專利名稱：使用OmpT蛋白酶突變體的多肽的切斷方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到利用大腸桿菌具有的OmpT蛋白酶或其突變體，從融合蛋白直接切出生理活性肽、蛋白質(zhì)和它們的衍生物的方法。詳細(xì)講涉及到在使用大腸桿菌成熟型OmpT蛋白酶的融合蛋白的切斷中，通過在切斷部位的P3位、P4位以及P5位配置堿性氨基酸，使該切斷部位的P1位和P1’位間的肽鍵的切斷率上升的方法，以及使用對(duì)OmpT蛋白酶的N末端的第97位氨基酸進(jìn)行置換后對(duì)該P(yáng)1’位的底物特異性改變了的突變體，即使在P1’位的氨基酸為精氨酸或賴氨酸以外的氨基酸的情況也可以從融合蛋白有效游離、生產(chǎn)生理活性肽、蛋白質(zhì)和它們的衍生物的方法。
背景技術(shù)：
大腸桿菌OmpT蛋白酶是存在于大腸桿菌外膜級(jí)分中，主要是有選擇地切斷堿性氨基酸對(duì)間的肽鍵的蛋白酶。與該大腸桿菌OmpT蛋白酶氨基酸序列具有同源性、而且具有或推定有蛋白酶活性的蛋白質(zhì)在沙門氏菌(Salmonella)、耶爾森氏菌(Yersinia)、志賀氏菌(Shigella)等腸內(nèi)菌中也發(fā)現(xiàn)了，這樣的一組蛋白質(zhì)被稱為omptin family。
大腸桿菌OmpT蛋白酶分子量約為33500。Sugimura等研究了OmpT蛋白酶底物特異性，報(bào)告了本酶是特異切斷精氨酸-精氨酸、賴氨酸-賴氨酸、精氨酸-賴氨酸以及賴氨酸-精氨酸堿性氨基酸對(duì)之間的肽鍵的酶(Sugimura，K.and Nishihara，T.J.Bacteriol.1705625-5632，1988)。
但是，本酶并不切斷所有的堿性氨基酸對(duì)，不用說其特異性高。例如，雖然在人γ-干擾素中有10個(gè)地方存在堿性氨基酸，但10個(gè)當(dāng)中只有2個(gè)地方被切斷(Sugimura，K.and Higashi，N.J.Bacteriol.1703650-3654，1988)。這可認(rèn)為作為底物的人γ-干擾素的空間結(jié)構(gòu)以及堿性氨基酸對(duì)周邊的酶識(shí)別的部位的氨基酸序列的影響造成的。
在本說明書中，根據(jù)Schechter和Berger的表記方法(Schechter，I.and Berger，A.Biochem.Biophys.Res.Commun.27157-162，1967)表記底物的氨基酸的位置。即，在Pn...P2-P1-P1’-P2’...Pn’中，P1位和P1’位間的肽鍵是切斷部位，氨基酸用單字母或3字母表示，↓為切斷部位。
例如，當(dāng)氨基酸序列-亮氨酸-酪氨酸-賴氨酸-精氨酸-組氨酸-在賴氨酸與精氨酸間被切斷時(shí)(-Leu-Tyr-Lys↓Arg-His-)，亮氨酸成為P3位，酪氨酸為P2位，賴氨酸為P1位，精氨酸為P1’位，組氨酸為P2’位的氨基酸。
另外，即使在切斷部位及其周邊氨基酸序列中導(dǎo)入氨基酸置換后，不受到切斷的情況或新的切斷部位生成的情況中，只要是沒有特別說明，作為原來序列上的對(duì)應(yīng)氨基酸的位置應(yīng)當(dāng)使用上述表記。
到目前為止，在堿性氨基酸對(duì)以外的氨基酸序列中也發(fā)現(xiàn)了OmpT蛋白酶切斷部位，Dekker等人報(bào)告了使用由Ala-Arg-Arg-Ala(P2-P1↓P1’-P2’)氨基酸序列構(gòu)成的在OmpT蛋白酶底物中導(dǎo)入了氨基酸置換的底物，OmpT蛋白酶一方面對(duì)作為切斷部位的P1位的氨基酸-堿性氨基酸精氨酸和賴氨酸表現(xiàn)出高的特異性，另一方面對(duì)于P1’位的氨基酸表現(xiàn)出寬容(Dekker，N.et al.Biochemistry401694-1701，2001)。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在有尿素存在的多肽變性條件下，用本酶能夠切斷的融合蛋白的P1’位導(dǎo)入了氨基酸置換的融合蛋白作為底物，P1’位的氨基酸為天冬氨酸、谷氨酸、以及脯氨酸以外的氨基酸時(shí)可切斷(Okuno，K.et al.Biosci.Biotechnol.Biochem.66127-134，2002，特愿2000-602803)。但是，在這些場(chǎng)合下，切斷效率比P1’位氨基酸為精氨酸或賴氨酸的場(chǎng)合低。
關(guān)于對(duì)切斷部位周邊序列的特異性，當(dāng)在P2位或P2’位配置酸性氨基酸時(shí)顯示不受到切斷(Dekker，N.et al.Biochemistry401694-1701，2001)。
另外，本發(fā)明人報(bào)告了在P4位或P6位配置堿性氨基酸精氨酸或賴氨酸時(shí)切斷效率增加，相反配置酸性氨基酸天冬氨酸或谷氨酸時(shí)，切斷效率降低(Okuno，K.etal.Biotechnol.Appl.Biochem.3677-84，2002，特愿2000-602803)。
有關(guān)對(duì)其它的切斷部位周邊序列的特異性雖然還不清楚，但由OmpT蛋白酶可切斷堿性高的抗菌肽魚精蛋白(Stumpe，S.etal.J.Bacteriol.1804002-4006，1998)、以及與蛋白酶活性相關(guān)的OmpT蛋白酶菌體外結(jié)構(gòu)域存在很多酸性氨基酸(Vandeputte-Rutten，L.et al.EMBO J.205033-5039，2001)推測(cè)電荷產(chǎn)生的作用對(duì)于OmpT蛋白酶和底物間的相互作用很重要。
有關(guān)OmpT蛋白酶的應(yīng)用方面，由于對(duì)切斷部位特異性高，另外由于是存在于大腸桿菌外膜的蛋白酶，所以本蛋白酶當(dāng)使目的肽從通過基因重組技術(shù)制作的融合蛋白游離時(shí)，可用作加工酶(processingenzyme)。
Hanke等人在使用大腸桿菌的膽固醇酯酶的分泌生產(chǎn)中，使該酶與大腸桿菌溶血素A蛋白融合分泌到菌體外后，使存在于外膜的OmpT蛋白酶作用，由融合蛋白得到有活性的膽固醇酯酶上獲得了成功。他們配置具有精氨酸-賴氨酸序列的鏈，用OmpT蛋白酶切斷該序列(Hanke，C.et al.Mol.Gen.Genet.23342-48，1992)。
另外，本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)了OmpT蛋白酶對(duì)變性劑具有抗性，表明通過利用這一性質(zhì)，可以在變性劑存在下能夠切斷以包涵體表達(dá)的融合蛋白。即，在通過大腸桿菌表達(dá)體系以包涵體表達(dá)金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)V8蛋白酶衍生物融合蛋白，通過尿素使包涵體溶化后，在尿素存在下使OmpT蛋白酶作用，從融合蛋白中游離出V8蛋白酶衍生物部分，不用進(jìn)行重折疊生產(chǎn)具有酶活性的V8蛋白酶衍生物(Yabuta，M.et al.Appl.Microbiol.Biotechnol.44118-125，1995)方面獲得了成功。
通常，由融合蛋白使目的多肽或目的蛋白質(zhì)游離時(shí)，作為加工酶常常使用對(duì)氨基酸序列特異性高的酶。在這方面使用的蛋白酶中已知有Xa因子、凝血酶、腸激酶等，這些酶都是起源于哺乳類的酶，由于其供給量低、費(fèi)用高，所以不適合通過融合蛋白法進(jìn)行肽和蛋白質(zhì)的工業(yè)上大量處理。另外就目的多肽、蛋白質(zhì)作為醫(yī)藥品使用時(shí)，來自酶的病毒污染以及作為瘋牛病的起因因子的變性朊蛋白的污染也必須考慮。
OmpT蛋白酶由于來源于大腸桿菌，顯然作為加工酶使用時(shí)在供給量、費(fèi)用以及安全性方面比上述的酶更優(yōu)越。另外，OmpT蛋白酶由于也存在于包涵體，所以在以包涵體使融合蛋白表達(dá)時(shí)，僅通過尿素等變性劑對(duì)融合蛋白進(jìn)行溶解，酶就可作用。另外，由于OmpT蛋白酶存在于大腸桿菌外膜，所以通過將菌體本身添加到反應(yīng)體系中，就可以進(jìn)行OmpT蛋白酶反應(yīng)(Grodberg，J.andDunn，J.J.J.Bacteriol.1701245-1253)。
在藥品制造等工業(yè)上肽生產(chǎn)中，對(duì)大腸桿菌生產(chǎn)的融合蛋白進(jìn)行加工，得到目的多肽時(shí)使用的很多蛋白酶由于都不是來自大腸桿菌，所以需要純化后使用。因此，由于不需要純化、只是添加大腸桿菌菌體本身、外膜級(jí)分或溶解包涵體，將OmpT蛋白酶作為加工蛋白酶使用對(duì)大幅度改善多肽的生產(chǎn)成本有用。然而，在以往使用大腸桿菌OmpT蛋白酶的融合蛋白的加工中，游離的多肽的N末端氨基酸除一部分例外，都被限定于賴氨酸或精氨酸。
OmpT蛋白酶的有用性雖然很大，但本發(fā)明以前，將OmpT蛋白酶作為融合蛋白的切斷酶使用時(shí)，但在對(duì)切斷部位及其周邊的氨基酸序列怎樣設(shè)計(jì)，在希望的部位是否可進(jìn)行特異、而且有效切斷方面的知識(shí)有限。因此，可有效切斷的目的多肽的N末端氨基酸的種類受到限定。所以出現(xiàn)可得到的目的多肽的種類受到限制，或即使可以切斷，也不能進(jìn)行有效切斷的問題。
專利文獻(xiàn)1特愿2000-602803非專利文獻(xiàn)1Sugimura，K.and Nishihara，T.J.Bacteriol.1705625-5632，1988非專利文獻(xiàn)2Sugimura，K.and Higashi，N.J.Bacteriol.1703650-3654，1988非專利文獻(xiàn)3Schechter，I.and Berger，A.Biochem.Biophys.Res.Commun.27157-162，1967非專利文獻(xiàn)4Dekker，N.et al.Biochemistry 401694-1701，2001非專利文獻(xiàn)5Okuno，K.et al.Biosci.Biotechnol.Biochem.66127-134，2002非專利文獻(xiàn)6Okuno，K.et al.Biotechnol.Appl.Biochem.3677-84，2002非專利文獻(xiàn)7Stumpe，S.et al.J.Bacteriol.1804002-4006，1998非專利文獻(xiàn)8Vandeputte-Rutten，L.et al.EMBO J.205033-5039，2001，非專利文獻(xiàn)9Hanke，C.et al.Mol.Gen.Genet.23342-48，1992非專利文獻(xiàn)10Yabuta，M.et al.Appl.Microbiol.Biotechnol.44118-125，1995非專利文獻(xiàn)11Grodberg，J.and Dunn，J.J.J.Bacteriol.1701245-1253，1988發(fā)明內(nèi)容在本發(fā)明中，作為本發(fā)明的課題就是克服上述的問題，作為加工酶利用OmpT蛋白酶或其突變體，使所有種類的目的多肽從融合蛋白中有效、且特異游離的方法，即將目的多肽的N末端氨基酸作為P1’位氨基酸殘基，只對(duì)融合蛋白的P1-P1’一個(gè)地方進(jìn)行有效切斷。
對(duì)于上述課題，本發(fā)明人對(duì)OmpT蛋白酶的切斷部位及其周邊氨基酸序列進(jìn)一步研究，如果發(fā)現(xiàn)新的切斷方法或識(shí)別·切斷序列，就可以解決上述那些限制，可認(rèn)為本酶作為融合蛋白的加工酶更有用。另外，認(rèn)為向OmpT蛋白酶本體導(dǎo)入部位特異的突變后，制作底物特異性與野生型不同的OmpT蛋白酶突變體，利用該突變體也是可能的。
由于切斷部位周邊的氨基酸序列對(duì)于OmpT蛋白酶的底物識(shí)別與切斷重要，因此本發(fā)明人為了利用已知的切斷部位，通過對(duì)切斷部位及其周邊氨基酸序列進(jìn)行研究，找出新的底物特異性，將該特異性應(yīng)用于融合蛋白的切斷中進(jìn)行了不斷研究。
本發(fā)明中所謂「OmpT蛋白酶」指的是信號(hào)肽被除去后的來自大腸桿菌的成熟型OmpT蛋白酶或該OmpT蛋白酶以外的具有OmpT蛋白酶活性的蛋白質(zhì)(OmpT樣蛋白酶)。作為OmpT樣蛋白酶如(1)鼠疫桿菌纖溶酶原激活物(Yersinia pestis plasminogen activator)、(2)鼠傷寒沙門氏桿菌E蛋白(Salmonella typhimurium E protein)、(3)大腸桿菌(Escherichia coli)以及(4)Shigella flexneri SopA等。
在本發(fā)明中所謂「OmpT蛋白酶97位氨基酸突變體」指的是上述的OmpT蛋白酶的第97位的天冬氨酸(Asp97)被其它的氨基酸置換后的OmpT蛋白酶突變體或在上述OmpT樣蛋白酶的氨基酸序列中對(duì)相當(dāng)于從OmpT蛋白酶的N末端的97位氨基酸的氨基酸進(jìn)行置換的突變體(OmpT樣蛋白酶相當(dāng)97位氨基酸突變體)。
作為置換OmpT蛋白酶的第97位的天冬氨酸的其它氨基酸，如丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸或組氨酸。另外，作為OmpT樣蛋白酶相當(dāng)97位氨基酸突變體，在上述OmpT樣蛋白酶中，(1)對(duì)于Yersiniapestis plasminogen activator，以117位(用在含有信號(hào)肽的全氨基酸序列中從N末端開始的氨基酸殘基的數(shù)字表示。與OmpT的情況同樣，如果用含有信號(hào)肽的氨基酸殘基數(shù)表示，97位氨基酸變成了117位)的天冬氨酸、(2)對(duì)于鼠疫桿菌纖溶酶原激活物，將134位的天冬氨酸、(3)對(duì)于大腸桿菌OmpP將117位的天冬氨酸、以及(4)對(duì)于Shigella flexneri SopA將117位的天冬氨酸置換為例如丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸或組氨酸后的突變體。
在本發(fā)明中所謂「目的肽」指的不僅是最終希望得到的肽，也包括從融合蛋白通過OmpT蛋白酶等切斷后，再接受修飾反應(yīng)或切斷反應(yīng)的制造中間體(所謂的前體肽)。
本發(fā)明中所謂「保護(hù)肽」是通過連接肽與目的肽構(gòu)成融合蛋白的肽，也包括連接肽的意思。
在本發(fā)明中所謂「希望的切斷部位」指的是多肽中的任意部位、由保護(hù)肽和通過連接肽融合的目的肽構(gòu)成的融合蛋白中的連接肽C末端與目的肽N末端之間的部位或該連接肽中的任意部位。
本發(fā)明的主要的主題涉及到以下的(1)～(4)事項(xiàng)。
(1)以多肽中希望的切斷部位涉及到的P1位為精氨酸或賴氨酸，P1’為天冬氨酸、谷氨酸或脯氨酸以外的氨基酸，在從P10位至P3或從P3’至P5’位的氨基酸序列中的任意部位連續(xù)配置1個(gè)堿性氨基酸或2個(gè)或3個(gè)堿性氨基酸(但是，配置1個(gè)堿性氨基酸時(shí)，除去P6或P4位)，使用OmpT蛋白酶在該多肽中希望的切斷部位進(jìn)行切斷為特征的多肽的切斷方法，以及以使用該切斷方法從融合蛋白獲得目的肽為特征的目的肽的制造方法。
(2)以使用OmpT蛋白酶97位氨基酸突變體在多肽中希望的切斷部位進(jìn)行切斷為特征的多肽的切斷方法，以及以使用該切斷方法從融合蛋白獲得目的肽為特征的目的肽的制造方法。
(3)上述(2)所述的方法，其中，多肽中希望的切斷部位涉及到的P1位為精氨酸或賴氨酸，P1’位為精氨酸或賴氨酸以外的氨基酸，在從P10位至P3或從P3’至P5’位的氨基酸序列中的任意部位連續(xù)配置1個(gè)堿性氨基酸或2個(gè)或3個(gè)堿性氨基酸。
(4)多肽的切斷方法，其使用OmpT蛋白酶或OmpT蛋白酶97位氨基酸突變體在多肽中希望的切斷部位進(jìn)行切斷，特征為當(dāng)該多肽中不希望被蛋白酶切斷的部位存在時(shí)，通過在該部位的P3位配置酸性氨基酸，可抑制在該部位的切斷。以及以使用該切斷方法從融合蛋白獲得目的肽為特征的目的肽的制造方法。
上述(1)是基于下述見解完成的，即通過將OmpT蛋白酶的切斷部位的優(yōu)選從P10位至P3(但是，只是P6或P4位的一處被堿性氨基酸置換的情況除去)，特別優(yōu)選P5位至P3位的氨基酸置換為堿性氨基酸，切斷率增加。但是由于OmpT具有容易切斷連續(xù)的堿性氨基酸之間的肽鍵的性質(zhì)，所以在P5位至P3位配置連續(xù)的堿性氨基酸時(shí)，這些部位的肽鍵可被OmpT切斷。
可是，利用OmpT對(duì)3個(gè)連續(xù)的精氨酸的切斷率比2個(gè)連續(xù)精氨酸的情況減少的已知性質(zhì)，當(dāng)在P5位至P3位配置3個(gè)連續(xù)的精氨酸時(shí)可抑制P5位至P3位的精氨酸之間的切斷。即由此可促進(jìn)在希望的部位的切斷(P1位和P1’位的氨基酸之間的切斷)，抑制在不希望的部位的切斷(P5位至P3位的氨基酸之間的切斷)。
由以上現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)在希望的多肽中設(shè)計(jì)在希望切斷部位的P3位、P4位以及P5位配置了堿性氨基酸(優(yōu)選是精氨酸)的氨基酸序列，不僅對(duì)于該多肽中的希望的切斷部位的P1’位為以往的精氨酸或賴氨酸的情況，而且對(duì)于除天冬氨酸、谷氨酸或脯氨酸以外的其它氨基酸的情況OmpT蛋白酶也可非常有效地進(jìn)行切斷。
另外，該方法特別適合使含有目的肽的融合蛋白在大腸桿菌宿主中制造、通過大腸桿菌本來具有的或通過基因工程導(dǎo)入的OmpT蛋白酶從融合蛋白中切出在希望的切斷部位的P1’位至C末端側(cè)配置的N末端氨基酸為除天冬氨酸、谷氨酸或脯氨酸以外的氨基酸的目的肽。
關(guān)于上述(2)和(3)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)將從OmpT蛋白酶N末端開始的第97位氨基酸置換為特定的氨基酸時(shí)，在OmpT蛋白酶不能切斷的切斷部位實(shí)際上也可以切斷，在目的肽的制造中由于對(duì)該肽的N末端氨基酸的種類可進(jìn)行多樣選擇，所以有用性非常高。特別是在使用融合蛋白的目的肽的制法中，通過將與融合蛋白連接的連接序列設(shè)計(jì)為-Arg-Arg-Arg-Ala-Arg-目的肽，而且通過將從OmpT蛋白酶的N末端開始的第97位天冬氨酸特別優(yōu)選置換為亮氨酸、蛋氨酸或組氨酸的蛋白酶突變體作為加工蛋白酶利用，即使可被游離的多肽的N末端氨基酸為賴氨酸或精氨酸以外的氨基酸也有效、且可特異游離。
在本申請(qǐng)中涉及到的實(shí)施例中，可以認(rèn)為雖然使用來自大腸桿菌的OmpT蛋白酶的突變體可實(shí)施融合蛋白的切斷，但使用OmpT蛋白酶以外的具有OmpT蛋白酶活性的酶或在其氨基酸序列中對(duì)從相當(dāng)于OmpT蛋白酶的N末端開始的第97位氨基酸的氨基酸進(jìn)行置換的突變體切斷融合蛋白也是十分可能的。
另外，關(guān)于上述(4)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)多肽或融合蛋白中不希望被OmpT蛋白酶及其異構(gòu)體切斷的部位存在時(shí)，通過在該部位的P3位配置酸性氨基酸，可抑制在該部位的切斷。這一見解特別是在由融合蛋白獲得目的肽時(shí)的融合蛋白的設(shè)計(jì)中有用，可以非常有效地進(jìn)行目的肽的制造。
更具體地講，本發(fā)明涉及到以下事項(xiàng)。
(1)一種多肽的切斷方法，其特征是與多肽中希望的切斷部位相關(guān)的P1位為精氨酸或賴氨酸，P1’為天冬氨酸、谷氨酸或脯氨酸以外的氨基酸，在從P10位至P3或從P3’至P5’位的氨基酸序列中的任意部位連續(xù)配置1個(gè)堿性氨基酸或2個(gè)或3個(gè)堿性氨基酸(但是，配置1個(gè)堿性氨基酸時(shí)，除去P6或P4位)，使用OmpT蛋白酶在該多肽中希望的切斷部位進(jìn)行切斷。
(2)一種目的肽的制造方法，其特征是用含有編碼融合蛋白的基因的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，所述融合蛋白由通過希望的切斷部位與C末端為精氨酸或賴氨酸的保護(hù)肽融合的N末端為天冬氨酸、谷氨酸或脯氨酸以外的氨基酸的目的肽構(gòu)成，在融合蛋白質(zhì)中該切斷部位的P10位至P3或P3’至P5’位的氨基酸序列中的任意部位連續(xù)配置1個(gè)堿性氨基酸或2個(gè)或3個(gè)堿性氨基酸(但是，配置1個(gè)堿性氨基酸時(shí)，除去P6或P4位)，上述切斷部位作為可被OmpT蛋白酶切斷的切斷部位，在該細(xì)胞內(nèi)使該基因表達(dá)，通過上述蛋白酶在上述切斷部位切斷，可以由融合蛋白獲得目的肽。
(3)上述(1)或(2)所述的方法，其中，當(dāng)多肽中或融合蛋白中不希望被OmpT蛋白酶切斷的部位存在時(shí)，通過在該部位的P3位配置酸性氨基酸，可抑制在該部位的切斷。
(4)上述(1)至(3)中任一項(xiàng)所述的方法，其中在多肽中或融合蛋白中與希望的切斷部位相關(guān)的P10～P3位之間配置2或3個(gè)連續(xù)的堿性氨基酸。
(5)上述(4)中所述的方法，其中在多肽中或融合蛋白中與希望的切斷部位相關(guān)的P5～P3位配置3個(gè)連續(xù)的堿性氨基酸。
(6)上述(1)～(5)中任一項(xiàng)所述的方法，其中堿性氨基酸為精氨酸和/或賴氨酸。
(7)上述(6)所述的方法，其中堿性氨基酸為精氨酸。
(8)一種制造方法，該方法是使用OmpT蛋白酶在多肽中希望的切斷部位進(jìn)行切斷的多肽的切斷方法或在融合蛋白中希望的切斷部位進(jìn)行切斷目的肽的制造方法，其特征是當(dāng)在該多肽中或融合蛋白中不希望被OmpT蛋白酶切斷的部位存在時(shí)，通過在該部位的P3位配置酸性氨基酸，可以抑制在該部位的切斷。
(9)上述(3)～(8)中任一項(xiàng)所述的方法，其中酸性氨基酸為天冬氨酸。
(10)上述(1)～(9)中任一項(xiàng)所述的方法，其中多肽中或融合蛋白中與希望的切斷部位相關(guān)的P5位至P1位的氨基酸序列是Arg-Arg-Arg-Ala-Arg。
(11)上述(1)～(9)中任一項(xiàng)所述的方法，其中多肽中或融合蛋白中與希望的切斷部位相關(guān)的P7位至P1位的氨基酸序列是Asp-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Arg。
(12)一種多肽的切斷方法，其特征是使用從OmpT蛋白酶的N末端開始的第97位氨基酸為丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸或組氨酸的OmpT蛋白酶97位氨基酸突變體，在多肽中希望的切斷部位進(jìn)行切斷。
(13)一種多肽的切斷方法，其特征是當(dāng)多肽中與希望的切斷部位相關(guān)的P1位為精氨酸或賴氨酸、P1’位為精氨酸或賴氨酸以外的氨基酸時(shí)，使用從OmpT蛋白酶的N末端開始的第97位氨基酸為丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸或組氨酸的OmpT蛋白酶97位氨基酸突變體，在多肽中希望的切斷部位進(jìn)行切斷。
(14)一種多肽的切斷方法，其特征是當(dāng)多肽中與希望的切斷部位相關(guān)的P1位為精氨酸或賴氨酸，P1’位為精氨酸或賴氨酸以外的氨基酸，在從P10位至P3或從P3’至P5’位的氨基酸序列中的任意部位連續(xù)配置1個(gè)堿性氨基酸或2個(gè)或3個(gè)堿性氨基酸，使用從OmpT蛋白酶的N末端開始的第97位氨基酸為丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸或組氨酸的OmpT蛋白酶97位氨基酸突變體，在多肽中希望的切斷部位進(jìn)行切斷。
(15)一種目的肽的制造方法，其特征是用含有編碼在希望的切斷部位，通過可被從OmpT蛋白酶的N末端開始的第97位氨基酸為丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸或組氨酸的OmpT蛋白酶97位氨基酸突變體切斷的切斷部位與保護(hù)肽融合的目的肽構(gòu)成的融合蛋白的基因的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，在該細(xì)胞內(nèi)使上述基因表達(dá)，通過上述蛋白酶在上述切斷部位進(jìn)行切斷，可從融合蛋白獲得目的肽。
(16)一種目的肽的制造方法，其特征是用含有編碼融合蛋白的基因的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，其中在希望的切斷部位，通過可被從OmpT蛋白酶的N末端開始的第97位的氨基酸為丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸或組氨酸的OmpT蛋白酶97位氨基酸突變體切斷，所述融合蛋白由通過該切斷部位與C末端為精氨酸或賴氨酸的保護(hù)肽融合的N末端為精氨酸或賴氨酸酸以外的氨基酸的目的肽構(gòu)成，在該細(xì)胞內(nèi)使該基因表達(dá)，通過上述蛋白酶在上述切斷部位進(jìn)行切斷，可從融合蛋白獲得目的肽。
(17)一種目的肽的制造方法，其特征是用含有編碼融合蛋白的基因的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，所述融合蛋白是通過在希望的切斷部位與C末端為精氨酸或賴氨酸的保護(hù)肽融合的N末端為精氨酸或賴氨酸酸以外的氨基酸的目的肽構(gòu)成，在融合蛋白質(zhì)中與該切斷部位相關(guān)的P10至P3位或P3’位至P5’位的氨基酸序列的任意部位連續(xù)配置1個(gè)堿性氨基酸或2個(gè)或3個(gè)堿性氨基酸，上述切斷部位作為可被從OmpT蛋白酶的N末端開始的第97位氨基酸為丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸或組氨酸的OmpT蛋白酶97位氨基酸突變體切斷的切斷部位，在該細(xì)胞內(nèi)使該基因表達(dá)，通過上述蛋白酶在上述切斷部位進(jìn)行切斷，可從融合蛋白獲得目的肽。
(18)上述(12)～(17)任一項(xiàng)所述的方法，其特征是包括當(dāng)多肽中或融合蛋白中不希望被OmpT蛋白酶第97位氨基酸突變體切斷的部位存在時(shí)，通過在與該部位相關(guān)的P3位配置酸性氨基酸，可以抑制在該部位的切斷。
(19)上述(12)～(18)任一項(xiàng)所述的方法，其特征是包括在多肽中或融合蛋白中與希望的切斷部位相關(guān)的P10～P3位之間配置2或3個(gè)連續(xù)的堿性氨基酸。
(20)上述(19)中所述的方法，在多肽中或融合蛋白中與希望的切斷部位相關(guān)的P5～P3位配置3個(gè)連續(xù)的堿性氨基酸。
(21)上述(14)、(17)～(20)任一項(xiàng)所述的方法，其中堿性氨基酸為精氨酸和/或賴氨酸。
(22)上述(21)所述的方法，其中堿性氨基酸為精氨酸。
(23)一種制造方法，該方法是包括使用OmpT蛋白酶第97位氨基酸突變體在多肽中希望的切斷部位進(jìn)行切斷的多肽的切斷方法或包括在融合蛋白中希望的切斷部位進(jìn)行切斷的目的肽的制造方法，其特征是當(dāng)多肽中或融合蛋白中不希望被OmpT蛋白酶97位氨基酸突變體切斷的部位存在時(shí)，通過在與該部位相關(guān)的P3位配置酸性氨基酸，可以抑制在該部位的切斷。
(24)上述(18)～(23)中任一項(xiàng)所述的方法，其中酸性氨基酸為天冬氨酸。
(25)上述(12)～(24)中任一項(xiàng)所述的方法，其中與多肽中或融合蛋白中希望的切斷部位相關(guān)的P5位至P1位的氨基酸序列是Arg-Arg-Arg-Ala-Arg。
(26)上述(12)～(24)中任一項(xiàng)所述的方法，其中多肽中或融合蛋白中與希望的切斷部位相關(guān)的P7位至P1位的氨基酸序列是Asp-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Arg。
(27)上述(12)～(26)中任一項(xiàng)所述的方法，其中從OmpT蛋白酶的N末端開始的第97位氨基酸是亮氨酸、蛋氨酸或組氨酸。
(28)上述(12)～(26)中任一項(xiàng)所述的方法，其特征是使用多肽中或融合蛋白中與希望的切斷部位相關(guān)的P1’或目的肽的N末端為絲氨酸或丙氨酸，第97位氨基酸為亮氨酸的OmpT蛋白酶97位氨基酸突變體。
(29)上述(12)～(26)中任一項(xiàng)所述的方法，其特征是使用多肽中或融合蛋白中與希望的切斷部位相關(guān)的P1’位或目的肽的N末端為苯丙氨酸、丙氨酸、絲氨酸、半胱氨酸或酪氨酸，第97位氨基酸為蛋氨酸的OmpT蛋白酶97位氨基酸突變體。
(30)上述(12)～(26)中任一項(xiàng)所述的方法，其特征是使用多肽中或融合蛋白中與希望的切斷部位相關(guān)的P1’或目的肽的N末端為丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺，第97位氨基酸為組氨酸的OmpT蛋白酶97位氨基酸突變體。
(31)上述(2)～(11)、(15)～(30)中任一項(xiàng)所述的方法，其中目的肽是由22個(gè)氨基酸殘基至45個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的肽。
(32)上述(31)所述的方法，其中目的肽是腎上腺皮質(zhì)刺激激素(1-24)、胃動(dòng)素或降鈣素前體。
(33)上述(2)～(11)、(15)～(32)中任一項(xiàng)所述的方法，其中宿主細(xì)胞是大腸桿菌。
(34)上述(1)～(33)中任一項(xiàng)所述的方法，其特征是作為切斷用蛋白酶使用表達(dá)編碼OmpT蛋白酶或表達(dá)編碼從OmpT蛋白酶的N末端開始的第97位氨基酸為丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸或組氨酸的OmpT蛋白酶97位氨基酸突變體的基因的菌體本身。
(35)上述(1)～(33)中任一項(xiàng)所述的方法，其特征是使編碼OmpT蛋白酶或編碼從OmpT蛋白酶的N末端開始的第97位氨基酸為丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸或組氨酸的OmpT蛋白酶97位氨基酸突變體的基因與編碼希望用該蛋白酶切斷的多肽或融合蛋白的基因共表達(dá)。
附圖的簡(jiǎn)要說明

圖1是表示融合蛋白質(zhì)PRR以及PRX結(jié)構(gòu)的圖。在融合蛋白PRR的氨基酸序列上表示出了各個(gè)氨基酸的位置，下面的數(shù)字表示從PRR的N末端開始的氨基酸序列編號(hào)。β-gal117S4H表示來自于大腸桿菌的β-半乳糖苷酶的從N末端開始的117個(gè)氨基酸的保護(hù)蛋白質(zhì)、GLP-1(7-37)表示人胰高血糖素樣肽-1(7-37)、連接肽表示從氨基酸序列編號(hào)的第128的谷氨酰胺至第153位精氨酸的序列。(黑三角)表示在融合蛋白PRR中的OmpT蛋白酶切斷部位。融合蛋白PRX是PRR的第141位天冬酰胺被其它19種氨基酸置換的融合蛋白。
圖2是表示融合蛋白PAn結(jié)構(gòu)的圖。在融合蛋白PA的氨基酸序列上表示出了各個(gè)氨基酸的位置，下面的數(shù)字表示從PA的N末端開始的氨基酸序列編號(hào)。β-gal117S4H表示來自于大腸桿菌的β-半乳糖苷酶的從N末端開始的117個(gè)氨基酸的保護(hù)蛋白質(zhì)、GLP-1(7-37)表示人胰高血糖素樣肽-1(7-37)、連接肽表示從氨基酸序列編號(hào)的第128的谷氨酰胺至第153位精氨酸的序列。(黑三角)表示在融合蛋白PA中的OmpT蛋白酶切斷部位。斜黑體字表示融合蛋白PAn中氨基酸置換導(dǎo)入后的精氨酸?！硎綪An的OmpT蛋白酶切斷部位。在圖中右側(cè)給出了以融合蛋白PA的切斷率為100％時(shí)的各融合蛋白的切斷率。a也包括在Arg139-Arg140的切斷率。b也包括在Arg141-Arg142的切斷率。c也包括在Arg143-Ala144的切斷率。
圖3是表示融合蛋白PA1A3’，PA1’A3’，PA23’，PA323’，以及PA2’3’結(jié)構(gòu)的圖。在融合蛋白PA3’的氨基酸序列上表示出了各個(gè)氨基酸的位置，下面的數(shù)字表示從PA3’的N末端開始的氨基酸序列編號(hào)。β-gal117S4H表示來自于大腸桿菌的β-半乳糖苷酶的從N末端開始的117個(gè)氨基酸的保護(hù)蛋白質(zhì)、GLP-1(7-37)表示人胰高血糖素樣肽-1(7-37)、連接肽表示從氨基酸序列編號(hào)的第128的谷氨酰胺至第153位精氨酸的序列。黑體字表示精氨酸。(切斷率73％)、(黑三角)(切斷率220％)表示在融合蛋白PA3’中的OmpT蛋白酶切斷部位。斜體字表示在融合蛋白PA1A3’，PA1’A3’，PA23’，PA323’，以及PA2’3’中，在PA3’中氨基酸置換導(dǎo)入后的精氨酸，↓表示OmpT蛋白酶切斷部位。在圖中右側(cè)給出了以融合蛋白PA的切斷率為100％時(shí)的在各融合蛋白的Arg140-Arg141(●)和Arg143-Arg144(○)的切斷率。ND表示不能檢測(cè)。a表示在Arg140-Ala141的切斷率。b也包括在Arg139-Arg140的切斷率。c也包括在Arg142-Arg143的切斷率。
圖4是表示融合蛋白PA3D23’，PA4D23’，PA5D23’結(jié)構(gòu)的圖。在融合蛋白PA23’的氨基酸序列上表示出了各個(gè)氨基酸的位置，下面的數(shù)字表示從PA23’的N末端開始的氨基酸序列編號(hào)。β-gal117S4H表示來自于大腸桿菌的β-半乳糖苷酶的從N末端開始的117個(gè)氨基酸的保護(hù)蛋白質(zhì)、GLP-1(7-37)表示人胰高血糖素樣肽-1(7-37)、連接肽表示從氨基酸序列編號(hào)的第128的谷氨酰胺至第153位精氨酸的序列。精氨酸用黑體字表示。(黑三角)表示在融合蛋白PA23’中主要的OmpT蛋白酶切斷部位。斜體表示在融合蛋白PA3D23’，PA4D23’和PA5D23’中，PA23’中氨基酸置換導(dǎo)入后的精氨酸，↓表示OmpT蛋白酶切斷部位。在圖中右側(cè)給出了以融合蛋白PA的切斷率為100％時(shí)的在各融合蛋白的Arg140-Arg141(●)和Arg143-Ala144(○)的切斷率。ND表示不能檢測(cè)。
圖5是表示融合蛋白PRMT以及PMT結(jié)構(gòu)的圖。兩個(gè)融合蛋白的氨基酸序列上的數(shù)字表示從N末端開始的氨基酸的序列編號(hào)。β-gal117S4H表示來自于從大腸桿菌β-半乳糖苷酶的N末端開始的117個(gè)氨基酸的保護(hù)蛋白質(zhì)、連接肽在PRMT中表示從氨基酸序列編號(hào)的第128的谷氨酰胺至第140位精氨酸的序列，在PMT中表示從氨基酸序列編號(hào)的第128的谷氨酰胺至第143位精氨酸的序列。直至融合蛋白PRMT的140位精氨酸之前的氨基酸序列與從具有圖1所示結(jié)構(gòu)的融合蛋白PRR(特愿2000-602803)的N末端開始直至140位精氨酸的氨基酸序列一致。另外直至融合蛋白PMT的143位精氨酸之前的氨基酸序列與從融合蛋白PA23’(圖4)的N末端開始直至143位精氨酸的氨基酸序列一致?！癖硎驹谌诤系鞍譖MT中的OmpT蛋白酶切斷部位。○表示OmpT蛋白酶突變體D97M的切斷部位。RAR-motilin包括通過Arg140-Arg141的切斷從PMT游離的Arg-Ala-Arg-motilin的多肽，RRAR-motilin包括通過Arg139-Arg140的切斷從PMT游離的Arg-Arg-Ala-Arg-motilin的多肽。
圖6表示通過HPLC對(duì)融合蛋白PRMT以及PMT與野生型OmpT蛋白酶以及OmpT蛋白酶突變體D97M的反應(yīng)(25℃、120分鐘)進(jìn)行解析的結(jié)果。
圖7是表示W(wǎng)3110 M25 PMT以及W3110 M25 OmpT D97M表達(dá)菌在2L高密度培養(yǎng)中的培養(yǎng)液OD660隨時(shí)間變化的圖?！馂閃3110 M25 PMT，●為W3110 M25 OmpT D97M。兩個(gè)重組大腸桿菌都在葡萄糖濃度1.5％、32℃下開始培養(yǎng)，在培養(yǎng)開始后約12小時(shí)，葡萄糖耗盡后，添加葡萄糖使?jié)舛冗_(dá)到2％，將培養(yǎng)溫度調(diào)到37℃，然后每當(dāng)葡萄糖耗盡時(shí)同樣按照終濃度達(dá)2％那樣添加葡萄糖(W3110 M25 PMT，↑，W3110M25 OmpT D97M，↓)，W3110 M25 PMT在培養(yǎng)開始后24小時(shí)停止培養(yǎng)，而W3110 M25 OmpT D97M在培養(yǎng)開始后20小時(shí)停止培養(yǎng)。
圖8是表示經(jīng)OmpT蛋白酶突變體D97M作用由融合蛋白PMT游離的胃動(dòng)素隨時(shí)間變化的圖。
圖9中，A表示60分鐘后的反應(yīng)液經(jīng)HPLC分析的結(jié)果，B表示用SDS-PAGE分析的結(jié)果。帶1只有PMT；2為PMT+D97M；3為胃動(dòng)素標(biāo)準(zhǔn)品。反應(yīng)液組成4M尿素，50mM磷酸鈉(pH7.0)，2mM EDTA，PMT OD660＝50，OmpT D97M OD660＝16；反應(yīng)溫度25℃；以120min-1進(jìn)行振蕩。
圖10中，A表示在實(shí)施例1、3、5、7、9、16以及18中構(gòu)建的融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)。B表示實(shí)施例11中構(gòu)建的OmpT蛋白酶或OmpT蛋白酶突變體表達(dá)質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)。
圖11表示融合蛋白PAC以及PCT的結(jié)構(gòu)。各個(gè)融合蛋白的氨基酸序列下的數(shù)字表示從N末端開始的氨基酸序列編號(hào)。β-gal117S4H表示來自于從大腸桿菌的β-半乳糖苷酶的N末端開始的117個(gè)氨基酸的保護(hù)蛋白質(zhì)、連接肽表示從氨基酸序列編號(hào)的第128的谷氨酰胺至第143位精氨酸為止的序列。各個(gè)融合蛋白的第143位精氨酸之前的氨基酸序列與從融合蛋白PA23’(圖4)的N末端開始直至143位精氨酸的氨基酸序列一致。
圖12表示通過HPLC對(duì)融合蛋白與野生型OmpT蛋白酶以及OmpT蛋白酶突變體的反應(yīng)進(jìn)行解析的結(jié)果。PAC與D97L于25℃下反應(yīng)10分鐘、PCT與D97H于25℃下反應(yīng)2小時(shí)。
圖13表示實(shí)施例17中構(gòu)建的OmpT蛋白酶突變體D97M表達(dá)質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)。MCS多克隆位點(diǎn)。
圖14是表示利用從對(duì)實(shí)施例17制作的融合蛋白PMT和OmpT蛋白酶突變體D97M進(jìn)行共表達(dá)的W3110 M25轉(zhuǎn)化大腸桿菌得到的包涵體，由融合蛋白PMT游離出的人胃動(dòng)素經(jīng)SDS-PAGE分析的結(jié)果。Mr，蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；帶1，反應(yīng)開始后20分鐘；2，40分鐘；3，60分鐘；4，120分鐘；5，180分鐘；6，240分鐘；7，300分鐘；8，360分鐘；9，1440分鐘(24小時(shí))；10，胃動(dòng)素標(biāo)準(zhǔn)品。反應(yīng)液組成4M尿素，50mM磷酸鈉(pH7.0)，2mM EDTA，包涵體OD660＝20；反應(yīng)溫度25℃。
圖15表示融合蛋白PMT、PMT6D以及PMT7D的結(jié)構(gòu)。各個(gè)融合蛋白的氨基酸序列下的數(shù)字表示從N末端開始的氨基酸序列編號(hào)。β-gal117S4H表示來自于從大腸桿菌的β-半乳糖苷酶的N末端開始的117個(gè)氨基酸的保護(hù)蛋白質(zhì)、連接肽表示從氨基酸序列編號(hào)的第128位的谷氨酰胺至第143位精氨酸為止的序列。這些融合蛋白的第143位精氨酸之前的氨基酸序列分別與從融合蛋白PA23’、PA3D23’以及PA4D23’(圖4)的N末端開始直至143位精氨酸的氨基酸序列一致。各個(gè)融合蛋白的可被OmpT蛋白酶突變體D97M切斷的切斷部位用箭頭表示。AR-motilin是由因Arg141-Ala142的切斷游離的Ala-Arg-motilin構(gòu)成的多肽，RRAR motilin是由因Arg139-Arg140的切斷游離的Arg-Arg-Ala-Arg-motilin構(gòu)成的多肽。
圖16表示通過HPLC對(duì)融合蛋白PMT與OmpT蛋白酶突變體D97M的反應(yīng)(25℃、120分鐘)進(jìn)行解析的結(jié)果。括弧內(nèi)的數(shù)字表示以由融合蛋白生成的胃動(dòng)素濃度為100時(shí)的各個(gè)副產(chǎn)物濃度。
圖17表示通過HPLC對(duì)融合蛋白PMT6D與OmpT蛋白酶突變體D97M的反應(yīng)(25℃、120分鐘)進(jìn)行解析的結(jié)果。括弧內(nèi)的數(shù)字表示以由融合蛋白生成的胃動(dòng)素濃度為100時(shí)的各個(gè)副產(chǎn)物濃度。
圖18表示通過HPLC對(duì)融合蛋白PMT7D與OmpT蛋白酶突變體D97M的反應(yīng)(25℃、120分鐘)進(jìn)行解析的結(jié)果。括弧內(nèi)的數(shù)字表示以由融合蛋白生成的胃動(dòng)素濃度為100時(shí)的各個(gè)副產(chǎn)物濃度。
具體實(shí)施例方式
以下對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
pG117S4HompPRR是表達(dá)含有胰高血糖素樣多肽-1(7-37)(GLP-1(7-37))的融合蛋白(PRR)的表達(dá)質(zhì)粒。
本融合蛋白的保護(hù)蛋白質(zhì)由含有大腸桿菌β-半乳糖苷酶的N末端117個(gè)氨基酸的β-gal117S4H作為保護(hù)蛋白質(zhì)、配置了精氨酸-精氨酸序列的26個(gè)氨基酸構(gòu)成的連接肽序列和GLP-1(7-37)構(gòu)成。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大腸桿菌OmpT蛋白酶切斷PRR的連接肽序列中的精氨酸-精氨酸序列中央的肽鍵，使含有GLP-1(7-37)的44個(gè)氨基酸的目的多肽游離(Okuno，K.et al.Biosci.Biotechnol.Biochem.66127-134，2002)。
然后本發(fā)明人制作了以融合蛋白(PRR)為基礎(chǔ)，P1位與P1’位為精氨酸、這些部位以外的從P10位至P5’位的氨基酸全部置換為丙氨酸的融合蛋白PA。
另外，從該融合蛋白PA出發(fā)，制作各個(gè)部位的每個(gè)丙氨酸都置換為精氨酸的融合蛋白(PAn)，通過在OmpT蛋白酶切斷部位周邊配置堿性氨基酸精氨酸研究對(duì)OmpT蛋白酶切斷的影響。
結(jié)果新發(fā)現(xiàn)了當(dāng)切斷部位周邊氨基酸序列的P10位至P3位或P3’位至P5’位存在堿性氨基酸(例如，精氨酸、賴氨酸)時(shí)(但是，除去僅P6或P4位一處被堿性氨基酸置換的情況)，切斷率上升。
另外，當(dāng)P2位或P2’位為精氨酸時(shí)，加上作為切斷部位配置的P1位或P1’位的2個(gè)精氨酸，精氨酸變成3個(gè)連續(xù)的序列，這種場(chǎng)合下切斷率反而降低了。即，雖然通過使精氨酸存在于切斷部位周邊，切斷率上升，但3個(gè)精氨酸連續(xù)的情況下，切斷率倒降低了，判明通過將切斷部位周邊的氨基酸序列置換為精氨酸，可對(duì)切斷率進(jìn)行調(diào)控。
另外判明在P3’位存在精氨酸的融合蛋白PA3’(切斷部位周邊氨基酸序列為-Ala-Ala-Arg[P1]-Arg[P1’]-Ala-Arg[P3’]-Ala[P4’]-Ala-)中，P3’位的精氨酸與P4’位的精氨酸之間也會(huì)發(fā)生切斷，發(fā)現(xiàn)了其中可有效切斷精氨酸-精氨酸之間的序列。在堿性氨基酸連續(xù)串聯(lián)排列以外的序列可有效切斷底物這一事實(shí)由于對(duì)以O(shè)mpT蛋白酶作為加工酶使用非常重要，所以本發(fā)明人進(jìn)行了進(jìn)一步研究。
根據(jù)通過在切斷部位周邊配置精氨酸，切斷效率上升的見解，以及對(duì)于精氨酸3個(gè)連續(xù)的情況，在精氨酸-精氨酸間難于切斷的見解，研究各種氨基酸序列時(shí)，發(fā)現(xiàn)在氨基酸序列-Arg-Arg-Arg-Ala-Arg-Ala-中，主要的切斷發(fā)生在-Arg-Arg-Arg-Ala-Arg↓Ala-。即，通過配置3個(gè)連續(xù)的堿性氨基酸，顯然具有促進(jìn)在存在于該序列以后的堿性氨基酸部位的切斷的性質(zhì)。
然而，在上述氨基酸序列(-Arg-Arg-Arg-Ala-Arg-Ala-)中，即使在3個(gè)連續(xù)的精氨酸序列中也會(huì)發(fā)生切斷。為了使這樣情況減少，制作在N末端側(cè)上游氨基酸序列配置了酸性氨基酸天冬氨酸的氨基酸序列-Asp-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Arg↓Ala-。通過使用該序列，精氨酸-丙氨酸間的切斷率下降一半，可成功地抑制3個(gè)連續(xù)的精氨酸序列中的切斷。即，在這些序列-Arg-Arg-Arg-Ala-Arg↓Ala-或-Asp-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Arg↓Ala-中，要考慮使OmpT蛋白酶的切斷在精氨酸-丙氨酸間容易發(fā)生那樣的最適化。預(yù)期通過使用這些序列(-Arg-Arg-Arg-Ala-Arg-Ala-以及Asp-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Arg-Ala-)、特別優(yōu)選使用Asp-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Arg-Ala-，即使P1’位為丙氨酸以外的氨基酸也可高效地切斷。
根據(jù)以上結(jié)果，通過在-Arg-Arg-Arg-Ala-Arg↓Ala-的切斷部位的C末端側(cè)氨基酸序列配置生理活性肽，是否可以用OmpT蛋白酶直接從融合蛋白切出該生理活性肽，以胃動(dòng)素(N末端氨基酸為苯丙氨酸)作為目的多肽進(jìn)行了研究。嘗試制作以胃動(dòng)素作為目的多肽的融合蛋白PMT，使OmpT蛋白酶作用，切出胃動(dòng)素。
可是判明不能有效地從融合蛋白PMT切出胃動(dòng)素。由此結(jié)果可以認(rèn)為作為OmpT蛋白酶的底物特異性，已知對(duì)P1’位的氨基酸是寬容的，但是為了在有效切斷中利用，認(rèn)為有必要在本蛋白酶自體導(dǎo)入突變，提高對(duì)P1’位氨基酸的特異性。
解析OmpT的結(jié)晶結(jié)構(gòu)的論文(Vandeputte-Rutten，L.et al.EMBO J.205033-5039，2001)已發(fā)表，在與此有關(guān)的論文(Kramer，RA.et al.FEBS lett.505426-430，2001)中，考察底物的P1’位氨基酸與OmpT蛋白酶的Asp97(從N末端開始的第97位天冬氨酸)是否相互作用。為了研究對(duì)這第97位氨基酸進(jìn)行置換時(shí)發(fā)生的底物特異性的變化，制作將OmpT的Asp97置換為20種氨基酸(包括對(duì)天冬氨酸的同義置換)的突變體的質(zhì)粒，將這些質(zhì)粒導(dǎo)入OmpT缺損大腸桿菌BL21株后，制備OmpT蛋白酶突變體OmpT D97X(X對(duì)應(yīng)于20種氨基酸)表達(dá)大腸桿菌20株。
以目的是研究OmpT蛋白酶的P1’位底物特異性而制備的具有如圖1所示結(jié)構(gòu)的融合蛋白質(zhì)PRX(X對(duì)應(yīng)于20種氨基酸，參照特愿2000-602803)作為底物，使上述突變體作用，研究各個(gè)融合蛋白質(zhì)的切斷。其結(jié)果判明將OmpT蛋白酶的97位天冬氨酸置換為丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸、組氨酸的序列，雖然在切斷率有高低之分，但具有切斷融合蛋白質(zhì)PRX的活性。已清楚突變體OmpT D97L對(duì)于絲氨酸、丙氨酸，OmpT D97M對(duì)于苯丙氨酸、丙氨酸、絲氨酸、半胱氨酸以及酪氨酸，OmpT D97H對(duì)于丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸以及天冬酰胺分別表現(xiàn)出高的特異性。
利用由此得到的見解，考慮使胃動(dòng)素的N末端氨基酸為苯丙氨酸，使當(dāng)P1’部位為苯丙氨酸時(shí)很好切斷的OmpT D97M作用于前述的融合蛋白PMT，可以高效切出胃動(dòng)素。即本發(fā)明人通過對(duì)OmpT蛋白酶的切斷部位周邊的序列進(jìn)行最適化，以及利用OmpT蛋白酶突變體，在到目前為止在所希望的位置OmpT蛋白酶切斷困難的切斷也變得可切斷方面獲得了成功。
另外為了驗(yàn)證該手法在工業(yè)上利用，對(duì)表達(dá)融合蛋白PMT大腸桿菌以及表達(dá)OmpT D97M蛋白酶突變體的大腸桿菌進(jìn)行高密度培養(yǎng)，直接向含有從表達(dá)融合蛋白PMT大腸桿菌制備的包涵體的反應(yīng)液中添加表達(dá)OmpT D97M蛋白酶突變體的大腸桿菌本身，于25℃、作用1小時(shí)。向該反應(yīng)液添加20mM乙酸(pH4.0)，除去沉淀后，將上清液進(jìn)行陽離子交換和反相層析。通過這一系列操作每1L表達(dá)融合蛋白PMT的大腸桿菌培養(yǎng)液可以以52％回收率生產(chǎn)純度99.0％或更高的胃動(dòng)素160mg，充分表現(xiàn)出可工業(yè)化生產(chǎn)的水準(zhǔn)。
另外為了證實(shí)該多肽生產(chǎn)系的通用性，制備作為目的多肽配置人腎上腺皮質(zhì)刺激激素(1-24)(N末端氨基酸為絲氨酸)以及人降鈣素前體(N末端氨基酸為半胱氨酸)的融合蛋白，用OmpT蛋白酶突變體進(jìn)行處理。任一個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果都可以得到所希望的目的多肽，成功地表現(xiàn)出該體系的通用性之廣。
另外，制備對(duì)融合蛋白PMT和OmpT D97M蛋白酶突變體進(jìn)行共表達(dá)的大腸桿菌，只是用尿素對(duì)培養(yǎng)該大腸桿菌得到的包涵體進(jìn)行溶解，也可確認(rèn)從融合蛋白PMT可以使人胃動(dòng)素游離。
另外，在下述的實(shí)施例中沒有給出具體的實(shí)驗(yàn)操作，只要是沒有特別敘述，都根據(jù)以下的方法。
(1)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建使用大腸桿菌JM109，按照常規(guī)方法進(jìn)行。構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒是目的質(zhì)粒這一事實(shí)可通過利用為導(dǎo)入突變進(jìn)行PCR得到的DNA區(qū)域以及通過合成DNA置換得到的DNA區(qū)域的堿基序列決定確認(rèn)。實(shí)施例1、3、5、7、9、16、18中制作的質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)如圖10A所示，實(shí)施例11中制作的質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)如圖10B所示。實(shí)施例17中制作的質(zhì)粒如圖13所示。
(2)OmpT蛋白酶酶活性的測(cè)定OmpT蛋白酶活性以強(qiáng)啡肽A(肽研究所制造)作為底物進(jìn)行測(cè)定。
向含有0.1％Triton X-100的50mM磷酸鈉(pH6.0)40μL中加1mg/mL的強(qiáng)啡肽A5μL，再加入OmpT蛋白酶活性測(cè)定樣品5μL，開始反應(yīng)。反應(yīng)在25℃下進(jìn)行10分鐘，加1NHCl 5μL停止反應(yīng)。將反應(yīng)液經(jīng)10000×g、3分鐘離心分離，回收上清液，取20μL進(jìn)行HPLC分析。
HPLC分析使用YMC PROTEINRP柱，于柱溫度40℃、流速1mL/min下進(jìn)行。用含有0.1％三氟乙酸的10％乙腈洗3分鐘后，通過10分鐘含0.1％三氟乙酸的10-15％乙腈的線性梯度洗脫。監(jiān)測(cè)220nm的吸收，檢測(cè)出分解產(chǎn)物肽Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg。將在該反應(yīng)條件下，25℃1分鐘內(nèi)切斷強(qiáng)啡肽A1μmol時(shí)的OmpT蛋白酶活性定為1unit。
(3)SDS-聚丙烯酰胺電泳為了研究融合蛋白的切斷使用的SDS-聚丙烯酰胺電泳，凝膠使用テフコ公司生產(chǎn)的16％Peptide-PAGEmini、電泳緩沖液使用BioRad公司生產(chǎn)的Tricine電泳緩沖液、分子量標(biāo)準(zhǔn)使用テフコ公司或BioRad公司生產(chǎn)的蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)。向樣品添加等量的含有4M尿素的2×SDS-PAGE樣品緩沖液，100℃、加熱5分鐘。取10μL進(jìn)行電泳，在テフコ公司指定的電泳條件下進(jìn)行電泳。電泳后用含有考馬司亮藍(lán)一R-250的染色液進(jìn)行染色。
(4)包涵體的制備在本實(shí)施例中，當(dāng)大腸桿菌中融合蛋白以包涵體表達(dá)，大腸桿菌表達(dá)OmpT蛋白酶時(shí)，得到的包涵體僅用尿素溶解就受到OmpT蛋白酶的切斷。因此為了避免切斷，用表達(dá)融合蛋白質(zhì)粒轉(zhuǎn)化OmpT蛋白酶缺損大腸桿菌株W3110 M25，使融合蛋白以包涵體形式表達(dá)。將表達(dá)各融合蛋白的W3110 M25重組大腸桿菌在2L三角燒瓶中用含有四環(huán)素10mg/L的LB液體培養(yǎng)基(0.5％(w/v)酵母提取物、1％(w/v)胰胨(tryptone)、0.5％氯化鈉)400mL于37℃下，以150rpm旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)一晚。
翌日，通過在4℃、6000×g條件下離心分離10分鐘，回收菌體，對(duì)菌體進(jìn)行超音波處理，破碎菌體。向該菌體破碎液加去離子水，調(diào)整到30mL，在4℃、25000×g條件下進(jìn)行15分鐘離心分離，廢棄上清回收沉淀級(jí)分(包涵體)。再懸浮于30mL的50mM Tris-HCl(pH8.0)，5mM EDTA，1％Triton X-100中，于4℃、25000×g條件下進(jìn)行15分鐘離心分離，得到沉淀。將該沉淀用30mL的去離子水懸浮后，在4℃、25000×g條件下進(jìn)行15分鐘離心分離，回收沉淀。向沉淀中加去離子水，調(diào)整到1.5mL，懸浮后通過在4℃、10000×g條件下進(jìn)行30分鐘離心分離，得到沉淀，再度重復(fù)同操作，直至達(dá)到OD660＝100，用去離子水將沉淀懸浮，將這樣制備的包涵體作為OmpT蛋白酶反應(yīng)的底物使用。
(5)OmpT蛋白酶反應(yīng)以融合蛋白作為底物，象下述那樣進(jìn)行OmpT蛋白酶反應(yīng)。向10M尿素20μL中加1M磷酸鈉(pH7.0)2.5μL、以及50mM EDTA 2μL，添加融合蛋白包涵體(OD660＝100)10μL，溶解包涵體。再添加10.5μL水，然后添加1.4units/mL的OmpT蛋白酶5μL，在反應(yīng)液量50μL中開始反應(yīng)。反應(yīng)溫度為25℃，進(jìn)行30分鐘。
與OmpT蛋白酶反應(yīng)得到的多肽的定量只要沒有特別說明，通過HPLC在以下的條件下進(jìn)行。向OmpT蛋白酶反應(yīng)液中添加150μL的6％乙酸、2M尿素，停止反應(yīng)，在10000×g下進(jìn)行3分鐘離心分離，將上清液20μL加到Y(jié)MC PROTEIN RP柱上。HPLC在柱溫度40℃、流速1mL/min條件下進(jìn)行。通過20分鐘含0.1％三氟乙酸的30-50％乙腈的線性梯度洗脫，監(jiān)測(cè)214nm吸收，進(jìn)行多肽的定量。
(6)多肽的質(zhì)量解析為了推定切斷部位，使用Thermo Finnigan公司生產(chǎn)SSQ710對(duì)通過HPLC分離的多肽進(jìn)行質(zhì)量分析。
(7)大腸桿菌外膜級(jí)分的制備象以下那樣制備宿主為W3110 M25的表達(dá)OmpT蛋白酶或OmpT蛋白酶突變體的大腸桿菌的外膜級(jí)分，在實(shí)施例10、14、16以及18中作為OmpT蛋白酶或OmpT蛋白酶突變體用在融合蛋白的切斷反應(yīng)中。培養(yǎng)方法與(4)同樣進(jìn)行，培養(yǎng)結(jié)束后、通過4℃、6000×g、10分鐘離心分離得到菌體。通過將該菌體用10mM Tris-HCl(pH8.0)、1mMEDTA(TE)懸浮、超聲波處理，破碎菌體。將菌體破碎液經(jīng)4℃、1000×g、10分鐘離心分離后，廢棄沉淀，回收破碎液。再將該破碎液經(jīng)4℃、36000×g、40分鐘離心分離，回收沉淀，用TE懸浮，再度于4℃、36000×g條件下進(jìn)行40分鐘離心分離。將得到的沉淀在TE懸浮使之達(dá)到OD660＝10。不使用時(shí)冷凍保存在-20℃下。
實(shí)施例以下給出實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
實(shí)施例1.融合蛋白PAn的制備OmpT蛋白酶是存在于大腸桿菌外膜的內(nèi)切蛋白酶。由于考慮到在本酶的切斷中切斷部位周邊的氨基酸序列中的堿性氨基酸有非常大的影響，所以本發(fā)明人利用本酶的已知的切斷部位，進(jìn)行如下所示的實(shí)驗(yàn)，研究堿性氨基酸的位置與切斷率的關(guān)系。
制作可被OmpT蛋白酶切斷的具有如圖2所示結(jié)構(gòu)的融合蛋白PA(將通過連接肽來自大腸桿菌的β-半乳糖苷酶的N末端117氨基酸的保護(hù)蛋白質(zhì)(β-gal117S4H)與人胰高血糖素肽-1(7-37)(GLP-1(7-37))的融合蛋白的切斷部位的P10位至P2位以及P2’位至P5’位的丙氨酸置換為精氨酸，對(duì)存在于連接肽內(nèi)的OmpT蛋白酶切斷部位進(jìn)行了變換的融合蛋白PAn(圖2n對(duì)應(yīng)于切斷部位的氨基酸的位置[Pn]，由P10至P2以及由P2’至P5’)，對(duì)于OmpT蛋白酶的切斷進(jìn)行研究。
無論是在融合蛋白的連接部分插入了作為大腸桿菌OmpT蛋白酶的識(shí)別·切斷部位的精氨酸-精氨酸序列的融合蛋白PRR(圖1)的表達(dá)質(zhì)粒，還是以具有圖10A所示結(jié)構(gòu)的pG117S4HompPRR(參照特愿2000-602803)為基礎(chǔ)，通過用PCR進(jìn)行部位特異的突變導(dǎo)入以及與合成DNA的置換表達(dá)融合蛋白PA的質(zhì)粒，都構(gòu)建如具有圖10A所示結(jié)構(gòu)的pG117S4HompPA。另外，融合蛋白PAn的表達(dá)質(zhì)粒pG117S4HompPAn是在具有如圖2所示結(jié)構(gòu)的融合蛋白PA的表達(dá)質(zhì)粒pG117S4HompPA中使用PCR導(dǎo)入置換堿基后構(gòu)建的。構(gòu)建的質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)如圖10A所示。用這些融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化OmpT蛋白酶缺損大腸桿菌株W3110M25，使融合蛋白以包涵體形式表達(dá)。
實(shí)施例2.OmpT蛋白酶對(duì)融合蛋白PAn的切斷使用將具有可被OmpT蛋白酶切斷的結(jié)構(gòu)的如圖2所示融合蛋白PA的OmpT蛋白酶切斷部位周邊的丙氨酸置換為精氨酸的融合蛋白PAn(圖2)，研究OmpT蛋白酶的切斷率。使PAn在pH7.0下與根據(jù)特愿2000-602803，使用苯甲脒瓊脂糖(ベンザミジンセファロ一ス)6B純化的OmpT蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)。酶反應(yīng)后，由HPLC分析結(jié)果得到的切斷率也表示在圖2中。另外，由質(zhì)量分析結(jié)果得到的切斷部位也表示在圖2。
所有的PAn在與原來的PA相同部位被OmpT蛋白酶切斷，PA2，PA2’以及PA3’在另外部位也發(fā)生切斷(圖2)。特別是PA3’在Arg140-Arg141以及Arg143-Ala1442個(gè)地方被切斷(切斷率分別為220，73％)，這表明在連續(xù)的堿性氨基酸以外的氨基酸之間(Arg143-Ala144)可進(jìn)行切斷。
在除了PA2與PA2’之外的所有PAn中確認(rèn)切斷率上升，可以認(rèn)為通過在切斷部位周邊氨基酸序列中的P10至P3以及P3’至P5’配置精氨酸，可以使切斷率提高。其中PA4表現(xiàn)出最高切斷率，約為PA的5倍，可知在P4位配置精氨酸是最有效果的。另一方面在PA2以及PA2’中，切斷率減少到約1/3，可知如果變成3個(gè)連續(xù)的精氨酸序列，切斷率降低。
實(shí)施例3.融合蛋白PA1A3’、PA1’A3’的制備已知OmpT蛋白酶是主要切斷連續(xù)的堿性氨基酸之間的酶。可是由實(shí)施例2的結(jié)果可知融合蛋白PA3’在Arg140-Arg141和Arg143-Ala142處被切斷，而且其中的一處是-Arg↓Ala-的切斷。在這個(gè)-Arg↓Ala-的切斷率與連續(xù)的堿性氨基酸間的切斷率比較雖然低，但有可能改善為在工業(yè)上可利用的切斷率。
因此為了抑制在融合蛋白PA3’的2個(gè)切斷部位Arg140-Arg141以及Arg143-Ala144中的Arg140-Arg141的切斷，制備具有Arg140或Arg141置換為丙氨酸的氨基酸序列的融合蛋白PA1A3’和PA1’A3’(圖3)，研究這些融合蛋白被OmpT蛋白酶的切斷。同時(shí)使用這些融合蛋白，對(duì)于Arg143-Ala144的切斷究竟需要Arg140(以Arg143、Ala144分別作為P1位、P1’位的P4位)和Arg141(以Arg143、Ala144分別作為P1位、P1’位的P3位)的哪一個(gè)也進(jìn)行了研究。
融合蛋白PA1A3’以及PA1’A3’的表達(dá)質(zhì)粒pG117S4HompPA1A3’和pG117S4HompPA1’A3’使用PCR向具有如圖3所示結(jié)構(gòu)的融合蛋白PA3’的表達(dá)質(zhì)粒pG117S4HompPA3’導(dǎo)入置換堿基后構(gòu)建。圖10A給出了構(gòu)建的質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)。用這些融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化OmpT蛋白酶缺損大腸桿菌株W3110 M25，使融合蛋白以包涵體形式表達(dá)。
實(shí)施例4.OmpT蛋白酶對(duì)融合蛋白PA1A3’以及PA1’A3’的切斷對(duì)如圖3所示融合蛋白PA1A3’以及PA1’A3’可被OmpT蛋白酶切斷的切斷部位以及切斷率進(jìn)行了研究。根據(jù)特愿2000-602803，用經(jīng)苯甲脒瓊脂糖6B純化的OmpT蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)品在pH7.0下與PA1A3’以及PA1’A3’反應(yīng)。酶反應(yīng)后，由HPLC分析結(jié)果得到的切斷率、以及由質(zhì)量分析結(jié)果得到的切斷部位都表示在圖3中?？芍狿A1A3’以及PA1’A3’都是在Arg143-Ala144被切斷。
然而，無論那一個(gè)切斷率與在PA的Arg140-Arg141的切斷率相比，切斷率值都低。另外在PA1’A3’中也確認(rèn)了在Arg140-Ala141的切斷。當(dāng)認(rèn)為Arg143-Ala144為切斷部位P1-P1’時(shí)，在Arg143-Ala144的切斷只要存在P3位精氨酸(PA1A3’的Arg141)或是P4位精氨酸(PA1’A3’的Arg140)中的任一個(gè)都會(huì)發(fā)生，表明在P4位和P3位兩處配置了精氨酸的PA3’與PA1A3’以及PA1’A3’相比切斷率更高。
實(shí)施例5.融合蛋白PA23’、PA323’和PA2’3’的制備由實(shí)施例4的結(jié)果可知融合蛋白PA1A3’和PA1’A3’在Arg143-Ala144被切斷，特別是PA1A3’只在Arg143-Ala144被切斷，而且其切斷率低。因此嘗試在融合蛋白PA3’導(dǎo)入氨基酸置換，設(shè)計(jì)使-Arg↓Ala-(Arg143-Ala144)的切斷率進(jìn)一步提高那樣的氨基酸序列。根據(jù)實(shí)施例2的結(jié)果，象以下那樣制備具有預(yù)想使-Arg↓Ala-(Arg143-Ala144)的切斷率提高，而使連續(xù)的堿性氨基酸間(Arg140-Arg141)的切斷率下降的氨基酸序列(使2個(gè)連續(xù)的精氨酸變成3個(gè)連續(xù)或4個(gè)連續(xù)的精氨酸)的融合蛋白PA23’、PA323’以及PA2’3’(圖3)，研究這些融合蛋白被OmpT蛋白酶的切斷情況。
融合蛋白PA23’以及PA2’A3’的表達(dá)質(zhì)粒pG117S4HompPA23’和pG117S4HompPA2’A3’使用PCR向具有如圖3所示結(jié)構(gòu)的融合蛋白PA3’的表達(dá)質(zhì)粒pG117S4HompPA3’導(dǎo)入置換堿基后構(gòu)建的。而融合蛋白PA323’的表達(dá)質(zhì)粒pG117S4HompPA323’使用PCR向具有如圖3所示結(jié)構(gòu)的融合蛋白PA23’的表達(dá)質(zhì)粒pG117S4HompPA23’導(dǎo)入置換堿基后構(gòu)建的。圖10A給出了構(gòu)建的質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)。用這些表達(dá)融合蛋白質(zhì)粒轉(zhuǎn)化OmpT蛋白酶缺損大腸桿菌株W3110M25，使融合蛋白以包涵體形式表達(dá)。
實(shí)施例6.0mpT蛋白酶對(duì)融合蛋白PA23’、PA323’以及PA2’3’的切斷對(duì)如圖3所示的融合蛋白PA23’、PA323’以及PA2’A3’可被OmpT蛋白酶切斷的切斷部位以及切斷率進(jìn)行了研究。根據(jù)特愿2000-602803使用經(jīng)苯甲脒瓊脂糖6B純化的OmpT蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)品在pH7.0下與PA23’PA323’以及PA2’3’在25℃反應(yīng)30分鐘。酶反應(yīng)后、由HPLC分析結(jié)果得到的切斷率、以及由質(zhì)量分析結(jié)果得到的切斷部位都表示在圖3中。確認(rèn)PA23’、PA323’和PA2’3’在Arg143-Ala144被切斷。PA23’在Arg143-Ala144的切斷率表現(xiàn)出是PA在Arg140-Arg141切斷率的2.9倍切斷率。
另外還看到了在Arg139-Arg140和Arg140-Arg141的切斷，其切斷率為在Arg143-Ala144切斷的13％。在PA323’的Arg143-Ala144的切斷率也表現(xiàn)出是在PA的Arg140-Arg141的切斷率的2.9倍切斷率，另外也看到了在Arg140-Arg141的切斷，是在Arg143-Ala144切斷率的59％。關(guān)于PA2’3’，確認(rèn)在Arg143-Ala144的切斷率低至在PA的Arg140-Arg141的切斷率的63％，以及在Arg140-Arg141以及Arg142-Arg143的切斷。以上結(jié)果表明這3種融合蛋白中，PA23’具有使-Arg↓Ala-(Arg143-Ala144)切斷率提高，而使連續(xù)的堿性氨基酸間切斷率下降的最適序列。
實(shí)施例7.融合蛋白PA5D23’、PA4D23’和PA3D23’的制各實(shí)施例6的結(jié)果表明在融合蛋白PA23’中Arg143-Ala144的切斷率非常高。另外還確認(rèn)了在Arg139-Arg140或Arg140-Arg141的切斷。因此，由于認(rèn)為在切斷部位旁邊存在酸性氨基酸時(shí)可抑制它的切斷，所以為了抑制在Arg139-Arg140或在Arg140-Arg141的切斷，象以下那樣制備將Ala136、Ala137或Ala138置換為天冬氨酸的融合蛋白PA5D23’、PA4D23’以及PA3D23’(圖4)，研究它們被OmpT蛋白酶切斷的情況。
融合蛋白PA5D23’、PA4D23’以及PA3D23’的表達(dá)質(zhì)粒pG117S4HompPA5D23’、pG117S4HompPA4D23’以及pG117S4HompPA3D23’利用PCR向具有圖4所示結(jié)構(gòu)的融合蛋白PA23’的表達(dá)質(zhì)粒pG117S4HompPA23’導(dǎo)入置換堿基后構(gòu)建。構(gòu)建的質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)如圖10A所示。用這些融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化OmpT蛋白酶缺損大腸桿菌株W3110M25，使融合蛋白以包涵體形式表達(dá)。
實(shí)施例8.OmpT蛋白酶對(duì)融合蛋白PA5D23’、PA4D23’和PA3D23’的切斷對(duì)圖4所示融合蛋白PA5D23’、PA4D23’以及PA3D23’被OmpT蛋白酶切斷的切斷部位以及切斷率進(jìn)行了研究。使PA5D23’、PA4D23’和PA3D23’在pH7.0下與根據(jù)特愿2000-602803使用苯甲脒瓊脂糖6B純化的OmpT蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)品在25℃下反應(yīng)30分鐘。酶反應(yīng)后，由HPLC分析結(jié)果得到的切斷率，由質(zhì)量分析結(jié)果得到的切斷部位都表示在圖4中。確認(rèn)PA5D23’、PA4D23’以及PA3D23’的主要切斷部位是Arg143-Ala144。
特別是PA4D23’在Arg143-Ala144的切斷率如果與PA23’比雖然下降，但表現(xiàn)出是在PA的Arg140-Arg141切斷率的2倍切斷率。另一方面沒有檢測(cè)到在PA23’檢測(cè)到的Arg139-Arg140以及Arg140-Arg141的切斷。即、將Arg140-Arg141設(shè)計(jì)為P1-P1’時(shí)，通過在P3位配置天冬氨酸，可以抑制該切斷。同樣將Arg139-Arg140設(shè)計(jì)為P1-P1’時(shí)，認(rèn)為通過在P2位配置天冬氨酸，可以抑制該切斷。在PA5D23’的Arg143-Ala144切斷率雖然表現(xiàn)出是在PA的Arg140-Arg141切斷率的1.9倍切斷率，但也看到了在Arg140-Arg141的切斷。
對(duì)于PA3D23’，與PA4D23’同樣沒有檢測(cè)到在Arg139-Arg140以及在Arg140-Arg141的切斷。即、當(dāng)將Arg140-Arg141作為P1-P1’考慮時(shí)，通過在P4位配置天冬氨酸，認(rèn)為可以抑制該切斷。同樣當(dāng)將Arg139-Arg140作為P1-P1’考慮時(shí)，通過在P3位配置天冬氨酸，認(rèn)為可以抑制該切斷。在Arg143-Ala144的切斷率與在PA的Arg140-Arg141切斷率同等程度，但比PA4D23’低。以上事實(shí)表明這3種融合蛋白中，PA4D23’具有使在-Arg↓Ala-(Arg143-Ala144)切斷率更高，而且具有用于抑制連續(xù)的堿性氨基酸間的切斷的最適序列。
因此，當(dāng)希望用OmpT蛋白酶從由保護(hù)蛋白質(zhì)-連接肽-目的多肽構(gòu)成的融合蛋白切出N末端氨基酸為天冬氨酸、谷氨酸和脯氨酸以外的17種氨基酸中任一個(gè)的目的多肽時(shí)，認(rèn)為通過在-Asp-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Arg-氨基酸序列的C末端后配置該目的多肽，有可以特異切出該目的多肽的可能性。
實(shí)施例9.融合蛋白PRMT和PMT的制備實(shí)施例6的結(jié)果表明OmpT蛋白酶可以有效地切斷圖3所示融合蛋白PA23’中本酶切斷部位周邊的氨基酸序列中-Arg↓Ala-。由此予想到切斷部位即使是-ArgXaa-(Xaa為酸性氨基酸天冬氨酸、谷氨酸以及脯氨酸以外的17種氨基酸)也可有效切斷。因此本發(fā)明人就接在實(shí)施例6中使用的融合蛋白PA23’的143位精氨酸之后N末端為酸性氨基酸、脯氨酸以外的氨基酸，以及置換為堿性氨基酸以外的氨基酸時(shí)，本酶怎樣切斷進(jìn)行研究。
首先作為對(duì)照制作在具有可被OmpT蛋白酶切斷Arg140-Arg141的如圖1所示結(jié)構(gòu)的融合蛋白PRR(特愿2000-602803參照)N末端開始的第140位精氨酸之后配置了人胃動(dòng)素的融合蛋白PRMT(圖5)。然后制作在融合蛋白PA23’(圖3和圖4)N末端開始的第143位精氨酸之后配置了人胃動(dòng)素的融合蛋白PMT(圖5)。
融合蛋白PRMT的表達(dá)質(zhì)粒pG117S4HompPRMT以及PMT的表達(dá)質(zhì)粒pG117S4HompPMT的結(jié)構(gòu)如圖10A所示。用這2種融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化OmpT蛋白酶缺損大腸桿菌株W3110 M25，制作融合蛋白生產(chǎn)菌。對(duì)得到的菌株培養(yǎng)后，以包涵體形式制備融合蛋白PRMT和PMT。
實(shí)施例10.OmpT蛋白酶對(duì)融合蛋白PRMT和PMT的切斷對(duì)于圖5所示的融合蛋白PRMT以及PMT被OmpT蛋白酶的切斷使用以W3110 M25為宿主表達(dá)OmpT蛋白酶的大腸桿菌的膜級(jí)分通過SDS-PAGE或HPLC進(jìn)行研究。在SDS-PAGE中，雖然可確認(rèn)OmpT蛋白酶對(duì)融合蛋白PMT的切斷，但沒有檢測(cè)到PRMT的切斷。通過HPLC雖然也可確認(rèn)融合蛋白PMT的切斷，但主要是在Arg139-Arg140或Arg140-Arg141的堿性氨基酸對(duì)間的切斷，在Arg143-Phe144的肽切斷片段，即人胃動(dòng)素通過質(zhì)量分析只檢測(cè)到極微量。
由此可知只是將切斷部位周邊的氨基酸序列做成-Arg-Arg-Arg-Ala-Arg-motilin，不能通過OmpT蛋白酶將作為主要的肽切斷片段的人胃動(dòng)素切出。由此認(rèn)為本蛋白酶對(duì)P1’位的氨基酸的底物特異性不嚴(yán)格，為了在有效切斷中利用，有必要通過向本蛋白酶自體導(dǎo)入突變，進(jìn)一步提高對(duì)P1’位氨基酸的特異性。因此制作OmpT蛋白酶突變體，對(duì)是否可以利用該突變體從融合蛋白主要切出人胃動(dòng)素進(jìn)行了研究。
實(shí)施例11.OmpT蛋白酶突變體表達(dá)大腸桿菌的制備為了考察在解析OmpT蛋白酶的結(jié)晶結(jié)構(gòu)的論文(Vandeputte-Rutten，L.et al.EMBO J.205033-5039，2001)以及與之相關(guān)的論文(Kramer，RA.et al.FEBSLlett.505426-430，2001)中底物的P1’位氨基酸與OmpT蛋白酶的Asp97是否進(jìn)行相互作用，象以下那樣利用PCR制作將OmpT蛋白酶的Asp97置換為20種氨基酸(包括對(duì)天冬氨酸的同義置換)的質(zhì)粒，將這些質(zhì)粒導(dǎo)入OmpT蛋白酶缺損大腸桿菌BL21株，制備OmpT蛋白酶突變體表達(dá)大腸桿菌20株。
為了對(duì)OmpT蛋白酶的Asp97容易導(dǎo)入突變，盡可能使利用PCR擴(kuò)增的DNA區(qū)域減少，首先通過將編碼具有圖10B所示結(jié)構(gòu)的OmpT蛋白酶表達(dá)質(zhì)粒pOmpTTcE(參照特愿2000-602803)的OmpT蛋白酶Ser99的AGT變換為TCT，構(gòu)建利用PCR導(dǎo)入了制限酶部位XbaI的OmpT蛋白酶表達(dá)質(zhì)粒pOmpTXbaI。然后對(duì)將OmpT蛋白酶的Asp97置換為20種氨基酸(包括對(duì)天冬氨酸的同義置換)的突變體OmpT D97X(X表示置換后的20種氨基酸)進(jìn)行表達(dá)的質(zhì)粒pOmpTD97X由OmpT蛋白酶表達(dá)質(zhì)粒pOmpTXbaI通過利用PCR導(dǎo)入突變來構(gòu)建。表達(dá)質(zhì)粒pOmpTXbaI以及pOmpTD97X的結(jié)構(gòu)如圖10B所示。
將得到的20種表達(dá)質(zhì)粒pOmpTD97X分別導(dǎo)入OmpT蛋白酶缺損大腸桿菌BL21株制備OmpT蛋白酶突變體OmpT D97X表達(dá)大腸桿菌20株。將這些大腸桿菌在試管內(nèi)用含有四環(huán)素10μg/mL的LB液體培養(yǎng)基2mL于37℃下振蕩培養(yǎng)至OD660＝1左右后，將菌體通過離心分離回收。向這些菌體中加1mL的TE(10mMTris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)，懸浮后，通過離心分離回收菌體。再重復(fù)進(jìn)行同樣操作，向得到的菌體添加TE達(dá)到OD660＝2，將懸浮的溶液作為OmpT蛋白酶突變體OmpTD97X反應(yīng)用的菌體懸浮液。這些菌體懸浮液在使用之前一直冷凍保存在-20℃下。
實(shí)施例12.OmpT蛋白酶突變體表達(dá)大腸桿菌菌體懸浮液中含有的OmpT蛋白酶突變體量的確認(rèn)為了確認(rèn)OmpT蛋白酶突變體表達(dá)大腸桿菌菌體懸浮液中含有的OmpT蛋白酶突變體量在所有的菌體懸浮液中是等量，使用抗OmpT蛋白酶抗體進(jìn)行免疫印跡和免疫染色?？筄mpT蛋白酶抗體通過將純化OmpT蛋白酶對(duì)兔進(jìn)行免疫致敏，從得到的抗血清中純化IgG級(jí)分，再從該級(jí)分中回收對(duì)純化OmpT蛋白酶具有親和性的級(jí)分來制備。
將相當(dāng)于每1個(gè)樣品槽OD660＝0.01的菌體懸浮液進(jìn)行12％SDS-PAGE，電泳結(jié)束后，使用PVDF膜進(jìn)行免疫印跡。將制備的印跡膜在封閉液(5％(w/v)skimmilk/1x TBST*)中浸漬，于室溫下進(jìn)行30分鐘振蕩。然后將膜浸漬在用封閉液稀釋了1000倍的抗OmpT蛋白酶抗體中，于室溫下振蕩100分鐘。然后舍去液，用1x TBST*洗3次，每次5分鐘。然后再將膜浸漬在用封閉液稀釋1000倍的過氧化物酶結(jié)合抗兔IgG抗體液中，于室溫下振蕩45分鐘。
用1×TBST*清洗4次，每次10分鐘，然后用ECL試劑盒(AmershamPharmacia公司生產(chǎn))進(jìn)行檢測(cè)。從作為宿主的OmpT蛋白酶缺損大腸桿菌BL21株沒有檢測(cè)到帶，但從其它的菌體懸浮液可以檢測(cè)到幾乎同等強(qiáng)度的帶，由此可以認(rèn)為OmpT蛋白酶突變體表達(dá)大腸桿菌菌體懸浮液中含有的OmpT蛋白酶突變體量在所有的菌體懸浮液中大致等量。(*1x TBST＝10mM Tris-HCl(pH7.0)，150mM NaCl，0.05％Tween 20)實(shí)施例13.OmpT蛋白酶突變體OmpT D97X的P1’位底物特異性的研究由于OmpT蛋白酶存在于大腸桿菌外膜，可以通過向反應(yīng)液中原樣加菌體，使其與底物作用。因此，為了研究OmpT蛋白酶突變體OmpTD97X的P1’位底物特異性，以具有圖1所示結(jié)構(gòu)的融合蛋白質(zhì)PRX(參照特愿2000-602803)作為底物，象以下那樣研究與OmpT蛋白酶突變體OmpT D97X的反應(yīng)性。向10M尿素20μL中加1M磷酸鈉(pH7.0)2.5μL、以及50mM EDTA 2μL，添加融合蛋白包涵體(OD660＝100)5μL，對(duì)包涵體進(jìn)行溶解。
然后向包涵體溶解液中加10.5μL水，添加在實(shí)施例11中制備的OmpT蛋白酶突變體表達(dá)大腸桿菌菌體懸浮液10μL，在反應(yīng)液量50μL中開始反應(yīng)。反應(yīng)于25℃下進(jìn)行60分鐘。在與OmpT蛋白酶反應(yīng)時(shí)相同的條件下，利用HPLC對(duì)反應(yīng)后得到的肽片段進(jìn)行定量。結(jié)果如表1所示。
使用SAS_微陣列解決方案軟件包(The SAS Institute，Cary，NC，USA)分析基因表達(dá)數(shù)據(jù)。隨后使用JMP_(The SAS Institute，Cary，NC，USA)將所得數(shù)據(jù)直觀化。
為此實(shí)驗(yàn)完成的分析是具有混合模型說明的ANOVA方法。(Wolfinger等人J.Comp.Biol.8625(2001))。從cDNA微陣列表達(dá)數(shù)據(jù)經(jīng)由混合模型評(píng)估基因重要性。應(yīng)用線性混合模型的兩個(gè)步驟。應(yīng)用第一個(gè)模型、即標(biāo)準(zhǔn)化模型以供在載片水平上全體標(biāo)準(zhǔn)化。應(yīng)用第二個(gè)模型、即基因模型對(duì)各基因作出嚴(yán)格的統(tǒng)計(jì)推論。兩個(gè)模型都表述為模型(1)和(2)。
log2(Yijkls)＝θij+Dk+DSkl+ωijkls    (1)(2)Yijkls表示用kth染料對(duì)ith細(xì)胞株應(yīng)用jth處理的lth載片中sth點(diǎn)強(qiáng)度。θij、Dk、Sl和DSkl表示jth處理對(duì)ith細(xì)胞株的平均作用、kth染料作用、lth載片隨機(jī)作用和kth染料在lth載片中的隨機(jī)相互作用效應(yīng)。ωijkls是隨機(jī)誤差項(xiàng)。Rijkls(g)表示來自模型(1)的gth基因殘留。
μij(g)、Dk(g)、sl(g)和DSkl(g)表示與θ1j、Dk、Sl和DSkl相似的作用，例外情況為它們對(duì)gth基因具有特異性。ssls(g)表示對(duì)gth基因載片隨機(jī)效應(yīng)的點(diǎn)。εijkls(g)表示隨機(jī)誤差項(xiàng)。假定所有隨機(jī)項(xiàng)在各模型內(nèi)是正常分布并且相互依賴。
根據(jù)上述分析，發(fā)現(xiàn)下表16中所示的某些cDNA被差異性表達(dá)。
表16

據(jù)推斷這些特異性基因參與木材發(fā)育是通過將基因的上調(diào)和下調(diào)與木材發(fā)育的特定階段相關(guān)。當(dāng)使基因表達(dá)相關(guān)性與木材發(fā)育相關(guān)時(shí)，在特定季節(jié)和樹干位置一個(gè)分段(韌皮部、形成層、發(fā)育木質(zhì)部、成熟木質(zhì)部)內(nèi)木材發(fā)育的空間連續(xù)性以及季節(jié)與樹干位置的關(guān)系都考慮在內(nèi)。
將野生型OmpT蛋白酶(D97D)與融合蛋白PRR反應(yīng)的切斷率作為100％表示相對(duì)切斷率。-表示相對(duì)切斷率不到3.0％。OmpT蛋白酶突變體D97V，D97I，D97P，D97W，D97G，D97Y，D97K和D97R與20種融合蛋白PRX的任一個(gè)的相對(duì)切斷率都不到3.0％。融合蛋白PRL，PRP，PRW，PRG，PRQ，PRD，PRE和PRH與任一個(gè)OmpT蛋白酶突變體OmpTD97X的相對(duì)切斷率也都不到3％。
該結(jié)果表明，可以得到幾個(gè)切斷率比較高，底物特異性與野生型OmpT蛋白酶不同的突變體。已知D97D (野生型)對(duì)融合蛋白PRR和PRK、D97L對(duì)PRS、D97M對(duì)PRF和PRY、D97H對(duì)PRA、PRV、PRI、PRM、PRT、PRC以及PRN分別表現(xiàn)出最高的特異性。其中使用對(duì)PRF特異性高的D97M突變體與在實(shí)施例9制備的融合蛋白PRMT和PMT進(jìn)行反應(yīng)，研究是否可將人胃動(dòng)素切出。
實(shí)施例14.通過OmDT蛋白酶D97M突變體從融合蛋白PMT切出人胃動(dòng)素利用OmpT蛋白酶D97M突變體從人胃動(dòng)素融合蛋白PRMT和PMT(圖5)切出人胃動(dòng)素的研究使用宿主為W3110 M25的表達(dá)野生型OmpT蛋白酶(D97D)和OmpT蛋白酶突變體D97M的大腸桿菌外膜級(jí)分進(jìn)行。向10M尿素20μL中加1M磷酸鈉(pH7.0)2.5μL、和50mM EDTA2μL，添加融合蛋白包涵體(OD660＝100)10μL，對(duì)包涵體進(jìn)行溶解。然后加10.5μL水，再添加重組大腸桿菌外膜級(jí)分5μL，于反應(yīng)液量50μL中開始反應(yīng)。反應(yīng)于25℃下進(jìn)行120分鐘。
向反應(yīng)液添加150μL的6％乙酸、2M尿素，停止反應(yīng)，在10000×g下進(jìn)行3分鐘離心分離，將上清液50μL加到Y(jié)MC PROTEIN RP柱。HPLC在柱溫度40℃、流速1mL/min下進(jìn)行。通過15分鐘含有0.1％三氟乙酸的20-27.5％乙腈的線性梯度洗脫，監(jiān)測(cè)214nm的吸收。切斷部位通過分離多肽片段，進(jìn)行質(zhì)量分析鑒定。圖6中給出了通過HPLC對(duì)對(duì)照OmpT蛋白酶D97D野生型以及D97M突變體對(duì)人胃動(dòng)素融合蛋白PRMT以及PMT的切斷進(jìn)行分析的結(jié)果。另外在表2給出了這些切斷部位與切斷率。

表12輻射松轉(zhuǎn)錄活性

而胃動(dòng)素的定量通過用6％乙酸、2M尿素對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行稀釋后的溶液在與實(shí)施例14所述的HPLC分析法同樣的條件下進(jìn)行分析，作為標(biāo)準(zhǔn)品使用由肽研究所購入的人胃動(dòng)素。而胃動(dòng)素的純度除了通過50分鐘含有0.1％三氟乙酸的0-50％乙腈的線性梯度洗脫以外，通過與定量時(shí)同樣條件的HPLC進(jìn)行分析。
(1)W3110 M25胃動(dòng)素融合蛋白PMT生產(chǎn)菌以及OmpT蛋白酶突變體OmpT D97M表達(dá)菌的2L規(guī)模高密度培養(yǎng)W3110 M25胃動(dòng)素融合蛋白PMT生產(chǎn)菌以及OmpT蛋白酶突變體OmpT D97M表達(dá)菌的2L規(guī)模高密度培養(yǎng)象以下那樣進(jìn)行，由各個(gè)菌分別制備包涵體和表達(dá)菌體。將PMT生產(chǎn)菌和OmpT D97M表達(dá)菌在500mL三角燒瓶中用含有四環(huán)素10mg/L的LB液體培養(yǎng)基100mL，于37℃下旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)過夜。翌日、將該培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到加入了2L的含4g/LK2HPO4，4g/L KH2PO4，2.7g/L Na2HPO4，0.2g/L NH4Cl，1.2g/L(NH4)2SO4，4g/L酵母提取物，2g/L MgSO4·7H2O，40mg/LCaCl2·2H2O，40mg/L FeSO4·7H2O，10mg/L MnSO4·nH2O，10mg/LAlCl3·6H2O，4mg/L CoCl2·6H2O，2mg/L ZnSO4·7H2O，2mg/L Na2MoO4·2H2O，1mg/L CuCl2·2H2O，0.5mg/L H3BO4，15g/L葡萄糖，10mg/L四環(huán)素的培養(yǎng)基的攪拌培養(yǎng)器中，于32℃下開始培養(yǎng)。
葡萄糖耗盡后、按照終濃度達(dá)2％那樣添加甘油，將培養(yǎng)溫度提高到37℃。然后在每次甘油耗盡時(shí)逐次按照終濃度達(dá)2％那樣添加甘油，繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)經(jīng)過如圖7所示。PMT生產(chǎn)菌在培養(yǎng)開始后24小時(shí)結(jié)束，培養(yǎng)液容量為1700mL。用Manton-Gaulin將菌體破碎后，通過于4℃、6000×g下的10分鐘離心分離，得到沉淀。將該沉淀用2000mL的去離子水懸浮，通過于4℃、6000×g下的10分鐘離心分離，回收沉淀。再將得到的沉淀懸浮于2000mL的50mM Tris-HCl(pH8.0)，5mM EDTA，1％Triton-X 100中，通過4℃、6000×g、10分鐘的離心分離，回收沉淀。
將該沉淀懸浮于2000mL的去離子水，于4℃、6000×g下進(jìn)行10分鐘離心分離，回收沉淀。再度重復(fù)同樣操作，得到26g沉淀。將該沉淀懸浮于26mL的去離子水中，作為包涵體懸浮液(OD660＝250，45mL)，在使用之前一直冷凍保存在-20℃下。OmpT蛋白酶突變體W3110M25OmpT D97M表達(dá)菌在培養(yǎng)開始后20小時(shí)結(jié)束培養(yǎng)，培養(yǎng)液容量為2100mL。通過將培養(yǎng)液于4℃、6000×g下進(jìn)行10分鐘離心分離，得到沉淀。將該沉淀用2000mL的TE(10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mMEDTA)懸浮，于4℃、6000×g下通過10分鐘離心分離回收沉淀。再度重復(fù)同樣操作，回收311g沉淀。將該沉淀懸浮于去離子水，作為菌體懸浮液(OD660＝320，390mL)，在使用之前，一直于-20℃下冷凍保存。
(2)OmpT蛋白酶突變體W3110 M25 OmpT D97M表達(dá)菌對(duì)包涵體融合蛋白PMT的切斷向8mL 10M尿素中添加1M磷酸鈉(pH7.0)1mL、以及50mMEDTA 0.8mL，添加融合蛋白包涵體PMT(OD660＝250)4mL，對(duì)包涵體進(jìn)行溶解。然后向其中加5.2mL水，添加(1)中制備的OmpT蛋白酶突變體W3110 M25 OmpT D97M表達(dá)菌懸浮液(OD660＝320)1mL，在反應(yīng)液量20mL中開始反應(yīng)。反應(yīng)于25℃下以120min-1振蕩，進(jìn)行60分鐘。60分鐘后，向13.5mL反應(yīng)液(相當(dāng)于W3110M25胃動(dòng)素融合蛋白PMT生產(chǎn)菌培養(yǎng)液100mL份的包涵體)中添加40.5mL的20mM乙酸(pH 4.0)，通過于4℃、25000×g下進(jìn)行10分鐘離心分離，得到上清液。通過離心分離可以除去幾乎所有的未反應(yīng)融合蛋白、保護(hù)肽和來自大腸桿菌的蛋白質(zhì)。
通過向該上清液加20mM乙酸(pH4.0)，將容量調(diào)整到200mL，供以下純化用。通過向該上清液加20mM乙酸(pH 4.0)使pH降低，可以吸附于以下的陽離子交換層析。另外在圖8中給出了為了決定胃動(dòng)素切出的反應(yīng)時(shí)間，在相同條件下直至120分以前對(duì)胃動(dòng)素游離隨時(shí)間變化進(jìn)行觀察的結(jié)果。另外，用HPLC和SDS-PAGE對(duì)在反應(yīng)開始后、在60分鐘的融合蛋白的切斷進(jìn)行分析的結(jié)果也一并表示在圖9的A以及B中。就像SDS-PAGE給出的那樣，由于在反應(yīng)開始后60分鐘，融合蛋白PMT幾乎完全被切斷，游離的胃動(dòng)素的增加幾乎停止。因此反應(yīng)時(shí)間定為60分鐘。
另外不僅檢測(cè)到在Arg143-Phe144切斷生成的人胃動(dòng)素，也檢測(cè)到在Arg139-Arg140切斷生成的多肽(RRAR-motilin)。在SDS-PAGE上，與人胃動(dòng)素相比，看到RRAR-motilin的帶濃、量多(圖9B)，但從HPLC的分析結(jié)果看，產(chǎn)生了與前面結(jié)果矛盾的結(jié)果，即人胃動(dòng)素的峰比RRAR-motilin的面積大、且量多的結(jié)果(圖9A)。這可認(rèn)為其原因是在SDS-PAGE中RRAR-motilin比人胃動(dòng)素更容易被染色。因此，認(rèn)為SDS-PAGE的結(jié)果中帶的深淺沒有正確反映兩者的量比。
(3)胃動(dòng)素的純化向預(yù)先用20mM乙酸(pH4.0)平衡的Amersham Pharmacia公司生產(chǎn)SP-sepharose Fast Flow(27mL，Φ26mm×50mm)加上述的上清液200mL。然后用100mL的20mM乙酸(pH4.0)以及100mL的20mM乙酸(pH4.0)，0.1M NaCl清洗柱子。用200mL 20mM乙酸(pH4.0)，0.1-0.5M NaCl的線性梯度進(jìn)行洗脫。該陽離子交換色譜的流速都是以5mL/min操作。洗脫級(jí)分按照每5mL一次進(jìn)行收集，從這些HPLC分析結(jié)果選擇級(jí)分，進(jìn)行收集。通過這樣操作可以除去融合蛋白PMT在Arg139-Arg140被切斷產(chǎn)生的多肽。
將收集的級(jí)分加到預(yù)先用0.1％三氟乙酸(TFA)平衡好的Vydac214TPB1520(24mL，Φ10mm×300mm)。通過0.1％TFA 100mL進(jìn)行清洗，用200mL 0.1％TFA，0-30％乙腈線性梯度進(jìn)行洗脫。該反相層析的流速都以1.6mL/min操作。按照每4mL一次對(duì)洗脫級(jí)分分別收集，由那些級(jí)分的HPLC分析結(jié)果選擇收集級(jí)分。本純化的結(jié)果如表3所示。
表3人胃動(dòng)素的純化結(jié)果

使用相當(dāng)于0.1L W3110 M25 PMT培養(yǎng)液的包涵體進(jìn)行純化在本純化中得到的標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC分析、質(zhì)量分析以及N末端氨基酸分析的結(jié)果與人胃動(dòng)素給出的結(jié)果一致。表明通過本純化可以在每1L的W3110 M25胃動(dòng)素融合蛋白PMT生產(chǎn)菌培養(yǎng)液中以52％回收率得到純度99.0％以上的人胃動(dòng)素160mg。
實(shí)施例16.使用OmpT蛋白酶突變體從融合蛋白使生理活性多肽游離例子除了人胃動(dòng)素以外，為了研究使用OmpT蛋白酶突變體是否可使生理活性多肽從融合蛋白游離，構(gòu)建如圖11所示的表達(dá)人腎上腺皮質(zhì)刺激激素(1-24)融合蛋白PAC和人降鈣素前體融合蛋白PCT的具有如圖10A所示結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒，從導(dǎo)入了這些質(zhì)粒的W3110 M25的轉(zhuǎn)化體中以包涵體形式制備各融合蛋白。分別與表達(dá)OmpT蛋白酶突變體D97L或D97H的大腸桿菌W3110 M25的外膜級(jí)分于25℃下反應(yīng)10分鐘或2小時(shí)。作為對(duì)照，兩融合蛋白也都用野生型OmpT蛋白酶進(jìn)行反應(yīng)。HPLC的解析結(jié)果如圖12所示。
另外，通過HPLC分離各融合蛋白的切斷片段，都進(jìn)行質(zhì)量分析。HPLC使用YMC PROTEINRP柱，在柱溫度40℃、1mL/min流速下進(jìn)行。通過50分鐘含有0.1％三氟乙酸的10-50％乙腈的線性梯度進(jìn)行洗脫，對(duì)214nm的吸收進(jìn)行監(jiān)測(cè)。融合蛋白PAC在Arg143-Ser144被野生型OmpT蛋白酶切斷，游離出人腎上腺皮質(zhì)刺激激素(1-24)。另外在Arg140-Arg141也被切斷，游離出RAR-ACTH。雖然在圖12沒有表示出，但在Arg143-Ser144和Lys158-Lys159也都被切斷，還生成ACTH(1-15)和ACTH(16-24)。另外，PAC在Arg143-Ser144被D97L切斷，游離出的人腎上腺皮質(zhì)刺激激素(1-24)為野生型OmpT蛋白酶作用情況的2.9倍。
在另外部位切斷產(chǎn)生的副產(chǎn)物沒有游離。融合蛋白PCT被野生型OmpT蛋白酶在Arg139-Arg140和Arg140-Arg141切斷，游離出RRAR-CT和RAR-CT。PCT被D97H在Arg139-Arg140、Arg141-Ala142和Arg143-Cys144切斷，游離出RRAR-CT、AR-CT和人降鈣素前體。確認(rèn)從任一個(gè)融合蛋白都可以通過變異型OmpT蛋白酶使目的生理活性多肽游離。這并不是說利用本實(shí)施例所示連接肽序列和OmpT蛋白酶突變體的生理活性多肽生產(chǎn)系只應(yīng)用于特定的生理活性多肽，可以認(rèn)為其通用性廣泛。
實(shí)施例17.融合蛋白PMT與OmpT蛋白酶突變體D97M的共表達(dá)對(duì)于在大腸桿菌中以包涵體形式表達(dá)融合蛋白，該宿主大腸桿菌表達(dá)OmpT蛋白酶的情況，只是將得到的包涵體用尿素溶解，就受到OmpT蛋白酶的切斷。因此對(duì)于OmpT蛋白酶缺損大腸桿菌株W3110M25作為宿主，對(duì)表達(dá)融合蛋白PMT的表達(dá)質(zhì)粒pG117S4HompPMT(實(shí)施例9參照)和表達(dá)OmpT蛋白酶突變體D97M的質(zhì)粒進(jìn)行共表達(dá)的情況，研究了通過包涵體溶解是否可游離人胃動(dòng)素。表達(dá)OmpT蛋白酶突變體D97M的質(zhì)粒pOmpTD97M由于與pG117S4HompPMT復(fù)制起點(diǎn)相同，所以不能共表達(dá)。
為了可共表達(dá)，象以下那樣構(gòu)建來自pMW218的OmpT蛋白酶突變體D97M表達(dá)質(zhì)粒(圖13)。以質(zhì)粒pOmpTD97M(實(shí)施例11參照)為模板，使用含有XhoI和HindIII制限酶部位的引物，通過PCR對(duì)pOmpTD97M的乳糖啟動(dòng)子至trpA終止子序列進(jìn)行擴(kuò)增。將得到的DNA片段用XhoI和HindIII消化后，插入到pMW218經(jīng)SalI和HindIII消化了的DNA片段，制作來自pMW218的OmpT蛋白酶突變體D97M表達(dá)質(zhì)粒。用如圖13所示的來自pMW218的OmpT蛋白酶突變體D97M表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化W3110 M25胃動(dòng)素融合蛋白PMT生產(chǎn)菌(實(shí)施例9參照)。
將該W3110 M25重組大腸桿菌在2L三角燒瓶中用含有四環(huán)素10mg/L以及卡那霉素20mg/L的LB液體培養(yǎng)基400mL于37℃下旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)過夜。包涵體的制備除了使用去離子水清洗以外都是按照常規(guī)方法進(jìn)行。人胃動(dòng)素從得到的包涵體游離的反應(yīng)象以下那樣進(jìn)行。向10M尿素160μL中加1M磷酸鈉(pH7.0)20μL、以及50mM EDTA 16μL，添加融合蛋白包涵體(OD660＝100)80μL，對(duì)包涵體進(jìn)行溶解。向溶解液中加124μL水，開始反應(yīng)。
反應(yīng)在25℃下進(jìn)行，在反應(yīng)開始后20、40、60、120、180、240、300、360、1440分后取樣，通過SDS-PAGE進(jìn)行分析(圖14)。由分析結(jié)果可知通過1440分鐘即24小時(shí)反應(yīng)，融合蛋白PMT幾乎完全被分解。這表明雖然并不象實(shí)施例15那樣使用表達(dá)OmpT蛋白酶突變體D97M的質(zhì)粒pOmpTD97M轉(zhuǎn)化大腸桿菌那樣迅速，但通過將反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，只是將由共表達(dá)菌得到的包涵體溶解，就可以完全分解融合蛋白PMT，使人胃動(dòng)素游離。
實(shí)施例18.融合蛋白PMT、PMT6D、PMT7D與OmpT蛋白酶突變體D97M的反應(yīng)由實(shí)施例14結(jié)果可知使用OmpT蛋白酶突變體D97M可由融合蛋白PMT生成胃動(dòng)素，但在Arg139-Arg140切斷也可生成副產(chǎn)物RRAR-motilin。另外，實(shí)施例8的結(jié)果表明通過在不希望切斷的部位P3或P4位配置酸性氨基酸天冬氨酸，可以抑制在該部位的切斷。
其中，胃動(dòng)素融合蛋白PMT的Arg139-Arg140由于是不希望切斷的部位，制作圖15所示的表達(dá)胃動(dòng)素融合蛋白PMT6D、PMT7D的具有如圖10A所示結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒，用這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)化W3110 M25大腸桿菌株，以包涵體形式回收這些融合蛋白，使用這些包涵體，在胃動(dòng)素融合蛋白濃度4mg/mL(OD660大約為20)、4M尿素、2mM EDTA、50mM磷酸鈉、OmpT蛋白酶突變體D97M 0.52mg/mL(OD660為1)中于25℃下、反應(yīng)2小時(shí)。另外包涵體蛋白質(zhì)濃度通過HPLC象以下那樣測(cè)定。向6％乙酸、2M尿素添加包涵體，達(dá)到OD660＝1，進(jìn)行10000×g的3分鐘離心分離，將上清液50μL加到Y(jié)MC PROTEIN RP柱上。HPLC在柱溫度40℃、流速1mL/min下進(jìn)行。
進(jìn)行40分鐘含有0.1％三氟乙酸的20-60％乙腈的線性梯度洗脫，對(duì)220nm的吸收進(jìn)行監(jiān)測(cè)。作為標(biāo)準(zhǔn)品使用牛血清清蛋白(BSA)，決定包涵體蛋白質(zhì)濃度。另外將大腸桿菌外膜級(jí)分中的OmpT蛋白酶突變體D97M懸浮液(OD660＝0.5)進(jìn)行SDS-PAGE，作為標(biāo)準(zhǔn)品使用純化OmpT，通過濃度計(jì)測(cè)定突變體濃度。圖16、17和18給出了HPLC分析反應(yīng)液的結(jié)果。從胃動(dòng)素融合蛋白PMT、PMT6D、PMT7D分別游離出了280、250、370μg/mL的胃動(dòng)素。
另外圖16～圖18給出了以從各個(gè)融合蛋白游離的胃動(dòng)素濃度為100時(shí)的副產(chǎn)物AR-motilin(在Arg141-Ala142被切斷后生成)、RRAR-motilin(在Arg139-Arg140被切斷后生成)的濃度。在PMT(圖16)中，分別生成2.8、33％的副產(chǎn)物，而在PMT6D(圖17)中為3.5、16％，特別RRAR-motilin的生成被抑制。另外在PMT7D(圖18)中沒有檢測(cè)到來自RRAR-motilin的峰。結(jié)果與實(shí)施例8的結(jié)果一致，可知對(duì)于使用OmpT突變體酶的情況，通過在不希望切斷的部位的P3或P4位配置酸性氨基酸天冬氨酸，可以抑制在該部位的切斷。從PMT7D游離出的胃動(dòng)素最多(370μg/mL)，這可認(rèn)為是沒有副產(chǎn)物生成，胃動(dòng)素游離濃度變高的原因。
以下給出了本發(fā)明涉及到的各種融合蛋白的各個(gè)基本全氨基酸序列。
融合蛋白PRR(序列編號(hào)1；圖1；實(shí)施例1～2、13)與PRR相關(guān)的序列Met Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Lys 15Asp Trp Glu Asn Pro Gly Val Thr Gln Leu Asn Arg Leu Ala Ala 30His Pro Pro Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Asp Asp Ala Arg Thr 45Asp Arg Pro Ser Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gly Glu Trp Arg 60Phe Ala Trp Phe Pro Ala Pro Glu Ala Val Pro Glu Ser Leu Leu 75Asp Leu Pro Glu Ala Asp Thr Val Val Val Pro Asp Ser Ser Asn 90Trp Gln Met His Gly Tyr Asp Ala Pro Ile Tyr Thr Asn Val Thr105Tyr Pro Ile Thr Val Asn Pro Pro Phe Val Pro Thr Glu Pro His120His His His Pro Gly Gly Arg Gln Met His Gly Tyr Asp Ala Glu135Leu Arg Leu Tyr His His Gly Ser Gly Ser Pro Tyr Arg150His Pro ArgHis Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser165Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val180Lys Gly Arg Gly184
在上述氨基酸序列中，下劃線部表示人胰高血糖素肽-1(7-37)(GLP-1(7-37))的氨基酸序列、雙下劃線部分表示作為OmpT蛋白酶切斷部位的堿性氨基酸對(duì)(Arg140-Arg141)。來自大腸桿菌的β-半乳糖苷酶的N末端117氨基酸的保護(hù)蛋白質(zhì)(β-gal117S4H)由氨基酸編號(hào)1的蛋氨酸至氨基酸編號(hào)127的精氨酸為止的氨基酸序列構(gòu)成。連接肽由氨基酸編號(hào)128的谷氨酰胺開始至氨基酸編號(hào)153的精氨酸的氨基酸序列構(gòu)成。
PA系融合蛋白(序列編號(hào)2；圖2；實(shí)施例1～2)PA涉及到的序列Met Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Lys 15Asp Trp Glu Asn Pro Gly Val Thr Gln Leu Asn Arg Leu Ala Ala 30His Pro Pro Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Asp Asp Ala Arg Thr 45Asp Arg Pro Ser Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gly Glu Trp Arg 60Phe Ala Trp Phe Pro Ala Pro Glu Ala Val Pro Glu Ser Leu Leu 75Asp Leu Pro Glu Ala Asp Thr Val Val Val Pro Asp Ser Ser Asn 90Trp Gln Met His Gly Tyr Asp Ala Pro Ile Tyr Thr Asn Val Thr 105Tyr Pro Ile Thr Val Asn Pro Pro Phe Val Pro Thr Glu Pro His 120His His His Pro Gly Gly Arg Gln Met His Ala Ala Ala Ala Ala 135Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Pro Tyr Arg 150His Pro ArgHis Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser165Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val180Lys Gly Arg Gly184在上述氨基酸序列中，下劃線部表示人胰高血糖素肽-1(7-37)(GLP-1(7-37))的氨基酸序列，雙重下劃線部分表示作為OmpT蛋白酶切斷部位的堿性氨基酸對(duì)(Arg140-Arg141)。來自大腸桿菌β-半乳糖苷酶的N末端117氨基酸的保護(hù)蛋白質(zhì)(β-gal117S4H)由氨基酸編號(hào)1的蛋氨酸至氨基酸編號(hào)127的精氨酸的氨基酸序列構(gòu)成。連接肽由氨基酸編號(hào)128的谷氨酰胺至氨基酸編號(hào)153的精氨酸的氨基酸序列構(gòu)成。
PA3’系融合蛋白(序列編號(hào)3；圖2～3；實(shí)施例3～6)與PA3’相關(guān)的序列Met Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Lys 15Asp Trp Glu Asn Pro Gly Val Thr Gln Leu Asn Arg Leu Ala Ala 30His Pro Pro Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Asp Asp Ala Arg Thr 45Asp Arg Pro Ser Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gly Glu Trp Arg 60Phe Ala Trp Phe Pro Ala Pro Glu Ala Val Pro Glu Ser Leu Leu 75Asp Leu Pro Glu Ala Asp Thr Val Val Val Pro Asp Ser Ser Asn 90Trp Gln Met His Gly Tyr Asp Ala Pro Ile Tyr Thr Asn Val Thr105Tyr Pro Ile Thr Val Asn Pro Pro Phe Val Pro Thr Glu Pro His120His His His Pro Gly Gly Arg Gln Met His Ala Ala Ala Ala Ala135Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Pro Tyr Arg 150His Pro ArgHis Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser165Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val180Lys Gly Arg Gly184在上述氨基酸序列中，下劃線部表示人胰高血糖素肽-1(7-37)(GLP-1(7-37))的氨基酸序列，雙重下劃線部表示OmpT蛋白酶切斷部位(Arg140-Arg141以及Arg143-Ala144)。來自大腸桿菌β-半乳糖苷酶的N末端117氨基酸的保護(hù)蛋白質(zhì)(β-gal117S4H)由氨基酸編號(hào)1的蛋氨酸至氨基酸編號(hào)127的精氨酸的氨基酸序列構(gòu)成。連接肽由氨基酸編號(hào)128的谷氨酰胺至氨基酸編號(hào)153的精氨酸的氨基酸序列構(gòu)成。
PA23’系融合蛋白(序列編號(hào)4；圖3～4；實(shí)施例5～8)與PA23’相關(guān)的序列Met Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Lys 15Asp Trp Glu Asn Pro Gly Val Thr Gln Leu Asn Arg Leu Ala Ala 30His Pro Pro Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Asp Asp Ala Arg Thr 45Asp Arg Pro Ser Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gly Glu Trp Arg 60Phe Ala Trp Phe Pro Ala Pro Glu Ala Val Pro Glu Ser Leu Leu 75Asp Leu Pro Glu Ala Asp Thr Val Val Val Pro Asp Ser Ser Asn 90Trp Gln Met His Gly Tyr Asp Ala Pro Ile Tyr Thr Asn Val Thr 105Tyr Pro Ile Thr Val Asn Pro Pro Phe Val Pro Thr Glu Pro His 120His His His Pro Gly Gly Arg Gln Met His Ala Ala Ala Ala Ala 135Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Pro Tyr Arg 150His Pro ArgHis Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser165Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val180Lys Gly Arg Gly184在上述氨基酸序列中，下劃線部表示人胰高血糖素肽-1(7-37)(GLP-1(7-37))的氨基酸序列，雙重下劃線部表示OmpT蛋白酶切斷部位(Arg139-Arg140、Arg140-Arg141以及Arg143-Ala144)。來自大腸桿菌β-半乳糖苷酶的N末端117氨基酸的保護(hù)蛋白質(zhì)(β-gal117S4H)由氨基酸編號(hào)1的蛋氨酸至氨基酸編號(hào)127的精氨酸的氨基酸序列構(gòu)成。連接肽由氨基酸編號(hào)128的谷氨酰胺至氨基酸編號(hào)153的精氨酸的氨基酸序列構(gòu)成。
融合蛋白PRMT(序列編號(hào)5；圖5；實(shí)施例9～10、14)與PRMT相關(guān)的序列Met Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Lys 15Asp Trp Glu Asn Pro Gly Val Thr Gln Leu Asn Arg Leu Ala Ala 30His Pro Pro Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Asp Asp Ala Arg Thr 45Asp Arg Pro Ser Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gly Glu Trp Arg 60Phe Ala Trp Phe Pro Ala Pro Glu Ala Val Pro Glu Ser Leu Leu 75Asp Leu Pro Glu Ala Asp Thr Val Val Val Pro Asp Ser Ser Asn 90Trp Gln Met His Gly Tyr Asp Ala Pro Ile Tyr Thr Asn Val Thr105Tyr Pro Ile Thr Val Asn Pro Pro Phe Val Pro Thr Glu Pro His120His His His Pro Gly Gly Arg Gln Met His Gly Tyr Asp Ala Glu135Lue Arg Leu Tyr 150Gln Arg Met Gln Glu Lys Glu Arg Asn Lys Gly Gln162在上述氨基酸序列中，下劃線部表示人胃動(dòng)素的氨基酸序列，雙重下劃線部表示相當(dāng)于融合蛋白PRR的OmpT蛋白酶切斷部位P1位的精氨酸(Arg140)。來自大腸桿菌β-半乳糖苷酶的N末端117氨基酸的保護(hù)蛋白質(zhì)(β-gal117S4H)由氨基酸編號(hào)1的蛋氨酸至氨基酸編號(hào)127的精氨酸的氨基酸序列構(gòu)成。連接肽由氨基酸編號(hào)128的谷氨酰胺至氨基酸編號(hào)140的精氨酸的氨基酸序列構(gòu)成。
融合蛋白PMT(序列編號(hào)6；圖5；實(shí)施例9～10、14～15、17～18)與PMT相關(guān)的序列
Met Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Lys 15Asp Trp Glu Asn Pro Gly Val Thr Gln Leu Asn Arg Leu Ala Ala 30His Pro Pro Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Asp Asp Ala Arg Thr 45Asp Arg Pro Ser Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gly Glu Trp Arg 60Phe Ala Trp Phe Pro Ala Pro Glu Ala Val Pro Glu Ser Leu Leu 75Asp Leu Pro Glu Ala Asp Thr Val Val Val Pro Asp Ser Ser Asn 90Trp Gln Met His Gly Tyr Asp Ala Pro Ile Tyr Thr Asn Val Thr105Tyr Pro Ile Thr Val Asn Pro Pro Phe Val Pro Thr Glu Pro His120His His His Pro Gly Gly Arg Gln Met His Ala Ala Ala Ala Ala135Ala Ala Ala Arg Arg Arg Ala ArgPhe Val Pro Ile Phe Thr Tyr150Gly Glu Leu Gln Arg Met Gln Glu Lys Glu Arg Asn Lys Gly Gln165在上述氨基酸序列中，下劃線部表示人胃動(dòng)素的氨基酸序列。來自大腸桿菌β-半乳糖苷酶的N末端117氨基酸的保護(hù)蛋白質(zhì)(β-gal117S4H)由氨基酸編號(hào)1的蛋氨酸至氨基酸編號(hào)127的精氨酸的氨基酸序列構(gòu)成。連接肽由氨基酸編號(hào)128的谷氨酰胺至氨基酸編號(hào)143的精氨酸的氨基酸序列構(gòu)成。
融合蛋白PAC(序列編號(hào)7；圖11；實(shí)施例16)與PAC相關(guān)的序列Met Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Lys 15Asp Trp Glu Asn Pro Gly Val Thr Gln Leu Asn Arg Leu Ala Ala 30His Pro Pro Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Asp Asp Ala Arg Thr 45Asp Arg Pro Ser Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gly Glu Trp Arg 60Phe Ala Trp Phe Pro Ala Pro Glu Ala Val Pro Glu Ser Leu Leu 75
Asp Leu Pro Glu Ala Asp Thr Val Val Val Pro Asp Ser Ser Asn 90Trp Gln Met His Gly Tyr Asp Ala Pro Ile Tyr Thr Asn Val Thr105Tyr Pro Ile Thr Val Asn Pro Pro Phe Val Pro Thr Glu Pro His120His His His Pro Gly Gly Arg Gln Met His Ala Ala Ala Ala Ala135Ala Ala Ala Arg Arg Arg Ala ArgSer Tyr Ser Met Glu His Phe150Arg Trp Gly Lys Pro Val Gly Lys Lys Arg Arg Pro Val Lys Val165Tyr Pro167在上述氨基酸序列中，下劃線部表示人腎上腺皮質(zhì)刺激激素(1-24)的氨基酸序列。來自大腸桿菌β-半乳糖苷酶的N末端117氨基酸的保護(hù)蛋白質(zhì)(β-gal117S4H)由氨基酸編號(hào)1的蛋氨酸至氨基酸編號(hào)127的精氨酸的氨基酸序列構(gòu)成。連接肽由氨基酸編號(hào)128的谷氨酰胺至氨基酸編號(hào)143的精氨酸的氨基酸序列構(gòu)成。
融合蛋白PCT(序列編號(hào)8；圖11；實(shí)施例16)與PCT相關(guān)的序列Met Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Lys 15Asp Trp Glu Asn Pro Gly Val Thr Gln Leu Asn Arg Leu Ala Ala 30His Pro Pro Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Asp Asp Ala Arg Thr 45Asp Arg Pro Ser Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gly Glu Trp Arg 60Phe Ala Trp Phe Pro Ala Pro Glu Ala Val Pro Glu Ser Leu Leu 75Asp Leu Pro Glu Ala Asp Thr Val Val Val Pro Asp Ser Ser Asn 90Trp Gln Met His Gly Tyr Asp Ala Pro Ile Tyr Thr Asn Val Thr105Tyr Pro Ile Thr Val Asn Pro Pro Phe Val Pro Thr Glu Pro His120His His His Pro Gly Gly Arg Gln Met His Ala Ala Ala Ala Ala135Ala Ala Ala Arg Arg Arg Ala ArgCys Gly Asn Leu Ser Thr Cys150
Met Leu Gly Thr Tyr Thr Gln Asp Phe Asn Lys Phe His Thr Phe165Pro Gln Thr Ala Ile Gly Val Gly Ala Pro Gly176在上述氨基酸序列中，下劃線部表示人降鈣素前體的氨基酸序列。來自大腸桿菌β-半乳糖苷酶的N末端117氨基酸的保護(hù)蛋白質(zhì)(β-gal117S4H)由氨基酸編號(hào)1的蛋氨酸至氨基酸編號(hào)127的精氨酸的氨基酸序列構(gòu)成。連接肽由氨基酸編號(hào)128的谷氨酰胺至氨基酸編號(hào)143的精氨酸的氨基酸序列構(gòu)成。
序列表<110>第一三得利制藥株式會(huì)社<120>使用OmpT蛋白酶突變體的多肽的切斷方法<130>P860<160>8<210>1<211>184<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>
<222>
<223>PRR融合蛋白的基本氨基酸序列<400>1Met Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Lys Asp1 5 10 15Trp Glu Asn Pro Gly Val Thr Gln Leu Asn Arg Leu Ala Ala His Pro20 25 30Pro Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Asp Asp Ala Arg Thr Asp Arg Pro35 40 45Ser Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gly Glu Trp Arg Phe Ala Trp Phe50 55 60Pro Ala Pro Glu Ala Val Pro Glu Ser Leu Leu Asp Leu Pro Glu Ala65 70 75 80Asp Thr Val Val Val Pro Asp Ser Ser Asn Trp Gln Met His Gly Tyr85 90 95Asp Ala Pro Ile Tyr Thr Asn Val Thr Tyr Pro Ile Thr Val Asn Pro100 105 110Pro Phe Val Pro Thr Glu Pro His His His His Pro Gly Gly Arg Gln115 120 125Met His Gly Tyr Asp Ala Glu Leu Arg Leu Tyr Arg Arg His His Gly130 135 140Ser Gly Ser Pro Tyr Arg His Pro Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr145 150 155 160Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile165 170 175
Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly180<210>2<211>184<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>
<222>
<223>PA融合蛋白的基本氨基酸序列<400>2Met Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Lys Asp1 5 10 15Trp Glu Asn Pro Gly Val Thr Gln Leu Asn Arg Leu Ala Ala His Pro20 25 30Pro Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Asp Asp Ala Arg Thr Asp Arg Pro35 40 45Ser Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gly Glu Trp Arg Phe Ala Trp Phe50 55 60Pro Ala Pro Glu Ala Val Pro Glu Ser Leu Leu Asp Leu Pro Glu Ala65 70 75 80Asp Thr Val Val Val Pro Asp Ser Ser Asn Trp Gln Met His Gly Tyr85 90 95Asp Ala Pro Ile Tyr Thr Asn Val Thr Tyr Pro Ile Thr Val Asn Pro100 105 110Pro Phe Val Pro Thr Glu Pro His His His His Pro Gly Gly Arg Gln115 120 125Met His Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Arg Arg Ala Ala Ala130 135 140Ala Gly Ser Pro Tyr Arg His Pro Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr145 150 155 160Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile165 170 175Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly180<210>3
<211>184<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>
<222>
<223>PA3’型融合蛋白的基本氨基酸序列<400>3Met Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Lys Asp1 5 10 15Trp Glu Asn Pro Gly Val Thr Gln Leu Asn Arg Leu Ala Ala His Pro20 25 30Pro Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Asp Asp Ala Arg Thr Asp Arg Pro35 40 45Ser Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gly Glu Trp Arg Phe Ala Trp Phe50 55 60Pro Ala Pro Glu Ala Val Pro Glu Ser Leu Leu Asp Leu Pro Glu Ala65 70 75 80Asp Thr Val Val Val Pro Asp Ser Ser Asn Trp Gln Met His Gly Tyr85 90 95Asp Ala Pro Ile Tyr Thr Asn Val Thr Tyr Pro Ile Thr Val Asn Pro100 105 110Pro Phe Val Pro Thr Glu Pro His His His His Pro Gly Gly Arg Gln115 120 125Met His Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Arg Arg Ala Arg Ala130 135 140Ala Gly Ser Pro Tyr Arg His Pro Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr145 150 155 160Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile165 170 175Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly180<210>4<211>184<212>PRT<213>人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>PA23’型融合蛋白的基本氨基酸序列<400>4Met Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Lys Asp1 5 10 15Trp Glu Asn Pro Gly Val Thr Gln Leu Asn Arg Leu Ala Ala His Pro20 25 30Pro Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Asp Asp Ala Arg Thr Asp Arg Pro35 40 45Ser Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gly Glu Trp Arg Phe Ala Trp Phe50 55 60Pro Ala Pro Glu Ala Val Pro Glu Ser Leu Leu Asp Leu Pro Glu Ala65 70 75 80Asp Thr Val Val Val Pro Asp Ser Ser Asn Trp Gln Met His Gly Tyr85 90 95Asp Ala Pro Ile Tyr Thr Asn Val Thr Tyr Pro Ile Thr Val Asn Pro100 105 110Pro Phe Val Pro Thr Glu Pro His His His His Pro Gly Gly Arg Gln115 120 125Met His Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Arg Arg Arg Ala Arg Ala130 135 140Ala Gly Ser Pro Tyr Arg His Pro Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr145 150 155 160Ser Asp ValSer Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile165 170 175Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly180<210>5<211>162<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>
<222>
<223>PRMT型融合蛋白的基本氨基酸序列<400>5Met Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Lys Asp1 5 10 15Trp Glu Asn Pro Gly Val Thr Gln Leu Asn Arg Leu Ala Ala His Pro20 25 30Pro Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Asp Asp Ala Arg Thr Asp Arg Pro35 40 45Ser Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gly Glu Trp Arg Phe Ala Trp Phe50 55 60Pro Ala Pro Glu Ala Val Pro Glu Ser Leu Leu Asp Leu Pro Glu Ala65 70 75 80Asp Thr Val Val Val Pro Asp Ser Ser Asn Trp Gln Met His Gly Tyr85 90 95Asp Ala Pro Ile Tyr Thr Asn Val Thr Tyr Pro Ile Thr Val Asn Pro100 105 110Pro Phe Val Pro Thr Glu Pro His His His His Pro Gly Gly Arg Gln115 120 125Met His Gly Tyr Asp Ala Glu Lue Arg Leu Tyr Arg Phe Val Pro Ile130 135 140Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gln Arg Met Gln Glu Lys Glu Arg Asn Lys145 150 155 160Gly Gln<210>6<211>165<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>
<222>
<223>PMT型融合蛋白的基本氨基酸序列<400>6Met Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Lys Asp1 5 10 15Trp Glu Asn Pro Gly Val Thr Gln Leu Asn Arg Leu Ala Ala His Pro20 25 30
Pro Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Asp Asp Ala Arg Thr Asp Arg Pro35 40 45Ser Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gly Glu Trp Arg Phe Ala Trp Phe50 55 60Pro Ala Pro Glu Ala Val Pro Glu Ser Leu Leu Asp Leu Pro Glu Ala65 70 75 80Asp Thr Val Val Val Pro Asp Ser Ser Asn Trp Gln Met His Gly Tyr85 90 95Asp Ala Pro Ile Tyr Thr Asn Val Thr Tyr Pro Ile Thr Val Asn Pro100 105 110Pro Phe Val Pro Thr Glu Pro His His His His Pro Gly Gly Arg Gln115 120 125Met His Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Arg Arg Arg Ala Arg Phe130 135 140Val Pro Ile Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gln Arg Met Gln Glu Lys Glu145 150 155 160Arg Asn Lys Gly Gln165<210>7<211>167<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>
<222>
<223>PAC型融合蛋白的基本氨基酸序列<400>7Met Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Lys Asp1 5 10 15Trp Glu Asn Pro Gly Val Thr Gln Leu Asn Arg Leu Ala Ala His Pro20 25 30Pro Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Asp Asp Ala Arg Thr Asp Arg Pro35 40 45Ser Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gly Glu Trp Arg Phe Ala Trp Phe50 55 60Pro Ala Pro Glu Ala Val Pro Glu Ser Leu Leu Asp Leu Pro Glu Ala
65 70 75 80Asp Thr Val Val Val Pro Asp Ser Ser Asn Trp Gln Met His Gly Tyr85 90 95Asp Ala Pro Ile Tyr Thr Asn Val Thr Tyr Pro Ile Thr Val Asn Pro100 105 110Pro Phe Val Pro Thr Glu Pro His His His His Pro Gly Gly Arg Gln115 120 125Met His Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Arg Arg Arg Ala Arg Ser130 135 140Tyr Ser Met Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Val Gly Lys Lys Arg145 150 155 160Arg Pro Val Lys Val Tyr Pro165<210>8<211>176<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>
<222>
<223>PCT型融合蛋白的基本氨基酸序列<400>8Met Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Lys Asp1 5 10 15Trp Glu Asn Pro Gly Val Thr Gln Leu Asn Arg Leu Ala Ala His Pro20 25 30Pro Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Asp Asp Ala Arg Thr Asp Arg Pro35 40 45Ser Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gly Glu Trp Arg Phe Ala Trp Phe50 55 60Pro Ala Pro Glu Ala Val Pro Glu Ser Leu Leu Asp Leu Pro Glu Ala65 70 75 80Asp Thr Val Val Val Pro Asp Ser Ser Asn Trp Gln Met His Gly Tyr85 90 95Asp Ala Pro Ile Tyr Thr Asn Val Thr Tyr Pro Ile Thr Val Asn Pro100 105 110
Pro Phe Val Pro Thr Glu Pro His His His His Pro Gly Gly Arg Gln115 120 125Met His Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Arg Arg Arg Ala Arg Cys130 135 140Gly Asn Leu Ser Thr Cys Met Leu Gly Thr Tyr Thr Gln Asp Phe Asn145 150 155 160Lys Phe His Thr Phe Pro Gln Thr Ala Ile Gly Val Gly Ala Pro Gly165 170
權(quán)利要求
1.一種多肽的切斷方法，其特征是與多肽中希望的切斷部位相關(guān)的P1位為精氨酸或賴氨酸，P1’為天冬氨酸、谷氨酸或脯氨酸以外的氨基酸，在從P10位至P3位或從P3’位至P5’位的氨基酸序列中的任意部位連續(xù)配置1個(gè)堿性氨基酸或2個(gè)或3個(gè)堿性氨基酸，但是，配置1個(gè)堿性氨基酸時(shí)，除去P6或P4位，使用OmpT蛋白酶在該多肽中希望的切斷部位進(jìn)行切斷。
2.一種目的肽的制造方法，其特征是用含有編碼融合蛋白的基因的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，所述融合蛋白由通過希望的切斷部位與C末端為精氨酸或賴氨酸的保護(hù)肽融合的N末端為天冬氨酸、谷氨酸或脯氨酸以外的氨基酸的目的肽構(gòu)成，在融合蛋白質(zhì)中該切斷部位的P10位至P3位或P3’位至P5’位的氨基酸序列中的任意部位連續(xù)配置1個(gè)堿性氨基酸或2個(gè)或3個(gè)堿性氨基酸，但是，配置1個(gè)堿性氨基酸時(shí)，除去P6或P4位，上述切斷部位是可被OmpT蛋白酶切斷的切斷部位，在該細(xì)胞內(nèi)使上述基因表達(dá)，通過上述蛋白酶在上述切斷部位進(jìn)行切斷，可以由融合蛋白獲得目的肽。
3.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，當(dāng)多肽中或融合蛋白中不希望被OmpT蛋白酶切斷的部位存在時(shí)，通過在該部位的P3位配置酸性氨基酸，可抑制在該部位的切斷。
4.權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其中，在與多肽中或融合蛋白中希望的切斷部位相關(guān)的P10～P3位之間配置2或3個(gè)連續(xù)的堿性氨基酸。
5.權(quán)利要求4中所述的方法，其中，在與多肽中或融合蛋白中希望的切斷部位相關(guān)的P5～P3位配置3個(gè)連續(xù)的堿性氨基酸。
6.權(quán)利要求1～5中任一項(xiàng)所述的方法，其中堿性氨基酸為精氨酸和/或賴氨酸。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其中堿性氨基酸為精氨酸。
8.一種制造方法，該方法包括使用OmpT蛋白酶在多肽中希望的切斷部位進(jìn)行切斷的多肽的切斷方法或包括在融合蛋白中希望的切斷部位進(jìn)行切斷的目的肽的制造方法，其特征是當(dāng)在該多肽中或該融合蛋白中不希望被OmpT蛋白酶切斷的部位存在時(shí)，通過在該部位的P3位配置酸性氨基酸，可以抑制在該部位的切斷。
9.權(quán)利要求3～8中任一項(xiàng)所述的方法，其中酸性氨基酸為天冬氨酸。
10.權(quán)利要求1～9中任一項(xiàng)所述的方法，其中與多肽中或融合蛋白中希望的切斷部位相關(guān)的P5位至P1位的氨基酸序列是Arg-Arg-Arg-Ala-Arg。
11.權(quán)利要求1～9中任一項(xiàng)所述的方法，其中與多肽中或融合蛋白中希望的切斷部位相關(guān)的P7位至P1位的氨基酸序列是Asp-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Arg。
12.一種多肽的切斷方法，其特征是使用從OmpT蛋白酶的N末端開始的第97位氨基酸是丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸或組氨酸的OmpT蛋白酶97位氨基酸突變體，在多肽中希望的切斷部位進(jìn)行切斷。
13.一種多肽的切斷方法，其特征是當(dāng)與多肽中希望的切斷部位相關(guān)的P1位為精氨酸或賴氨酸、P1’位為精氨酸或賴氨酸以外的氨基酸時(shí)，使用從OmpT蛋白酶的N末端開始的第97位氨基酸是丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸或組氨酸的OmpT蛋白酶97位氨基酸突變體，在多肽中希望的切斷部位進(jìn)行切斷。
14.一種多肽的切斷方法，其特征是與多肽中希望的切斷部位相關(guān)的P1位為精氨酸或賴氨酸，P1’位為精氨酸或賴氨酸以外的氨基酸，在從P10位至P3位或從P3’位至P5’位的氨基酸序列中的任意部位連續(xù)配置1個(gè)堿性氨基酸或2個(gè)或3個(gè)堿性氨基酸，使用從OmpT蛋白酶的N末端開始的第97位氨基酸是丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸或組氨酸的OmpT蛋白酶97位氨基酸突變體，在該多肽中希望的切斷部位進(jìn)行切斷。
15.一種目的肽的制造方法，其特征是用含有編碼融合蛋白的基因的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，其中，在希望的切斷部位可被從OmpT蛋白酶的N末端開始的第97位氨基酸是丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸或組氨酸的OmpT蛋白酶97位氨基酸突變體切斷，所述融合蛋白通過該切斷部位與保護(hù)肽融合的目的肽構(gòu)成，在該細(xì)胞內(nèi)使該基因表達(dá)，在上述切斷部位通過上述蛋白酶切斷，由融合蛋白獲得目的肽。
16.一種目的肽的制造方法，其特征是用含有編碼融合蛋白的基因的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，其中在希望的切斷部位可被OmpT蛋白酶的N末端開始的第97位的氨基酸是丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸或組氨酸的OmpT蛋白酶97位氨基酸突變體切斷，所述融合蛋白由通過該切斷部位與C末端為精氨酸或賴氨酸的保護(hù)肽融合的N末端為精氨酸或賴氨酸酸以外的氨基酸的目的肽構(gòu)成，在該細(xì)胞內(nèi)使該基因表達(dá)，在上述切斷部位通過上述蛋白酶切斷，可以由融合蛋白獲得目的肽。
17.一種目的肽的制造方法，其特征是用含有編碼融合蛋白的基因的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，所述融合蛋白是通過在希望的切斷部位與C末端為精氨酸或賴氨酸的保護(hù)肽融合的N末端為精氨酸或賴氨酸酸以外的氨基酸的目的肽構(gòu)成的，在融合蛋白質(zhì)中的與該切斷部位相關(guān)的P10至P3位或P3’位至P5’位的氨基酸序列的任意部位連續(xù)配置1個(gè)堿性氨基酸或2個(gè)或3個(gè)堿性氨基酸，上述切斷部位是可被從OmpT蛋白酶的N末端開始的第97位氨基酸是丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸或組氨酸的OmpT蛋白酶97位氨基酸突變體切斷的切斷部位，在該細(xì)胞內(nèi)使該基因表達(dá)，在上述切斷部位通過上述蛋白酶切斷，由融合蛋白獲得目的肽。
18.權(quán)利要求12～17任一項(xiàng)所述的方法，其中，當(dāng)多肽中或融合蛋白中不希望被OmpT蛋白酶第97位氨基酸突變體切斷的部位存在時(shí)，通過在與該部位相關(guān)的P3位配置酸性氨基酸，可以抑制在該部位的切斷。
19.權(quán)利要求12～18任一項(xiàng)所述的方法，其中，在多肽中或融合蛋白中與希望的切斷部位相關(guān)的P10～P3位之間配置2或3個(gè)連續(xù)的堿性氨基酸。
20.權(quán)利要求19中所述的方法，其中，在與多肽中或融合蛋白中希望的切斷部位相關(guān)的P5～P3位配置3個(gè)連續(xù)的堿性氨基酸。
21.權(quán)利要求14、17～20任一項(xiàng)所述的方法，其中堿性氨基酸為精氨酸和/或賴氨酸。
22.權(quán)利要求21所述的方法，其中堿性氨基酸為精氨酸。
23.一種制造方法，該方法是包括使用OmpT蛋白酶97位氨基酸突變體在多肽中希望的切斷部位進(jìn)行切斷的多肽的切斷方法或包括在融合蛋白中希望的切斷部位進(jìn)行切斷的目的肽的制造方法，其特征是當(dāng)多肽中或融合蛋白中不希望被OmpT蛋白酶97位氨基酸突變體切斷的部位存在時(shí)，通過在與該部位相關(guān)的P3位配置酸性氨基酸，可以抑制在該部位的切斷。
24.權(quán)利要求18～23中任一項(xiàng)所述的方法，其中酸性氨基酸為天冬氨酸。
25.權(quán)利要求12～24中任一項(xiàng)所述的方法，其中與多肽中或融合蛋白中希望的切斷部位相關(guān)的P5位至P1位的氨基酸序列是Arg-Arg-Arg-Ala-Arg。
26.權(quán)利要求12～24中任一項(xiàng)所述的方法，其中與多肽中或融合蛋白中希望的切斷部位相關(guān)的P7位至P1位的氨基酸序列是Asp-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Arg。
27.權(quán)利要求12～26中任一項(xiàng)所述的方法，其中從OmpT蛋白酶的N末端開始的第97位氨基酸是亮氨酸、蛋氨酸或組氨酸。
28.權(quán)利要求12～26中任一項(xiàng)所述的方法，其中，使用與多肽中或融合蛋白中希望的切斷部位相關(guān)的P1’位或目的肽的N末端是絲氨酸或丙氨酸，第97位氨基酸是亮氨酸的OmpT蛋白酶97位氨基酸突變體。
29.權(quán)利要求12～26中任一項(xiàng)所述的方法，其中，使用與多肽中或融合蛋白中希望的切斷部位相關(guān)的P1’位或目的肽的N末端是苯丙氨酸、丙氨酸、絲氨酸、半胱氨酸或酪氨酸，第97位氨基酸是蛋氨酸的OmpT蛋白酶97位氨基酸突變體。
30.權(quán)利要求12～26中任一項(xiàng)所述的方法，其中，使用與多肽中或融合蛋白中希望的切斷部位相關(guān)的P1’位或目的肽的N末端是丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺，第97位氨基酸是組氨酸的OmpT蛋白酶97位氨基酸突變體。
31.權(quán)利要求2～11、15～30中任一項(xiàng)所述的方法，其中目的肽是由22個(gè)氨基酸殘基至45個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的肽。
32.權(quán)利要求31所述的方法，其中目的肽是腎上腺皮質(zhì)刺激激素(1-24)、胃動(dòng)素或降鈣素前體。
33.權(quán)利要求2～11、15～32中任一項(xiàng)所述的方法，其中宿主細(xì)胞是大腸桿菌。
34.權(quán)利要求1～33中任一項(xiàng)所述的方法，作為切斷用蛋白酶使用表達(dá)編碼OmpT蛋白酶或表達(dá)編碼從OmpT蛋白酶的N末端開始的第97位氨基酸是丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸或組氨酸的OmpT蛋白酶97位氨基酸突變體的基因的菌體本身。
35.權(quán)利要求1～33中任一項(xiàng)所述的方法，使編碼OmpT蛋白酶或編碼從OmpT蛋白酶的N末端開始的第97位氨基酸是丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸或組氨酸的OmpT蛋白酶97位氨基酸突變體的基因與編碼希望用該蛋白酶切斷的多肽或融合蛋白的基因共表達(dá)。
全文摘要
具有以下特征的多肽的切斷方法與多肽中希望的切斷部位相關(guān)的P1位為精氨酸或賴氨酸，P1’為天冬氨酸、谷氨酸或脯氨酸，在從P10位至P3或從P3’至P5’位的氨基酸序列中的任意部位連接配上1個(gè)堿性氨基酸或2個(gè)或3個(gè)堿性氨基酸(但是，配置1個(gè)堿性氨基酸時(shí)，除去P6或P4位)，使用OmpT蛋白酶或?qū)ζ銷末端至第97位的氨基酸進(jìn)行了置換的突變酶，在該多肽中的希望切斷部位進(jìn)行切斷。
文檔編號(hào)C12P21/02GK1860226SQ20048002852
公開日2006年11月8日 申請(qǐng)日期2004年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月30日
發(fā)明者奧野和昭, 藪田雅之 申請(qǐng)人:第一阿斯比奧制藥株式會(huì)社