專利名稱：一種蛋白酶及其制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酶學(xué)中的一種蛋白酶及其制備工藝。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，美國(guó)、日本等各發(fā)達(dá)國(guó)家十分重視骨系列食品的開(kāi)發(fā)研制，諸如骨松、骨泥、骨味素、骨味汁等。我國(guó)生豬飼養(yǎng)約占世界總量的46％，年出攔肉豬達(dá)4.8億頭，豬骨占胴體的12.9％，豬骨的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，充分利用尤其重要。而目前還未被很好利用，尤其是胴雜骨，甚至廢棄污染環(huán)境。從中國(guó)蓖種西南保藏中心篩選出的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeraginosa)PA303，該菌株產(chǎn)生的胞外酶能水解骨汁蛋白，但該菌株產(chǎn)酶量很低，發(fā)酵液酶活低，僅76U/ml。

發(fā)明內(nèi)容
為了充分利用豬骨資源開(kāi)發(fā)骨系列食品，通過(guò)生物酶技術(shù)轉(zhuǎn)化，利用豬骨生產(chǎn)骨味素及其副產(chǎn)品。本發(fā)明研制了一種蛋白酶及其制備工藝，以銅綠假單胞菌PA303為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外線照射和CO2激光幅射復(fù)合誘變與底物誘導(dǎo)相結(jié)合，引起菌體DNA突變、染色體畸變、酶的激活和鈍化而篩選得到一種能產(chǎn)生中性蛋白酶的變異株P(guān)A303-023，用該變異株做菌種發(fā)酵制備中性蛋白酶水解骨汁，使骨蛋白的水分解度達(dá)42.4％，且骨蛋白經(jīng)中性蛋白酶降解成多種氨基酸和多肽后，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、功能性質(zhì)和生理效果顯著提升。制備的工藝流程是(1)將菌種接種在斜面試管內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)；(2)將在斜面試管內(nèi)經(jīng)過(guò)培養(yǎng)的菌種植入三角瓶培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)；(3)將在三角瓶?jī)?nèi)經(jīng)過(guò)培養(yǎng)的菌種植入種子發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)酵罐內(nèi)的空氣需先經(jīng)空氣壓縮機(jī)壓縮并經(jīng)過(guò)空氣過(guò)濾系統(tǒng)殺菌過(guò)濾處理。
(4)按配方稱量好原輔材料，并進(jìn)行殺菌處理；(5)將原料和種子發(fā)酵內(nèi)的菌種置于發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)酵罐內(nèi)的空氣需先經(jīng)過(guò)殺菌過(guò)濾處理；(6)發(fā)酵完成后對(duì)發(fā)酵的原料進(jìn)行壓濾分離，濾渣作飼料用；將濾液收集到清液桶內(nèi)再用超濾器進(jìn)行過(guò)濾；
(7)對(duì)濾液進(jìn)行濃縮處理后得濃縮酶液。
將銅綠假單胞菌PA303置于培養(yǎng)基中進(jìn)行菌種誘變選育，培養(yǎng)基包括種子培養(yǎng)基、粗篩培養(yǎng)基、復(fù)篩培養(yǎng)基、搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基；每100ml種子培養(yǎng)基中有牛肉膏0.5g、NaCl 0.5g、蛋白胨0.8g、骨汁3ml；每100ml粗篩培養(yǎng)基中有明膠2g、蛋白胨0.4g、豬骨汁2ml、葡萄糖1g、KH2PO40.05g、MgSO4.7H2O 0.02g、NaCl 0.01g、瓊脂1.6-2.0g、PH7.0-7.5；每100ml復(fù)篩培養(yǎng)基中有葡萄糖2g、酵母膏0.15g、豬骨汁2ml、CaCl20.02g、K2HPO4.3H2O 0.25g、KH2PO4.2H2O 0.04g、瓊脂1.6-2.0g、PH7.0-7.5；每100ml搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中有葡萄糖2g、黃豆粉4g、蛋白胨2g、豬骨汁4ml、CaCl20.02g、K2HPO4.3H2O 0.28g、KH2PO4.2H2O0.04g、PH7.0-7.5。對(duì)培養(yǎng)后的出發(fā)菌株進(jìn)行紫外線照射誘變是用15W的紫外燈管，照射距離30cm，照射時(shí)間5min；CO2激光輻輻射誘變是將經(jīng)紫外線誘變后的出發(fā)菌株經(jīng)篩選后進(jìn)行，激光束光斑直徑Φ0.4cm，照射距離20cm，照射時(shí)間30s，激光器的輸入電壓210V、功率10W；用紫外線和激光輻射反復(fù)誘變，并在培養(yǎng)基中加入豬骨汁進(jìn)行底物誘導(dǎo)而獲得變異株P(guān)A303-023。發(fā)酵制酶工藝是(1)種子培養(yǎng)a、以變異株P(guān)A303-023為菌種，植入斜面試管菌種培養(yǎng)，每100ml培養(yǎng)基中有葡萄糖2g、黃豆粉4g、蛋白胨2g、豬骨汁4ml、CaCl20.02g、K2HPO4.3H2O 0.28g、KH2PO4.2H2O 0.04g、瓊脂1.6-2.0g、PH7.0-7.5、121℃滅菌20min，接種32℃培養(yǎng)48h后，轉(zhuǎn)入冰箱保存?zhèn)溆?。b、植入三角瓶種子培養(yǎng)，培養(yǎng)基用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為1接種環(huán)，32℃振蕩培養(yǎng)20h；c、植入30L種子罐培養(yǎng)，培養(yǎng)基每升葡萄糖20g、黃豆50g、蛋白胨20g、豬骨汁40ml、CaCl20.2g、K2HPO4.3H2O 0.28g、KH2PO4.2H2O 0.4g、PH7.0-7.5，裝量15L，121℃罐內(nèi)濕熱滅菌20min，冷卻至32℃，接入三角瓶種子，接種量5％，溫度32℃，攪拌轉(zhuǎn)速300r/min，通氣比1∶1，罐壓0.05Mpa，培養(yǎng)18h；(2)200L發(fā)酵罐發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)基每升有葡萄糖25g、黃豆粉60g、蛋白胨20g、豬骨汁40ml、CaCl20.2g、K2HPO4.3H2O 2.8g、KH2PO4.2H2O 0.4g、pH7.0-7.5，裝量(含種子)120L，121℃罐內(nèi)濕熱滅菌20min，冷卻至32℃，接入種子罐培養(yǎng)的種子，接種量10％；控溫32℃，攪拌轉(zhuǎn)速250r/min，通氣比1∶0.8，罐壓0.05Mpa，用單硬脂酸甘油酯作消泡劑，發(fā)酵72h，檢測(cè)發(fā)酵液酶活力達(dá)950U/m。(3)提制酶液發(fā)酵液經(jīng)板框壓濾機(jī)壓濾，除去菌體后，經(jīng)截流分子量為10000D的中空纖維超濾器超濾，除去無(wú)機(jī)鹽及其它雜質(zhì)，濃縮5倍得到濃縮酶液22L，檢測(cè)酶活力達(dá)4650U/ml，-10℃冷凍儲(chǔ)存。本發(fā)明采用紫外線照射和CO2激光輻射對(duì)銅綠假單胞菌PA303復(fù)合誘變，并結(jié)合底物誘導(dǎo)的方法，選育出一種能產(chǎn)生中性蛋白酶的變異株P(guān)A303-023，再用該變異株做菌種，發(fā)酵制備能水解骨汁的中性蛋白酶，發(fā)酵液酶活提升到950U/ml，比出發(fā)菌株P(guān)A303提高了12.4倍，且變異株的遺傳性能穩(wěn)定，是優(yōu)良的工業(yè)生產(chǎn)菌株。


圖1是制備的工藝流程圖，圖2是實(shí)施例的菌種選育技術(shù)路線圖。
具體實(shí)施例方式由圖1、圖2，對(duì)培養(yǎng)后的出發(fā)菌株進(jìn)行紫外線照射誘變，紫外線燈管15W，照射距離30cm，照射時(shí)間5min。經(jīng)篩選后，又用CO2激光輻射誘變，激光束光斑直徑0.4cm，照射距離20cm，照射時(shí)間30s，激光器的輸入電壓210V、功率10W。用這兩種反復(fù)誘變，并在培養(yǎng)基中加入豬骨汁進(jìn)行底物誘導(dǎo)，篩選獲得變異株P(guān)A303-023，發(fā)酵后產(chǎn)中性蛋白酶由初始的76U/ml上升到940U/ml，提高了12.4倍。經(jīng)8次傳代培養(yǎng)，產(chǎn)酶活性穩(wěn)定在940U/ml左右，性能穩(wěn)定，選育效果顯著。變異株P(guān)A303-023經(jīng)200L/ml發(fā)酵罐發(fā)酵，發(fā)酵液平均酶活力達(dá)到950U/ml。發(fā)酵工藝參數(shù)為接種量10％，溫度32℃，攪拌轉(zhuǎn)速250r/min，通氣比1∶0.8，罐壓0.05Mpa，起始PH7.5，時(shí)間72h。
權(quán)利要求
1.一種蛋白酶及其制備工藝，其特征在于以銅綠假單胞菌PA303為發(fā)出菌株，經(jīng)紫外線照射和CO2激光輻射復(fù)合誘變與底物誘導(dǎo)相結(jié)合，篩選得到一種能產(chǎn)生中性蛋白酶的變異株P(guān)A303-023，再用該變異株做菌種，發(fā)酵制備能水解骨汁的中性蛋白酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蛋白酵及其制備工藝，其工藝流程是(1)將菌種接種在斜面試管內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)；(2)將在斜面試管內(nèi)經(jīng)過(guò)培養(yǎng)的菌種植入三角瓶培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)；(3)將在三角瓶?jī)?nèi)經(jīng)過(guò)培養(yǎng)的菌種植入種子發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)酵罐內(nèi)的空氣需先經(jīng)空氣壓縮機(jī)壓縮并經(jīng)過(guò)空氣過(guò)濾系統(tǒng)殺菌過(guò)濾處理。(4)按配方稱量好原輔材料，并進(jìn)行殺菌處理；(5)將原料和種子發(fā)酵內(nèi)的菌種置于發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)酵罐內(nèi)的空氣需先經(jīng)過(guò)殺菌過(guò)濾處理；(6)發(fā)酵完成后對(duì)發(fā)酵的原料進(jìn)行壓濾分離，濾渣作飼料用；將濾液收集到清液桶內(nèi)再用超濾器進(jìn)行過(guò)濾；(7)對(duì)濾液進(jìn)行濃縮處理后得濃縮酶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蛋白酶及其制備工藝，其特征在于將銅綠假單胞菌PA303置于培養(yǎng)基中進(jìn)行菌種誘變選育，培養(yǎng)基包括種子培養(yǎng)基、粗篩培養(yǎng)基、復(fù)篩培養(yǎng)基、搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基；每100ml種子培養(yǎng)基中有牛肉膏0.5g、NaCl 0.5g、蛋白胨0.8g、骨汁3ml；每100ml粗篩培養(yǎng)基中有明膠2g、蛋白胨0.4g、豬骨汁2ml、葡萄糖1g、KH2PO40.05g、MgSO4.7H2O 0.02g、NaCl 0.01g、瓊脂1.6-2.0g、PH7.0-7.5；每100ml復(fù)篩培養(yǎng)基中有葡萄糖2g、酵母膏0.15g、豬骨汁2ml、CaCl20.02g、K2HPO4.3H2O 0.25g、KH2PO4.2H2O 0.04g、瓊脂1.6-2.0g、PH7.0-7.5；每100ml搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中有葡萄糖2g、黃豆粉4g、蛋白胨2g、豬骨汁4ml、CaCl20.02g、K2HPO4.3H2O 0.28g、KH2PO4.2H2O 0.04g、PH7.0-7.5。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蛋白酶及其制備工藝，其特征在于對(duì)培養(yǎng)后的出發(fā)菌株進(jìn)行紫外線照射誘變是用15W的紫外燈管，照射距離30cm，照射時(shí)間5min；CO2激光輻射誘變是將經(jīng)紫外線誘變后的出發(fā)菌株經(jīng)篩選后進(jìn)行，激光束光斑直徑Φ0.4cm，照射距離20cm，照射時(shí)間30s，激光器的輸入電壓210V、功率10W；用紫外線和激光輻射反復(fù)誘變，并在培養(yǎng)基中加入豬骨汁進(jìn)行底物誘導(dǎo)而獲得變異PA303-023。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蛋白酶及其制備工藝，其特征在于發(fā)酵制酶工藝是(1)種子培養(yǎng)a、以變異株P(guān)A303-023為菌種，植入斜面試管菌種培養(yǎng)，每100ml培養(yǎng)基中有葡萄糖2g、黃豆粉4g、蛋白胨2g、豬骨汁4ml、CaCl20.02g、K2HPO4.3H2O 0.28g、KH2PO4.2H2O 0.04g、瓊脂1.6-2.0g、PH7.0-7.5、121℃滅菌20min，接種32℃培養(yǎng)48h后，轉(zhuǎn)入冰箱保存?zhèn)溆茫籦、植入三角瓶種子培養(yǎng)，培養(yǎng)基用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為1接種環(huán)，32℃振蕩培養(yǎng)20h；c、植入30L種子罐培養(yǎng)，培養(yǎng)基每升葡萄糖20g、黃豆50g、蛋白胨20g、豬骨汁40ml、CaCl20.2g、K2HPO4.3H2O 0.28g、KH2PO4.2H2O 0.4g、PH7.0-7.5，裝量15L，121℃罐內(nèi)濕熱滅菌20min，冷卻至32℃，接入三角瓶種子，接種量5％，溫度32℃，攪拌轉(zhuǎn)速300r/min，通氣比1∶1，罐壓0.05Mpa，培養(yǎng)18h；(2)200L發(fā)酵罐發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)基每升有葡萄糖25g、黃豆粉60g、蛋白胨20g、豬骨汁40ml、CaCl20.2g、K2HPO4.3H2O 0.28g、KH2PO4.2H2O 0.4g、PH7.0-7.5，裝量(含種子)120L，121℃罐內(nèi)濕熱滅菌20min，冷卻至32℃，接入種子罐培養(yǎng)的種子，接種量10％；控溫32℃，攪拌轉(zhuǎn)速250r/min，通氣比1∶0.8，罐壓0.05Mpa，用單硬脂酸甘油酯作消泡劑，發(fā)酵72h，檢測(cè)發(fā)酵液酶活力達(dá)950U/ml；(3)提制酶液發(fā)酵液經(jīng)板框壓濾機(jī)壓濾、除去菌體后，經(jīng)截流分子量為10000D的中空纖維超濾器超濾，除去無(wú)機(jī)鹽及其它雜質(zhì)，濃縮5倍得到濃縮酶液22L，檢測(cè)酶活力達(dá)4650U/ml，-10℃冷凍儲(chǔ)存。
全文摘要
本發(fā)明是一種蛋白酶及其制備工藝，以銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeraginosa)PA303為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外線照射和CO
文檔編號(hào)C12N13/00GK1872998SQ20051002101
公開(kāi)日2006年12月6日 申請(qǐng)日期2005年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月30日
發(fā)明者趙勤 申請(qǐng)人:四川高金翔達(dá)食品有限公司