專利名稱：保持蛋白磷酸化狀態(tài)的組織細胞裂解液提取方法和裝置的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種組織細胞蛋白裂解液的提取方法，尤其涉及一種保持 蛋白磷酸化狀態(tài)的組織細胞裂解液的提取方法，該方法在提取活體組織裂 解液的過程中同時抑制磷酸酶，從而保持其中蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài)，及其 )IJ于該方法的裝置。
背景技術：
迅速裂解動物組織是尋找和研究生物標記、抗體、蛋白表達、蛋白相互
作用以及ELISA和免疫沉淀等實驗所必須的步驟。此外，生物體細胞內(nèi)的磷 酸化和去磷酸化的蛋白表達能揭示-系列生物現(xiàn)象，包括與細胞內(nèi)信號傳遞、 細胞凋亡、細胞分化和增殖相關聯(lián)的分子開關。
目標蛋白通過蛋白激酶，在絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基上轉(zhuǎn)移磷酸基 團，使得蛋白處理磷酸化狀態(tài)，其鍵結合改變了蛋白的形態(tài)結構以及結合反 應能力。蛋白的磷酸化檢測被廣泛應用于疾病的的體外診斷。
除具用專業(yè)分子生物實驗的部門外，如在醫(yī)院鏡檢部門的日?；?體組織檢驗過程中，都是預先一周內(nèi)由專業(yè)分子生物實驗室制備磷酸酶抑 制劑，放入某種容器或試管內(nèi)準備好，在使用時容器放置在冰上，預備在 鏡檢的操作室內(nèi)，或把活檢組織直接投入液氮。其制備過程繁瑣并會對鏡 檢部門原有的設置和條件產(chǎn)生影響，此外，配制的磷酸酶抑制劑易受空氣
中酸性物質(zhì)(如二氧化碳等)的影響而使得其對酶的抑制失效，或者在 從液氮中復蘇，蛋白磷酸化的狀態(tài)也會有很大變化。由于采集到的活體組 織又需要快速裂解，以穩(wěn)定其中蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài)，而磷酸酶抑制劑不 宜長期保存，在檢測過程中組織裂解液當中的磷酸化蛋白狀態(tài)易發(fā)生改 變，都影響了被檢測的蛋白磷酸化水平。
實驗室配制的磷酸酶抑制劑其保存時間通常為兩周左右，當其暴露
于空氣中時，其抑制效果會顯著下降。GENMED公司提供一種磷酸酶抑 制劑混合液，包括氟化鈉(Sodium Fluoride )、釩酸鈉(SodiumOrthovanadate )、 焦石粦酸納 (Sodium Pyrophosphate )禾口甘油石粦酸 (Glycerophosphate)等化合物實現(xiàn)對組織提取液中磷酸化酶的抑制，使 樣品中的各類蛋白質(zhì)處理原始的生理狀態(tài)。在4"C溫度下，該抑制劑的穩(wěn) 定性能保持12個月。
以醫(yī)院鏡檢部門為例，其對活體組織的檢驗通常采用微陣列檢測(即 蛋白或組織芯片)，這就要求活體組織細胞經(jīng)常規(guī)方法裂解后，還必須要 經(jīng)過測定和校正裂解液中的蛋白質(zhì)濃度后，才能進行相應的蛋白磷酸化水
平檢測。因此受到多種因素的影響(如裂解液制備時間過長，磷酸酶抑 制也會不穩(wěn)定)，使得磷酸酶抑制劑的抑制效果下降，導致樣品中蛋白質(zhì) 的磷酸化狀態(tài)發(fā)生改變，并進而影響檢測結果。還有檢測方法借助熒光技 術直接作用于被檢測組織上，但其受細胞膜的阻礙作用，抗體效果會受表 達不穩(wěn)定影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的 一 個目的在于提供 一 種保持蛋白磷酸化狀態(tài)的組織細胞裂 解液提取方法，盡可能地保護磷酸化狀態(tài)并能使組織細胞盡快裂解的方 法，以適應于醫(yī)院活檢組織鏡檢的需要，簡化和統(tǒng)一被檢的樣本的制備， 從而提高檢測的通量、制備樣本一致性和實時的準確性，來更好地評價生 命現(xiàn)象。
本發(fā)明的另 一 個目的在于提供 一 種保持蛋白磷酸化狀態(tài)的組織細胞 裂解液提取裝置，配合本發(fā)明的提取方法，能實現(xiàn)不具備特殊實驗室條件 的單位，如醫(yī)院鏡檢部門對活檢組織的蛋白磷酸化檢測的樣本制備。
鏡檢指通過纖維鏡進行的檢測，纖維鏡是一種可隨意彎曲、細小、柔 軟的內(nèi)腔鏡，由導光性能良好的玻璃纖維制成，其外部有冷光源照明，能 按操作要求進入成角度的生理或病理性小腔道內(nèi)，觀察微小的病變，采取 組織或細胞樣本。
在纖維氣管鏡或胃腸道鏡檢過程中，技術人員通常需要對活體器官進 行取樣，以便于通過進一歩的組織檢測分析病情。這些活體組織在離體后， 其中某些蛋白質(zhì)的磷酸化水平會發(fā)生變化，使得其與生理狀態(tài)不相一致，
比如在離體狀態(tài)下，JNK蛋白的磷酸化程度在逐漸增加，而ERK蛋白的磷酸化程度則在減少。因此，在離體的組織或細胞樣本中需要加入磷酸 酶抑制劑，減少活組織離體后某些蛋白磷酸化表達變化，保持活組織離體 后蛋白磷酸化原有狀態(tài)，以確保檢測的結果與實際的生命狀況相一致，能 為生命現(xiàn)象和疾病的診斷提供依據(jù)。
在鏡檢的整個過程當中，實時的蛋白磷酸化狀態(tài)是極其不穩(wěn)定或易發(fā) 生改變，不僅需要對離體樣本的及時處理，還需要對處理后樣品制備及快 速地分析。因此，保持組織細胞的蛋白磷酸化狀態(tài)的技術一直是很重要的。 一種保持蛋白磷酸化狀態(tài)的組織細胞裂解液提取方法，包括如卜步
驟
將盛有冷凍液的容器冷凍至0 — 4"C，再將磷酸酶抑制劑和裂解液等 體積混合后按相同體積分裝于微型離心管內(nèi)，微型離心管置于容器中，將 容器密閉后，在其-一開口 (抽氣口)處抽真空并使容器內(nèi)的真空度至-5Pa 一-10Pa，再用橡膠軟塞封閉該開口。
在活檢取材后，打開封閉容器蓋，將組織直接放入各個微型離心管內(nèi)， 用小型硬塑料制成的研磨棒研磨組織后，離心取上清液，即組織細胞裂解 液。
優(yōu)選的，取相同體積和相同類型的活體組織置于各個試管內(nèi)，研磨并 離心后取上層組織裂解液。提取得到的組織裂解液中的蛋白濃度為l一 4(ig l，即可直接用于微陣列比較(即檢測)。
磷酸酶抑制劑獨立地選自于氟化鈉、釩酸鈉、焦磷酸鈉和甘油磷酸或 二個以上化合物任意比例的組合。優(yōu)先選擇pH值為10，濃度為2mmol/L 的釩酸鈉溶液。
裂解液為濃度為1一2% (w/v)的十二烷基磺酸鈉(Sodium lauryl sulfate, SDS)溶液。
為了避免溶解于溶液中氣體的影響，實現(xiàn)對磷酸酶更好的抑制效果， 可以通過超聲的方式將配制后的磷酸酶抑制劑和裂解液中的氣體排除。具 體方法如將溶液先超聲10 — 30分鐘后，靜置20 — 60分鐘，再振搖后 超聲5 — 15分鐘后，靜置10 — 30分鐘。
微型離心管為1.8ml Eppendorf離心管。
冷凍液為試管提供低溫環(huán)境，.具體為水?；顧z組織源自于活體動物器官的細胞或形態(tài)相似、功能相同的細胞群
及其細胞間質(zhì)。活體動物包括人、野生動物和家畜(Livestock)。野生動
物為自然狀態(tài)下未經(jīng)人工馴化的動物。家畜是為了提供食物來源而人工飼
養(yǎng)的動物，如狗、鼠、倉鼠、豬、兔、奶牛、水牛、公牛、綿羊、山羊、 鵝和雞等，活體動物器官的具體類型，但不僅限于，如鼻、喉、食管、 支氣管、胃、十二指腸、膽道、結腸、膀胱或?qū)m腔等。
為配合上述提取方法，先預冷凍裝置盒0至-6t:—個小時，再進行蛋
白磷酸酶抑制劑和裂解液制備及分裝在微型離心管內(nèi)，然后將其微型離心
管置于真空容器中，在0 — 4。C避光條件下的制劑能有效保存14一16個月， 以實現(xiàn)醫(yī)院等鏡檢部I'—]對活檢組織的快速檢測。
一種保持蛋白磷酸化狀態(tài)的組織細胞裂解液提取裝置，包括
密閉容器，由頂蓋和容器腔體組成，腔體內(nèi)盛有冷凍液體，液體的體積
小于腔體的容積；12至24個大小相同的微型離心管，置于密閉容器的腔體 內(nèi)，各個試管中盛有相同體積的裂解液及磷酸酶抑制劑。
另一種保持蛋白磷酸化狀態(tài)的組織細胞裂解液提取裝置，包括
由頂蓋和雙層容器腔體組成的密閉容器，容器腔體內(nèi)盛有冷凍液體，液
體的體積小于腔體的容積；管槽與容器腔體側(cè)面內(nèi)壁固定連接，將腔體分為
上下兩層，12至24個大小相同的微型離心管垂直放置于管槽內(nèi)；各個微型
離心管中盛有相同體積的裂解液及磷酸酶抑制劑。
容器腔體側(cè)面和頂蓋面至少設有一個與內(nèi)腔向連通的開口。
裂解液為l一2。/。(w/v)十二烷基磺酸鈉溶液，磷酸酶抑制劑2mmol/L 釩酸鈉溶液(pH10)，裂解液和磷酸酶抑制劑按等體積混合后分裝于微 型離心管內(nèi)。
真空裝置通過密閉容器上的開口與容器連接，將內(nèi)腔中的空氣排除， 使其真空度至少小于-1Pa，優(yōu)先選擇真空度為-5Pa — -10Pa。之后將開口 密閉并將裝置置于4。C保存。使用時，打開容器頂蓋，將相同體積和相同 類型的活檢組織樣本置于試管內(nèi)，研磨并離心后得到上清組織裂解液，直 接用于蛋白的微陣列檢測。本發(fā)明所涉及的術語與其在本領域的一般概念相同。 所述的"真空度"為相對真空度。
本發(fā)明技術方案實現(xiàn)的有益效果
本發(fā)明通過置于盛有冷凍液的真空度小于-5Pa密閉容器中的磷酸酶 抑制劑裂解液能較長時間保存，使得裂解和抑制磷酸化在0 — 4 。C下同時 進行，實現(xiàn)了保持原有的蛋白磷酸化狀態(tài)和組織細胞裂解液的快速制備。 再取相同體積和相同類型的活體組織置于盛有相同體積裂解液的試管中， 提取得到的裂解液中的蛋白濃度為1 一 4pg/W ，不必測定和校正蛋白濃度， 即可以直接用于磷酸化蛋白質(zhì)的微陣列檢測。該方法不僅能使磷酸酶抑制 劑保持穩(wěn)定，而且能適應醫(yī)院大量活體組織鏡檢的需要，簡化檢測步驟， 從而提高檢觀lj準確性和穩(wěn)定性。
為了配合本發(fā)明的提取方法，采用了提取活體組織裂解液的裝置，可
用于醫(yī)院活體組織中磷酸化蛋白微陣列的檢測，減少對醫(yī)院纖維鏡檢部r」
原有的設置影響和條件要求。該裝置能在5 — 6小時內(nèi)完好保存蛋白的生 理狀態(tài)，可集中收集多個活體組織，還能穩(wěn)妥護送組織樣本到分子生物實 驗中心進行磷酸化蛋白微陣列的檢測。置于該裝置的磷酸酶抑制劑可在0 一4'C的冷藏柜里避光保存1年半。


圖1為提取活體組織裂解液的裝置一實施例的示意圖。
具體實施例方式
以下結合附圖詳細描述本發(fā)明的技術方案，本發(fā)明實施例僅用以說明 本發(fā)明的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說 明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對發(fā)明的技術方案進行修改或 者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的精神和范圍，其均應涵蓋在本發(fā) 明的權利要求范圍中。
本發(fā)明所用的試劑若未明確指明，則均購自西格瑪一奧德里奇 (Sigma— Aldrich)。實施例1
結合圖1，本發(fā)明的一保持蛋白磷酸化狀態(tài)的組織細胞裂解液提取裝 置，包括由頂蓋11和容器腔體12組成的密閉容器1，腔體內(nèi)盛有冷凍液
體13，其體積小于容器腔體容積。管槽4與容器腔體12側(cè)面內(nèi)壁固定連 接，將腔體分為上下兩層，12至24個大小相同的微型離心管2設置于管 槽內(nèi)，各個離心管中盛有裂解液和磷酸酶抑制劑按相同體積混合的溶液 21。
容器腔體側(cè)面設有一個與內(nèi)腔向連通的抽氣口 3。 真空裝置通過密閉容器上的開口與容器內(nèi)腔連接，將內(nèi)腔中的空氣排除， 使其真空度小于一lPa，最后用橡膠塞將抽氣口 3封閉。
實施例2
1) 制備裂解液配制2mM釩酸鈉(pH=10)禾n 1% (w/v)十二烷基 磺酸鈉溶液。分別取200微升加入1.8毫升的微量離心管(Eppendorf管)，
然后置于盛有水的溫度為o — 4r的密閉容器中。
2) 水循環(huán)真空泵與密閉容器上的抽氣孔相連接，使容器內(nèi)的真空度 為-5Pa。然后，用橡皮塞封閉抽氣孔。
3) 將密閉容器放到低溫條件下，于0 — 4匸條件下避光保存。
4) 使用時，打開容器蓋，把等體積的相同類型的活體組織置入預備 好的微量離心管內(nèi)，該容器能保持在3小時內(nèi)將溫度維持在0 —4°C。待 取樣完成后研磨，13,000rpm離心20分鐘后得到上清組織裂解液。裂解 液中的蛋白濃度在l一4pg爾l，直接用于磷酸化蛋白的微陣列檢測。
權利要求
1. 一種保持蛋白磷酸化狀態(tài)的組織細胞裂解液提取方法，包括如下步驟將磷酸酶抑制劑和裂解液等體積混合后冷凍至0—4℃，按相同體積分裝于微型離心管中，然后置于盛有冷凍液的容器中，將容器密閉后，在其一開口處抽氣并使其內(nèi)的真空度為-5Pa—-10Pa，之后將冷凍液溫度降至0—4℃，再取相同體積和相同類型的活體組織置于各個微型離心管內(nèi)，研磨并離心后取上清液為組織裂解液。
2. 根據(jù)權利要求1所述的保持蛋白磷酸化狀態(tài)的組織細胞裂解液提取方 法，其特征在于所述磷酸酶抑制劑為2mmol/L釩酸鈉溶液，所述裂解液為1 一2%， w/v十二垸基磺酸鈉溶液。
3. 根據(jù)權利要求1所述的保持蛋白磷酸化狀態(tài)的組織細胞裂解液提取方 法，其特征在于所述上層組織裂解液，其中的蛋白濃度為l一4嗎/pl。
4. 一種保持蛋白磷酸化狀態(tài)的組織細胞裂解液提取裝置，其特征在于， 包括密閉容器，由頂蓋和容器腔體組成，腔體內(nèi)盛有冷凍液體，液體的體積 小于腔體的容積；12至24個大小相同的微型離心管，置于密閉容器的腔體內(nèi)，各個試管 中盛有相同體積的裂解液及磷酸酶抑制劑。
5. —種保持蛋白磷酸化狀態(tài)的組織細胞裂解液提取裝置，其特征在于，包括密閉容器，由頂蓋和雙層容器腔體組成，容器腔體內(nèi)盛有冷凍液體，液 體的體積小于腔體的容積；管槽，與容器腔體側(cè)面內(nèi)壁固定連接，將腔體分為上下兩層，12至24個大小相同的微型離心管設置于管槽內(nèi)；各個微型離心管中盛有相同體積的裂解液及磷酸酶抑制劑。
6. 根據(jù)權利要求4或5所述的保持蛋白磷酸化狀態(tài)的組織細胞裂解液提取裝置，其特征在于所述磷酸酶抑制劑為釩酸鈉溶液，所述裂解液為十二烷 基磺酸鈉溶液。
7. 根據(jù)權利要求4或5所述的保持蛋白磷酸化狀態(tài)的組織細胞裂解液提 取裝置，其特征在于容器腔體側(cè)面和頂蓋面設有一個與容器內(nèi)腔相連通的抽氣口。
8. 根據(jù)權利要求4或5所述的保持蛋白磷酸化狀態(tài)的組織細胞裂解液提 取裝置，其特征在于所述密閉容器，腔體內(nèi)的真空度為一l 一10Pa。
全文摘要
一種保持蛋白磷酸化狀態(tài)的組織細胞裂解液提取方法和裝置，將磷酸酶抑制劑和裂解液等體積混合后冷凍至0-4℃，按相同體積分裝于微型離心管中，置于盛有冷凍液的密閉容器中，真空抽氣到-5Pa下，再密封保存。本裝置磷酸酶抑制劑及裂解液有效期14-16個月。使用本裝置，能使活檢在抑制磷酸酶同時還同步進行組織細胞裂解，蛋白濃度為1-4μg/μl，不測定和校正蛋白濃度，即可直接用于磷酸化蛋白微陣列檢測。該方法和裝置能保持被檢測組織的蛋白磷酸化狀態(tài)，適合醫(yī)院等部門的組織鏡檢需要，簡化樣本制備步驟及縮短時間，能保證檢測組織質(zhì)和量的一致性，從而能提高了檢測速度和數(shù)量。實現(xiàn)了快速制備組織細胞裂解液。
文檔編號G01N1/28GK101545836SQ20091005060
公開日2009年9月30日 申請日期2009年5月5日 優(yōu)先權日2009年5月5日
發(fā)明者吳建乾, 吳達龍, 周新妹, 宋柱芹, 尹滿香, 張成文, 張高忠, 斌 李, 杜開齊, 林雪平, 顧旭東 申請人:嘉興學院;張成文