專(zhuān)利名稱(chēng)：一種酪蛋白抗凝血肽口服液的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種酪蛋白抗凝血肽口服液，具體涉及一種利用4酶混合酶解酪蛋白制備抗凝血肽口服液的方法，屬于醫(yī)藥、保健食品生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
世界上心腦血管疾病的死亡率一直居于前二位，全世界每年死于該類(lèi)疾病的人數(shù)超過(guò)1500萬(wàn)，其中血栓栓塞性心腦血管疾病發(fā)病率和死亡率最高。據(jù)衛(wèi)生部統(tǒng)計(jì),我國(guó)每年死于心腦血管疾病約200萬(wàn)人，超過(guò)全部死亡病人的50%。心腦血管疾病中有很大比例是血栓病,并以血栓病的發(fā)病率、致殘率和死亡率最高,其病因是血栓的形成。血栓性疾病治療的最有效辦法是溶栓治療，人類(lèi)每年需要為該類(lèi)疾病支出巨額藥費(fèi)。
導(dǎo)致血管內(nèi)血栓形成雖有多種因素，但凝血酶誘發(fā)的血液凝固是血栓形成的主要觸發(fā)機(jī)理。水蛭素是水蛭唾液腺內(nèi)一類(lèi)相對(duì)分子質(zhì)量約7 000的多肽，是凝血酶的特效抑制劑，它主要通過(guò)靠近肽鏈C-端的由3 4個(gè)酸性氨基酸組成的活性部位與凝血酶富含堿性氨基酸的活性部位特異性結(jié)合。試驗(yàn)結(jié)果表明，水蛭素既能防止新的血栓形成，還能使已形成的血栓溶解，對(duì)多種血栓疾病都具有極好的預(yù)防和治療作用。目前，有人嘗試使用水蛭素治療血栓栓塞性心腦血管疾病，發(fā)現(xiàn)口服給藥雖然方便，但因水蛭素被患者胃腸道水解，幾乎完全喪失了抗栓、溶栓的效果；雖然注射給藥療效很好，但反復(fù)注射會(huì)給患者帶來(lái)很大的痛苦和不便，難以適應(yīng)大多數(shù)慢性高凝態(tài)患者長(zhǎng)期抗凝治療的需要。而且水蛭飼養(yǎng)成本較高，高純度水蛭素提取工藝復(fù)雜、設(shè)備投入大，注射劑價(jià)格較高，患者承受的經(jīng)濟(jì)壓力大。酪蛋白是牛奶中的主要蛋白質(zhì)，由a、P、Y和K酪蛋白組成，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，經(jīng)酸化或凝乳酶處理后沉淀分離、干燥而得。研究發(fā)現(xiàn)，酪蛋白分子內(nèi)含有若干具有抗凝血酶活性的肽段，按生物化學(xué)理論，在蛋白酶的作用下，蛋白質(zhì)被水解為肽段，在合適的工藝條件下水解酪蛋白，可使這些肽段釋放出來(lái)，從而獲得功能與水蛭素類(lèi)似的抗凝血肽，但到目前為止尚無(wú)成功的報(bào)道，而且近年研究發(fā)現(xiàn)，2 3肽能被人體完全迅速吸收，4肽、5肽甚至6肽都能被動(dòng)物直接吸收。本發(fā)明以酪蛋白為原料，以木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶構(gòu)成的4酶混合水解系統(tǒng)進(jìn)行水解，使酪蛋白中的抗凝血肽釋放出來(lái)，從而獲得富含抗凝血肽的酶解液。以此為主要原料，加上一些輔料制成抗凝血肽口服液。本發(fā)明開(kāi)發(fā)出一種抗血栓及溶解血栓效果好、使用方便快捷、價(jià)格低、安全可靠的抗凝血肽口服產(chǎn)品，以消除血栓栓塞性心腦血管疾病患者痛苦。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種酪蛋白抗凝血肽口服液的制備方法，制得的抗凝血肽口服產(chǎn)品抗血栓及溶解血栓效果好、使用方便快捷、價(jià)格低、安全可靠。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明的目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下
一種酪蛋白抗凝血肽口服液的制備方法，包括以下幾個(gè)步驟(1)酪蛋白溶液的制備將酪蛋白與無(wú)菌水按3:16的比例調(diào)成糊狀，以300r mirT1攪拌，邊加熱邊加入2 mo I L—1食用氫氧化鈉溶液調(diào)至pH值為8 10，至50°C停止加熱，保溫；當(dāng)糊狀液體變得均勻、透明時(shí)，用2 mol .171食用鹽酸調(diào)至pH值為6 8，停止攪拌并在容器壁作好液面記號(hào)；
(2)4酶混合物調(diào)配按每千克酪蛋白分別添加木瓜蛋白酶(80萬(wàn)U/g) 8 12g、菠蘿蛋白酶(80萬(wàn)U/g)l(T20g、中性蛋白酶(40萬(wàn)U/g)10 15 g、堿性蛋白酶(40萬(wàn)U/g) l(T20g的比例，4種酶按需要量取出后，倒在同一個(gè)不銹鋼容器內(nèi)，用不銹鋼勺混合均勻，備用；
(3)4酶混合水解在4酶混合物內(nèi)加入相當(dāng)于其3倍質(zhì)量的50 °C無(wú)菌水，用不銹鋼勺混合均勻，倒入上述已預(yù)熱至50 "€的酪蛋白溶液中，以300 r mirT1邊攪拌邊加熱并開(kāi)始計(jì)時(shí)，維持酪蛋白溶液(50 ± I) V’酶解3 5h后，停止攪拌及加熱，往酪蛋白溶液中補(bǔ)加50°C無(wú)菌水至液面記號(hào)；
(4)滅酶將酶解完畢的酪蛋白溶液迅速升溫至100°C保持1(T15 min后，停止加熱放 冷至室溫，加無(wú)菌水至液面記號(hào)攪拌均勻；
(5)離心除雜將酪蛋白4酶混合水解液以10000 r ^irT1離心15 25 min，去除沉淀收集液相，得酪蛋白混合酶解液原液；
(6)調(diào)整酶解液活力將上述原液用無(wú)菌水調(diào)節(jié)至35(T360抗凝血酶活力單位(ATU) mL'得酪蛋白混合酶解液；
(7)調(diào)味及制成產(chǎn)品將酪蛋白混合酶解液、甜蜜素、檸檬酸按質(zhì)量以I000:0. ro. 3r3的比例混合，溶解、混合均勻，得酪蛋白抗凝血肽口服液原液。與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明的突出實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步是
(1)以4酶混合水解比單酶(ProteaseN)水解能顯著提高酶解效果，本發(fā)明3批酶解液3肽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均98. 53%，提高了約27. 53% ;抗凝血酶活力平均413. 29 ATU mL—1 ；3批酶解液有關(guān)數(shù)據(jù)如下表I。表I 3批酶解液原液中3肽占水解物總量的比例以及抗凝血酶活力強(qiáng)度
廳解液序 3 K占水解_總量的庾量分 抗_血靡活力< ATUniL-)
I號(hào)'
I9S 7!429；
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卜翁9S—53丨4U—3I
(2)在混合酶的作用下，酪蛋白被水解為肽段并釋放出來(lái)，從而獲得功能與水蛭素類(lèi)似的抗凝血肽，可被人體直接吸收，抑制凝血酶的作用，防止血栓的形成，與現(xiàn)有技術(shù)相比，成本低，效果好，無(wú)副作用。(3)開(kāi)發(fā)出了一種抗血栓及溶解血栓效果好、使用方便快捷、價(jià)格低、安全可靠的抗凝血肽口服產(chǎn)品,可以消除血栓栓塞性心腦血管疾病患者痛苦。
具體實(shí)施方式
下面通過(guò)實(shí)例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，這些實(shí)例僅用來(lái)說(shuō)明本發(fā)明，并不限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例I
I、按質(zhì)量比將酪蛋白與無(wú)菌水以3:16的比例調(diào)成糊狀，以300 r mirT1攪拌，邊加熱邊加入2 mo I L—1食用氫氧化鈉溶液調(diào)至pH值為8，至50°C停止加熱，保溫。當(dāng)糊狀液體變成均勻、透明的溶液后，用2 mol L—1食用鹽酸調(diào)至pH值為6，停止攪拌。2、根據(jù)以上酪蛋白質(zhì)量，按每千克分別加木瓜蛋白酶(80萬(wàn)U/g)8 g、菠蘿蛋白酶(80萬(wàn)U/g) 10g、中性蛋白酶(40萬(wàn)U/g) 10g、堿性蛋白酶(40萬(wàn)U/g) IOg的比例,4種酶按需要量取出后，倒在同一個(gè)不銹鋼容器內(nèi)，用不銹鋼勺混合均勻成為4酶混合物。按4酶混合物的質(zhì)量加入3倍的50 °C無(wú)菌水，用不銹鋼勺混合均勻，倒入上述已預(yù)熱至50 0C的酪蛋白溶液中，記錄液面位置。以300 r ^irT1邊攪拌邊加熱并開(kāi)始記時(shí)，維持酪蛋白 溶液(50±1) °C，酶解3h后，停止攪拌及加熱，補(bǔ)加50 1無(wú)菌水至液面的記號(hào)。3、將酶解完畢的酪蛋白混合酶解液迅速升溫至100 °C保持10 min后，停止加熱放冷至室溫，加無(wú)菌水至液面的記號(hào)，攪拌均勻。4、將步驟3所得的酪蛋白酶混合酶解液以10 000 r mirT1離心15 min,去除沉
淀收集液相，得酪蛋白混合酶解液原液。5、測(cè)定酪蛋白混合酶解液原液ATU，用無(wú)菌水稀釋至350 ATU -mL'得酪蛋白混合酶解液。6、上述酪蛋白混合酶解液與甜蜜素、檸檬酸按質(zhì)量以I 000:0. 1:1的比例混合，
溶解、混合均勻，得酪蛋白抗凝血肽口服液。7、酪蛋白抗凝血肽口服液液分裝、滅菌、檢測(cè)。經(jīng)實(shí)際測(cè)定，酪蛋白抗凝血肽口服液各項(xiàng)微生物指標(biāo)符合中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)保健(功能)食品通用標(biāo)準(zhǔn)(GB 16740-1997);抗凝血酶活力為350 ATU mL'8、包裝得到產(chǎn)品。實(shí)施例2
I、按質(zhì)量比將酪蛋白與無(wú)菌水以3:16的比例調(diào)成糊狀，以300 r mirT1攪拌，邊加熱邊加入2 mol L—1食用氫氧化鈉溶液調(diào)至pH值為10，至50 1停止加熱，保溫。當(dāng)糊狀液體變成均勻、透明的溶液后，用2 mol L—1食用鹽酸調(diào)至pH值為8，停止攪拌。2、根據(jù)以上酪蛋白質(zhì)量，按每千克分別加木瓜蛋白酶(80萬(wàn)U/g) 12g、菠蘿蛋白酶(80萬(wàn)U/g) 20 g、中性蛋白酶(40萬(wàn)U/g) 15g、堿性蛋白酶(40萬(wàn)U/g) 20 g的比例，4種酶按需要量取出后，倒在同一個(gè)不銹鋼容器內(nèi)，用不銹鋼勺混合均勻成為4酶混合物。按4酶混合物的質(zhì)量加入3倍的50 °C無(wú)菌水,用不銹鋼勺混合均勻，倒入上述已預(yù)熱至50°〇的酪蛋白溶液中，記錄液面位置。以300 r ^irT1邊攪拌邊加熱并開(kāi)始記時(shí)，維持酪蛋白溶液(50±1) °C，酶解5h后，停止攪拌及加熱，補(bǔ)加50 1無(wú)菌水至液面的記號(hào)。3、將酶解完畢的酪蛋白混合酶解液迅速升溫至100 °C保持15min后，停止加熱放冷至室溫，加無(wú)菌水至液面的記號(hào)，攪拌均勻。4、將步驟3所得的酪蛋白酶混合酶解液以10 000 r mirT1離心25 min,去除沉
淀收集液相，得酪蛋白混合酶解液原液。5、測(cè)定酪蛋白混合酶解液原液ATU，用無(wú)菌水稀釋至360 ATU -mL'得酪蛋白混合酶解液。6、上述酪蛋白混合酶解液與甜蜜素、檸檬酸按質(zhì)量以I 000:0. 3:3的比例混合，溶解、混合均勻，得酪蛋白抗凝血肽口服液。7、酪蛋白抗凝血肽口服液液分裝、滅菌、檢測(cè)。經(jīng)實(shí)際測(cè)定，酪蛋白抗凝血肽口服液各項(xiàng)微生物指標(biāo)符合中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)保健(功能)食品通用標(biāo)準(zhǔn)(GB 16740-1997);抗凝血酶活力為360 ATU mL'8、包裝得到產(chǎn)品。實(shí)施例3
I、按質(zhì)量比將酪蛋白與無(wú)菌水以3:16的比例調(diào)成糊狀，以300 r mirT1攪拌，邊加熱邊加入2 mol -r1食用氫氧化鈉溶液調(diào)至pH值為9. 0，至50 1停止加熱，保溫。當(dāng)糊狀液體變成均勻、透明的溶液后，用2 mol L—1食用鹽酸調(diào)至pH值為7. 0，停止攪拌。 2、根據(jù)以上酪蛋白質(zhì)量，按每千克分別加木瓜蛋白酶(80萬(wàn)U/g) 10 g、菠蘿蛋白酶(80萬(wàn)U/g) 15 g、中性蛋白酶(40萬(wàn)U/g) 12 g、堿性蛋白酶(40萬(wàn)U/g) 15 g的比例，4種酶按需要量取出后，倒在同一個(gè)不銹鋼容器內(nèi)，用不銹鋼勺混合均勻成為4酶混合物。按4酶混合物的質(zhì)量加入3倍的50 °C無(wú)菌水,用不銹鋼勺混合均勻,倒入上述已預(yù)熱至50°〇的酪蛋白溶液中，記錄液面位置。以300 r ^irT1邊攪拌邊加熱并開(kāi)始記時(shí)，維持酪蛋白溶液(50±1) °C，酶解4 h后，停止攪拌及加熱，補(bǔ)加50 1無(wú)菌水至液面的記號(hào)。3、將酶解完畢的酪蛋白混合酶解液迅速升溫至100 °C保持10 min后，停止加熱放冷至室溫，加無(wú)菌水至液面的記號(hào)，攪拌均勻。4、將步驟3所得的酪蛋白酶混合酶解液以10 000 r mirT1離心20 min,去除沉
淀收集液相，得酪蛋白混合酶解液原液。5、測(cè)定酪蛋白混合酶解液原液ATU，用無(wú)菌水稀釋至350 ATU 得酪蛋白混合酶解液。6、上述酪蛋白混合酶解液與甜蜜素、檸檬酸按質(zhì)量以I 000:0. 2:2的比例混合，
溶解、混合均勻，得酪蛋白抗凝血肽口服液。7、酪蛋白抗凝血肽口服液液分裝、滅菌、檢測(cè)。經(jīng)實(shí)際測(cè)定，酪蛋白抗凝血肽口服液各項(xiàng)微生物指標(biāo)符合中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)保健(功能)食品通用標(biāo)準(zhǔn)(GB 16740-1997);抗凝血酶活力為350ATU mL'8、包裝得到產(chǎn)品。實(shí)施例4
I、按質(zhì)量比將酪蛋白與無(wú)菌水以3:16的比例調(diào)成糊狀，以300 r mirT1攪拌，邊加熱邊加入2 mol L—1食用氫氧化鈉溶液調(diào)至pH值為9. 0，至50 1停止加熱，保溫。當(dāng)糊狀液體變成均勻、透明的溶液后，用2 mol L—1食用鹽酸調(diào)至pH值為7.0，停止攪拌。2、根據(jù)以上酪蛋白質(zhì)量，按每千克分別加木瓜蛋白酶(80萬(wàn)U/g)9. 5 g、菠蘿蛋白酶(80萬(wàn)U/g) 15 g、中性蛋白酶(40萬(wàn)U/g) 12. 5 g、堿性蛋白酶(40萬(wàn)U/g) 15. 5 g的比例，4種酶按需要量取出后，倒在同一個(gè)不銹鋼容器內(nèi)，用不銹鋼勺混合均勻成為4酶混合物。按4酶混合物的質(zhì)量加入3倍的50 °C無(wú)菌水，用不銹鋼勺混合均勻，倒入上述已預(yù)熱至50 "€的酪蛋白溶液中，記錄液面位置。以300 r mirT1邊攪拌邊加熱并開(kāi)始記時(shí),維持酪蛋白溶液(50±1) °C，酶解4 h后，停止攪拌及加熱，補(bǔ)加50 °〇無(wú)菌水至液面的記號(hào)。
3、將酶解完畢的酪蛋白混合酶解液迅速升溫至100 °C保持10 min后，停止加熱放冷至室溫，加無(wú)菌水至液面的記號(hào)，攪拌均勻。4、將步驟3所得的酪蛋白酶混合酶解液以10 000 r mirT1離心20 min,去除沉
淀收集液相，得酪蛋白混合酶解液原液。5、測(cè)定酪蛋白混合酶解液原液ATU，用無(wú)菌水稀釋至360 ATU 得酪蛋白混合酶解液。6、上述酪蛋白混合酶解液與甜蜜素、檸檬酸按質(zhì)量以I 000:0. 2:2的比例混合，
溶解、混合均勻，得酪蛋白抗凝血肽口服液。
7、酪蛋白抗凝血肽口服液液分裝、滅菌、檢測(cè)。經(jīng)實(shí)際測(cè)定，酪蛋白抗凝血肽口服液各項(xiàng)微生物指標(biāo)符合中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)保健(功能)食品通用標(biāo)準(zhǔn)(GB 16740-1997);抗凝血酶活力為360 ATU mL'8、包裝得到產(chǎn)品。
權(quán)利要求
1.一種酪蛋白抗凝血肽口服液的制備方法，其特征在于包括如下步驟 (1)酪蛋白溶液的制備將酪蛋白與無(wú)菌水按比例調(diào)成糊狀，以300r miiT1攪拌，邊加熱邊加入2 mol .171食用氫氧化鈉溶液調(diào)至pH值為8 10，至50°C停止加熱，保溫；當(dāng)糊狀液體變得均勻、透明時(shí)，用2 mol .I/1食用鹽酸調(diào)至pH值為6 8，停止攪拌并在容器壁作好液面記號(hào)； (2)4酶混合物調(diào)配按每千克酪蛋白分別添加木瓜蛋白酶8 12g、菠蘿蛋白酶l(T20g、中性蛋白酶l(Tl5g、堿性蛋白酶15 20g的比例，4種酶按需要量取出后，倒在同一個(gè)不銹鋼容器內(nèi)，用不銹鋼勺混合均勻，備用； (3)4酶混合水解在4酶混合物內(nèi)加入相當(dāng)于其3倍質(zhì)量的50°C無(wú)菌水，用不銹鋼勺混合均勻，倒入步驟(I)所述已預(yù)熱至50°C的酪蛋白溶液中，以300 r mirT1邊攪拌邊加熱并開(kāi)始記時(shí)，維持酪蛋白溶液(50±1) °C，酶解T5 h后，停止攪拌及加熱，往酪蛋白溶液中補(bǔ)加50°C無(wú)菌水至液面記號(hào)； (4)滅酶將酶解完畢的酪蛋白溶液迅速升溫至100°C保持1(T15 min后，停止加熱放冷至室溫，加無(wú)菌水至液面記號(hào)攪拌均勻； (5)離心除雜將酪蛋白4酶混合水解液以10000 r ^irT1離心15 25 min，去除沉淀收集液相，得酪蛋白混合酶解液原液； (6)調(diào)整酶解液活力步驟(6)所得原液用無(wú)菌水調(diào)節(jié)至35(T360抗凝血酶活力單位(ATU) mL'測(cè)定酪蛋白混合酶解液原液的ATU，得酪蛋白混合酶解液； (7)調(diào)味及制成產(chǎn)品將酪蛋白混合酶解液、甜蜜素、檸檬酸按質(zhì)量以I000:0. ro. 3r3的比例混合，溶解、混合均勻，得酪蛋白抗凝血肽口服液原液。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種酪蛋白抗凝血肽口服液的制備方法，其特征在于步驟(I)所述的比例為酪蛋白與無(wú)菌水按3:16的重量比例調(diào)成糊狀。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種酪蛋白抗凝血肽口服液的制備方法，其特征在于所述的木瓜蛋白酶的酶活力為80萬(wàn)U/g。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種酪蛋白抗凝血肽口服液的制備方法，其特征在于所述的菠蘿蛋白酶的酶活力為80萬(wàn)U/g。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種酪蛋白抗凝血肽口服液的制備方法，其特征在于所述的中性蛋白酶的酶活力為40萬(wàn)U/g。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種酪蛋白抗凝血肽口服液的制備方法，其特征在于所述的堿性蛋白酶的酶活力為40萬(wàn)U/g。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種酪蛋白抗凝血肽口服液的制備方法，包括酪蛋白溶液的制備、4酶混合物調(diào)配、4酶混合水解、滅酶、離心除雜、調(diào)整酶解液活力、調(diào)味及制成產(chǎn)品幾個(gè)步驟，具體是將酪蛋白與無(wú)菌水按質(zhì)量比3:16混合調(diào)成糊狀，用氫氧化鈉溶液調(diào)至pH值為8~10，加熱使酪蛋白充分溶解，用食用鹽酸降低pH值為6~8；加入木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶組成的4酶混合物酶解酪蛋白；酶解完成之后滅活蛋白酶，冷卻至室溫；酶解液離心除雜后，用無(wú)菌水調(diào)節(jié)酶解液活力并加適量甜蜜素、檸檬酸制成產(chǎn)品；本方法工藝簡(jiǎn)單易行，生產(chǎn)周期較短；制得的抗凝血肽口服產(chǎn)品抗血栓及溶解血栓效果好、使用方便快捷、價(jià)格低、安全可靠。
文檔編號(hào)A61P7/02GK102861315SQ20121039806
公開(kāi)日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2012年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月19日
發(fā)明者方富永, 苗艷麗, 王宏波, 蘆志剛, 廖艷, 宋文東 申請(qǐng)人:廣東海洋大學(xué)