善脅迫耐受性的藻類、纖毛蟲、真菌或其他微生物如谷氨酸棒桿菌，本發(fā)明也提供了能與此處所述核酸編碼的CKSRP或其部分特異性結(jié)合的抗體.抗體可由多種已知方法制備(見如Harlow和Lane，"Antibodies;ALaboratoryManual,"ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork,(1988))。簡(jiǎn)言之，可將純化抗原注射入動(dòng)物體內(nèi)，其注射量和間隔均足以激發(fā)出免疫應(yīng)答。可直接純化抗體，或獲取動(dòng)物的脾細(xì)胞.然后可將這些細(xì)胞與永生細(xì)胞系融合并篩選其抗體分泌，抗體可用于篩逸核酸克隆文庫(kù)中分泌抗原的細(xì)胞.然后測(cè)序那些陽(yáng)性克隆(見如Kelly等人，1992，Bio/Technology10:163-167;Bebbington等人,1992，股o/Technoiogy10:169-175)。表述"選擇性結(jié)合"和"特異性結(jié)合"于多肽，是指能確定外源性多肽種群和其他生物制劑中是否存在多肽的結(jié)合反應(yīng)。因此在指定的免疫測(cè)定條件下，結(jié)合于特定多肽的特異性抗體不會(huì)與樣品中存在的其他多肽大量結(jié)合。此種情況下抗體的選擇性結(jié)合可能需要選擇對(duì)特定多肽具有特異性的抗體。多種免疫測(cè)定形式可用于選擇與特定多肽選擇性結(jié)合的抗體。例如，常規(guī)使用固相ELISA免疫測(cè)定以選擇與多JIUC生選擇性免^應(yīng)的抗體.見Harlow和Lane，"Antibodies,ALaboratoryManual"ColdSpringHarborPublications,NewYork,(1988)中對(duì)可用于確定選擇性結(jié)合的免疫測(cè)定形式和條件的描述.在某些情況下，需要制備來(lái)自多種宿主的單克隆抗體。對(duì)制備此類單克隆抗體的技術(shù)描述可見于Stites等人編輯，"BasicandClinicalImmunology,"(LangeMedicalPublications,LosAltos，Calif"FourthEdition)及其中引用參考文獻(xiàn)，以及Harlow和Lane"Antibodies,ALaboratoryManual"ColdSpringHarborPublications,NewYork,1988。本申請(qǐng)中參考了多種出版物。所有這些出版物及其中引用參考文獻(xiàn)的乂>開此處4^引用入本申請(qǐng)作為參考，以期更全面地描述本發(fā)明涉及的領(lǐng)域的狀態(tài)，也應(yīng)當(dāng)理解前文涉及本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案，可不背離本發(fā)明范圍而其進(jìn)行多種改動(dòng)。以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明了本發(fā)明，這些實(shí)施例的構(gòu)建不在于對(duì)本發(fā)明的范圍實(shí)施限制。與之相反，應(yīng)當(dāng)清楚認(rèn)識(shí)到可以采用多種其他實(shí)施例、修飾及其等效物，其在閱讀此處說(shuō)明后對(duì)于本領(lǐng)域技"員而言顯而易見，且不背離本發(fā)明的精神和/或所附權(quán)利要求書的范圍，實(shí)施例實(shí)施例1一小2碗岸雄##蘭長(zhǎng)，本研究中使用來(lái)自UniversityofHamburg遺傳學(xué)研究部保藏的植物物種小立碗蘚(Hedw.)B.S.GL.它們來(lái)自GransdenWood,Huntingdonshire(England)的H丄.K.Whitehouse保藏的植林16/14,是Engel(1968，Am.J.BotS5，438-446)孢子的亞培養(yǎng)，通過(guò)孢子方法和配子體再生方法實(shí)施植物的增殖a單倍體孢子產(chǎn)生原絲體，成為富葉綠體的綠絲體和少葉綠體的莖絲體，約12天后其上形成芽.這些生長(zhǎng)成為帶有配子托的精子器和頸卵器。受精后產(chǎn)生帶有短蒴柄和孢子囊的雙倍體孢子體，減數(shù)孢子在其中成熟，在氣溫25'C、光密度55微摩爾/米、秒(白光；PhilipsTL65W/25熒光管)、it/暗變化為16/8小時(shí)的氣候室中進(jìn)行培養(yǎng)。在如Reski和Abel(1985，Planta165:354-358)使用的Knop培養(yǎng)基的液體培養(yǎng)物中修飾蘚類，或在使用1%Oxoid瓊月旨(Unipath，Basingstoke,England)的Knop固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)之。在通風(fēng)的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)用于RNA和DNA分離的原絲體。每9天粉碎原絲體并轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中。實(shí)施例2一灰控浙^分薦省DiV丄分離總DNA的細(xì)節(jié)涉及操作濕重1克的植物材料。使用的材料包括以下緩沖液CTAB緩沖液2%(w/v)N-十六烷基-N，N，N-三甲基溴化銨(CTAB);100mMTrisHC1pH8.0;1.4MNaCl;20mMEDTA;N-月桂醇J^酸緩沖液10%(w/v)N-月桂醇I/L^酸;100mMTrisHC1pH8.0;和20mMEDTA。液氮下于研缽中研磨植物材料，得到細(xì)微粉末并轉(zhuǎn)移到2ml的Eppendorf管中。然后用一層1ml的分解緩沖液(lmlCTAB緩沖液，100plN-月桂醇M^酸緩沖液，20pljS^L^乙醇和10/d蛋白酶K溶液，10mg/ml)覆蓋冰凍的植物材料，并在60t:持續(xù)搖晃溫育l小時(shí)。將得到的勻漿分到2個(gè)Eppendorf管(2ml)中，并用相同體積的氯仿/異戊醇(24:l)振蕩提取兩次。為了相分離，將^^在8000g和室溫下離心15分鐘。然后使用水冷的異丙醇將DNA在-70r下沉淀30分鐘,在4"和IO，OOOg下沉積沉淀DNA30分鐘并重懸浮于180/tlTE緩沖液中(Sambrook等人，1989，ColdSpringHarborLaboratoryPress:ISBN0-87969-3096)。為進(jìn)一步純化，用NaCl(終濃度1.2M)處理DNA,并用兩倍體積的純乙醇在-70'C再度沉淀30分鐘。用70%乙醇清洗之后，干燥DNA,隨后以50/tl水+RNAse(最終濃度50mg/ml)溶解之，在4"C過(guò)夜溶解DNA,然后在37t!進(jìn)行RNAse消化l小時(shí).4"下存放DNA,實(shí)施例3-從V、J碗岸分岸省/AC4和^*脊磁必2A^"及c2)AMJt岸沐餘建，為研究轉(zhuǎn)錄物，分離了總RNA和M普酸化RNA.根據(jù)GTC方法(Reski等人，1994，Mol.Gen.Genet.，244:352-359)從野生型9天齡的原絲體中獲取總RNA'采用DynaBeads(Dynal，Oslo,Norway)方法，根據(jù)生產(chǎn)商手冊(cè)分離聚腺苷酸化RNA。確定了RNA或聚腺苷酸化RNA的濃"，通#入1/10體積的pH4.6的3M醋酸鈉和2倍體積的乙醇沉淀RNA并貯存于-70t:。為建立cDNA文庫(kù)，利用鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(Roche，Mannheim，德國(guó))和寡聚-d(T)-引物合成第一鏈，與DNA聚合酶I、Klenow酶和RNAseH在12t!(2小時(shí))、16°C(1小時(shí))和22。C(1小時(shí))溫育消化，合成第二鏈。在65。C溫育10分鐘以終止反應(yīng)，然后轉(zhuǎn)移到冰上。在37"(30分鐘)用T4-DNA聚合酶(Roche，Mannheim)將雙鏈DNA分子補(bǔ)平。用酚/氯仿提取和S印hadexG50旋轉(zhuǎn)柱除去核苷酸。用T4-DNA連接酶(Roche,12'C，過(guò)夜)將EcoRI銜接子(Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國(guó))連接到cDNA末端，并與多核苷酸激酶(Roche，37T，30分鐘)溫育而磷酸化。在低熔點(diǎn)瓊脂糖:^上分離該混合物。從皿上洗脫大于3004!^的DNA分子、酚提取、在Elutip-D-柱上濃縮(Schleicher和Schuell，Dassel，德國(guó))、并且將其連接入栽體臂，和根據(jù)生產(chǎn)商的材料和指南，利用GigapackGold試劑盒(Stratagene，Amsterdam,荷蘭)將其包裝進(jìn)XZAPII噬菌體或XZAP-Express逸菌體。實(shí)施例4一小ji碗岸五sr時(shí)灑^和甜雜遂斧.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法將實(shí)施例3描述的cDNA文庫(kù)用于DNA測(cè)序，務(wù)沐而言利用ABIPRISM說(shuō)gDyeTerminatorCycleSequencingReadyReactionKit(Perkin-Elmer，Weiterstadt,德國(guó))通過(guò)鏈終止方法進(jìn)行.通過(guò)體內(nèi)大量剪切、再轉(zhuǎn)化和隨后在瓊脂平板上鋪上DH10B(具體材料和方法來(lái)自Stratagene,Amsterdam，荷蘭)，從cDNA文庫(kù)中回收制備的質(zhì)粒后，實(shí)施隨機(jī)測(cè)序。根據(jù)生產(chǎn)商的方法，在QiageneDNA制備自動(dòng)M上(Qiagen，Hilden),從在含有氨千青霉素的Luria-Bnrth培養(yǎng)基中過(guò)夜生長(zhǎng)的大麻桿菌(五."/Z)培養(yǎng)物中制備質(zhì)粒DNA(見Sambrook等人，1989，ColdSpringHarborLaboratoryPress:ISBN0-87969-309-6)。使用具有下列核苷酸序列的測(cè)序引物5，-CAGGAAACAGCTATGACC-3，SEQIDNO:215，-CTAAAGGGAACAAAAGCTG"3，SEQIDNO:225，-TGTAAAACGACGGCCAGT誦3，SEQIDNO:23采用Bio-Max(Munich,德國(guó))商業(yè)提供的軟件包EST-MAX處理序列并進(jìn)行注釋，該程序?qū)嶋H上整合了蛋白質(zhì)序列的功能和結(jié)構(gòu)性表征的所有重要生物信息學(xué)方'法。參見pedant.mips.biochem.mpg.de.網(wǎng)站。整合入EST-MAX中最重要的算法有FASTA(估計(jì)統(tǒng)計(jì)顯著性的高靈敏度的序列數(shù)據(jù)庫(kù)搜索；PearsonW.R.，1990，RapidandsensitivesequencecomparisonwithFASTPandFASTA.MethodsEnzymol.183:63-98);BLAST(估計(jì)統(tǒng)計(jì)顯著性的高靈敏度的序列數(shù)據(jù)庫(kù)搜索；AltschulS.F.等人，Basiclocalalignmentsearchtool,JournalofMolecularBiology215:403-10);PREDATOR(從單個(gè)和多個(gè)序列預(yù)測(cè)高精確度的二級(jí)結(jié)構(gòu)。Frishman，D.和Argos，P"1997，75%accuracyinproteinsecondarystruc加reprediction.Proteins,27:329-335);CLUSTALW:多重序列比對(duì).Thompson,J.D.等人，1994，CLUSTALW(通過(guò)序列權(quán)重、位置特異性空位罰分和權(quán)重矩陣選擇，提高累進(jìn)多重序列比對(duì)的靈敏度。NucleicAcidsResearch,22:4673-4680);TMAP(從多個(gè)比對(duì)的序列預(yù)測(cè)跨膜區(qū)域.Persson，B.和Argos，P.，1994，Predictionoftransmembranesegmentsinproteinsutilizingmultiplesequencealignments.J.Mol.Biol.237:182-192);ALOM2(從單個(gè)序列預(yù)澳Ji^膜區(qū)域。Klein，P.等人Predictionofproteinfunctionfromsequenceproperties:Adiscriminateanalysisofadatabase.Biochim.Biophys.Acta787:221-226(1984).第2版由Dr.K.Nakai提供)；PROSEARCH(檢測(cè)PROSITE蛋白質(zhì)序列模式。KolakowskiL.F.Jr.，LeunissenJ.A.M.，SmithJ.E,1992，ProSearch:fastsearchingofproteinsequenceswithregularexpressionpatternsrelatedtoproteinstructureandfunction.Biotechiiiques13,919-921);BLIMPS(對(duì)無(wú)空位微數(shù)據(jù)庫(kù)的相似性搜索，J.C.WallaceandHenikoffS.，1992);PATMAT(—種序列、模式、模塊查詢和數(shù)據(jù)庫(kù)的搜索和提秘序，CABIOS8:249-254.由說(shuō)llAlford所寫)，實(shí)施例5-婆定^^應(yīng)于i^cu、i/，or-2、Ppor"和P/Wjr-4碗岸O及尸'采用EST-MAX程序，通過(guò)BLAST分析，在小立碗蘚EST測(cè)序程序中鑒定了部分PpCK-l、PpCK-2、PpCK4和PpPK4的小立碗蘚部分cDNA(EST)。選擇編碼蛋白質(zhì)激酶的特定克隆進(jìn)一步分析。表2PpCK-l與其它激酶的^J^酸同一性和相似性程度(使用了成對(duì)比較:空位罰分10;空位拓展罰分0.1;分?jǐn)?shù)矩陣blosum62)<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>(G:C)和腺嘌呤配對(duì)DNA中胸腺嘧咬(A:T),或腺噪呤配對(duì)RNA中尿嘧啶(A:U)的組合。應(yīng)當(dāng)理解兩個(gè)多核苷酸即使彼此不完全互補(bǔ)也可相互雜交，只要彼此間有至少一個(gè)區(qū)域基本互補(bǔ)。術(shù)語(yǔ)"反義核酸，，包括單鏈RNA以及能轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生反義RNA的雙鏈DNA表達(dá)盒。"活性，，反義核酸為能與初級(jí)轉(zhuǎn)錄物或編碼多肽的mRNA選擇性雜交的反義RNA分子，所述多肽與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:IO、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18或SEQIDNO:20的多肽具有至少80%的序列同一性。反義核酸可與整個(gè)CKSRP編碼鏈互補(bǔ)，或僅與其部分互補(bǔ)。在一個(gè)實(shí)施方案中，反義核酸分子與編碼CKSRP核苷酸序列編碼鏈的"編碼區(qū)"反義。術(shù)語(yǔ)"編碼區(qū)"指含有能翻譯為氨基酸戎基的密碼子的核苷酸序列區(qū)域。在另一實(shí)施方案中，反義核酸分子與編碼CKSRP核苷酸序列編碼鏈的"非編碼區(qū)，，反義。術(shù)語(yǔ)"非編碼區(qū)"指與編碼區(qū)側(cè)接而不會(huì)被翻譯為絲酸的5，和3，序列(即所謂的5，和3，非翻譯區(qū)).反義核酸分子可與CKSRPmRNA的整個(gè)編碼區(qū)互補(bǔ)，但更優(yōu)選為僅與CKSRPmRNA的編碼或非編碼區(qū)部分反義的寡核苷酸。例如，反義寡核苷酸可互補(bǔ)于CKSRPmRNA翻#^始位點(diǎn)周圍的區(qū)域，反義寡核苷酸的長(zhǎng)度可為如約5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個(gè)核苷酸，一般而言，本發(fā)明的反義分子含有RNA,其與SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17或SEQIDNO:19,或編碼SEQH)NO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18或SEQIDNO:20多肽的多核苷酸的至少14個(gè)連續(xù)核苷酸具有60-100%的序列同一性。優(yōu)選的序列同一性為至少70%，更優(yōu)選至少75%、80%、85%、90%、95%或98%，最優(yōu)選99%,利用本領(lǐng)域已知的操作使用化學(xué)合成和酶連接反應(yīng)可構(gòu)建本發(fā)明的反義核酸。例如，可利用天然存在的核苷酸或經(jīng)多種修飾的核苷酸化學(xué)合成反義核酸(如反義寡核苷酸)，設(shè)計(jì)所述修飾核苷酸以提高分子的生物穩(wěn)定PpCK-l、PpCK-2、PpCK-4和PpPK-4全長(zhǎng)編碼區(qū)域的序列，可用于設(shè)計(jì)用于每一基因全長(zhǎng)克隆的寡聚引物(見以下全長(zhǎng)擴(kuò)增)。全長(zhǎng)擴(kuò)增利用基因特異性引物(見表6)，以原始EST為模板，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)獲得對(duì)應(yīng)于PpCK-l、PpCK-2和PpCK-4的全長(zhǎng)克隆。反應(yīng)條件是PWODNA聚合酶(Roche)的標(biāo)準(zhǔn)條件。祁》據(jù)標(biāo)準(zhǔn)條件和生產(chǎn)商說(shuō)明實(shí)施PCR(Sambrook等人，1989，MolecularCloning,ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y"BiometraT3Thermocycler)。反應(yīng)^lt為941!5分鐘，隨后5個(gè)循環(huán)(94t！l分鐘、50'Cl分鐘和72t！1.5*)。然后是25個(gè)循環(huán)(94"l分鐘、65"1M和72'C1.5分鐘)。通過(guò)利用表6中給定的基因特異性引物的重復(fù)RACE方法，分離PpPK-4(SEQIDNO:7)的全長(zhǎng)克隆。根據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明，采用QIA快速^L提取試刑盒(Qiagen)從瓊脂糖凝敗提取擴(kuò)增的片段，并連接^TOPOpCR2.1栽體(Invitrogen).在標(biāo)準(zhǔn)條件下將重組栽體轉(zhuǎn)化入Top10細(xì)胞(Invitrogen)(Sambrook等人，1989，MolecularCloning,ALaboratoryManual.第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY),在含有100mg/ml羧千青霉素、0.8mgX-gal(5-溴4-氯-3-丐l咮-z3-D-半乳糖苷)和0.8mg1PTG(異丙基琉代_p-D-半乳糖苷)的LB瓊脂上37'C過(guò)夜生長(zhǎng)以選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。選擇白色的菌落，用于接種含有100mg/ml氨爺青霉素的3ml液體LB，并于37"過(guò)夜生長(zhǎng)。根據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明，使用QIApr鄰SpinMiniprepKit(Qiagen)提取質(zhì)粒DNA。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)分析隨后的克隆和限制性圖鐠(Sambrook等Aj1989，MolecularCloning,ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.)。表6用于克隆全長(zhǎng)克隆的方案和引物。<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>實(shí)施例7-婆定對(duì)^于&CXJ時(shí)癍潘脊母0及F。釀酒酵母中編碼酪蛋白激酶I的ORF760基因，首次描述于MetanomicsInc.遞交于2003年9月30日的歐洲專利申請(qǐng)?zhí)?3022225.1。Metanomics的專利申請(qǐng)?jiān)诖颂幷w引用作為參考。通過(guò)用于擴(kuò)增操作的PfuDNA聚合酶或PfulTaqDNA聚合酶混合物(Herculase)標(biāo)準(zhǔn)方法，分離ORF760基因。通過(guò)^電泳分析擴(kuò)增的ORF片段。每個(gè)引物由1個(gè)通用5，端和ORF特異的3，端組成，依上所述的通用序列對(duì)于正向和反向引物不同(正向引物序列對(duì)酵母含有EcoRI或者對(duì)大腸桿菌含有Smal，反向引物序列對(duì)酵母含有Smal或?qū)Υ竽c桿菌含有SacI),從而進(jìn)行單向克隆。擴(kuò)增的PCR反應(yīng)物包括lxPCR緩沖液、.2mMdNTP、100ng釀酒酵母基因組DNA(S288C)或60ng大腸桿菌K-12基因組DNA(MG1655)、25pmol反向引物、2.5uPfu或HerculaseDNA聚合酶.反應(yīng)條件包括94匸3分鐘1個(gè)循環(huán)；接著是25個(gè)循環(huán)，94"30秒、55"30秒和72"C5-6分鐘；接著是在6-10分沖1個(gè)循環(huán)，然后于4"C不確定時(shí)間，ScCK-l(ORF760)的正向序列是5，-GGAATTCCAGCTGACCACCATGTCCCAACGATCTTCACAACAC-3，(SEQIDNO:33)ScCK-l(ORF760)的反向序列是5，-GATCCCCGGGAATTGCCATGTCAAAAAAAAAAAGGAAAAAGAGAAAAG-3，(SEQIDNO:34).實(shí)施例8-婆定^/^T:f5"Or"、i"ar-2、5wCU、5wCKW和J/fCJT-5好欽辦磁衷做F.收獲組織、分離RNA和構(gòu)建cDNA文庫(kù)在多種條件和處理下生長(zhǎng)油菜植物，并在各個(gè)發(fā)育階段^不同的組織，以策略性方式進(jìn)行植物生長(zhǎng)和收獲，使在至少一個(gè)或更多產(chǎn)生的文庫(kù)中獲得^可表達(dá)基因的概率最大化.如實(shí)施例3所il^每個(gè)收集的樣品中分離mRNA，并構(gòu)建cDNA文庫(kù).在生產(chǎn)文庫(kù)過(guò)程中不采用擴(kuò)增步驟，以最大程度減少樣品中的基因冗余并保留表達(dá)信息。所有的文庫(kù)都從寡聚dT柱純化的mRNA的3，產(chǎn)生。隨;Mfe選cDNA文庫(kù)轉(zhuǎn)化入大腸桿菌的菌落，并置于微量滴定板上。探針雜交從大腸桿菌菌落中分離質(zhì)粒DNA，然后點(diǎn)在膜上。一組288個(gè)"P放射性標(biāo)記的7核苷酸的寡核苷酸依次與這些膜雜交。為提高通量，處理雙份膜。每次雜交后，通過(guò)磷屏圖像掃描捕捉印跡圖像，產(chǎn)生每一寡核苷酸的雜交鐠。經(jīng)由UMS將這一初步的數(shù)據(jù)圖像自動(dòng)傳送至計(jì)算機(jī)。通過(guò)對(duì)圖像盒、過(guò)濾器以及盒中方位進(jìn)行條形編碼，使其保持完全一致。然后用相對(duì)溫和的條件處理過(guò)濾器以除去結(jié)合的探針，并送回到雜交箱進(jìn)行下一輪雜交。重復(fù)雜交和成^^的循環(huán)，直至完成該組288個(gè)寡聚體。完成雜M，對(duì)于每一斑點(diǎn)(代表一個(gè)cDNA插入片段)均產(chǎn)生了關(guān)于288個(gè)33P^t射性同位素標(biāo)記的7核苷酸的寡核苷酸中哪些與該特定點(diǎn)(cDNA插入片段)結(jié)合，以及結(jié)合到什么程度的鐠。該謙被定義為由該克隆產(chǎn)生的識(shí)別標(biāo)志。將v^每個(gè)克隆產(chǎn)生的識(shí)別標(biāo)志與相同生物產(chǎn)生的所有其它識(shí)別標(biāo)志比較，以鑒定相關(guān)識(shí)別標(biāo)志的簇。此方法在測(cè)序前將來(lái)自一個(gè)生物的所有克隆"^Et"為簇.基因分離根據(jù)這些克隆相同或相似的雜交識(shí)別標(biāo)志，將其M入不同的簇.簇應(yīng)該是單個(gè)基因或基因家族的表達(dá)提示。該分析的副產(chǎn)物是在特定文庫(kù)中每個(gè)基因豐度的表達(dá)誥。采用從5，端的單程測(cè)序，通it^序列數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行相似性和基序搜索，預(yù)測(cè)特定克隆的功能.將釀酒酵母ScCK-l(SEQIDNO:9)的全長(zhǎng)DNA序列對(duì)私有的油菜疊連群數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，E值為E-10(Altschul，St鄰hen等A^GappedBLASTandPSI一BLAST:anewgenerationofproteindatabasesearchprogram,NucleicAcidsRes.25:3389-3402),分析對(duì)于推測(cè)的全長(zhǎng)序列的所有命中的疊連群，并對(duì)代表推測(cè)的全長(zhǎng)疊連群的最長(zhǎng)克隆進(jìn)行全長(zhǎng)測(cè)序.從私有疊連群數(shù)據(jù)庫(kù)中分離的5個(gè)這樣的疊連群為BnCK-l、BnCK-2、BnCK-3、BnCK-4和BnCK-5'在表8-12中顯示了BnCK-l、BnCK-2、BnCK-3、BnCK-4和BnCK-5的M酸序列與現(xiàn)有技術(shù)已知最近基因的同源性。BnCK-l與相似蛋白質(zhì)的氨基酸同一性和相似性程度(使用成對(duì)比較:空位罰分10;空位拓展罰分0.1;分?jǐn)?shù)矩陣blosum62)基因名稱公共數(shù)據(jù)庫(kù)序列蛋白質(zhì)名稱物種序列同一性(％)序列相似性(％)BnCK-lQ93Z18絲氨必蘇氨酸蛋白激酶擬南芥53.965.1表9BnCK-2與相似蛋白質(zhì)的氨基酸同一性和相似性程度(使用了成對(duì)比較空位罰分10;空位拓展罰分0.1;分?jǐn)?shù)矩陣blosum62)基因名稱公共數(shù)據(jù)庫(kù)序列蛋白質(zhì)名稱物種序列同一性(％)序列相似性(％)BnCK-2NP一680447推測(cè)的i^白激酶擬南芥91.394.7表IOBnCK-3與相似蛋白質(zhì)的氨基酸同一性和相似性程度(使用了成對(duì)比較空位罰分10;空位拓展罰分0.1;分?jǐn)?shù)矩陣blosrnn62)基因名稱公共數(shù)據(jù)庫(kù)序列蛋白質(zhì)名稱物種序列同一性(％)序列相似性(％)BnCK-3NP_567812推測(cè)的B^"白激酶擬南芥92.595.6表llBnCK-4與相似蛋白質(zhì)的氨基酸同一性和相似性程度(使用了成對(duì)比較空位罰分10;空位拓展罰分0.1;分?jǐn)?shù)矩陣blosum62)基因名稱公共數(shù)據(jù)庫(kù)序列蛋白質(zhì)名稱物種序列同一性(%)序列相似性(%)BnCK~4Q9SE85絲白激酶I相似蛋白質(zhì)甘藍(lán)(Brassicaoleracea)91.291.4表12BnCK-5與相似蛋白質(zhì)的氨基酸同一性和相似性程度(使用了成對(duì)比較空位罰分10;空位拓展罰分0.1;分?jǐn)?shù)矩陣blosum62)<table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>實(shí)施例9一遞i^過(guò)量在迷印CU、i^OT-2、i^O^、i^i^4、&C:U、丑/iCJS:-7、JJwCJT-2、5wCJT-3、丑wCiT-4々5wCr-5差厲，歡it^^jL^遂考菱遂擬^齊在炎.'二元栽體構(gòu)建dBPS-JH001。根據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明，用HindIII(Roche)消化pLMNC53質(zhì)粒構(gòu)建體(Mankin，2000，Ph.D.thesis,UniversityofNorthCarolina),并用Klenow酶和0.1mMdNTP補(bǔ)平。用瓊脂糖凝膠純化該片段，并根據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明通過(guò)QIA快速^J^提取試劑盒(Qiagen)提取.然后再用EcoRI(Roche)消化純化的片段，瓊脂糖凝歐純化，并根據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明使用QIA快速M(fèi)J^提取試劑盒(Qiagen)^取。得到的1.4kb片段，慶大霉素盒，包括nos啟動(dòng)子、aacCI基因和g7終止子。#>據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明用EcoRI和Smal(Roche)消化pBlueScript栽體，再根據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明用QIA快速^R提取試劑盒(Qiagen)，從瓊脂糖^J^提取產(chǎn)生的片段。根據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明用T4DNA連接酶(Roche)將消化的pBluescript栽體和慶大霉素盒片段連在一起，使兩個(gè)分別的EcoRI位點(diǎn)相連，平端化的扭ndIII位點(diǎn)和Smal位點(diǎn)相連.采用標(biāo)準(zhǔn)條件，將重組栽體(pGMBS)轉(zhuǎn)化進(jìn)入Topl0細(xì)胞(Invitrogen).在含有100pg/ml羧爺青霉素、0.8mgX-gal(5-溴-4-氯-3-吲味-p-D-半乳糖苷)和0.8mgIPTG(異丙基疏代-P-D-半乳糖苷)的LB瓊脂上37"過(guò)夜生長(zhǎng)，篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞。選擇白色菌落，用于接種含有100mg/ml氨芐青霉素的3ml液體LB，并在37'C過(guò)夜生長(zhǎng)。根據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明，使用QIApr印SpinMiniprepKit(Qiagen)提取質(zhì)粒DNA。棉4t標(biāo)準(zhǔn)的分子生物73學(xué)技術(shù)(Sambrook等人1989，MolecularCloning,ALaboratoryManual,第2版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.)，分析隨后的克隆和限制性圖鐠。根據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明用Xbal和Kpnl(Roche)消化pGMBS載體和plbxS叩erGUS栽體，從pGMBS上切下慶大霉素盒，并從plbxSuperGUS載體產(chǎn)生骨架。根據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明，利用QIA快速^J^提取試劑盒(Qiagen)從瓊脂糖凝膠提取產(chǎn)生的片段，根據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明利用T4DNA連接酶(Roche)將這兩個(gè)片段相連。采用標(biāo)準(zhǔn)條件，將產(chǎn)生的重組栽體(pBPS-JHOOl)轉(zhuǎn)化進(jìn)入ToplO細(xì)胞(Invitrogen),在含有100|tg/ml羧千青霉素、0.8mgX誦gal(5-溴-4-氯畫3-吲味-p-D-半乳糖苷)和0.8mgIPTG(異丙J^L代-P-D-半乳糖苷)的LB瓊脂上37'C過(guò)夜生長(zhǎng)，篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞.選擇白色菌落，用于接種含有100mg/ml氨節(jié)音霉素的3ml液體LB，并在37"C過(guò)夜生長(zhǎng)。根據(jù)生產(chǎn)商指南，使用QIAprepSpinMinipr鄰Kit(Qiagen)提取質(zhì)粒DNA,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技^Sambrook等人，1989，MolecularCloning,ALaboratoryManual,第2版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.),分析隨后的克隆和限制性圖譖.將PdCK-1、PdCK-2、PdCK4、PpPK~4、ScCK-l、BnCK-l、BnCK-2、BnCK-3、BnCK~4和BnCK-5亞克隆入二元栽體,根據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明，采用限制性酶兩端消化，從重組的PCR2.1TOPO栽體中切下含有不同小立碗蘚S^白激酶的片段(見表13),再根據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明，用QIA快速^J^提取試劑盒(Qiagen)從瓊脂糖凝膠切下隨后的片段，連接入二元載體,用合適的酶裂解(見表13)，并在連接之前去磷酸化.產(chǎn)生的重組栽體含有處于組成型超級(jí)啟動(dòng)子控制之下的對(duì)應(yīng)正義方向的酪蛋白激酶。表13列出用于植物轉(zhuǎn)化的小立碗蘚酪蛋白激酶構(gòu)建體的名稱。<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>將ScCK-l亞克隆1二元栽體,將ScCK-l基因亞克隆l含有bar基因(由其T-DNA上的masl啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng))的二元栽體(Velten等人1984，EMBOJ.3:2723-2730;Mengiste等人1997，PlantJ.，12:945-948),該T-DNA的克隆盒前^^有一個(gè)組成型啟動(dòng)子，后面為nos終止子(Depicker等人，J.Mol.Appl.Gen.l(6):561-573)?？寺『杏尚蛄?，-GGAATTCCAGCTGACCACCATGGCAATTCCCGGGGATC-3，(SEQIDNO:37)組成。其它選擇系統(tǒng)和啟動(dòng)子為本領(lǐng)域所公知，并可在本發(fā)明中有相似應(yīng)用(例如，AHAS標(biāo)記物、泛素啟動(dòng)子(Callis等人J.Biol.Chem.19卯，265:12486"12493;US5，510，474;US6,020,190;Kawalleck等人，1993，PlantMol.Biol.21:673-684)、34S啟動(dòng)子(GenBank登錄號(hào)M59930和X16673))。利用供應(yīng)商(MBIFermentas，德國(guó))提供的標(biāo)準(zhǔn)方法，用EcoRI和Smal消化二元栽體和ORF760基因(100ng).使用Qiagen柱(Qiagen，Hilden，德國(guó))純化ORF760基因，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法(Maniatis等人)與限制性消化的二元栽體(30ng)相連.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)條件，將重組載體轉(zhuǎn)化3iAjL瘤農(nóng)桿菌C58C1和PMP卯中(Hoefgen和Willmitzer，1990;Koncz和Schell，1986，Mol.Gen.Genet.204:383-396)。植物轉(zhuǎn)化。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)條件，生長(zhǎng)并轉(zhuǎn)化擬南芥生態(tài)型C24(Bechtold，1993，Acad.Sci.Paris.316:1194-1199;Bent等人，1994，Science265:1856-1860)。篩選含有小立碗蘚基因的轉(zhuǎn)化植抹。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)Tl種子進(jìn)行滅菌(Xiong等人，1999，PlantMolecularBiologyReporter17:159-170)。在添加1%蔗糖和2pg/ml苯來(lái)特(benomyl)(Sigma-Aldrich)的1/2Murashige和Skoog培養(yǎng)基(MS)(Sigma-Aldrich)、0.6%瓊脂上篩選種子。于4。C春化處理平板上的種子4天。這些種子在氣溫221:、光密度40微摩爾/米2秒(白光；PhilipsTL65W/25熒光管)的氣候室中萌發(fā)，并采用16小時(shí)光照和8小時(shí)黑暗的循環(huán)。14天后篩選轉(zhuǎn)化的幼苗并轉(zhuǎn)移至添加了0.6%瓊脂、1%蔗糖的1/2MS培養(yǎng)基中，使其恢復(fù)5-7天。>^有小立碗蘚基因的轉(zhuǎn)化植抹的千旱耐受性篩選將T1幼苗轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)niL中的干燥無(wú)菌濾紙，并使其在Sanyo生長(zhǎng)箱MLR-350H，徵學(xué)爾/米2秒(白光；PhilipsTL65W/25熒光管)中，以80%RH(相對(duì)濕度)干燥2小時(shí).然后將RH降為60y。，再干燥幼苗8小時(shí)，然后移出幼苗，置于添加2ng/ml苯來(lái)特的1/2MS0.6yn瓊脂平板上，5天后記錄.然后篩選干旱耐受性提高的轉(zhuǎn)基因植林。在干旱脅迫條件下，過(guò)量表達(dá)PpCK-l的擬南芥植抹干旱脅迫的存活率為50%(10個(gè)受脅迫植林中存活5個(gè))，過(guò)量表達(dá)PpCK-2的擬南芥tt^干旱脅迫的存活率為52%(31個(gè)受脅iitt抹中存活16個(gè))，而過(guò)量表達(dá)PpCK-4的擬南芥植林干旱脅迫中的存活率為14%(7個(gè)受脅迫植抹中存活1個(gè))，相對(duì)未轉(zhuǎn)化的對(duì)照tt^在干旱脅迫中的存活率為11%(9個(gè)受脅iMt林中存活1個(gè))，在三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中，篩選含有ScCK-l基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥;lt^的干旱耐受性。笫一個(gè)實(shí)驗(yàn)將植林置于為期12天的干旱條件下.12天之后篩選轉(zhuǎn)基因植林中干旱耐受性提高者。如其膨脹的外觀和持續(xù)的綠色所示，含ScCK-l轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因植林(ll個(gè)植林)保持活力，其存活時(shí)間比未轉(zhuǎn)化的野生型對(duì)照相L林平均多2.2天。第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中采用來(lái)自多個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)基因抹系的植林。將含有ScCK-l轉(zhuǎn)基因的三周齡的轉(zhuǎn)基因植林置于干旱脅迫條件下。如其膨脹的外，見和持續(xù)的綠色所示，含ScCK-l轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因植林(6個(gè)植林)保持活力，其存活時(shí)間比未轉(zhuǎn)化的野生型對(duì)照檢昧平均多0.3天。第三個(gè)實(shí)驗(yàn)中，采用來(lái)自一個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)基因林系的多個(gè)植林。將含有ScCK-l轉(zhuǎn)基因的三周齡的轉(zhuǎn)基因柏:林置于干旱脅迫條件下。結(jié)果如表14顯示。含ScCK-l轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因植抹的光合產(chǎn)量顯著高于未轉(zhuǎn)化的野生型對(duì)照植林。對(duì)于ScCK-l，列出了5個(gè)重復(fù);ti林的平均結(jié)果；對(duì)于野生型植林，列出了20-25個(gè),的平均結(jié)果。表14<formula>formulaseeoriginaldocumentpage77</formula>16對(duì)含有小立碗蘚基因轉(zhuǎn)化植株的水凍耐受性篩選將幼苗轉(zhuǎn)移至含有添加2%蔗糖和2|ig/ml苯來(lái)特的1/2MS0.6%瓊脂的培養(yǎng)i中.4天后，4X3下溫育幼苗1小時(shí)，再用水屑覆蓋。然后把幼苗放置在EnvironineiitalSpecialistES2000環(huán)境室中，從-1.0。C開始，每小時(shí)降低-1.0。C，溫育3.5小時(shí).此后將這些幼苗在-5.0。C孵育24小時(shí)，然后在5。C融化12小時(shí).將^#出，S^記錄幼苗.篩選這些轉(zhuǎn)基因植^MI:高的水凍耐受性，證明轉(zhuǎn)基因表達(dá)能賦予冰凍耐受性.在水凍脅迫條件下，過(guò)量表達(dá)PpCK-l的擬南芥;tiL^在水凍脅迫中的存活率為100。/。(14個(gè)受脅迫^t抹中存活14個(gè))，相比而言，未轉(zhuǎn)化的對(duì)照植林存活率為2%(48個(gè)受脅il^中存活1個(gè))。鹽耐受性篩選鹽耐受性篩選前的晚上，將幼苗轉(zhuǎn)移至浸泡在1/2MS的濾紙上，并置于添加2pg/ml苯來(lái)特的1/2MS、0.6%瓊脂上.為了鹽耐受性篩選，將載有幼苗的濾紙轉(zhuǎn)移到無(wú)菌濾紙紙堆上，浸泡于50mMNaCl的培養(yǎng)DIL中.2小時(shí)后，將載有幼苗的濾紙轉(zhuǎn)移到無(wú)菌濾紙紙堆上，浸泡于200mMNaCl的培養(yǎng)亞中。2小時(shí)后，將栽有幼苗的濾紙轉(zhuǎn)移到無(wú)菌濾紙紙堆上，浸泡于600mMNaCl的培:^中。IO小時(shí)后，將幼苗轉(zhuǎn)移到添加2/ig/ml苯來(lái)特的1/2MS、0.6%瓊脂的培養(yǎng)臟中。5天后記錄幼苗。篩選過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因植抹的鹽耐受性，證明轉(zhuǎn)基因表達(dá)賦予鹽耐受性。在冰凍脅迫條件下，過(guò)量表達(dá)PpCK-l的擬南芥植林在冰凍脅迫中的存活率為0%(20個(gè)受脅迫植林中存活0個(gè))，過(guò)量表達(dá)PpCK-2的擬南芥植林在水凍脅迫中的存活率為10%(10個(gè)受脅迫植林中存活1個(gè))，過(guò)量表達(dá)PpCK-4的擬南芥植林在水凍脅迫中的存活率為0%(6個(gè)受脅迫植林中存活O個(gè))，相比而言，未轉(zhuǎn)化的對(duì)照植林在水凍脅迫中的存活率為13%(23個(gè)受脅迫植林中存活3個(gè))，在水限制條件下的生長(zhǎng)篩選在組成型啟動(dòng)子控制下，于擬南芥中it4達(dá)pCK-l、PpCK-2、PpCK-4和PpPK4基因。測(cè)定轉(zhuǎn)基因林系的水利用效率(WUE)，并在干旱循環(huán)后測(cè)定某些林系的生物量(圖8).SC024代表空栽體對(duì)照，BPSC24代表用于轉(zhuǎn)化的擬南芥生態(tài)型。DW表示干重，E代表植物水利用.測(cè)定柱下面的字母^獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，在組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)時(shí)，測(cè)定的轉(zhuǎn)基因抹系中，EST289(PpCK4)轉(zhuǎn)基因林的干重顯著提髙。EST142(PpCK4)轉(zhuǎn)基因^t干旱循環(huán)4Hf下的WUE和生物量顯著提高，EST194(PpCK-l)在干旱循環(huán)^H^下的生物量顯著提高.對(duì)于所有的轉(zhuǎn)基因林，每一參數(shù)的平均值與兩個(gè)對(duì)照相比都有提髙，WUE為5-8。/。，DW為11-19%,E為6-9。/。.可以用轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平和轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)的差異來(lái)解釋基因與基因之間的表型差異.特殊的字母指定每一獨(dú)立的測(cè)定.表15在組成型啟動(dòng)子控制下于擬南芥中過(guò)量表達(dá)ScCK-l(ORF760)。測(cè)定轉(zhuǎn)基因林系的干燥耐受性，在野生型對(duì)照死亡后測(cè)量存活的平均天數(shù)。<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>實(shí)施例10—在脊差厲擬4《孩禱^發(fā)浙脊差厲。為檢測(cè)轉(zhuǎn)基因擬南芥林系中轉(zhuǎn)基因的存在，如下例對(duì)污染RNA樣品的基因組DNA進(jìn)行PCR。根據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明，采用r辨DNA聚合Sl(RocheMolecular股ochemicals)，在50piPCRM使用2.5微升RNA樣品。在其中克隆入每個(gè)基因的二元栽體質(zhì)粒用作PCR反應(yīng)中的陽(yáng)性對(duì)照，而野生型C24基因組DNA用作PCR反應(yīng)中的陰性對(duì)照.在0.8%的瓊脂糖-溴乙咬凝膠上分析10piPCR反應(yīng)物.PcCK-1:用于反應(yīng)的引物是GCTGACACGCCAAGCCTCGCTAGTC(SEQIDNO:38)GCGTTAACATGCCCATCTTCTCATACTCAGACC(SEQIDNO:39)PCR程序如下94"l分鐘、62"1分鐘和72"4分鐘，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，然后72'CIO分鐘.從陽(yáng)性對(duì)照和轉(zhuǎn)基因植林中產(chǎn)生1.7kb的片段。PcCK-2:用于及"虔的引物是GCTGACACGCCAAGCCTCGCTAGTC(SEQIDNO:40)GCGTTAACCTTAGGAATCGTATGGCAGAGAGCT(SEQIDNO:41)PCR程序如下94。Cl分鐘、62'C1分鐘和72。C4分鐘，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，然后72。CIO分鐘。從陽(yáng)性對(duì)照和轉(zhuǎn)基因植林中產(chǎn)生1.9kb的片段。PpPK-4:用于M的引物是5，ATCCCGGGAGGCATTGAACTACCTGGAGTGAG3，(SEQIDNO:42)5，GCGATATCGTTGAACTAGTAATCTGTGTTAACTTTATC3，(SEQIDNO:43)PCR程序如下94"lM、62"1^和72t！4分鐘，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，然后72"IO分鐘。從陽(yáng)性對(duì)照和轉(zhuǎn)基因植林中產(chǎn)生1.7kb的片段。從T1轉(zhuǎn)基因抹系中成功擴(kuò)增了轉(zhuǎn)基因，但野生型C24中則沒有。該結(jié)果提示Tl轉(zhuǎn)基因植林含有至少一個(gè)轉(zhuǎn)基因拷貝.沒有跡象顯示在未轉(zhuǎn)化的擬南芥對(duì)照中存在相同或非常相似的基因，所M因可以通過(guò)此法從野生型拔眛中擴(kuò)增.實(shí)施例11一逸過(guò)過(guò)#表遂i>/d-/、/^CU、、JP/^JiT4、5"cOST-i、5"cjr-j、丑"CK-2、丑"CX"3、5"cx^/成5ncr-5差厲，政i^遂^^愛'勝義^^fc沐，用70%乙醇對(duì)大豆種子進(jìn)行表面滅菌，在室溫下持續(xù)搖晃4分鐘，接著加入添加0.05%(v/v)吐溫的20%(v/v)Clorox持續(xù)搖晃20分鐘，然后，用蒸鎦水洗滌種子4次，并于培養(yǎng)臟中濕潤(rùn)的無(wú)菌濾紙上在室溫下留置6-39小時(shí)。剝?nèi)シN皮，從胚軸上除去子葉。檢查胚軸確定沒有破壞分生組織區(qū).將切開的胚軸收集于半開的無(wú)菌培養(yǎng)臟中，并在封口的培^jdl中用空氣干燥至水分含量少于20%(鮮重)，以備后用.^入合適選擇試劑的LB固體培養(yǎng)基上的單菌落制備根瘤農(nóng)桿菌，使單菌落生長(zhǎng)于液體LB培養(yǎng)基中，直至其600irni下光密度為0.8。然后于室溫以7000rpm離心7分鐘使細(xì)菌培養(yǎng)物沉淀，并重懸浮于加入100乙酰丁香酮的MS(Murashige和Skoog，1962)培養(yǎng)基中，使用前在此預(yù)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中于室溫孵育細(xì)菌培養(yǎng)物2小時(shí)。使水分含量約為15%的大豆合子種子胚軸在室溫下吸收預(yù)誘導(dǎo)的農(nóng)桿菌重懸物2小時(shí)。從吸中取出胚，轉(zhuǎn)移到加入2。/。蔗糖的含有固體MS培養(yǎng)基的培^:中，室溫下黑暗中孵育2天?；蛘邔⑴咧糜谂囵B(yǎng)i中濕潤(rùn)的(液體MS培養(yǎng)基)無(wú)菌濾紙頂端，于上述同樣條件下溫育。其后，將胚胎轉(zhuǎn)移到含有500mg/L羧芐青霉素或300mg/L頭孢嚷肟的固體或液體MS培養(yǎng)基中，以殺死農(nóng)桿菌。利用液體培養(yǎng)基潤(rùn)濕無(wú)菌濾紙。在150(onoln^秒"和12小時(shí)光周期下，將胚胎在25"孵育4周。一旦幼苗生長(zhǎng)出根，將其轉(zhuǎn)移到無(wú)菌的Metromix土壤。在將植物轉(zhuǎn)移至土壤之前，洗去體外植林的培養(yǎng)基.將植抹在塑,蓋下保持l周，以促進(jìn)其環(huán)境適應(yīng)過(guò)程。然后轉(zhuǎn)移植林到生長(zhǎng)室，在其內(nèi)150nmoln^秒"光密度和12小時(shí)光周期下，于25"袢育約80天。根據(jù)實(shí)施例9所述的篩選方法，篩選轉(zhuǎn)基因植林提高的干旱、鹽和冷凍耐受性，證明轉(zhuǎn)基因表達(dá)能賦予脅迫耐受性和/或提高水利用效率.這耐愛遂磁衷;^磁衷扭梯，此處描述的植物轉(zhuǎn)化方法也可應(yīng)用于蕓苔和其它作物.用70%乙醇對(duì)油菜種子在室溫進(jìn)行持續(xù)搖晃的表面滅菌4分鐘，接著加入含0.05n/。(v/v)吐溫的20。/。(v/v)Clorox，室溫下持續(xù)搖晃20分鐘。然后用蒸鎦水洗滌種子4次，并室溫下在培養(yǎng)亞中濕潤(rùn)的無(wú)菌濾紙上留置18小時(shí).然后剝?nèi)シN皮，在半開的培養(yǎng)亞中空氣干燥過(guò)夜.此過(guò)程中種子會(huì)失去約85%的水含量，接著將種子保藏在室溫密閉的培^中直至進(jìn)一步使用.DNA構(gòu)建體和胚吸收作用如實(shí)施例10所述.用PCR分析初級(jí)轉(zhuǎn)基因植抹樣品(T0)，以確認(rèn)存在T-DNA。用Southern雜交確認(rèn)此結(jié)果，其中DNA在1。/。的瓊脂糖凝膠上電泳并轉(zhuǎn)移到帶有正電荷的尼龍膜上(RocheDiagnostics),利用PCRDIG探針合成試劑盒(RocheDiagnostics)通過(guò)PCR制備標(biāo)記有地高辛配基的PCR探針，并根據(jù)生產(chǎn)商推薦的方法使用，根據(jù)實(shí)施例9所描述的篩選方法，篩選轉(zhuǎn)基因植M高的脅迫耐受性，證明轉(zhuǎn)基因表達(dá)賦予脅迫耐受性和/或提高的水利用效率.實(shí)施例13通過(guò)過(guò)量表達(dá)PpCK0-1PpCL-2PpPK-4ScCK-1必"CiST-J、丑"CJT-2、5"CA"5、J5"CJJT-4^丑"CJ^-5差厲，攻i^遵^^爻'絲好玉術(shù)>2^#。利用Ishida等人，1996，NatureBiotech.14745-50中描述的方法用目標(biāo)基因轉(zhuǎn)化玉米(ZeaMaysL.)。將未成熟胚與帶有"超級(jí)二元，，栽體的根瘤農(nóng)桿菌共同培養(yǎng)，通過(guò)器官形成回收轉(zhuǎn)基因植林。此方法的轉(zhuǎn)化效率在2.5%-20%之間。根據(jù)實(shí)施例9所述的篩選方法，篩選轉(zhuǎn)基因檔:林提高的干旱、鹽和冷凍耐受性，證明轉(zhuǎn)基因表達(dá)賦予脅迫耐受性和/或提高水利用效率。實(shí)施例14一遞過(guò)過(guò):f^迷i^CU、i^OT-2、i^CA^/、i^i^一、5^CA"7、丑"Ciir-j、u"cjt-2、丑"cjj:-3、5"cjs:-4ig丑nc:jsr-5差厲，攻ii^遂^A爻'勝'/、老孩禱，采用Ishida等人1996年描述的方法(Ishida等人1996，NatureBiotech.14745-50)用目標(biāo)基因轉(zhuǎn)化小麥。將未成熟胚與帶有"超級(jí)二元，，栽體的根瘤農(nóng)桿菌共同培養(yǎng)，通過(guò)器官形成回收轉(zhuǎn)基因植林。此方法的轉(zhuǎn)化效率在2.5%-20%之間。根據(jù)實(shí)施例9所述的篩選方法，篩選轉(zhuǎn)基因植林提高的脅迫耐受性，證明轉(zhuǎn)基因表達(dá)賦予脅迫耐受性和/或提高水利用效率.實(shí)施例15—婆定^潘;^弄糸差厲。基因序列可用于從cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)中鑒定同源或異源基因。可使用如cDNAi^通過(guò)核酸雜交分離同源基因(例如全長(zhǎng)cDNA克隆)。根據(jù)目標(biāo)基因的豐度，鋪板100,000到l，OOO，OOO個(gè)重組噬菌體并轉(zhuǎn)移其至尼龍膜上.堿變性后，通過(guò)UV交聯(lián)將DNA固定在膜上。在高嚴(yán)4MHf下進(jìn)行雜交，在水溶液中，以1MNaCl的離子強(qiáng)度和溫度68"的M進(jìn)行雜交，通過(guò)如放射性^P)缺口轉(zhuǎn)錄標(biāo)記(HighPrime,Roche，Mannheim,德國(guó))，產(chǎn)生雜交探針。通過(guò)放射自顯影檢測(cè)信號(hào)?？捎门c上述操作相似的方法，使用低嚴(yán)格度的雜交和皿條件鑒定相關(guān)但不完全相同的部分同源或異源的基因。對(duì)于水相雜交，通常保持離子強(qiáng)度為1MNaCl而將溫度從68。C逐步降低至42。C.利用合成的放射標(biāo)記的寡核苷酸探針，分離只在一個(gè)明顯結(jié)構(gòu)域(如10-20個(gè)M酸)具有同源性(或序列同一性/相似性)的基因序列，利用T4多核苷酸激酶通過(guò)磷酸化兩條互補(bǔ)寡核苷酸的5，端，來(lái)制備放射性標(biāo)記的寡核苷酸。將互補(bǔ)的寡核苷酸退火，并連接形成串聯(lián)體。然后用如缺口轉(zhuǎn)錄方法，放射性標(biāo)記該雙鏈串聯(lián)體。通常在低嚴(yán)格條件下，采用高濃度的寡核苷酸進(jìn)行雜交。寡核苷酸雜交溶液6xSSC0.01M磷酸鈉1mMEDTA(pH8)0.5%SDS100ng/ml變性鮭精DNA0.1%脫脂干奶粉雜交過(guò)程中逐步將溫度降低到估測(cè)寡核苷酸Tm的5-10"以下或降至室溫，然后進(jìn)行洗脫步驟和放射自顯影。在低嚴(yán)格條件下洗脫，如采用4xSSC洗脫3次.更多細(xì)節(jié)見述于Sambrook，J等人1989，"MolecularCloning:ALaboratoryManual,"ColdSpringHarborLaboratoryPress或者Ausubel，F(xiàn).M.等Aj1994，"CurrentProtocolsinMolecularBiology",JohnWiley&Sons。實(shí)施例16—^拔琳謬遂《^Jt^蔞定^謬差厲，cDNA克隆可用于在如大腸桿菌中生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)(例如QiagenQIAexpresspQE系統(tǒng)).然后通常用Ni-NTA親和層析(Qiagen)親合純化重組蛋白質(zhì).此后使用如兔免疫的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，將重組蛋白質(zhì)用于生產(chǎn)特異性抗體.如Gu等人，1994，BioTechniques17:257-262所述，用重組抗原飽和的Ni-NTA柱親合純化抗體。該抗體可用于篩i^達(dá)cDNA文庫(kù)，以通過(guò)免疫篩選鑒定同源或異源基因(Sambrook,J.等人，1989，"MolecularCloning:ALaboratoryManual",ColdSpringHarborLaboratoryPress或Ausubel，F(xiàn).M.等人，1994，"CurrentProtocolsinMolecularBiology",JohnWiley和Sons).實(shí)施例17—琳^資爻?？梢酝ㄟ^(guò)經(jīng)由大腸桿菌或其他微生物(例如芽孢桿菌(5fla7/"ss/j;p.)或酵母如釀酒酵母)的質(zhì)粒DNA(或其它載體)傳代，進(jìn)行微生物的體內(nèi)誘變，其破壞維持遺傳信息完整性的能力。典型的突變菌林在DNA修復(fù)系統(tǒng)基因具有突變(例如mutHLS、mutD、mutT等，參見Rupp,W.D.，1996,DNArepairmechanisms,in:EscherichiacoliandSalmonella,p.2277-2294，ASM:Washington.作為參考)。此類菌林為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。此類菌林的使用見于如Greener,A.和Callahan,M.，1994，Strategies7:32-34。優(yōu)選在微生物篩選和測(cè)試之后，將突變的DNA分子轉(zhuǎn)入植物。根據(jù)本發(fā)明文檔中不同的說(shuō)明例，生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植林。實(shí)施例18—琳/浙脊差厲4浙^/、立碗岸差厲好甜雜。酶活性和動(dòng)力學(xué)M的確定已經(jīng)為本領(lǐng)域所熟知。確定任一給定的改變酶活性的實(shí)驗(yàn)，必須與野生型酶的特異性活性相適應(yīng)，并為本領(lǐng)域的技術(shù)人員的能力所及。對(duì)酵類的一般說(shuō)明，以及關(guān)于結(jié)構(gòu)、動(dòng)力學(xué)、原理、方法、應(yīng)用和許多確定酶活性的實(shí)例可見于以下參考文獻(xiàn)Dixon，M.和Webb，E.C.，1979，Enzymes.Longmans:London;Fersht，1985，EnzymeStructureandMechanism.Freeman:NewYork;Walsh，1979，EnzymaticReactionMechanisms.Freeman:SanFrancisco;Price,N.C.，Stevens,L.，1982，F(xiàn)undamentalsofEnzymology.OxfordUniv.Press:Oxford;Boyer，P.D.編輯，1983,TheEnzymes,第3版.AcademicPress:NewYork;Bisswanger，H.，1994，Enzymkinetik，第2版.VCH:Weinheim(ISBN3527300325);Bergmeyer,H.U.，Bergmeyer,J"Gra/1，M.編輯，1983-1986，MethodsofEnzymaticAnalysis,第3版，巻I-XII，VerlagChemie:Wdnheim;以及UHmann，sEncyclopediaofIndustrialChemistry,1987，巻A9，Enzymes.VCH:Weinheim,352-363頁(yè)，可以用若干明確的方法如DNA條帶轉(zhuǎn)移測(cè)定(也叫做亂歐阻滯測(cè)定)，測(cè)定結(jié)合DNA的蛋白質(zhì)活性。用報(bào)告基因測(cè)定法可測(cè)量此類蛋白質(zhì)對(duì)其它分子表達(dá)的影響(如Kolmar，H.等人，1995，EMBOJ.14:3895-3904及其所引的文獻(xiàn))，報(bào)告基因測(cè)試系統(tǒng)眾所周知，并已使用如--半乳糖苷酶、綠色熒光蛋白和一些其他種類的酶，建立用于原核和真核細(xì)胞中.根據(jù)如Gennis,R.B.，1989，Pores，ChannelsandTransporters,inBiomembranes，MolecularStructureandFunction,笫85-137、199-234和270-322頁(yè)，Springer:Heidelberg.所述的技術(shù)，可以確定膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性。實(shí)施例19一^掙必i參^^^厚坎產(chǎn)^。利用本領(lǐng)域公知的多種方法，可以從植物材料(即小立碗蘚或擬南芥)、真菌、藻類、纖毛蟲、谷氨酸棒桿菌細(xì)胞或其它用此處所述核酸序列轉(zhuǎn)化的細(xì)菌細(xì)胞中，或上述培養(yǎng)物的上清液中回收目的產(chǎn)物.如果目的產(chǎn)物并非從細(xì)胞分泌，則可用低速離心從培養(yǎng)物中收獲細(xì)胞，并采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如機(jī)械力或超聲裂解細(xì)胞?？梢詮钠渌M織或器官;Wfe分離植物器官.勻漿后，離心除去細(xì)胞殘骸，保留含有可溶蛋白質(zhì)的上清液部分以進(jìn)一步純化得到目的化合物.如果該產(chǎn)物為目的細(xì)胞所分泌，則用低速離心將這些細(xì)^培#^除去，并保留上清液部分用于進(jìn)一步純化'W^—純化方法得到的上清液進(jìn)行合適樹脂的層析，其中目的分子被層析樹脂保留而樣品中的許多雜質(zhì)則不能被保留，或者雜質(zhì)被樹脂保留而樣品不被保留，必要時(shí)可采用相同或不同的層析樹脂，重復(fù)這些層析步驟.本領(lǐng)域技術(shù)人員熟練掌握合適層析樹脂的選擇，及其對(duì)特定待純化分子的最有效應(yīng)用方法。可用通過(guò)過(guò)濾或超濾濃縮純化的產(chǎn)物，并保存于該產(chǎn)物最穩(wěn)定的溫度下。很多純化方法為本領(lǐng)域所公知，并不僅限于前面描述的純化方法。這些純化技術(shù)已述于如Bailey，J.E.和Ollis，1986，D.F.BiochemicalEngineeringFundamentals,McGraw-Hill:NewYork,此夕卜，可利用>^領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)評(píng)定分離化合物的特征和純度，這些包括高效液相色譜(HPLC)、分光法、染色方法、薄層層析、NIRS、酶測(cè)定或者微生物方法。這些分析方法的綜述見于Patek等人，1994，Appl.Environ.Microbiol.60:133-140;Malakhova等人，1996，Biotekhnologiya11:27-32;和Schmidt等人,1998,BioprocessEngineer.19:67-70;UImann，sEncyclopediaofIndustrialChemistry,1996，巻A27，VCH:Weinheim，第89-卯頁(yè)，521-540頁(yè)，540-547頁(yè)，559-566、575-581和581-587頁(yè)；Michal，GL，1999，BiochemicalPathways:AnAtlasofBiochemistryandMolecularBiology,JohnWiley和Sons;FaUon,A.等人，1987，LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology,巻17中的ApplicationsofHPLCinBiochemistry。權(quán)利要求1.用編碼多肽的核酸轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中該多肽如SEQIDNO2所定義。2.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中該核酸包含如在SEQIDNO:l中定義的多核苷酸。3.用編碼多肽的核酸轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中該多肽在植物細(xì)胞中的表達(dá)使該植物細(xì)胞相對(duì)于該植物細(xì)胞野生型品種對(duì)選自干旱和溫度低于或等于O'C中的一種或多種環(huán)境脅迫的耐受性增加；其中所述核酸在嚴(yán)格M下與SEQIDNO:l序列及SEQIDNO:l序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列中至少一個(gè)序列雜交；且其中所述嚴(yán)格條件包括于65'C在6x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)溶液中雜交.4.用編碼多肽的核酸轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，所迷多肽與SEQIDNO:2定義的多肽之間具有至少80%的序列同一性，其中多肽在植物細(xì)胞中的表達(dá)使該植物細(xì)胞相對(duì)于該植物細(xì)胞野生型品種對(duì)選自干旱和溫度低于或等于O'C中的一種或多種環(huán)境脅迫的耐受性增加。5.含有權(quán)利要求1、2、3或4中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因植物。6.含有權(quán)利要求l、2、3或4中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的種子.7.由含有權(quán)利要求l、2、3或4中任一項(xiàng)的植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的種子，其中所述種子含有編碼多肽的核酸，其中所述種子為相對(duì)于該植物細(xì)胞野生型品種對(duì)環(huán)境脅迫的耐受性增強(qiáng)的真實(shí)遺傳，且其中環(huán)境脅迫選自千早和溫度低于或等于0°C中的一種或多種。8.分離的編碼多肽的核酸，其中所述核酸包含編碼如SEQIDNO:2所定義多肽的多核苷酸。9.權(quán)利要求8的核酸，其中所述核酸包含如SEQIDNO:l定義的多核苷酸。10.分離的編碼多肽的核酸，其中所述多肽在植物細(xì)胞中的表達(dá)使該植物細(xì)胞相對(duì)于該植物細(xì)胞野生型品種對(duì)選自干旱和溫度低于或等于o。c中的一種或多種環(huán)境脅迫的耐受性增加；其中所述核酸在嚴(yán)格條件下與SEQIDNO:l序列及SEQIDNO:l序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列中至少一個(gè)序列雜交；且其中嚴(yán)格條件包括于65'C在6x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)溶液中雜交。11.分離的編碼多肽的核酸，所述多肽與SEQIDNO:2定義的多肽之間具有至少80%的序列同一性，其中該多肽在植物細(xì)胞中的表達(dá)使該植物細(xì)胞相對(duì)于該植物細(xì)胞野生型品種對(duì)選自干旱和溫度低于或等于0'C中的一種或多種環(huán)境脅迫的耐受性增加.12.包含權(quán)利要求8、9、10或11中任一項(xiàng)的分離的核酸的種子。13.包含權(quán)利要求8、9、10或11中任一項(xiàng)的核酸的分離的重組表達(dá)野生型品種對(duì)環(huán)境脅迫的耐受性增強(qiáng)，且其中環(huán)境脅迫選自干旱和溫度低于或等于O'C中的一種或多種.14.產(chǎn)生含有編碼多肽核酸的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括a.使用權(quán)利要求13的表達(dá)栽體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；和b.從該植物細(xì)胞產(chǎn)生表達(dá)所述多肽的轉(zhuǎn)基因植物；其中該多肽如SEQIDNO:2所定義。15.產(chǎn)生含有編碼多肽核酸的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中所述多肽在植物中的表達(dá)使該植物相對(duì)于該植物的野生型品種對(duì)環(huán)境脅迫的耐受性增強(qiáng)，包括，a.使用權(quán)利要求13的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；和b.從該植物細(xì)胞產(chǎn)生表達(dá)多肽的轉(zhuǎn)基因植物；其中所述核酸在嚴(yán)格條件下與SEQIDNO:l序列及SEQIDNO:l序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列中的至少一個(gè)序列雜交;其中嚴(yán)旨降包括于65aC在6x氯化鈉/杼檬酸鈉(SSC)溶液中雜交；且其中環(huán)境脅迫選自干旱和溫度低于或等于O'C中的一種或多種.16.產(chǎn)生含有編碼多肽核酸的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中所述多肽在植物中的表達(dá)使該植物相對(duì)于該植物的野生型品種對(duì)環(huán)境脅迫的耐受性增強(qiáng)，包括，a.使用權(quán)利要求13的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；和b.從該植物細(xì)胞產(chǎn)生表達(dá)多肽的轉(zhuǎn)基因植物；其中所述多肽與SEQIDNO:2定義的多肽之間具有至少80%的序列同一性，且其中環(huán)境脅迫選自干旱和溫度低于或等于0'C中的一種或多種。17.用編碼多肽的核酸轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，所述多肽與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQEDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18或SEQIDNO:20定義多肽的中央蛋白激酶結(jié)構(gòu)域具有至少50%的序列同一性，其中多肽在植物細(xì)胞中的表達(dá)使該植物細(xì)胞相對(duì)于該植物細(xì)胞野生型品種對(duì)選自干旱和溫度低于或等于0'C中的一種或多種環(huán)境脅迫的耐受性增加。18.權(quán)利要求17的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中所述核酸編碼的多肽所具有的中央蛋白激酶結(jié)構(gòu)域包含a.第一區(qū)，從位置l的甘氨酸殘基開始，且在其位置3為甘氨酸而在位置5為苯丙氛酸殘基；b.位于第一區(qū)下游的第二區(qū)，從位置l的纈氨酸殘基開始，且在位置4為賴氨酸，位置6谷氨酸殘基、位置14谷氨酰胺殘基，位置15亮氨酸殘基，位置18谷氨酸殘基，位置22酪氨酸殘基，位置32脯氨酸殘基，位置38甘氨酸殘基，位置44天冬酰胺殘基，位置50和51為亮氨酸殘基，位置52甘氨酸殘基，位置53脯氨酸殘基，位置55亮氨酸殘基，位置58亮氨酸殘基，位置59苯丙氨酸殘基，位置62半胱氨酸殘基，位置66苯丙氨酸殘基，位置69賴氨酸殘基，位置70蘇氨酸殘基，位置77谷氨酰胺殘基，位置79異亮氨酸殘基，位置86組氨酸殘基，位置93精氨酸殘基，位置94天冬氨酸殘基，位置96賴氨酸殘基，位置97脯氨酸殘基，位置99天冬酰胺殘基，位置100苯丙氨酸殘基，以及位置101為亮氨酸殘基；c.位于第二區(qū)下游的第三區(qū)，從位置l的天冬氨酸殘基開始，且其位置5為丙氨酸殘基，位置6賴氨酸殘基，位置8酪氨酸殘基，位置10天冬氨酸殘基，位置13蘇氨酸殘基，位置16組氨酸殘基，位置17異亮氨酸殘基，位置18脯氨酸殘基，位置19酪氨酸殘基，位置20精氨酸殘基，位置23賴氨酸殘基，位置27甘氨酸殘基，位置28蘇氨酸殘基，位置29丙氨酸殘基，位置30精氨酸殘基，位置31酪氨酸殘基，位置33絲氨酸殘基，位置35天冬酰胺殘基，位置37組氨酸殘基，位置39甘氨酸殘基，位置41谷氨酸殘基，位置43絲氨酸殘基，位置44精氨酸殘基，位置45精氨酸殘基，位置46天冬氨酸殘基，位置47天冬氨酸殘基，位置49谷氨酸殘基，位置52甘氨酸殘基，位置57酪氨酸殘基，位置58苯丙氨酸殘基，位置63亮氨酸殘基，位置64脯氨酸殘基，位置65色氦酸殘基，位置66谷氨酰胺殘基，位置67甘氨酸殘基，以及d.位于第三區(qū)下游的笫四區(qū)，從位置l的脯氨酸殘基開始，且其位置12為精氨酸殘基，位置14亮氨酸殘基，位置16苯丙氨酸殘基，位置20脯氨酸殘基，位置21天冬氨酸殘基，位置22酪氨酸^fc，位置41天冬氨酸殘基，位置45天冬氨酸殘基，以及位置46色氨酸殘基。19.含有權(quán)利要求17的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因植物。20.含有權(quán)利要求18的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因植物。21.含有權(quán)利要求17的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的種子，22.含有權(quán)利要求18的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的種子。23.由含有權(quán)利要求17的植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的種子，其中所述種子含有編碼多肽的核酸，其中所述種子為相對(duì)于該植物細(xì)胞野生型品種對(duì)環(huán)境脅迫的耐受性增強(qiáng)的真實(shí)遺傳，且其中環(huán)境脅迫選自干旱和溫度低于或等于O'C中的一種或多種，24.由含有權(quán)利要求18的植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的種子，其中所述種子含有編碼多肽的核酸，其中所述種子為相對(duì)于該植物細(xì)胞野生型品種對(duì)環(huán)境脅迫的耐受性增強(qiáng)的真實(shí)遺傳，且其中環(huán)境脅迫選自干旱和溫度低于或等于or中的一種或多種。25.分離的編碼多肽的核酸，所述多肽與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:IO、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18或SEQIDNO:20所定義多肽的中央蛋白激酶結(jié)構(gòu)域具有至少80°/。的序列同一性，其中多肽在植物細(xì)胞中的表達(dá)使該植物細(xì)胞相對(duì)于該植物細(xì)胞野生型品種對(duì)選自干旱和溫度低于或等于0'C中的一種或多種環(huán)境脅迫的耐受性增加。26.權(quán)利要求25的分離的核酸，其中所述核酸編碼的多肽具有的中央蛋白激酶結(jié)構(gòu)域包含a.第一區(qū)，從位置l的甘氨酸殘基開始，且在其位置3為甘氨酸而在位置5為苯丙氨酸殘基；b.位于第一區(qū)下游的第二區(qū)，從位置l的纈氨酸殘基開始，且其位置4為賴氨酸，位置6谷氨酸殘基、位置14谷氨酰胺殘基，位置15亮氨酸殘基，位置18谷氨酸殘基，位置22酪氨酸殘基，位置32脯氨酸殘基，位置38甘氨酸殘基，位置44天冬酰胺殘基，位置50和51為亮氨酸殘基，位置52甘氨酸殘基，位置53脯氨酸殘基，位置55亮氨酸殘基，位置58亮氨酸殘基，位置59苯丙氨酸殘基，位置62半胱氨酸殘基，位置66苯丙氨酸殘基，位置69賴氨酸殘基，位置70蘇氨酸殘基，位置77谷氨酖胺殘基，位置79異亮氨酸殘基，位置86組氨酸殘基，位置93精氨酸殘基，位置94天冬氨酸殘基，位置96賴氨酸殘基，位置97脯氨酸殘基，位置99天冬酰胺殘基，位置100苯丙氨酸殘基，以及位置101為亮氨酸殘基；c.位于第二區(qū)下游的第三區(qū)，從位置l的天冬氨酸殘基開始，且其位置5為丙氨酸殘基，位置6賴氨酸殘基，位置8酪氨酸殘基，位置10天冬氨酸殘基，位置13蘇氨酸殘基，位置16組氨酸殘基，位置17異亮氨酸殘基，位置18脯氨酸殘基，位置19酪氨酸殘基，位置20精氨酸殘基，位置23賴氨酸殘基，位置27甘氨酸殘基，位置28蘇氨酸殘基，位置29丙氨酸殘基，位置30精氨酸殘基，位置31酪氨酸殘基，位置33絲氨酸殘基，位置35天冬酰胺殘基，位置37組氨酸殘基，位置39甘氨酸殘基，位置41谷氨酸殘基，位置43絲氨酸殘基，位置44精氨酸殘基，位置45精氨酸殘基，位置46天冬氨酸殘基，位置47天冬氨酸殘基，位置49谷氨酸殘基，位置52甘氨酸殘基，位置57酪氨酸殘基，位置58苯丙氨酸殘基，位置63亮氨酸殘基，位置64脯氨酸殘基，位置65色氨酸殘基，位置66谷氨酰胺殘基，位置67甘氨酸殘基，以及d.位于第三區(qū)下游的第四區(qū)，從位置1的脯氨酸殘基開始，且其位置12為精氨酸殘基，位置14亮氨酸殘基，位置16苯丙氨酸殘基，位置20脯氨酸殘基，位置21天冬氨酸殘基，位置22酪氨酸殘基，位置41天冬氨酸殘基，位置45天冬氨酸殘基，以及位置46色氨酸殘基。全文摘要由酪蛋白激酶脅迫相關(guān)多肽(CKSRP)的編碼核酸轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物，其中核酸序列在植物中的表達(dá)使其相對(duì)于該植物野生型對(duì)環(huán)境脅迫的耐受性增強(qiáng)。本發(fā)明還提供了由該轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的包括種子在內(nèi)的農(nóng)產(chǎn)品。還提供了分離的CKSRP、分離的CKSRP編碼核酸以及含有后者的載體和宿主細(xì)胞。文檔編號(hào)C07K14/415GK101102665SQ200580046694公開日2008年1月9日申請(qǐng)日期2005年11月17日優(yōu)先權(quán)日2004年11月17日發(fā)明者A·雪莉,D·艾倫,L·V·米爾斯,N·范蒂倫,O·達(dá)寇斯塔伊希爾法,陳若英申請(qǐng)人:巴斯福植物科學(xué)有限公司