專利名稱：一種牙本質(zhì)磷蛋白的生化檢測方法及裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于電化學(xué)酶聯(lián)免疫測試技術(shù)領(lǐng)域。特別涉及牙根吸收早期診斷的一種牙 本質(zhì)磷蛋白的生化檢測方法及裝置。
背景技術(shù)：
大多數(shù)患者在正畸過程中都會出現(xiàn)輕度牙根吸收，矯治結(jié)束后不會出現(xiàn)牙齒松 動。但是少數(shù)患者會出現(xiàn)嚴(yán)重的牙根吸收，牙齒會出現(xiàn)松動甚至脫落；正畸牙根吸收是正 畸治療的主要并發(fā)癥。如果能夠及早診斷出牙根吸收，可以防止患者牙齒松動加重或脫落。 目前主要使用曲面斷層、根尖片、CT等影像學(xué)方法診斷牙根吸收，迫切需要尋找一種更為敏 感、安全、及時(shí)的新方法實(shí)現(xiàn)對牙根吸收的早期診斷、早期預(yù)防。無創(chuàng)性生化方法是近年來 牙根吸收診斷方法的新方向。主要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)是牙根吸收患者口腔齦溝液中牙本質(zhì)磷蛋白 抗原的量會增加，通過酶聯(lián)免疫檢測法(ELISA)測定其中牙本質(zhì)磷蛋白(DPP)含量變化可 間接診斷牙根吸收。與傳統(tǒng)的影像學(xué)方法相比，ELISA法具有敏感性高、輻射損傷性小、可 以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)控等優(yōu)點(diǎn)，在牙根吸收的臨床診斷中具有良好的應(yīng)用前景。目前主要使用的 分光光度酶聯(lián)免疫法檢測牙本質(zhì)磷蛋白含量變化，該方法原理簡單，儀器價(jià)格便宜，可以目 測得到結(jié)果，并且儀器的自動化程度高，是一種成熟的檢測手段。但是，由于齦溝液樣品量 少，待測液中的有效成分更是希罕，很難保證酶聯(lián)板的均一性和透光性，使用分光光度法限 制了測定的精密度和檢測限，容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果，目前尚沒有解決上述問題的有效方法。微納米尺度的微電極，具有許多常規(guī)電極所不能比擬的電學(xué)特性，如傳質(zhì)快、電流 密度大、反應(yīng)活性高，此外還具有奧姆降低、時(shí)間常數(shù)小等特點(diǎn)，在納米生物傳感器、微量痕 量檢測、單細(xì)胞生化分析等領(lǐng)域顯示出巨大的應(yīng)用潛力。但是在牙本質(zhì)磷蛋白生化檢測領(lǐng) 域尚無獲得應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對傳統(tǒng)分光光度酶聯(lián)免疫方法檢測限低、精度差，無法滿足牙 本質(zhì)磷蛋白的精確檢測要求而提供一種基于三維微柱陣列結(jié)構(gòu)工作電極的牙本質(zhì)磷蛋白 檢測裝置及檢測方法。一種牙本質(zhì)磷蛋白的生化檢測裝置，該裝置由電解池1，外加電源2與檢測儀表3 連接構(gòu)成，其特征在于，所述生化檢測裝置的工作電極6為具有三維微柱陣列結(jié)構(gòu)的金屬 電極；參比電極7為具有恒定電位的飽和甘汞電極；輔助電極8為鉬電極，輔助電極8通過 精密電阻9與外加電源2連接；檢測儀表3由示波管10、垂直偏向放大器11和水平偏向放 大器12構(gòu)成，其中微柱的材質(zhì)為金、銀、鎳或鉬。所述電解池中聚苯乙烯容器4內(nèi)裝入待測樣品溶液5，由工作電極6、參比電極7 以及輔助電極8構(gòu)成的三電極體系的下部浸泡在待測樣品溶液5液面以下，外加電源2與 工作電極6及輔助電極8連接并在兩電極之間產(chǎn)生一個(gè)-0. 78V電位，相對于參比電極為0 而言；垂直偏向放大器11則連接于電阻9的兩端，可測量流過電阻9的電流大小，水平偏向放大器12分別與工作電極6及參比電極7連接，測量二者之間的電壓變化。—種牙本質(zhì)磷蛋白的生化檢測方法，其特征在于，所述牙本質(zhì)磷蛋白的生化檢測 方法是在牙本質(zhì)磷蛋白的生化檢測裝置中進(jìn)行的，包括牙本質(zhì)磷蛋白的提取及純化和電化 學(xué)“雙抗體夾心”酶聯(lián)免疫方法檢測牙本質(zhì)磷蛋白的含量兩個(gè)步驟；1)牙本質(zhì)磷蛋白的提取和純化采用“濾紙吸著法”提取患者口腔齦溝液中的牙 本質(zhì)磷蛋白，并采用“蛋白提取液純化法”提純?nèi)忧埃紫惹鍧嵖谇谎烂娌⒋蹈蓪⑽痹?紙尖端緊貼于牙齒的頰舌側(cè)牙面的齦溝邊緣，放置30秒以上，取出后放入離心密封管作待 測樣品，并于_75°C保存；待測樣品提純是在待測樣品中加入15 μ 1蛋白提取液，冰浴25分 鐘，于4°C下15000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘后，提取30 μ 1上清液，加入等量蛋白上樣液，煮沸 并冷卻，于-20°C保存待測；其中蛋白提取液配制是先以300 500ml蒸餾水溶解60. 57g三羥甲基氨基甲烷，加 入HCl后，用濃度為lmol/L的HCl或濃度為lmol/L的NaOH，將pH調(diào)至7 8，最后蒸餾水 加至1000ml，得到濃度為0. 5mol/L的蛋白提取液，在4°C冰箱中保存?zhèn)溆?；蛋白上樣液配制是先量?20ml上述0. 5mol/L蛋白提取液，依次加入200ml質(zhì) 量濃度比為10%的十二烷基磺酸鈉水溶液，500ml品質(zhì)濃度比為50%的甘油水溶液，50ml 的2-巰基乙醇，IOOml品質(zhì)濃度比為的溴酚蘭水溶液，最后蒸餾水加至1000ml，在4°C 冰箱中保存?zhèn)溆茫?)電化學(xué)酶聯(lián)免疫方法檢測牙本質(zhì)磷蛋白含量a.基于“雙抗體夾心法”酶聯(lián)免疫反應(yīng)及“電化學(xué)”檢測法相結(jié)合精確測定牙本質(zhì) 磷蛋白的精確含量；酶聯(lián)免疫反應(yīng)過程為將兔抗牙本質(zhì)磷蛋白抗體吸附到以聚苯乙烯容器 作為固相載體上，孵育后洗滌除去未吸附的抗體；加入含有待測牙本質(zhì)磷蛋白的抗原樣品， 使之與吸附于固相載體上的兔抗牙本質(zhì)磷蛋白抗體反應(yīng)，孵育后洗滌除去未反應(yīng)的樣品； 加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗牙本質(zhì)磷蛋白抗體與待測牙本質(zhì)磷蛋白的抗原反應(yīng)，形成 所謂“雙抗體夾心抗原”結(jié)構(gòu)，此時(shí)酶與雙抗體夾心抗原之間形成等量關(guān)系；最后加入主要 成分包括鄰苯二胺和過氧化氫的底物，在酶催化下，底物鄰苯二胺和過氧化氫反應(yīng)生成可 進(jìn)行電化學(xué)方法精確測定的待測樣品二氨基吩嗪。b. “電化學(xué)”測試法為包括鄰苯二胺和過氧化氫的底物溶液在辣根過氧化物酶催 化下，過氧化氫將鄰苯二胺氧化生成產(chǎn)物二氨基吩嗪，二氨基吩嗪在三維微柱陣列結(jié)構(gòu)工 作電極表面上發(fā)生還原反應(yīng)，其反應(yīng)電流的大小與二氨基吩嗪的量呈正比定量關(guān)系，進(jìn)而 與辣根過氧化物酶的量呈I = 34. 6-5. 861og2X線性定量關(guān)系，式中I為反應(yīng)電流的大小， 單位為微安μ A，X為辣根過氧化物酶的含量，單位為納克每毫升ng/ml，則通過測定上述反 應(yīng)電流的大小，測定二氨基吩嗪的量，進(jìn)而測定辣根過氧化物酶的量，進(jìn)而測定待測樣品中 牙本質(zhì)磷蛋白的量。所述孵育后洗滌除去未吸附的抗體是用包被緩沖液將兔抗牙本質(zhì)磷蛋白抗體 (如E92436HU，武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司)稀釋至蛋白質(zhì)含量為1 10μ g/ml，優(yōu)選 5ug/mL·在聚苯乙烯容器中加0. 1ml，4°C過夜，以使抗體與固相載體充分吸附。次日，棄去 容器內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液沖洗三次，每次三分鐘，洗去未發(fā)生吸附的抗體；其中包被緩沖 液為PH9. 6的碳酸鹽緩沖液，其配制方法為1. 59g碳酸鈉Na2CO3與2. 93g碳酸氫鈉NaHCO3 溶解于蒸餾水中并稀釋至IOOOml配制而成。
所述孵育后洗滌除去未反應(yīng)的樣品是于聚苯乙烯容器中加0. Iml牛血清蛋白稀 釋液，稀釋的待測牙本質(zhì)磷蛋白抗原樣品，于37°C孵育1小時(shí)，使固相載體上的兔抗牙本質(zhì) 磷蛋白抗體與待測牙本質(zhì)磷蛋白抗原充分結(jié)合。用洗滌緩沖沖洗三次，每次三分鐘，洗去待 測牙本質(zhì)磷蛋白抗原樣品中的未反應(yīng)的樣品；其中牛血清蛋白稀釋液是由0. Ig牛血清蛋 白溶解于IOOOml蒸餾水中稀釋配制而成。所述形成所謂“雙抗體夾心抗原”結(jié)構(gòu)是于聚苯乙烯容器中加入0. Iml牛血清蛋 白稀釋液稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記牙本質(zhì)磷蛋白抗體，于37°C孵育1小時(shí)，使酶標(biāo)牙本 質(zhì)磷蛋白抗體與牙本質(zhì)磷蛋白抗原充分結(jié)合，形成所謂“雙抗體夾心”結(jié)構(gòu)，用洗滌緩沖液 沖洗三次，每次三分鐘，洗去未反應(yīng)成分。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)對齦溝液中牙本質(zhì)磷蛋白變化規(guī)律的精確 檢測，基于牙本質(zhì)磷蛋白含量與牙根吸收發(fā)生程度之間的必然聯(lián)系，可以實(shí)現(xiàn)對患者牙根 吸收的早期診斷；本檢測方法具有操作簡單、靈敏度高、無輻射損傷等優(yōu)點(diǎn)，在牙根吸收的 臨床診斷中具有良好的應(yīng)用前景。


圖1是電化學(xué)酶聯(lián)免疫法檢測裝置結(jié)構(gòu)示意圖。圖2是具有三維微柱陣列結(jié)構(gòu)的金屬工作電極結(jié)構(gòu)示意圖。圖3是牙本質(zhì)磷蛋白“雙抗體夾心法”酶聯(lián)免疫反應(yīng)過程示意圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提供一種牙本質(zhì)磷蛋白的檢測方法及其裝置。下面將結(jié)合附圖和實(shí)施例來 詳細(xì)說明本發(fā)明。圖1為電化學(xué)酶聯(lián)免疫法檢測裝置，該裝置包括了電解池1，外加電源2與檢測儀 表3連接構(gòu)成。在作為固相載體的聚苯乙烯容器4內(nèi)裝入待測樣品溶液5，工作電極6、參 比電極7以及輔助電極8構(gòu)成的三電極體系，三電極體系下部浸泡在待測樣品溶液5液面 以下，其中工作電極6為具有三維微柱陣列結(jié)構(gòu)的金屬電極；參比電極7為具有恒定電位的 飽和甘汞電極；輔助電極8為鉬電極。輔助電極8通過精密電阻9與外加電源2連接。檢 測儀表3由示波管10、垂直偏向放大器11和水平偏向放大器12構(gòu)成。外加電源2與工作 電極6及輔助電極8連接并在兩電極之間產(chǎn)生一個(gè)電壓。垂直偏向放大器11則連接于電 阻9的兩端，可測量流過電阻9的電流大小。水平偏向放大器12分別與工作電極6及參比 電極7連接，可測量二者之間的電壓變化。所述聚苯乙烯容器4同時(shí)作為固相載體，聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性 能，蛋白質(zhì)抗原和抗體吸附其上后保留原來的免疫活性，待測牙本質(zhì)磷蛋白、抗體、酶標(biāo)記 抗體都吸附固定在固相載體上。所述外加電源2在工作電極6和參比電極7之間由計(jì)算機(jī)控制施加一個(gè)電壓，由 此精確控制工作電極6的-0. 78V電位處(相對于參比電極為0)，在此電位下二氨基吩嗪在 工作電極6的微柱表面發(fā)生電化學(xué)還原反應(yīng)，檢測儀表3記錄工作電極6，微柱表面二氨基 吩嗪發(fā)生還原反應(yīng)而產(chǎn)生的電流。圖2是具有三維微柱陣列結(jié)構(gòu)的金屬工作電極。微柱直徑為20微米-100微米，優(yōu)選50微米，微柱高度為100微米-1000微米，優(yōu)選500微米。微柱柱心間距為100微米-500 微米，優(yōu)選200微米。微柱材質(zhì)為金、銀、鎳或鉬，優(yōu)選鉬。圖3為牙本質(zhì)磷蛋白酶聯(lián)免疫反應(yīng)過程示意圖，將兔抗牙本質(zhì)磷蛋白抗體13吸附 到聚苯乙烯容器作為固相載體4上，孵育后洗滌除去未吸附的抗體；加入含有待測牙本質(zhì) 磷蛋白(抗原)15樣品，使之與吸附于固相載體4上的特異性抗體13反應(yīng)，孵育后洗滌除 去未反應(yīng)的樣品；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的特異性抗體16與待測抗原15反應(yīng)，形成所 謂“雙抗體夾心抗原”結(jié)構(gòu)，此時(shí)酶與抗原之間形成定量關(guān)系；最后加入包含過氧化氫17和 鄰苯二胺18的底物，在酶催化下，過氧化氫17和鄰苯二胺18反應(yīng)生成可進(jìn)行電化學(xué)方法 精確測定產(chǎn)物，酶的量與產(chǎn)物的量呈正比定量關(guān)系。產(chǎn)物的量可以通過圖1中所示的裝置 及方法加以測定。進(jìn)而可以測定待測樣品中牙本質(zhì)磷蛋白的含量并診斷牙根吸收發(fā)生的程 度。本發(fā)明的方法包括牙本質(zhì)磷蛋白的提取及純化。電化學(xué)“雙抗體夾心”酶聯(lián)免疫 方法檢測牙本質(zhì)磷蛋白的含量。1)牙本質(zhì)磷蛋白的提取和純化采用“濾紙吸著法”提取患者口腔齦溝液中的牙 本質(zhì)磷蛋白，并采用“蛋白提取液純化法”提純?nèi)忧?，首先清潔口腔牙面并吹干將吸潮?紙尖端緊貼于牙齒的頰舌側(cè)牙面的齦溝邊緣，放置30秒以上，取出后放入離心密封管作待 測樣品，并于_75°C保存；待測樣品提純是在待測樣品中加入15 μ 1蛋白提取液，冰浴25分 鐘，于4°C下15000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘后，提取30 μ 1上清液，加入等量蛋白上樣液，煮沸 并冷卻，于-20°C保存待測；其中蛋白提取液配制是先以300 500ml蒸餾水溶解60. 57g三羥甲基氨基甲烷，加 入HCl后，用濃度為lmol/L的HCl或濃度為lmol/L的NaOH，將pH調(diào)至7 8，最后蒸餾水 加至1000ml，得到濃度為0. 5mol/L的蛋白提取液，在4°C冰箱中保存?zhèn)溆?；蛋白上樣液配制是先量?20ml上述0. 5mol/L蛋白提取液，依次加入200ml質(zhì) 量濃度比為10%的十二烷基磺酸鈉水溶液，500ml品質(zhì)濃度比為50%的甘油水溶液，50ml 的2-巰基乙醇，IOOml品質(zhì)濃度比為的溴酚蘭水溶液，最后蒸餾水加至1000ml，在4°C 冰箱中保存?zhèn)溆?；所述齦溝液中牙本質(zhì)磷蛋白的純化方法為在待測樣品中加入20μ 1蛋白提取 液，冰浴20 30分鐘，于4°C下15000轉(zhuǎn)/分鐘(r/min)離心10分鐘后，提取20 μ 1上清 液，加入等量蛋白上樣液，煮沸并冷卻，于-20°C保存待測。所述蛋白提取液配制方法先以少量蒸餾水(300 500ml)溶解60. 57g Tris (三 羥甲基氨基甲烷)，加入HCl后，用HCl (lmol/L)或Na0H(lmol/L)將pH調(diào)至7. 6，最后蒸餾 水加至1000ml，Tis濃度為0. 5mol/L。此液為儲備液，4°C冰箱中保存。所述蛋白上樣液配制方法先量取120ml上述0. 5mol/L蛋白提取液，依次加入 200ml質(zhì)量濃度比為10%的SDS (十二烷基磺酸鈉)水溶液，500ml品質(zhì)濃度比為50%的甘 油水溶液，50ml的2-巰基乙醇，IOOml品質(zhì)濃度比為1 %的溴酚蘭水溶液，最后蒸餾水加至 1000ml。此液為儲備液，4°C冰箱中保存。電化學(xué)“雙抗體夾心”酶聯(lián)免疫方法檢測牙本質(zhì)磷蛋白含量包括基于“雙抗體夾 心法”酶聯(lián)免疫反應(yīng)及“電化學(xué)”檢測法相結(jié)合精確測定牙本質(zhì)磷蛋白的精確含量。電化學(xué)“雙抗體夾心”酶聯(lián)免疫方法反應(yīng)過程為用包被緩沖液將兔抗牙本質(zhì)磷蛋白抗體13(如如E92436HU，武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司)稀釋至蛋白質(zhì)含量為1 10μ g/ml，優(yōu)選5μ g/ml。在聚苯乙烯容器中加0. lml，4°C過夜，以使抗體與固相載體充分 吸附。次日，棄去容器內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液沖洗三次，每次三分鐘，洗去未發(fā)生吸附的抗 體，于聚苯乙烯容器中加0. Iml稀釋液(如圖3所示)適當(dāng)稀釋的待測牙本質(zhì)磷蛋白抗原 樣品15，于37°C孵育1小時(shí)，使固相載體上的兔抗牙本質(zhì)磷蛋白抗體13與待測樣品中的牙 本質(zhì)磷蛋白抗原15充分結(jié)合；用洗滌緩沖沖洗三次，每次三分鐘，洗去待測樣品中的其它 成分(如圖3所示)；所述稀釋液為牛血清蛋白稀釋液，其配制方法為將0. Ig牛血清蛋白 溶解于蒸餾水中并稀釋至IOOOml中配制而成。于聚苯乙烯容器中加入0. Iml牛血清蛋白 稀釋液稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記牙本質(zhì)磷蛋白抗體16，于37°C孵育1小時(shí)，使酶標(biāo)牙本 質(zhì)磷蛋白抗體16與牙本質(zhì)磷蛋白抗原15充分結(jié)合，形成所謂“雙抗體夾心”結(jié)構(gòu)，用洗滌 緩沖液沖洗三次，每次三分鐘，洗去其它成分，備用(如圖3所示)，此時(shí)所形成“雙抗體夾 心”結(jié)構(gòu)中待測牙本質(zhì)磷蛋白抗原與辣根過氧化物酶之間形成定量關(guān)系。將工作電極6、參 比電極7以及輔助電極8插入反應(yīng)液中，于-0. 78V電位(相比于參比電極7)測定并記錄 工作電極6表面反應(yīng)峰電流大小，進(jìn)而根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算辣根過氧化物酶量的多少。所述包被緩沖液為PH9. 6的碳酸鹽緩沖液，其配制方法為1. 59g碳酸鈉Na2CO3與 2. 93g碳酸氫鈉NaHCO3溶解于蒸餾水中并稀釋至IOOOml配制而成。上述酶聯(lián)免疫反應(yīng)過 程中洗滌緩沖液為PH7. 4的磷酸鹽緩沖液，其配制方法為0. 2g磷酸二氫鉀KH2PO4, 2. 9g磷 酸二氫鈉，8g氯化鈉NaCl，0. 2g KC1，0. 5ml吐溫Tween-20，混合溶解于蒸餾水并稀釋至 IOOOml中配制而成。電化學(xué)方法檢測牙本質(zhì)磷蛋白的含量包括電化學(xué)檢測體系的建立以及在此基礎(chǔ) 上牙本質(zhì)磷蛋白含量的測定，電化學(xué)檢測體系為鄰苯二胺_過氧化氫_辣根過氧化物酶檢 測體系。過氧化氫17可以氧化鄰苯二胺18生成二氨基吩嗪，該反應(yīng)十分緩慢，產(chǎn)物微量， 而在辣根過氧化物酶催化下，該反應(yīng)速度大大加快，生成大量產(chǎn)物二氨基吩嗪。所生成二氨 基吩嗪可以在工作電極6上于-0. 78V (相對于參比電極7)發(fā)生還原反應(yīng)產(chǎn)生還原電流，并 相應(yīng)在檢測儀表3的示波管10上記錄下一個(gè)靈敏的電流峰。辣根過氧化物酶含量與電流 峰大小在0. 04X10_9-4X10_9g/ml濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)正比定量關(guān)系，通過該方法可以精確測 定辣根過氧化物酶含量。在IOml的比色管中加入少量蒸餾水，依次加入1 X 10_2mol/L的鄰苯二胺溶液1ml， 0. lmol/L的PH = 4. 8的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液l_3ml (優(yōu)選2ml)，1 X lO-W/L過氧化氫 2-5ml (優(yōu)選4ml)，以及不同量的標(biāo)準(zhǔn)辣根過氧化物酶，稀釋至刻度，在室溫下反應(yīng)60分鐘。 取此溶液3ml于另外一只IOml比色管中，計(jì)入PH = 9的B-R緩沖溶液2_5ml (優(yōu)選3ml)， 搖勻并稀釋至IOml標(biāo)準(zhǔn)刻度，將IOml最終配制完成溶液倒入容器中，反應(yīng)1小時(shí)，將工作 電極6、參比電極7以及輔助電極8插入反應(yīng)液中，于-0. 78V電位處相對于參比電極為0， 測定并記錄工作電極6表面反應(yīng)峰電流大小。以標(biāo)準(zhǔn)品辣根過氧化物酶濃度為橫坐標(biāo)，以 反應(yīng)峰電流大小為縱坐標(biāo)，生成標(biāo)準(zhǔn)曲線和直線回歸方程。以標(biāo)準(zhǔn)品辣根過氧化物酶濃度為橫坐標(biāo)，以反應(yīng)峰電流大小為縱坐標(biāo)，可以生成 標(biāo)準(zhǔn)曲線和直線回歸方程，根據(jù)公式I = 34. 6-5. 861og2X，可計(jì)算未知樣品的濃度，式中I 為反應(yīng)電流的大小，單位為微安μ A，X為辣根過氧化物酶的含量，單位為納克每毫升ng/ ml ；通過上述方法測定辣根過氧化物酶檢測限可達(dá)到0. 02X 10_9g/mL。
實(shí)施例上述電化學(xué)檢測體系的待測樣品中牙本質(zhì)磷蛋白含量測定方法是在IOml的比色管中加入少量蒸餾水，依次加入1 X 10_2mol/L的鄰苯二胺溶液1ml， 0. lmol/L的PH = 4. 8的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液2ml，1 X 10_3mol/L過氧化氧4ml，稀釋至 IOml標(biāo)準(zhǔn)刻度，在室溫下反應(yīng)60分鐘。取此溶液3ml于另外一只IOml比色管中，計(jì)入PH =9的B-R緩沖溶液3ml，搖勻并稀釋至IOml標(biāo)準(zhǔn)刻度，將IOml最終配制完成溶液倒入前 述完成酶聯(lián)免疫反應(yīng)帶有“雙抗體夾心結(jié)構(gòu)”的聚苯乙烯容器中，反應(yīng)1小時(shí)，將工作電極 6、參比電極7以及輔助電極8插入反應(yīng)液中(如圖1所示)，于-0. 78V電位(相比于參比 電極7)測定并記錄工作電極6表面反應(yīng)峰電流大小，進(jìn)而根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算辣根過氧化物 酶量的多少。進(jìn)而根據(jù)辣根過氧化物酶與牙本質(zhì)磷蛋白抗原含量之間的定量關(guān)系，根據(jù)公 式I = 34. 6-5. 861og2X，計(jì)算待測樣品中牙本質(zhì)磷蛋白含量；由于待測樣品中辣根過氧化 物酶的量與牙本質(zhì)磷蛋白抗原的量呈定量關(guān)系，因此該方法可精確測定齦溝液中牙本質(zhì)磷 蛋白的含量。上述PH = 5. 7的B-R緩沖溶液配制方法為，在IOOml三酸混合液(磷酸、醋酸、硼 酸，濃度均為0. 04mol/L)中，加入40ml的0. 2mol/L NaOH,即得。上述PH = 8的B-R緩沖溶液配制方法為，在IOOml三酸混合液(磷酸、醋酸、硼酸， 濃度均為0. 04mol/L)中，加入60ml的0. 2mol/L NaOH,即得。上述結(jié)合附圖及實(shí)施例對本發(fā)明的進(jìn)一步說明、理解，并不構(gòu)成對本發(fā)明的不當(dāng) 限定。需要說明的是，在不沖突的情況下，本申請中的實(shí)施例及實(shí)施例中的特征可以相互組
I=I O
權(quán)利要求
一種牙本質(zhì)磷蛋白的生化檢測裝置，該裝置由電解池(1)，外加電源(2)與檢測儀表(3)連接構(gòu)成，其特征在于，所述生化檢測裝置的工作電極(6)為具有三維微柱陣列結(jié)構(gòu)的金屬電極；參比電極(7)為具有恒定電位的飽和甘汞電極；輔助電極(8)為鉑電極，輔助電極(8)通過精密電阻(9)與外加電源(2)連接；檢測儀表(3)由示波管(10)、垂直偏向放大器(11)和水平偏向放大器(12)構(gòu)成，其中微柱的材質(zhì)為金、銀、鎳或鉑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種牙本質(zhì)磷蛋白的生化檢測裝置，其特征在于，所述電解池 中聚苯乙烯容器⑷內(nèi)裝入待測樣品溶液(5)，由工作電極(6)、參比電極(7)以及輔助電 極(8)構(gòu)成三電極體系，三電極體系的下部浸泡在待測樣品溶液(5)液面以下，外加電源 (2)與工作電極(6)及輔助電極(8)連接并在兩電極之間產(chǎn)生一個(gè)-0. 78V電位，相對于參 比電極為0而言；垂直偏向放大器(11)則連接于電阻(9)的兩端，可測量流過電阻(9)的 電流大小，水平偏向放大器(12)分別與工作電極(6)及參比電極(7)連接，測量二者之間 的電壓變化。
3.一種牙本質(zhì)磷蛋白的生化檢測方法，其特征在于，所述牙本質(zhì)磷蛋白的生化檢測方 法是在牙本質(zhì)磷蛋白的生化檢測裝置中進(jìn)行的，包括牙本質(zhì)磷蛋白的提取及純化和電化學(xué) “雙抗體夾心”酶聯(lián)免疫方法檢測牙本質(zhì)磷蛋白的含量兩個(gè)步驟；1)牙本質(zhì)磷蛋白的提取和純化采用“濾紙吸著法”提取患者口腔齦溝液中的牙本質(zhì) 磷蛋白，并采用“蛋白提取液純化法”提純?nèi)忧?，首先清潔口腔牙面并吹干將吸潮試紙?端緊貼于牙齒的頰舌側(cè)牙面的齦溝邊緣，放置30秒以上，取出后放入離心密封管作待測樣 品，并于_75°C保存；待測樣品提純是在待測樣品中加入15μ 1蛋白提取液，冰浴25分鐘， 于4°C下15000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘后，提取30 μ 1上清液，加入等量蛋白上樣液，煮沸并 冷卻，于-20°C保存待測；其中蛋白提取液配制是先以300 500ml蒸餾水溶解60. 57g三羥甲基氨基甲烷，加入HCl 后，用濃度為lmol/L的HCl或濃度為lmol/L的NaOH，將pH調(diào)至7 8，最后蒸餾水加至 1000ml，得到濃度為0. 5mol/L的蛋白提取液，在4°C冰箱中保存?zhèn)溆茫坏鞍咨蠘右号渲剖窍攘咳?20ml上述0. 5mol/L蛋白提取液，依次加入200ml質(zhì)量 濃度比為10%的十二烷基磺酸鈉水溶液，500ml品質(zhì)濃度比為50%的甘油水溶液，50ml的 2-巰基乙醇，IOOml品質(zhì)濃度比為1 %的溴酚蘭水溶液，最后蒸餾水加至IOOOml，在4°C冰箱 中保存?zhèn)溆茫?)電化學(xué)酶聯(lián)免疫方法檢測牙本質(zhì)磷蛋白含量a.基于“雙抗體夾心法”酶聯(lián)免疫反應(yīng)及“電化學(xué)”檢測法相結(jié)合精確測定牙本質(zhì)磷蛋 白的精確含量；酶聯(lián)免疫反應(yīng)過程為將兔抗牙本質(zhì)磷蛋白抗體吸附到以聚苯乙烯容器作為 固相載體上，孵育后洗滌除去未吸附的抗體；加入含有待測牙本質(zhì)磷蛋白的抗原樣品，使之 與吸附于固相載體上的特異性牙本質(zhì)磷蛋白抗體反應(yīng)，孵育后洗滌除去未反應(yīng)的樣品；加 入辣根過氧化物酶標(biāo)記的特異性牙本質(zhì)磷蛋白抗體與待測牙本質(zhì)磷蛋白的抗原反應(yīng)，形成 所謂“雙抗體夾心抗原”結(jié)構(gòu)，此時(shí)酶與雙抗體夾心抗原之間形成等量關(guān)系；最后加入主要 成分包括鄰苯二胺和過氧化氫的底物，在酶催化下，底物鄰苯二胺和過氧化氫反應(yīng)生成可 進(jìn)行電化學(xué)方法精確測定的待測樣品二氨基吩嗪；b.“電化學(xué)”測試法是包括鄰苯二胺和過氧化氫的底物溶液在辣根過氧化物酶催化下， 過氧化氫將鄰苯二胺氧化生成產(chǎn)物二氨基吩嗪，二氨基吩嗪在三維微柱陣列結(jié)構(gòu)工作電極表面上發(fā)生還原反應(yīng)，其反應(yīng)電流的大小與二氨基吩嗪的量呈正比定量關(guān)系，進(jìn)而與辣根 過氧化物酶的量呈I = 34. 6-5. 861og2X線性定量關(guān)系，式中I為反應(yīng)電流的大小，單位為 微安μ A，X為辣根過氧化物酶的含量，單位為納克每毫升ng/ml，則通過測定上述反應(yīng)電流 的大小，測定二氨基吩嗪的量，進(jìn)而測定辣根過氧化物酶的量，進(jìn)而測定待測樣品中牙本質(zhì) 磷蛋白的量。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種牙本質(zhì)磷蛋白的生化檢測方法，其特征在于，所述 孵育后洗滌除去未吸附的抗體是用包被緩沖液將武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司生產(chǎn)的 E92436HU兔抗牙本質(zhì)磷蛋白抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1 10yg/ml后，加0. Iml在聚苯 乙烯容器中，4°C過夜，以使抗體與固相載體充分吸附，次日，棄去容器內(nèi)溶液，用洗滌緩沖 液沖洗三次，每次三分鐘，洗去未發(fā)生吸附的抗體；其中包被緩沖液為PH9. 6的碳酸鹽緩沖 液，其配制方法為1. 59g碳酸鈉Na2CO3與2. 93g碳酸氫鈉NaHCO3溶解于蒸餾水中并稀釋至 IOOOml配制而成。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種牙本質(zhì)磷蛋白的生化檢測方法，其特征在于，所述孵育 后洗滌除去未反應(yīng)的樣品是于聚苯乙烯容器中加0. Iml牛血清蛋白稀釋液，稀釋的待測牙 本質(zhì)磷蛋白抗原樣品，于37°C孵育1小時(shí)，使固相載體上的兔抗牙本質(zhì)磷蛋白抗體與待測 牙本質(zhì)磷蛋白抗原充分結(jié)合；用洗滌緩沖沖洗三次，每次三分鐘，洗去待測牙本質(zhì)磷蛋白抗 原樣品中的未反應(yīng)的樣品；其中牛血清蛋白稀釋液是由0. Ig牛血清蛋白溶解于IOOOml蒸 餾水中稀釋配制而成。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種牙本質(zhì)磷蛋白的生化檢測方法，其特征在于，所述形成 所謂“雙抗體夾心抗原”結(jié)構(gòu)是于聚苯乙烯容器中加入0. Iml牛血清蛋白稀釋液稀釋的辣 根過氧化物酶標(biāo)記牙本質(zhì)磷蛋白抗體，于37°C孵育1小時(shí)，使酶標(biāo)牙本質(zhì)磷蛋白抗體與牙 本質(zhì)磷蛋白抗原充分結(jié)合，形成所謂“雙抗體夾心”結(jié)構(gòu)，用洗滌緩沖液沖洗三次，每次三分 鐘，洗去未反應(yīng)的成分。
全文摘要
本發(fā)明公開了屬于電化學(xué)酶聯(lián)免疫測試技術(shù)領(lǐng)域的涉及牙根吸收早期診斷的一種牙本質(zhì)磷蛋白的生化檢測方法及裝置。在由三維微柱陣列結(jié)構(gòu)工作電極、鉑輔助電極和飽和甘汞參比電極構(gòu)成的電解池、外加電源與檢測儀表連接的裝置中，采用“濾紙吸著法”提取患者口腔齦溝液中的牙本質(zhì)磷蛋白，提純后放入離心密封管作待測樣品；采用“雙抗體夾心法”酶聯(lián)免疫反應(yīng)及“電化學(xué)”檢測法相結(jié)合精確測定牙本質(zhì)磷蛋白的精確含量，本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)對齦溝液中牙本質(zhì)磷蛋白變化規(guī)律的精確檢測，可以實(shí)現(xiàn)對患者牙根吸收的早期診斷。本檢測方法具有操作簡單、靈敏度高、無輻射損傷等優(yōu)點(diǎn)，在牙根吸收的臨床診斷中具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號G01N33/545GK101949938SQ201010259690
公開日2011年1月19日 申請日期2010年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月23日
發(fā)明者沙海亮, 白玉興 申請人:首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院