專(zhuān)利名稱(chēng)：Rage融合蛋白及使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及高級(jí)糖基化終產(chǎn)物的受體(RAGE)的調(diào)節(jié)。更具體而言，本發(fā)明描述了包含RAGE多肽的融合蛋白，制造此類(lèi)融合蛋白的方法，以及此類(lèi)蛋白用于治療基于RAGE的病癥的用途。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)或脂質(zhì)與醛糖糖類(lèi)一起孵育導(dǎo)致蛋白質(zhì)上氨基的非酶促糖基化和氧化從而形成Amadori加合物。隨著時(shí)間的進(jìn)程，該加合物經(jīng)歷另外的重排、脫水以及與其他蛋白質(zhì)交聯(lián)而形成已知為高級(jí)糖基化終產(chǎn)物(AGEs)的復(fù)合物。促進(jìn)AGEs形成的因素包括延遲的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換(例如，在淀粉樣變性中)、具有高賴(lài)氨酸含量的大分子的積聚以及高血糖水平(例如，在糖尿病中)(Hori等人，J.Biol.Chem.27025752-761，(1995))。AGEs已涉及各種病癥，包括與糖尿病相關(guān)的并發(fā)癥，和正常的衰老。
AGEs顯示出與在單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、微血管系統(tǒng)的內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、腎小球膜細(xì)胞(mesengial cell)和神經(jīng)元上的細(xì)胞表面受體的特異性和可飽和性結(jié)合。高級(jí)糖基化終產(chǎn)物的受體(RAGE)是免疫球蛋白超基因家族分子的成員。RAGE的胞外(N-末端)結(jié)構(gòu)域包含三個(gè)免疫球蛋白類(lèi)型區(qū)域一個(gè)V(可變的)類(lèi)型結(jié)構(gòu)域，隨后為兩個(gè)C-型(恒定的)結(jié)構(gòu)域(Neeper等人，J.Biol.Chem.，26714998-15004(1992)；Schmidt等人，Circ.(Suppl.)96#194(1997))。單個(gè)跨膜穿越結(jié)構(gòu)域和短的、高度帶電荷的胞質(zhì)尾部在胞外域之后。通過(guò)RAGE的蛋白質(zhì)水解或通過(guò)分子生物學(xué)方法可以分離N-末端的胞外域以產(chǎn)生包含V和C結(jié)構(gòu)域的可溶性RAGE(sRAGE)。
RAGE表達(dá)于多種細(xì)胞類(lèi)型中，包括白細(xì)胞、神經(jīng)元、小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮(例如，Hori等人，J.Biol.Chem.，27025752-761(1995))。在衰老組織中(Schleicher等人，J.Clin.Invest.，99(3)457-468(1997))，以及在糖尿病患者的視網(wǎng)膜、脈管系統(tǒng)和腎臟中(Schmidt等人，Nature Med.，11002-1004(1995))中也發(fā)現(xiàn)RAGE水平增加。
除了AGEs之外，其他化合物也可結(jié)合并調(diào)節(jié)RAGE。RAGE結(jié)合多個(gè)在功能和結(jié)構(gòu)上不同的配體，包含淀粉樣蛋白β(Aβ)、血清淀粉樣蛋白A(SAA)、高級(jí)糖基化終產(chǎn)物(AGEs)、S100(鈣粒蛋白家族的促炎性成員)、羧甲基賴(lài)氨酸(CML)、兩性蛋白(amphoterin)和CD11b/CD18(Bucciarelli等人，Cell Mol.Life Sci.，591117-128(2002)；Chavakis等人，Microbes Infect.，61219-1225(2004)；Kokkola等人，Scand.J.Immunol.，611-9(2005)；Schmidt等人，J.Clin.Invest.，108949-955(2001)；Rocken等人，Am.J.Pathol.，1621213-1220(2003))。
已顯示配體例如AGEs、S100/鈣粒蛋白、β-淀粉樣蛋白、CML(Nε-羧甲基賴(lài)氨酸)和兩性蛋白與RAGE的結(jié)合可以修飾各種基因的表達(dá)。這些相互作用隨后可以啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，包括p38活化、p21ras、MAP激酶、Erk1-2磷酸化以及炎性信號(hào)傳導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄介質(zhì)NF-κB的活化(Yeh等人，Diabetes，501495-1504(2001))。例如，在許多細(xì)胞類(lèi)型中，RAGE與其配體之間的相互作用可以產(chǎn)生氧化應(yīng)激，它從而導(dǎo)致自由基敏感性轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活化，以及NF-κB調(diào)節(jié)的基因的活化，例如細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α。此外，RAGE的表達(dá)經(jīng)由NF-κB上調(diào)，并且在炎癥或氧化應(yīng)激位點(diǎn)處顯示出表達(dá)增強(qiáng)(Tanaka等人，J.Biol.Chem.，27525781-25790(2000))。因此，由配體結(jié)合啟動(dòng)的正反饋回路可以推動(dòng)向上的并且通常是有害的盤(pán)旋上升。
在不同的組織和器官中的RAGE活化可以導(dǎo)致眾多病理生理學(xué)的后果。RAGE已涉及各種病狀，包括急性和慢性炎癥(Hofmann等人，Cell 97889-901(1999))，糖尿病晚期并發(fā)癥的發(fā)展，例如血管通透性增強(qiáng)(Wautier等人，J.Clin.Invest.，97238-243(1995))、腎病(Teillet等人，J.Am.Soc.Nephrol.，111488-1497(2000))、動(dòng)脈硬化(Vlassara等人，The Finnish Medical Society DUODECIM，Ann.Med，28419-426(1996))和視網(wǎng)膜病(Hammes等人，Diabetologia，42603-607(1999))。RAGE還涉及阿爾茨海默病(Yan等人，Nature，382685-691(1996))以及腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移(Taguchi等人，Nature，405354-357(2000))。
盡管RAGE有著廣泛表達(dá)及其在多種不同的疾病模型中的明顯多效的作用，但RAGE似乎并非是正常發(fā)育所必需的。例如，RAGE敲除的小鼠沒(méi)有明顯的異常表型，這提示盡管RAGE在受長(zhǎng)期刺激時(shí)能夠在疾病病理中起作用，但RAGE的抑制似乎并不有助于任何不希望的急性表型(Liliensiek等人，J.Clin.Invest.，1131641-50(2004))。
生理學(xué)配體與RAGE的拮抗性結(jié)合可以下調(diào)由過(guò)量濃度的AGEs及其他RAGE配體引起的病理生理學(xué)改變。通過(guò)減少內(nèi)源性配體與RAGE的結(jié)合，可以減少與RAGE介導(dǎo)的病癥相關(guān)的癥狀?？扇苄訰AGE(sRAGE)能夠有效地拮抗RAGE配體與RAGE的結(jié)合。然而，當(dāng)在體內(nèi)施用時(shí)，sRAGE可以具有可能太短以至于不能對(duì)一種或多種病癥治療有用的半壽期。因此，需要開(kāi)發(fā)拮抗AGEs及其他生理學(xué)配體結(jié)合RAGE受體的化合物，其中該化合物具有所希望的藥代動(dòng)力學(xué)特性。
發(fā)明概述本發(fā)明的實(shí)施方案包括RAGE融合蛋白及此類(lèi)蛋白的使用方法。本發(fā)明可以以各種方式實(shí)施。本發(fā)明的實(shí)施方案可以包括包含RAGE多肽的融合蛋白，所述RAGE多肽與第二種非RAGE多肽連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，融合蛋白包含RAGE配體結(jié)合位點(diǎn)。融合蛋白可以進(jìn)一步包含直接與包含免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域或部分CH2結(jié)構(gòu)域的多肽連接的RAGE多肽。
本發(fā)明還包括制造RAGE融合蛋白的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括將RAGE多肽與第二種非RAGE多肽連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，RAGE多肽包含RAGE配體結(jié)合位點(diǎn)。該方法可以包括將RAGE多肽直接與包含免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域或部分CH2結(jié)構(gòu)域的多肽連接。
在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明可以包括治療受試者中RAGE介導(dǎo)的病癥的方法和組合物。該方法可以包括對(duì)受試者施用本發(fā)明的融合蛋白。該組合物可以包含在藥物學(xué)上可接受的載體(carrier)中的本發(fā)明的RAGE融合蛋白。
存在可能與本發(fā)明的具體實(shí)施方案相關(guān)的各種優(yōu)點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白當(dāng)施用于受試者時(shí)可以是代謝穩(wěn)定的。此外，本發(fā)明的融合蛋白可以顯示與RAGE配體的高親和力結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白以高nM至低μM范圍內(nèi)的親和力與RAGE配體結(jié)合。通過(guò)以高親和力與生理學(xué)RAGE配體結(jié)合，本發(fā)明的融合蛋白可以用于抑制內(nèi)源性配體與RAGE的結(jié)合，從而提供了改善RAGE介導(dǎo)的疾病的手段。
此外，本發(fā)明的融合蛋白可以以蛋白質(zhì)或核酸的形式提供。在一個(gè)示例實(shí)施方案中，融合蛋白可以被全身性地施用并且停留在脈管系統(tǒng)中以有效力地治療部分地由RAGE介導(dǎo)的脈管疾病。在另一示例實(shí)施方案中，該融合蛋白可以被局部施，以治療其中RAGE配體有助于疾病病理的疾病?？商娲?，通過(guò)使用合適的載體例如病毒或裸露的DNA可以將編碼融合蛋白的核酸構(gòu)建體輸送到暫時(shí)的局部表達(dá)可以局部抑制RAGE配體和受體之間相互作用的位點(diǎn)處。因此，施用在性質(zhì)上可以是暫時(shí)的(例如，當(dāng)施用融合蛋白時(shí))或較持久的(例如，當(dāng)作為重組DNA施用融合蛋白時(shí))。
本發(fā)明的另外的特征將在下文中描述。應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明在其應(yīng)用方面不局限于下述權(quán)利要求、說(shuō)明書(shū)和附圖中所述的細(xì)節(jié)。本發(fā)明能夠有其他的實(shí)施方案并且能夠以各種方式被實(shí)踐或施行。
附圖簡(jiǎn)述本發(fā)明的各種特征、方面和優(yōu)點(diǎn)在參照下列附圖后將變得更為明顯。


圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明可選實(shí)施方案的各種RAGE序列圖A，SEQID NO1，人RAGE的氨基酸序列；和SEQ ID NO2，不含信號(hào)序列氨基酸1-22的人RAGE的氨基酸序列；圖B，SEQ ID NO3，不含信號(hào)序列氨基酸1-23的人RAGE的氨基酸序列；圖C，SEQ ID NO4，人sRAGE的氨基酸序列；SEQ ID NO5，不含信號(hào)序列氨基酸1-22的人sRAGE的氨基酸序列；和SEQ ID NO6，不含信號(hào)序列氨基酸1-23的人sRAGE的氨基酸序列；圖D，SEQ ID NO7，包含人RAGE的V-結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列；SEQ ID NO8，包含人RAGE的V-結(jié)構(gòu)域的可選氨基酸序列；SEQ ID NO9，人RAGE的V-結(jié)構(gòu)域的N-末端片段；SEQ IDNO10，人RAGE的V-結(jié)構(gòu)域的可選N-末端片段；SEQ ID NO11，人RAGE氨基酸124-221的氨基酸序列；SEQ ID NO12，人RAGE氨基酸227-317的氨基酸序列；SEQ ID NO13，人RAGE氨基酸23-123的氨基酸序列；圖E，SEQ ID NO14，人RAGE氨基酸24-123的氨基酸序列；SEQ ID NO15，人RAGE氨基酸23-136的氨基酸序列；SEQ IDNO16，人RAGE氨基酸24-136的氨基酸序列；SEQ ID NO17，人RAGE氨基酸23-226的氨基酸序列；SEQ ID NO18，人RAGE氨基酸24-226的氨基酸序列；圖F，SEQ ID NO19，人RAGE氨基酸23-251的氨基酸序列；SEQ ID NO20；人RAGE氨基酸24-251的氨基酸序列；SEQ ID NO21，RAGE域間連接體；SEQ ID NO22，第二個(gè)RAGE域間連接體；SEQ ID NO23，第三個(gè)RAGE域間連接體；SEQ ID NO24，第四個(gè)RAGE域間連接體；圖G，SEQ ID NO25，編碼人RAGE氨基酸1-118的DNA；SEQ ID NO26，編碼人RAGE氨基酸1-123的DNA；和SEQ ID NO27，編碼人RAGE氨基酸1-136的DNA；圖H，SEQ ID NO28，編碼人RAGE氨基酸1-230的DNA；和SEQ ID NO29，編碼人RAGE氨基酸1-251的DNA；圖I，SEQ ID NO38，人IgG CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的部分氨基酸序列；SEQ ID NO39，編碼人IgG的人CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的部分的DNA；SEQ ID NO40，人IgG CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列；圖J，SEQ ID NO41，編碼人IgG的人CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的DNA；SEQ ID NO42，人IgG CH2結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列；SEQ ID NO43，人IgG CH3結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列；和SEQ ID NO44，第5個(gè)RAGE域間連接體。
圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的RAGE融合蛋白(TTP-4000)編碼區(qū)的DNA序列(SEQ ID NO30)。以粗體突出的編碼序列1-753編碼RAGE N-末端的蛋白質(zhì)序列，而序列754-1386編碼人IgGFc(γ1)的蛋白質(zhì)序列。
圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的可選RAGE融合蛋白(TTP-3000)編碼區(qū)的DNA序列(SEQ ID NO31)。以粗體突出的編碼序列1-408編碼RAGE N-末端的蛋白質(zhì)序列，而序列409-1041編碼人IgGFc(γ1)的蛋白質(zhì)序列。
圖4顯示了根據(jù)本發(fā)明的可選實(shí)施方案的氨基酸序列SEQ IDNO32(TTP-4000)、SEQ ID NO33和SEQ ID NO34，每一個(gè)均編碼四結(jié)構(gòu)域的RAGE融合蛋白。RAGE序列以粗字體突出。
圖5顯示了根據(jù)本發(fā)明的可選實(shí)施方案的氨基酸序列SEQ IDNO35(TTP-3000)、SEQ ID NO36和SEQ ID NO37，每一個(gè)均編碼三結(jié)構(gòu)域的RAGE融合蛋白。RAGE序列以粗字體突出。
圖6，圖A顯示人RAGE和人IgGγ-1Fc蛋白的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域比較，以及用于制造根據(jù)本發(fā)明的可選實(shí)施方案的TTP-3000(在位置136處)和TTP-4000(在位置251處)的裂解位點(diǎn)；和圖B顯示根據(jù)本發(fā)明的可選實(shí)施方案的TTP-3000和TTP-4000的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。
圖7顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，sRAGE以及RAGE融合蛋白TTP-4000(TT4)和TTP-3000(TT3)與RAGE配體即淀粉樣蛋白-β(A-β)、S100b(S100)和兩性蛋白(Ampho)的體外結(jié)合測(cè)定。
圖8顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，與僅包含免疫檢測(cè)試劑(“單獨(dú)的復(fù)合物”)的陰性對(duì)照相比，RAGE融合蛋白TTP-4000(TT4)(“蛋白質(zhì)”)與淀粉樣蛋白-β的體外結(jié)合測(cè)定結(jié)果，以及RAGE拮抗劑(“RAGE配體”)對(duì)此類(lèi)結(jié)合的拮抗作用。
圖9顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，與僅包含免疫檢測(cè)試劑(“單獨(dú)的復(fù)合物”)的陰性對(duì)照相比，RAGE融合蛋白TTP-3000(TT3)(“蛋白質(zhì)”)與淀粉樣蛋白-β的體外結(jié)合測(cè)定結(jié)果，以及RAGE拮抗劑(“RAGE配體”)對(duì)此類(lèi)結(jié)合的拮抗作用。
圖10顯示了基于細(xì)胞的測(cè)定結(jié)果，所述測(cè)定測(cè)量根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的RAGE融合蛋白TTP-3000(TT3)和TTP-4000(TT4)以及sRAGE對(duì)S100b-RAGE誘導(dǎo)的TNF-α產(chǎn)生的抑制。
圖11顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的RAGE融合蛋白TTP-4000的藥代動(dòng)力學(xué)特性曲線(xiàn)圖，其中每條曲線(xiàn)代表在相同實(shí)驗(yàn)條件下的一種不同的動(dòng)物。
圖12顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，作為炎癥應(yīng)答的量度，由于受RAGE融合蛋白TTP-4000刺激和人IgG刺激而從THP-1細(xì)胞中釋放的TNF-α的相對(duì)水平。
圖13顯示了根據(jù)本發(fā)明的可選實(shí)施方案使用RAGE融合蛋白TTP-4000減少了糖尿病動(dòng)物中的再狹窄，其中圖A顯示與陰性對(duì)照(IgG)相比TTP-4000 RAGE融合蛋白減小了內(nèi)膜/中膜比(intima/mediaratio)，和圖B顯示TTP-4000 RAGE融合蛋白以劑量-響應(yīng)方式減少了血管平滑肌細(xì)胞增殖。
圖14顯示了根據(jù)本發(fā)明的可選實(shí)施方案使用RAGE融合蛋白TTP-4000減少了阿爾茨海默病(AD)動(dòng)物中的淀粉樣蛋白形成和認(rèn)知障礙，其中圖A顯示TTP-4000 RAGE融合蛋白減少了大腦中的淀粉樣蛋白的負(fù)荷，和圖B顯示TTP-4000 RAGE融合蛋白改善了認(rèn)知功能。
圖15顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，TTP-4000與各種被固定的已知RAGE配體的飽和-結(jié)合曲線(xiàn)。
發(fā)明詳述為了本說(shuō)明書(shū)的目的，除非另有說(shuō)明，本說(shuō)明書(shū)中所使用的表示成分的量、反應(yīng)條件等等的所有數(shù)字被理解為在所有情況下被術(shù)語(yǔ)“大約”修飾。因此，除非有相反的說(shuō)明，下述說(shuō)明書(shū)中所列出的數(shù)字參數(shù)為近似值，它可以依據(jù)本發(fā)明所尋求獲得的所需特性而改變。最低限度，并且不企圖限制對(duì)于權(quán)利要求范圍應(yīng)用等同原則，每個(gè)數(shù)字參數(shù)應(yīng)當(dāng)至少根據(jù)所報(bào)告的有效數(shù)字的數(shù)目并且通過(guò)應(yīng)用普通的舍入法進(jìn)行解釋。
雖然闡述出本發(fā)明的寬范圍的數(shù)字范圍和參數(shù)為近似值，但在具體實(shí)例中列出的數(shù)值盡可能精確地給出。然而，任何數(shù)值固有地包含由標(biāo)準(zhǔn)差必然引起的某些誤差，所述標(biāo)準(zhǔn)差發(fā)現(xiàn)于它們各自的測(cè)試測(cè)量之中。此外，應(yīng)理解本文所公開(kāi)的所有范圍涵蓋其中所包含的任何及所有亞范圍。例如，指定范圍“1-10”應(yīng)視為包含最小值1和最大值10之間(并包含1和10)的任何及所有亞范圍；即，以1或更大的最小值開(kāi)始的所有亞范圍，例如1-6.1，和以10或更小的最大值結(jié)束的所有亞范圍，例如5.5-10。另外，任何提及“在本文中引入”之處應(yīng)理解為以其整體引入。
進(jìn)一步指出的是，如本說(shuō)明書(shū)中所使用的，除非清楚明確地限定為一個(gè)事物，否則單數(shù)形式的“a”、“an”和“the”包括復(fù)數(shù)。除非上下文另有明確說(shuō)明，否則術(shù)語(yǔ)“或”與術(shù)語(yǔ)“和/或”可互換使用。
另外，術(shù)語(yǔ)“部分”和“片段”可互換地用于指多肽、核酸或其他分子構(gòu)建體的部分。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“上游”在分子為蛋白質(zhì)時(shí)指位于第二個(gè)殘基N-末端的殘基，或者在分子為核酸時(shí)指位于第二個(gè)殘基5’端的殘基。同樣如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“下游”在分子為蛋白質(zhì)時(shí)指位于第二個(gè)殘基C-末端的殘基，或者在分子為核酸時(shí)指位于第二個(gè)殘基3’端的殘基。
除非另外定義，本文所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。關(guān)于本領(lǐng)域的定義和術(shù)語(yǔ)從業(yè)者特別可參見(jiàn)Current Protocols in Molecular Biology(Ansubel)。氨基酸殘基的縮寫(xiě)是本領(lǐng)域用于指20種常見(jiàn)L-氨基酸之一的標(biāo)準(zhǔn)的3字母和/或1字母代碼。
“核酸”是多核苷酸例如脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。該術(shù)語(yǔ)用于包括單鏈核酸、雙鏈核酸以及由核苷酸或核苷類(lèi)似物制造的RNA和DNA。
術(shù)語(yǔ)“載體(vector)”指可以用于將第二種核酸分子運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)的核酸分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，載體允許插入到該載體中的DNA序列復(fù)制。載體可以包含啟動(dòng)子以增強(qiáng)核酸分子在至少某些宿主細(xì)胞中的表達(dá)。載體可以自主復(fù)制(染色體外的)或者可以整合到宿主細(xì)胞染色體中。在一個(gè)實(shí)施方案中，載體可以包括能夠產(chǎn)生蛋白質(zhì)的表達(dá)載體，所述蛋白質(zhì)來(lái)源于插入到載體中的至少部分核酸序列。
如本領(lǐng)域已知的，核酸序列彼此雜交的條件可以被描述為從低到高嚴(yán)緊性的范圍。一般地，高嚴(yán)緊性雜交條件指在低鹽緩沖液中在高溫下洗滌雜交物。雜交可以濾選出結(jié)合的DNA，利用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)雜交溶液例如0.5M NaHPO4、7％十二烷基硫酸鈉(SDS)，在65℃，并且在0.25M NaHPO4、3.5％ SDS中洗滌，隨后取決于探針的長(zhǎng)度在室溫至68℃在0.1×SSC/0.1％ SDS中洗滌(參見(jiàn)，例如Ausubel，F(xiàn).M.等人，Short Protocols in Molecular Biology，4thEd.，Chapter 2，John Wiley&Sons，N.Y)。例如，高嚴(yán)緊性洗滌包括在6×SSC/0.05％焦磷酸鈉中洗滌，對(duì)于14個(gè)堿基的寡核苷酸探針在37℃，或?qū)τ?7個(gè)堿基的寡核苷酸探針在48℃，或?qū)τ?0個(gè)堿基的寡核苷酸探針在55℃，或?qū)τ?5個(gè)堿基的寡核苷酸探針在60℃，或?qū)τ陂L(zhǎng)度約250個(gè)核苷酸的核苷酸探針在65℃。核酸探針可以用含末端標(biāo)記的放射性核苷酸例如[γ-32P]ATP，或通過(guò)隨機(jī)引物標(biāo)記而摻入的放射標(biāo)記核苷酸例如[α-32P]dCTP進(jìn)行標(biāo)記?？商娲兀梢酝ㄟ^(guò)摻入生物素化的或熒光素標(biāo)記的核苷酸來(lái)標(biāo)記探針，并且利用鏈霉抗生物素蛋白或抗熒光素抗體來(lái)檢測(cè)探針。
如本文所使用的，“有機(jī)小分子”是分子量小于2,000道爾頓的分子，它包含至少1個(gè)碳原子。
“多肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換地用于描述可以包含部分或全長(zhǎng)蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)分子。
術(shù)語(yǔ)“融合蛋白”指具有來(lái)源于兩種或更多種蛋白質(zhì)的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或多肽。融合蛋白還可包含在來(lái)源于分開(kāi)的蛋白質(zhì)的氨基酸部分之間的氨基酸連接區(qū)。
如本文所使用的，“非RAGE多肽”是不來(lái)源于RAGE或其片段的任何多肽。此類(lèi)非RAGE多肽包括免疫球蛋白肽、二聚化性多肽、穩(wěn)定化性多肽、兩親性肽或包含為靶向或純化蛋白質(zhì)提供“標(biāo)簽”的氨基酸序列的多肽。
如本文所使用的，“免疫球蛋白肽”可以包含免疫球蛋白重鏈或其部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，重鏈的部分可以是Fc片段或其部分。如本文所使用的，F(xiàn)c片段包含以單體或二聚體形式的免疫球蛋白重鏈的重鏈鉸鏈多肽以及CH2和CH3結(jié)構(gòu)域?；蛘撸珻H1和Fc片段可以用作免疫球蛋白多肽。重鏈(或其部分)可以來(lái)源于任何一個(gè)已知的重鏈同種型IgG(γ)、IgM(μ)、IgD(δ)、IgE(ε)或IgA(α)。此外，重鏈(或其部分)可以來(lái)源于任何一個(gè)已知的重鏈亞型IgG1(γ1)、IgG2(γ2)、IgG3(γ3)、IgG4(γ4)、IgA1(α1)、IgA2(α2)，或者這些同種型或亞型的改變生物學(xué)活性的突變。可以被改變的生物學(xué)活性的實(shí)例包括例如通過(guò)鉸鏈區(qū)的修飾來(lái)降低同種型結(jié)合某些Fc受體的能力。
術(shù)語(yǔ)“同一性”或“百分比同一”指兩個(gè)氨基酸序列之間或兩個(gè)核酸序列之間的序列同一性。百分比同一性可以通過(guò)比對(duì)兩個(gè)序列來(lái)確定并且指在被比較的序列所共有的位置處的相同殘基(即氨基酸或核苷酸)的數(shù)目。序列比對(duì)和比較可以利用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)算法(例如，Smith和Waterman，1981，Adv.Appl.Math.2482；Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48443；Pearson和Lipman，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，852444)或通過(guò)公眾可獲得的這些算法的計(jì)算機(jī)化版本(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，WI)如BLAST和FASTA來(lái)進(jìn)行。此外，通過(guò)National Institutes of Health，Bethesda MD可獲得的ENTREZ也可以用于序列比較。在一個(gè)實(shí)施方案中，兩個(gè)序列的百分比同一性可以利用GCG以1的缺口權(quán)重來(lái)確定，從而使得每個(gè)氨基酸缺口是加權(quán)的，就好像它是兩個(gè)序列之間的單個(gè)氨基酸錯(cuò)配。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“保守殘基”指在具有相同結(jié)構(gòu)和/或功能的多個(gè)蛋白質(zhì)中為相同的氨基酸。保守殘基區(qū)對(duì)于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或功能可能是重要的。因此，在三維蛋白質(zhì)中鑒定出的鄰接的保守殘基對(duì)于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或功能可能是重要的。為了找出保守殘基，或3-D結(jié)構(gòu)的保守區(qū)，可以進(jìn)行來(lái)自不同物種或相同物種的不同個(gè)體的相同或相似蛋白質(zhì)的序列比較。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“同系物”是指與野生型氨基酸序列具有一定程度的同源性的多肽。同源性比較可以通過(guò)眼睛或更通常地借助于易獲得的序列比較程序來(lái)進(jìn)行。這些商業(yè)上可獲得的計(jì)算機(jī)程序可以計(jì)算出兩個(gè)或更多個(gè)序列之間的同源性百分?jǐn)?shù)(例如Wilbur，W.J.和Lipman，D.J.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80726-730)。例如，同源序列可以用于包括在可選實(shí)施方案中彼此具有至少75％的同一性、85％的同一性、90％的同一性、95％的同一性或98％的同一性的氨基酸序列。
如本文所使用的，多肽或蛋白質(zhì)“結(jié)構(gòu)域”包括沿著多肽或蛋白質(zhì)的區(qū)域，其包含獨(dú)立單元。結(jié)構(gòu)域可以依據(jù)結(jié)構(gòu)、序列和/或生物學(xué)活性進(jìn)行限定。在一個(gè)實(shí)施方案中，多肽結(jié)構(gòu)域可以包含以基本上不依賴(lài)于蛋白質(zhì)其余部分的方式進(jìn)行折疊的蛋白質(zhì)區(qū)域。利用結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)例如，但不限于PFAM、PRODOM、PROSITE、BLOCKS、PRINTS、SBASE、ISREC PROFILES、SAMRT和PROCLASS，可以鑒定結(jié)構(gòu)域。
如本文所使用的，“免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域”是在結(jié)構(gòu)上與免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域同源或相同的氨基酸序列。免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的長(zhǎng)度可以是任何長(zhǎng)度。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域可以少于250個(gè)氨基酸。在一個(gè)示例實(shí)施方案中，免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的長(zhǎng)度可以是約80-150個(gè)氨基酸。例如，IgG的可變區(qū)以及CH1、CH2和CH3區(qū)每一個(gè)均為免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。在另一實(shí)例中，IgM的可變區(qū)以及CH1、CH2、CH3和CH4區(qū)每一個(gè)均為免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。
如本文所使用的，“RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域”是來(lái)自RAGE蛋白的氨基酸序列，其在結(jié)構(gòu)上與免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域同源或相同。例如，RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域可以包括RAGE V-結(jié)構(gòu)域、RAGE Ig-樣C2-型1結(jié)構(gòu)域(“C1結(jié)構(gòu)域”)或RAGE Ig-樣C2-型2結(jié)構(gòu)域(“C2結(jié)構(gòu)域”)。
如本文所使用的，“域間連接體”包括將兩個(gè)結(jié)構(gòu)域連接在一起的多肽。Fc鉸鏈區(qū)是IgG中的域間連接體的實(shí)例。
如本文所使用的，“直接連接”鑒定了在兩個(gè)不同基團(tuán)(例如核苷酸序列、多肽、多肽結(jié)構(gòu)域)之間的共價(jià)鍵，其在被連接的兩個(gè)基團(tuán)之間沒(méi)有任何插入性原子。
如本文所使用的，“配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域”指負(fù)責(zé)結(jié)合配體的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。術(shù)語(yǔ)配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的同系物或其部分。在這方面，只要配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合特異性被保留，基于殘基的極性、電荷、溶解性、疏水性或親水性方面的相似性，就可以在配體結(jié)合位點(diǎn)處進(jìn)行慎重的氨基酸置換。
如本文所使用的，“配體結(jié)合位點(diǎn)”包括蛋白質(zhì)中直接與配體相互作用的殘基，或參與配體定位并非常接近與配體直接相互作用的那些殘基的殘基。配體結(jié)合位點(diǎn)中的殘基的相互作用可以通過(guò)殘基與配體在模型或結(jié)構(gòu)中的空間接近來(lái)定義。術(shù)語(yǔ)配體結(jié)合位點(diǎn)包括配體結(jié)合位點(diǎn)的同系物或其部分。在這方面，只要配體結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合特異性被保留，基于殘基的極性、電荷、溶解性、疏水性或親水性方面的相似性，就可以在配體結(jié)合位點(diǎn)處進(jìn)行慎重的氨基酸置換。配體結(jié)合位點(diǎn)可以存在于蛋白質(zhì)或多肽的一個(gè)或多個(gè)配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域中。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“相互作用”指配體或化合物或其部分或片段與第二種目的分子的一部分之間接近的情況。相互作用可以是非共價(jià)的，例如，由于氫鍵、范德華相互作用或靜電或疏水相互作用，或者它可以是共價(jià)的。
如本文所使用的，“配體”指與配體結(jié)合位點(diǎn)相互作用的分子或化合物或?qū)嶓w，包括底物或其類(lèi)似物或部分。如本文所描述的，術(shù)語(yǔ)“配體”可以指與目的蛋白結(jié)合的化合物。配體可以是激動(dòng)劑、拮抗劑或調(diào)節(jié)劑?；蛘?，配體可以不具有生物效應(yīng)?；蛘?，配體可以阻斷其他配體的結(jié)合從而抑制生物效應(yīng)。配體可以包括，但不限于，小分子抑制劑。這些小分子可以包括肽、擬肽(peptidomimetics)、有機(jī)化合物等。配體還可以包括多肽和/或蛋白質(zhì)。
如本文所使用的，“調(diào)節(jié)劑化合物”指轉(zhuǎn)變或改變目的分子的生物學(xué)活性的分子。調(diào)節(jié)劑化合物可以增加或減少目的分子的活性，或改變其物理或化學(xué)特征、或功能或免疫學(xué)特性。對(duì)于RAGE，調(diào)節(jié)劑化合物可以增加或減少RAGE或其部分的活性，或改變其特征、或功能或免疫學(xué)特性。調(diào)節(jié)劑化合物可以包括天然的和/或化學(xué)合成的或人工的肽、修飾過(guò)的肽(例如磷酸肽)、抗體、糖類(lèi)、單糖、寡糖、多糖、糖脂、雜環(huán)化合物、核苷或核苷酸或其部分、和有機(jī)或無(wú)機(jī)小分子。調(diào)節(jié)劑化合物可以是內(nèi)源性生理學(xué)化合物，或者它可以是天然的或合成的化合物?；蛘?，調(diào)節(jié)劑化合物可以是有機(jī)小分子。術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)劑化合物”還包括化學(xué)修飾的配體或化合物，并且包括異構(gòu)體和外消旋形式。
“激動(dòng)劑”包括與受體結(jié)合而形成復(fù)合物的化合物，它引起對(duì)所涉及的受體特異的藥理學(xué)應(yīng)答。
“拮抗劑”包括與激動(dòng)劑或受體結(jié)合而形成復(fù)合物的化合物，它不引起實(shí)質(zhì)的藥理學(xué)應(yīng)答并且可以抑制由激動(dòng)劑誘導(dǎo)的生物學(xué)應(yīng)答。
因此RAGE激動(dòng)劑可以結(jié)合RAGE并刺激RAGE介導(dǎo)的細(xì)胞過(guò)程，和RAGE拮抗劑可以抑制RAGE介導(dǎo)的過(guò)程被RAGE激動(dòng)劑激發(fā)。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，由RAGE激動(dòng)劑激發(fā)的細(xì)胞過(guò)程包括TNF-α基因轉(zhuǎn)錄的活化。
術(shù)語(yǔ)“肽模擬物(peptide mimetics)”指在分子間相互作用中充當(dāng)肽替代物的結(jié)構(gòu)(Morgan等人，1989，Ann.Reports Med.Chem.，24243-252)。肽模擬物可以包括合成的結(jié)構(gòu)，所述合成的結(jié)構(gòu)可以含有或不含氨基酸和/或肽鍵但保留肽或激動(dòng)劑或拮抗劑的結(jié)構(gòu)和功能特征。肽模擬物還包括類(lèi)肽(peptoid)、寡類(lèi)肽(Simon等人.，1972，Proc.Natl.Acad Sci.，USA，899367)；以及包含有設(shè)計(jì)長(zhǎng)度的肽的肽文庫(kù)，其代表相應(yīng)于本發(fā)明的肽或激動(dòng)劑或拮抗劑的所有可能的氨基酸序列。
術(shù)語(yǔ)“進(jìn)行治療”指改善疾病或病癥的癥狀并且可以包括治愈病癥，基本上阻止病癥發(fā)作，或改善受試者的病狀。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“治療”指對(duì)于患者所患有的給定病癥的全方位治療，包括由那種病癥引起的一種癥狀或大多數(shù)癥狀的減輕，特定病癥的治愈，或阻止病癥的發(fā)作。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“EC50”被定義為導(dǎo)致50％被測(cè)量的生物效應(yīng)的試劑濃度。例如，具有可測(cè)量的生物效應(yīng)的治療劑的EC50可以包括該試劑顯示50％生物效應(yīng)時(shí)的值。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“IC50”被定義為導(dǎo)致被測(cè)量的效應(yīng)的50％抑制的試劑濃度。例如，RAGE結(jié)合的拮抗劑的IC50可以包括拮抗劑將配體與RAGE的配體結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合減少50％時(shí)的值。
如本文所使用的，“有效量”是指對(duì)于在受試者中產(chǎn)生預(yù)期效果有效的試劑量。術(shù)語(yǔ)“治療上有效量”表示將會(huì)引起所調(diào)查的動(dòng)物或人的治療應(yīng)答的藥物或藥物試劑的量。包括有效量的實(shí)際劑量可以取決于給藥途徑、受試者的尺寸和健康狀況、被治療的病癥等。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“藥物學(xué)上可接受的載體”可以指適合于在人類(lèi)或動(dòng)物受試者中使用的化合物和組合物，例如，對(duì)于為了治療RAGE介導(dǎo)的病癥或疾病而施用的治療組合物。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“藥物組合物”表示可以以包含常規(guī)的無(wú)毒性載體、稀釋劑、佐劑、媒介物(vehicle)等的單位劑量制劑形式，例如口服地、腸胃外地、局部地、通過(guò)吸入噴霧、鼻內(nèi)地或直腸地施用于哺乳動(dòng)物宿主的組合物。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“腸胃外”包括皮下注射，靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腦池內(nèi)注射或輸注技術(shù)。
RAGE融合蛋白本發(fā)明的實(shí)施方案包括RAGE融合蛋白、制造此類(lèi)融合蛋白的方法以及此類(lèi)融合蛋白的使用方法。本發(fā)明可以以各種方式進(jìn)行實(shí)施。
例如，本發(fā)明的實(shí)施方案提供了包含RAGE多肽的融合蛋白，所述RAGE多肽與第二種非RAGE多肽連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，融合蛋白可以包含RAGE配體結(jié)合位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，配體結(jié)合位點(diǎn)可以包含融合蛋白的最N-末端結(jié)構(gòu)域。RAGE配體結(jié)合位點(diǎn)可以包含RAGE的V結(jié)構(gòu)域或其部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，RAGE配體結(jié)合位點(diǎn)包含SEQID NO9或與其90％同一的序列，或者SEQ ID NO10或與其90％同一的序列。
在一個(gè)實(shí)施方案中，RAGE多肽可以與包含免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域或免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的部分(例如，其片段)的多肽連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的多肽包含人IgG的CH2或CH3結(jié)構(gòu)域中至少一個(gè)的至少一部分。
RAGE蛋白或多肽可以包含全長(zhǎng)的人RAGE蛋白(例如SEQ ID NO1)，或人RAGE的片段。如本文所使用的，RAGE多肽的片段的長(zhǎng)度為至少5個(gè)氨基酸，可以大于30個(gè)氨基酸，但小于全部的氨基酸序列。在可選實(shí)施方案中，RAGE多肽可以包含與人RAGE或其片段70％、或80％、或85％、或90％同一的序列。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，RAGE多肽可以包含以甘氨酸而不是甲硫氨酸作為第一個(gè)殘基的人RAGE或其片段(參見(jiàn)，例如Neeper等人，(1992))?；蛘?，人RAGE可以包含去除信號(hào)序列的全長(zhǎng)RAGE(例如，SEQ ID NO2或SEQ ID NO3)(圖1A和1B)或那個(gè)氨基酸序列的一部分。
本發(fā)明的融合蛋白還可包含s RAGE(例如SEQ ID NO4)、與sRAGE或sRAGE的片段90％同一的多肽。如本文所使用的，sRAGE是不包含跨膜區(qū)或胞質(zhì)尾部的RAGE蛋白(Park等人，Nature Med.，41025-1031(1998))。例如，RAGE多肽可以包含以甘氨酸而不是甲硫氨酸作為第一個(gè)殘基的人sRAGE或其片段(參見(jiàn)，例如Neeper等人，(1992))?；蛘撸琑AGE多肽可以包含去除信號(hào)序列的人sRAGE(例如，SEQ ID NO5或SEQ ID NO6)(圖1C)或那個(gè)氨基酸序列的一部分。
在其他實(shí)施方案中，RAGE蛋白可以包含RAGE V結(jié)構(gòu)域(例如SEQID NO7或SEQ ID NO8，圖1D)(Neeper等人，(1992)；Schmidt等人，(1997))?；蛘?，可以使用與RAGE V結(jié)構(gòu)域或其片段90％同一的序列。
或者，RAGE蛋白可以包含RAGE V結(jié)構(gòu)域的片段(例如SEQ ID NO9或SEQ ID NO10，圖1D)。在一個(gè)實(shí)施方案中，RAGE蛋白可以包含配體結(jié)合位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，配體結(jié)合位點(diǎn)可以包含SEQ IDNO9或與其90％同一的序列，或者SEQ ID NO10或與其90％同一的序列。在另一實(shí)施方案中，RAGE片段是合成肽。
因此，用于本發(fā)明融合蛋白的RAGE多肽可以包含全長(zhǎng)RAGE的片段。如本領(lǐng)域已知的，RAGE包含三個(gè)免疫球蛋白樣多肽結(jié)構(gòu)域，即V結(jié)構(gòu)域以及C1和C2結(jié)構(gòu)域，每個(gè)結(jié)構(gòu)域通過(guò)域間連接體相互連接。全長(zhǎng)RAGE還包含位于C2結(jié)構(gòu)域下游(C-末端)并與C2結(jié)構(gòu)域連接的跨膜多肽和胞質(zhì)尾部。
在一個(gè)實(shí)施方案中，RAGE多肽不包含任何信號(hào)序列殘基。RAGE的信號(hào)序列可以包含全長(zhǎng)RAGE的殘基1-22或殘基1-23。
例如，RAGE多肽可以包含人RAGE的氨基酸23-116(SEQ ID NO7)或與其90％同一的序列，或人RAGE的氨基酸24-116(SEQ ID NO8)或與其90％同一的序列，相應(yīng)于RAGE的V結(jié)構(gòu)域?；蛘撸琑AGE多肽可以包含人RAGE的氨基酸124-221(SEQ ID NO11)或與其90％同一的序列，相應(yīng)于RAGE的C1結(jié)構(gòu)域。在另一實(shí)施方案中，RAGE多肽可以包含人RAGE的氨基酸227-317(SEQ ID NO12)或與其90％同一的序列，相應(yīng)于RAGE的C2結(jié)構(gòu)域?；蛘?，RAGE多肽可以包含人RAGE的氨基酸23-123(SEQ ID NO13)或與其90％同一的序列，或人RAGE的氨基酸24-123(SEQ ID NO14)或與其90％同一的序列，相應(yīng)于RAGE的V結(jié)構(gòu)域以及下游的域間連接體。或者，RAGE多肽可以包含人RAGE的氨基酸23-226(SEQ ID NO17)或與其90％同一的序列，或人RAGE的氨基酸24-226(SEQ ID NO18)或與其90％同一的序列，相應(yīng)于V結(jié)構(gòu)域、C1結(jié)構(gòu)域以及連接這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的域間連接體?；蛘?，RAGE多肽可以包含人RAGE的氨基酸23-339(SEQ ID NO5)或與其90％同一的序列，或人RAGE的24-339(SEQ ID NO6)或與其90％同一的序列，相應(yīng)于sRAGE(即，編碼V、C1和C2結(jié)構(gòu)域以及域間連接體)?；蛘?，可以利用這些序列中每一個(gè)的片段。
融合蛋白可以包含不來(lái)源于RAGE或其片段的幾種類(lèi)型的肽。融合蛋白的第二種多肽可以包括來(lái)源于免疫球蛋白的多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫球蛋白多肽可以包含免疫球蛋白重鏈或其部分(即片段)。例如，重鏈片段可以包含來(lái)源于免疫球蛋白Fc片段的多肽，其中該Fc片段包含作為單體的免疫球蛋白重鏈的重鏈鉸鏈多肽以及CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。重鏈(或其部分)可以來(lái)源于任何一個(gè)已知的重鏈同種型IgG(γ)、IgM(μ)、IgD(δ)、IgE(ε)或IgA(α)。此外，重鏈(或其部分)可以來(lái)源于任何一個(gè)已知的重鏈亞型IgG1(γ1)、IgG2(γ2)、IgG3(γ3)、IgG4(γ4)、IgA1(α1)、IgA2(α2)，或這些同種型或亞型的改變生物學(xué)活性的突變。第二種多肽可以包含人IgG1的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域或這些結(jié)構(gòu)域中任何一個(gè)或兩個(gè)的一部分。作為一個(gè)示例實(shí)施方案，包含人IgG1的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域或其部分的多肽可以包含SEQ ID NO38或SEQ ID NO40。
免疫球蛋白鏈的Fc部分在體內(nèi)可以是促炎癥的。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的RAGE融合蛋白包含來(lái)源于RAGE的域間連接體而不是來(lái)源于免疫球蛋白的域間鉸鏈多肽。
因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，融合蛋白可以進(jìn)一步包含直接與包含免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域或者免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域的片段或部分的多肽連接的RAGE多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，CH2結(jié)構(gòu)域或其片段包含SEQ IDNO42。在一個(gè)實(shí)施方案中，RAGE多肽可以包含配體結(jié)合位點(diǎn)。RAGE配體結(jié)合位點(diǎn)可以包含RAGE的V結(jié)構(gòu)域或其部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，RAGE配體結(jié)合位點(diǎn)包含SEQ ID NO9或與其90％同一的序列，或者SEQ ID NO10或與其90％同一的序列。
用于本發(fā)明融合蛋白的RAGE多肽可以包含RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。附加地或可替代地，RAGE的片段可以包含域間連接體?；蛘撸琑AGE多肽可以包含與上游(即更接近N-末端)或下游(即，更接近C-末端)域間連接體連接的RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，RAGE多肽可以包含兩個(gè)(或更多個(gè))RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，每個(gè)結(jié)構(gòu)域通過(guò)域間連接體相互連接。RAGE多肽可以進(jìn)一步包含通過(guò)一個(gè)或多個(gè)域間連接體相互連接的多個(gè)RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，并且有末端域間連接體連接在N-末端RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域和/或C-末端免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域上。RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域和域間連接體的另外組合也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，RAGE多肽包含與RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域連接的RAGE域間連接體，從而使得RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的C-末端氨基酸連接至域間連接體的N-末端氨基酸，并且RAGE域間連接體的C-末端氨基酸直接連接至包含免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域或其片段的多肽的N-末端氨基酸。包含免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域的多肽可以包含人IgG1的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域或這些結(jié)構(gòu)域中任何一個(gè)或兩個(gè)的一部分。作為一個(gè)示例實(shí)施方案，包含人IgG1的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域或其部分的多肽可以包含SEQ ID NO38或SEQ ID NO40。
如上所述，本發(fā)明的融合蛋白可以包含單個(gè)或多個(gè)來(lái)自RAGE的結(jié)構(gòu)域。此外，包含與RAGE多肽結(jié)構(gòu)域連接的域間連接體的RAGE多肽可以包含全長(zhǎng)RAGE蛋白的片段。例如，RAGE多肽可以包含人RAGE的氨基酸23-136(SEQ ID NO15)或與其90％同一的序列，或者人RAGE的氨基酸24-136(SEQ ID NO16)或與其90％同一的序列，相應(yīng)于RAGE的V結(jié)構(gòu)域以及下游的域間連接體?；蛘撸琑AGE多肽可以包含人RAGE的氨基酸23-251(SEQ ID NO19)或與其90％同一的序列，或者人RAGE的氨基酸24-251(SEQ ID NO20)或與其90％同一的序列，相應(yīng)于V結(jié)構(gòu)域、C1結(jié)構(gòu)域、連接這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的域間連接體以及C1下游的第二個(gè)域間連接體。
例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，融合蛋白可以包含來(lái)源于RAGE蛋白的兩個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域以及來(lái)源于人Fc多肽的兩個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。融合蛋白可以包含第一個(gè)RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域和連接第二個(gè)RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的第一個(gè)RAGE域間連接體以及第二個(gè)RAGE域間連接體，從而使得第一個(gè)域間連接體的N-末端氨基酸連接至第一個(gè)RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的C-末端氨基酸，第二個(gè)RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的N-末端氨基酸連接至第一個(gè)域間連接體的C-末端氨基酸，第二個(gè)域間連接體的N-末端氨基酸連接至第二個(gè)RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的C-末端氨基酸，以及RAGE第二個(gè)域間連接體的C-末端氨基酸直接連接至CH2免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的N-末端氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，四結(jié)構(gòu)域的RAGE融合蛋白可以包含SEQ ID NO32。在一個(gè)可選實(shí)施方案中，四結(jié)構(gòu)域的RAGE融合蛋白包含SEQ ID NO33或SEQ ID NO34。
可替代地，三結(jié)構(gòu)域的融合蛋白可以包含一個(gè)來(lái)源于RAGE的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域以及兩個(gè)來(lái)源于人Fc多肽的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。例如，融合蛋白可以包含經(jīng)由RAGE域間連接體與CH2免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域或部分CH2免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的N-末端氨基酸連接的單個(gè)RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，三結(jié)構(gòu)域的RAGE融合蛋白可以包含SEQID NO35。在可選實(shí)施方案中，三結(jié)構(gòu)域的RAGE融合蛋白可以包含SEQ ID NO36或SEQ ID NO37。
RAGE域間連接體片段可以包含天然地位于RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域下游并因此與之連接的肽序列。例如，對(duì)于RAGE V結(jié)構(gòu)域，域間連接體可以包含天然地位于V結(jié)構(gòu)域下游的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，連接體可以包含SEQ ID NO21，相應(yīng)于全長(zhǎng)RAGE的氨基酸117-123?；蛘撸B接體可以包含具有天然RAGE序列的另外部分的肽。例如，可以利用包含SEQ ID NO21的上游和下游數(shù)個(gè)氨基酸(例如1-3、1-5、或1-10、或1-15個(gè)氨基酸)的域間連接體。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，域間連接體包含SEQ ID NO23，其包含全長(zhǎng)RAGE的氨基酸117-136?；蛘?，可以利用從連接體的任何一端刪除例如1、2或3個(gè)氨基酸的SEQ ID NO21的片段。在可選實(shí)施方案中，連接體可以包含與SEQ ID NO21或SEQ ID NO2370％同一、或80％同一或90％同一的序列。
對(duì)于RAGE C1結(jié)構(gòu)域，連接體可以包含天然地位于C1結(jié)構(gòu)域下游的肽序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，連接體可以包含SEQ ID NO22，相應(yīng)于全長(zhǎng)RAGE的氨基酸222-251?；蛘撸B接體可以包含具有天然RAGE序列的另外部分的肽。例如，可以利用包含SEQ ID NO22的上游和下游數(shù)個(gè)氨基酸(例如1-3、1-5、或1-10、或1-15個(gè)氨基酸)的連接體?；蛘?，可以利用從連接體的任何一端刪除例如1-3、1-5、或1-10、或1-15個(gè)氨基酸的SEQ ID NO22的片段。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，RAGE域間連接體可以包含SEQ ID NO24，相應(yīng)于氨基酸222-226?；蛘撸蜷g連接體可以包含SEQ ID NO44，相應(yīng)于RAGE的氨基酸318-342。
產(chǎn)生RAGE融合蛋白的方法本發(fā)明還包括制造RAGE融合蛋白的方法。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括制造RAGE融合蛋白的方法，其包括共價(jià)連接與第二種非RAGE多肽連接的RAGE多肽的步驟，其中該RAGE多肽包含RAGE配體結(jié)合位點(diǎn)。例如，被連接的RAGE多肽和第二種非RAGE多肽可以由重組DNA構(gòu)建體編碼。該方法可以進(jìn)一步包括將所述DNA構(gòu)建體整合到表達(dá)載體中的步驟。此外，該方法可以包括將表達(dá)載體插入到宿主細(xì)胞中的步驟。
例如，本發(fā)明的實(shí)施方案提供了包含RAGE多肽的融合蛋白，所述RAGE多肽與第二種非RAGE多肽連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，融合蛋白可以包含RAGE配體結(jié)合位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，配體結(jié)合位點(diǎn)可以包含融合蛋白的最N-末端結(jié)構(gòu)域。RAGE配體結(jié)合位點(diǎn)可以包含RAGE的V結(jié)構(gòu)域或其部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，RAGE配體結(jié)合位點(diǎn)包含SEQID NO9或與其90％同一的序列，或者SEQ ID NO10或與其90％同一的序列。
在一個(gè)實(shí)施方案中，RAGE多肽可以與包含免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域或免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的部分(例如其片段)的多肽連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的多肽包含人IgG的CH2或CH3結(jié)構(gòu)域中至少一個(gè)的至少一部分。
融合蛋白可以通過(guò)重組DNA技術(shù)進(jìn)行改造。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明可以包含分離的核酸序列，其編碼與第二種非RAGE多肽連接的RAGE多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，RAGE多肽可以包含RAGE配體結(jié)合位點(diǎn)。
RAGE蛋白或多肽可以包含全長(zhǎng)的人RAGE(例如，SEQ ID NO1)或人RAGE的片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，RAGE多肽不包含任何信號(hào)序列殘基。RAGE的信號(hào)序列可以包含全長(zhǎng)RAGE(SEQ ID NO1)的殘基1-22或殘基1-23。在可選實(shí)施方案中，RAGE多肽可以包含與人RAGE或其片段70％、或80％、或90％同一的序列。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，RAGE多肽可以包含以甘氨酸而不是甲硫氨酸作為第一個(gè)殘基的人RAGE或其片段(參見(jiàn)，例如Neeper等人，(1992))?；蛘撸薘AGE可以包含去除信號(hào)序列的全長(zhǎng)RAGE(例如，SEQ ID NO2或SEQ ID NO3)(圖1A和1B)或那個(gè)氨基酸序列的一部分。本發(fā)明的融合蛋白還可以包含sRAGE(例如SEQ ID NO4)、與sRAGE或sRAGE片段90％同一的多肽。例如，RAGE多肽可以包含以甘氨酸而不是甲硫氨酸作為第一個(gè)殘基的人sRAGE或其片段(參見(jiàn)，例如Neeper等人，(1992))?；蛘?，人RAGE可以包含去除信號(hào)序列的sRAGE(例如，SEQ ID NO5或SEQ ID NO6)(圖1C)或那個(gè)氨基酸序列的一部分。在其他實(shí)施方案中，RAGE蛋白可以包含V結(jié)構(gòu)域(例如SEQ ID NO7或SEQ ID NO8；圖1D)?；蛘?，可以使用與V結(jié)構(gòu)域或其片段90％同一的序列。或者，RAGE蛋白可以包含含有部分V結(jié)構(gòu)域的RAGE片段(例如SEQ ID NO9或SEQ ID NO10；圖1D)。在一個(gè)實(shí)施方案中，配體結(jié)合位點(diǎn)可以包含SEQ ID NO9或與其90％同一的序列，或者SEQ ID NO10或與其90％同一的序列。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，RAGE片段是合成肽。
在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸序列包含SEQ ID NO25以編碼人RAGE的氨基酸1-118或其片段。例如包含SEQ ID NO25的核苷酸1-348的序列可以用于編碼人RAGE的氨基酸1-116。或者，該核酸可以包含SEQ ID NO26以編碼人RAGE的氨基酸1-123?；蛘?，該核酸可以包含SEQ ID NO27以編碼人RAGE的氨基酸1-136?；蛘撸摵怂峥梢园琒EQ ID NO28以編碼人RAGE的氨基酸1-230。或者，該核酸可以包含SEQ ID NO29以編碼人RAGE的氨基酸1-251?；蛘?，這些核酸序列的片段可以用于編碼RAGE多肽片段。
融合蛋白可以包含不來(lái)源于RAGE或其片段的幾種類(lèi)型的肽。融合蛋白的第二種多肽可以包含來(lái)源于免疫球蛋白的多肽。重鏈(或其部分)可以來(lái)源于任何一個(gè)已知的重鏈同種型IgG(γ)、IgM(μ)、IgD(δ)、IgE(ε)或IgA(α)。此外，重鏈(或其部分)可以來(lái)源于任何一個(gè)已知的重鏈亞型IgG1(γ1)、IgG2(γ2)、IgG3(γ3)、IgG4(γ4)、IgA1(α1)、IgA2(α2)，或這些同種型或亞型的改變生物學(xué)活性的突變。第二種多肽可以包含人IgG1的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域或這些結(jié)構(gòu)域中任何一個(gè)或兩個(gè)的一部分。作為一個(gè)示例實(shí)施方案，包含人IgG1的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域或其部分的多肽可以包含SEQ ID NO38或SEQ ID NO40。免疫球蛋白肽可以由SEQ ID NO39或SEQ ID NO41的核酸序列編碼。
免疫球蛋白鏈的Fc部分在體內(nèi)可以是促炎癥的。因此，本發(fā)明的RAGE融合蛋白可以包含來(lái)源于RAGE的域間連接體而不是來(lái)源于免疫球蛋白的域間鉸鏈多肽。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，融合蛋白可以由重組DNA構(gòu)建體編碼。此外，該方法可以包括將DNA構(gòu)建體整合到表達(dá)載體中的步驟。此外，該方法可以包括將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中。
因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括制造RAGE融合蛋白的方法，其包括將RAGE多肽與包含免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域或部分免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域的多肽共價(jià)連接的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，融合蛋白可以包含RAGE配體結(jié)合位點(diǎn)。RAGE配體結(jié)合位點(diǎn)可以包含RAGE的V結(jié)構(gòu)域或其部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，RAGE配體結(jié)合位點(diǎn)包含SEQ ID NO9或與其90％同一的序列，或者SEQ ID NO10或與其90％同一的序列。
例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包含編碼RAGE多肽的核酸，所述RAGE多肽直接與包含免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域或其片段的多肽連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，CH2結(jié)構(gòu)域或其片段包含SEQ ID NO42。第二種多肽可以包含人IgG1的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。作為一個(gè)示例實(shí)施方案，包含人IgG1的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的多肽可以包含SEQ ID NO38或SEQID NO40。免疫球蛋白肽可以由SEQ ID NO39或SEQ ID NO41的核酸序列編碼。
在一個(gè)實(shí)施方案中，RAGE多肽可以包含與RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域連接的RAGE域間連接體，從而使得RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的C-末端氨基酸連接至域間連接體的N-末端氨基酸，并且RAGE域間連接體的C-末端氨基酸直接連接至包含免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域或其片段的多肽的N-末端氨基酸。包含免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域的多肽可以包括包含人IgG1的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域或這些結(jié)構(gòu)域中任何一個(gè)或兩個(gè)的一部分的多肽。作為一個(gè)示例實(shí)施方案，包含人IgG1的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域或其部分的多肽可以包含SEQ ID NO38或SEQ ID NO40。
本發(fā)明的融合蛋白可以包含單個(gè)或多個(gè)來(lái)自RAGE的結(jié)構(gòu)域。此外，包含與RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域連接的域間連接體的RAGE多肽可以包含全長(zhǎng)RAGE蛋白的片段。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，融合蛋白可以包含來(lái)源于RAGE蛋白的兩個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域以及來(lái)源于人Fc多肽的兩個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。融合蛋白可以包含第一個(gè)RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域和連接第二個(gè)RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的第一個(gè)域間連接體以及第二個(gè)RAGE域間連接體，從而使得第一個(gè)域間連接體的N-末端氨基酸連接至第一個(gè)RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的C-末端氨基酸，第二個(gè)RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的N-末端氨基酸連接至第一個(gè)域間連接體的C-末端氨基酸，第二個(gè)域間連接體的N-末端氨基酸連接至RAGE第二個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的C-末端氨基酸，以及RAGE第二個(gè)域間連接體的C-末端氨基酸直接連接至包含CH2免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域或其片段的多肽的N-末端氨基酸。例如，RAGE多肽可以包含人RAGE的氨基酸23-251(SEQ ID NO19)或與其90％同一的序列，或人RAGE的氨基酸24-251(SEQ ID NO20)或與其90％同一的序列，相應(yīng)于V結(jié)構(gòu)域、C1結(jié)構(gòu)域、連接這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的域間連接體以及C1下游的第二個(gè)域間連接體。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含SEQ ID NO30或其片段的核酸構(gòu)建體可以編碼四結(jié)構(gòu)域的RAGE融合蛋白。
可替代地，三結(jié)構(gòu)域的融合蛋白可以包含一個(gè)來(lái)源于RAGE的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域以及兩個(gè)來(lái)源于人Fc多肽的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。例如，融合蛋白可以包含經(jīng)由RAGE域間連接體與包含CH2免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域或其片段的多肽的N-末端氨基酸連接的單個(gè)RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。例如，RAGE多肽可以包含人RAGE的氨基酸23-136(SEQ ID NO15)或與其90％同一的序列，或人RAGE的氨基酸24-136(SEQ ID NO16)或與其90％同一的序列，相應(yīng)于RAGE的V結(jié)構(gòu)域以及下游的域間連接體。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含SEQ ID NO31或其片段的核酸構(gòu)建體可以編碼三結(jié)構(gòu)域的RAGE融合蛋白。
RAGE域間連接體片段可以包含天然地位于RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域下游并因此與之連接的肽序列。例如，對(duì)于RAGE V結(jié)構(gòu)域，域間連接體可以包含天然地位于V結(jié)構(gòu)域下游的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，連接體可以包含SEQ ID NO21，相應(yīng)于全長(zhǎng)RAGE的氨基酸117-123。或者，連接體可以包含具有天然RAGE序列的另外部分的肽。例如，可以利用包含SEQ ID NO21的上游和下游數(shù)個(gè)氨基酸(例如1-3、1-5、或1-10、或1-15個(gè)氨基酸)的域間連接體。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，域間連接體包含SEQ ID NO23，其包含全長(zhǎng)RAGE的氨基酸117-136?；蛘撸梢岳脧倪B接體的任何一端刪除例如1、2或3個(gè)氨基酸的SEQ ID NO21的片段。在可選實(shí)施方案中，連接體可以包含與SEQ ID NO21或SEQ ID NO23 70％同一、或80％同一、或90％同一的序列。
對(duì)于RAGE C1結(jié)構(gòu)域，連接體可以包含天然地位于C1結(jié)構(gòu)域下游的肽序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，連接體可以包含SEQ ID NO22，相應(yīng)于全長(zhǎng)RAGE的氨基酸222-251。或者，連接體可以包含具有天然RAGE序列的另外部分的肽。例如，可以利用包含SEQ ID NO22的上游和下游數(shù)個(gè)氨基酸(例如1-3、1-5、或1-10、或1-15個(gè)氨基酸)的連接體?；蛘?，可以利用從連接體的任何一端刪除例如1-3、1-5、或1-10、或1-15個(gè)氨基酸的SEQ ID NO22的片段。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，RAGE域間連接體可以包含SEQ ID NO24，相應(yīng)于氨基酸222-226?；蛘撸蜷g連接體可以包含SEQ ID NO44，相應(yīng)于RAGE的氨基酸318-342。
該方法可以進(jìn)一步包括將DNA構(gòu)建體整合到表達(dá)載體中的步驟。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括編碼包含RAGE多肽的融合蛋白的表達(dá)載體，所述RAGE多肽直接連接至包含免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域或部分免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域的多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，RAGE多肽包含具有與RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域連接的RAGE域間連接體的構(gòu)建體，例如本文所描述的那些，從而使得RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的C-末端氨基酸連接至域間連接體的N-末端氨基酸，并且RAGE域間連接體的C-末端氨基酸直接連接至包含免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域或其部分的多肽的N-末端氨基酸。例如，用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的表達(dá)載體可以包含核酸序列SEQ ID NO30或其片段，或者SEQ ID NO31或其片段。
該方法可以進(jìn)一步包括用本發(fā)明的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞的步驟。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括用表達(dá)本發(fā)明的RAGE融合蛋白的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，從而使得該細(xì)胞表達(dá)包含RAGE多肽的融合蛋白，所述RAGE多肽直接連接至包含免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域或部分免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域的多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，RAGE多肽包含具有與RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域連接的RAGE域間連接體的構(gòu)建體，例如本文所描述的那些，從而使得RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的C-末端氨基酸連接至域間連接體的N-末端氨基酸，并且RAGE域間連接體的C-末端氨基酸直接連接至包含免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域或其部分的多肽的N-末端氨基酸。例如，表達(dá)載體可以包含核酸序列SEQ ID NO30或其片段，或者SEQ ID NO31或其片段。
例如，可以通過(guò)將不同長(zhǎng)度的人RAGE的5’cDNA序列與人IgG1 Fc(γ1)的3’cDNA序列融合來(lái)構(gòu)建表達(dá)RAGE-IgG Fc融合蛋白的質(zhì)粒。利用標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)可以將表達(dá)盒序列插入到表達(dá)載體例如pcDNA3.1表達(dá)載體(Invitrogen，CA)中。
此外，該方法還可以包括將表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中。在一個(gè)實(shí)施方案中，該重組體可以被轉(zhuǎn)染到中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中并優(yōu)化地表達(dá)。在可選實(shí)施方案中，該細(xì)胞可以產(chǎn)生0.1-20克/升、或0.5-10克/升、或約1-2克/升。
如本領(lǐng)域所已知的，此類(lèi)核酸構(gòu)建體可以通過(guò)突變進(jìn)行修飾，例如，通過(guò)用包含目的突變的引物對(duì)核酸模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。這樣，可以設(shè)計(jì)具有不同的對(duì)于RAGE配體的親和力的多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，突變的序列可以與起始DNA有90％或更高的同一性。照此，變體可以包括在嚴(yán)緊條件(即相當(dāng)于在1M鹽中低于DNA雙鏈體的解鏈溫度(TM)約20-27℃)下雜交的核苷酸序列。
通過(guò)將表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到合適的宿主中可以表達(dá)編碼序列。例如，重組載體可以穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染到中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中，并且選擇和克隆表達(dá)融合蛋白的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)應(yīng)用抗生素G418就質(zhì)粒編碼的新霉素抗性對(duì)表達(dá)重組構(gòu)建體的細(xì)胞進(jìn)行選擇?？梢赃x擇單獨(dú)的克隆，和可以擴(kuò)展由細(xì)胞上清液的Western印跡分析而檢測(cè)的表達(dá)高水平重組蛋白的克隆，并使用A蛋白柱通過(guò)親和層析來(lái)純化基因產(chǎn)物。
編碼本發(fā)明融合蛋白的重組核酸的樣品實(shí)施方案顯示于圖2-5中。例如，如上所述，由重組的DNA構(gòu)建體產(chǎn)生的融合蛋白可以包含與第二種非RAGE多肽連接的RAGE多肽。融合蛋白可以包含兩個(gè)來(lái)源于RAGE蛋白的結(jié)構(gòu)域以及兩個(gè)來(lái)源于免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)域。圖2(SEQID NO30)顯示了編碼具有這種類(lèi)型結(jié)構(gòu)的融合蛋白TTP-4000(TT4)的核酸構(gòu)建體的實(shí)例。如圖2中所示，編碼序列1-753(以粗體突出)編碼RAGE N-末端蛋白質(zhì)序列，而754-1386的序列編碼IgG Fc蛋白質(zhì)序列。
當(dāng)來(lái)源于SEQ ID NO30或與其90％同一的序列時(shí)，融合蛋白可以包含SEQ ID NO32的四結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，或者去除信號(hào)序列的多肽(例如SEQ ID NO33或SEQ ID NO34)(圖4)。在圖4中，RAGE氨基酸序列用粗字體突出。免疫球蛋白序列為IgG的CH2和CH3免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。如圖6B中所示，全長(zhǎng)的TTP-4000 RAGE融合蛋白的最初251個(gè)氨基酸包含下列序列作為RAGE多肽序列包含氨基酸1-22/23的信號(hào)序列、包含氨基酸23/24-116的V免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域(包括配體結(jié)合位點(diǎn))、包含氨基酸117-123的域間連接體、包含氨基酸124-221的第二個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域(C1)和包含氨基酸222-251的下游域間連接體。
在一個(gè)實(shí)施方案中，融合蛋白不必包含第二個(gè)RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。例如，融合蛋白可以包含一個(gè)來(lái)源于RAGE的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域以及兩個(gè)來(lái)源于人Fc多肽的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。圖3(SEQ ID NO31)顯示了編碼這種類(lèi)型的融合蛋白的核酸構(gòu)建體的實(shí)例。如圖3中所示，核苷酸1-408的編碼序列(以粗體突出)編碼RAGE N-末端蛋白質(zhì)序列，而409-1041的序列編碼IgG1 Fc(γ1)蛋白質(zhì)序列。
當(dāng)來(lái)源于SEQ ID NO31或與其90％同一的序列時(shí)，融合蛋白可以包含SEQ ID NO35的三結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，或去除信號(hào)序列的多肽(例如SEQ ID NO36或SEQ ID NO37)(圖5)。在圖5中，RAGE氨基酸序列用粗字體突出。如圖6B中所示，全長(zhǎng)的TTP-3000 RAGE融合蛋白的最初136個(gè)氨基酸包含下列序列作為RAGE多肽包含氨基酸1-22/23的信號(hào)序列、包含氨基酸23/24-116的V免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域(包括配體結(jié)合位點(diǎn))和包含氨基酸117-136的域間連接體。137-346的序列包含IgG CH2和CH3免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。
本發(fā)明的融合蛋白可以具有相對(duì)于不包含第二種多肽的RAGE多肽來(lái)說(shuō)得到改善的體內(nèi)穩(wěn)定性。融合蛋白可以被進(jìn)一步修飾以增加穩(wěn)定性、有效性、效能和生物利用度。因此，可以通過(guò)翻譯后加工或通過(guò)化學(xué)修飾來(lái)修飾本發(fā)明的融合蛋白。例如，可以合成制備融合蛋白以包含L-氨基酸、D-氨基酸或非天然的氨基酸，α-雙取代的氨基酸，或N-烷基氨基酸。此外，蛋白質(zhì)可以通過(guò)乙酰化、?；DP-核糖基化、酰胺化、附加脂質(zhì)例如磷脂酰肌醇、二硫鍵形成等進(jìn)行修飾。此外，可以加入聚乙二醇以增加融合蛋白的生物穩(wěn)定性。
RAGE拮抗劑與RAGE融合蛋白的結(jié)合本發(fā)明的融合蛋白可以具有眾多應(yīng)用。例如，本發(fā)明的融合蛋白可以用于結(jié)合測(cè)定法中以鑒別RAGE配體，例如RAGE激動(dòng)劑、拮抗劑或調(diào)節(jié)劑。
例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了檢測(cè)RAGE調(diào)節(jié)劑的方法，其包括(a)提供包含與第二種非RAGE多肽連接的RAGE多肽的融合蛋白，其中所述RAGE多肽包含配體結(jié)合位點(diǎn)；(b)將目的化合物和具有已知RAGE結(jié)合親和力的配體與融合蛋白混和；和(c)在目的化合物存在下測(cè)量已知的RAGE配體與RAGE融合蛋白的結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，配體結(jié)合位點(diǎn)包含融合蛋白的最N-末端結(jié)構(gòu)域。
RAGE融合蛋白還可以提供用于檢測(cè)RAGE調(diào)節(jié)劑的試劑盒。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒可以包含(a)具有已知RAGE結(jié)合親和力的化合物，作為陽(yáng)性對(duì)照；(b)包含與第二種非RAGE多肽連接的RAGE多肽的融合蛋白，其中所述RAGE多肽包含配體結(jié)合位點(diǎn)；和(c)用法說(shuō)明書(shū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，配體結(jié)合位點(diǎn)包含融合蛋白的最N-末端結(jié)構(gòu)域。
RAGE蛋白或多肽可以包含全長(zhǎng)的人RAGE(例如，SEQ ID NO1)，或人RAGE的片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，RAGE多肽不包含任何信號(hào)序列殘基。RAGE的信號(hào)序列可以包含全長(zhǎng)RAGE(SEQ ID NO1)的殘基1-22或殘基1-23。在可選實(shí)施方案中，RAGE多肽可以包含與人RAGE或其片段70％、80％、或90％同一的序列。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，RAGE多肽可以包含以甘氨酸而不是甲硫氨酸作為第一個(gè)殘基的人RAGE或其片段(參見(jiàn)Neeper等人，(1992))?；蛘?，人RAGE可以包含去除信號(hào)序列的全長(zhǎng)RAGE(例如，SEQ ID NO2或SEQ ID NO3)(圖1A和1B)或那個(gè)氨基酸序列的一部分。本發(fā)明的融合蛋白還可以包含sRAGE(例如SEQ ID NO4)、與sRAGE或sRAGE片段90％同一的多肽。例如，RAGE多肽可以包含以甘氨酸而不是甲硫氨酸作為第一個(gè)殘基的人sRAGE或其片段(參見(jiàn)，例如Neeper等人，(1992))?；蛘?，人RAGE可以包含去除信號(hào)序列的sRAGE(例如，SEQ ID NO5或SEQ ID NO6)(圖1C)或那個(gè)氨基酸序列的一部分。在其他實(shí)施方案中，RAGE蛋白可以包含V結(jié)構(gòu)域(例如SEQ ID NO7或SEQ ID NO8；圖1D)。或者，可以使用與V結(jié)構(gòu)域或其片段90％同一的序列?；蛘撸琑AGE蛋白可以包含含有部分V結(jié)構(gòu)域的RAGE片段(例如SEQ ID NO9或SEQ ID NO10；圖1D)。在一個(gè)實(shí)施方案中，配體結(jié)合位點(diǎn)可以包含SEQ ID NO9或與其90％同一的序列，或者SEQ ID NO10或與其90％同一的序列。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，RAGE片段是合成肽。
融合蛋白可以包含不來(lái)源于RAGE或其片段的幾種類(lèi)型的肽。融合蛋白的第二種多肽可以包含來(lái)源于免疫球蛋白的多肽。重鏈(或其部分)可以來(lái)源于任何一個(gè)已知的重鏈同種型IgG(γ)、IgM(μ)、IgD(δ)、IgE(ε)或IgA(α)。此外，重鏈(或其部分)可以來(lái)源于任何一個(gè)已知的重鏈亞型IgG1(γ1)、IgG2(γ2)、IgG3(γ3)、IgG4(γ4)、IgA1(α1)、IgA2(α2)，或這些同種型或亞型的改變生物學(xué)活性的突變。第二種多肽可以包含人IgG1的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域或這些結(jié)構(gòu)域中任何一個(gè)或兩個(gè)的一部分。作為一個(gè)示例實(shí)施方案，包含人IgG1的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域或其部分的多肽可以包含SEQ ID NO38或SEQ ID NO40。免疫球蛋白肽可以由SEQ ID NO39或SEQ ID NO41的核酸序列編碼。
免疫球蛋白鏈的Fc部分在體內(nèi)可以是促炎癥的。因此，本發(fā)明的RAGE融合蛋白可以包含來(lái)源于RAGE而不是來(lái)源于免疫球蛋白鏈的Fc序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，融合蛋白可以包含與包含CH2免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域或其片段的多肽連接的RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，RAGE多肽可以包含與RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域連接的RAGE域間連接體，從而使得RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的C-末端氨基酸連接至域間連接體的N-末端氨基酸，并且RAGE域間連接體的C-末端氨基酸直接連接至包含免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域或其片段的多肽的N-末端氨基酸。包含免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域的多肽可以包括包含人IgG1的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域或這些結(jié)構(gòu)域中任何一個(gè)或兩個(gè)的一部分的多肽。作為一個(gè)示例實(shí)施方案，包含人IgG1的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域或其部分的多肽可以包含SEQ ID NO38或SEQ ID NO40。
本發(fā)明的融合蛋白可以包含單個(gè)或多個(gè)來(lái)自RAGE的結(jié)構(gòu)域。此外，包含與RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域連接的域間連接體的RAGE多肽可以包含全長(zhǎng)RAGE蛋白的片段。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，融合蛋白可以包含兩個(gè)來(lái)源于RAGE蛋白的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域以及兩個(gè)來(lái)源于人Fc多肽的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。融合蛋白可以包含第一個(gè)RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域和連接第二個(gè)RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的第一個(gè)域間連接體以及第二個(gè)RAGE域間連接體，從而使得第一個(gè)域間連接體的N-末端氨基酸連接至第一個(gè)RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的C-末端氨基酸，第二個(gè)RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的N-末端氨基酸連接至第一個(gè)域間連接體的C-末端氨基酸，第二個(gè)域間連接體的N-末端氨基酸連接至RAGE第二個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的C-末端氨基酸，以及RAGE第二個(gè)域間連接體的C-末端氨基酸直接連接至包含CH2免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域或其片段的多肽的N-末端氨基酸。例如，RAGE多肽可以包含人RAGE的氨基酸23-251(SEQ ID NO19)或與其90％同一的序列，或人RAGE的氨基酸24-251(SEQ ID NO20)或與其90％同一的序列，相應(yīng)于V結(jié)構(gòu)域、C1結(jié)構(gòu)域、連接這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的域間連接體以及C1下游的第二個(gè)域間連接體。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含SEQ ID NO30或其片段的核酸構(gòu)建體可以編碼四結(jié)構(gòu)域的RAGE融合蛋白。
可替代地，三結(jié)構(gòu)域的融合蛋白可以包含一個(gè)來(lái)源于RAGE的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域以及兩個(gè)來(lái)源于人Fc多肽的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。例如，融合蛋白可以包含經(jīng)由RAGE域間連接體與包含CH2免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域或其片段的多肽的N-末端氨基酸連接的單個(gè)RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。例如，RAGE多肽可以包含人RAGE的氨基酸23-136(SEQ ID NO15)或與其90％同一的序列，或人RAGE的氨基酸24-136(SEQ ID NO16)或與其90％同一的序列，相應(yīng)于RAGE的V結(jié)構(gòu)域以及下游的域間連接體。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含SEQ ID NO31或其片段的核酸構(gòu)建體可以編碼三結(jié)構(gòu)域的RAGE融合蛋白。
如本文所述，RAGE域間連接體片段可以包含天然地位于RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域下游并因此與之連接的肽序列。例如，對(duì)于RAGE V結(jié)構(gòu)域，域間連接體可以包含天然地位于V結(jié)構(gòu)域下游的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，連接體可以包含SEQ ID NO21，相應(yīng)于全長(zhǎng)RAGE的氨基酸117-123?；蛘?，連接體可以包含具有天然RAGE序列的另外部分的肽。例如，可以利用包含SEQ ID NO21的上游和下游數(shù)個(gè)氨基酸(例如1-3、1-5、或1-10、或1-15個(gè)氨基酸)的域間連接體。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，域間連接體包含SEQ ID NO23，其包含全長(zhǎng)RAGE的氨基酸117-136。或者，可以利用從連接體的任何一端刪除例如1、2或3個(gè)氨基酸的SEQ ID NO21的片段。在可選實(shí)施方案中，連接體可以包含與SEQ ID NO21或SEQ ID NO23 70％同一、或80％同一、或90％同一的序列。
對(duì)于RAGE C1結(jié)構(gòu)域，連接體可以包含天然地位于C1結(jié)構(gòu)域下游的肽序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，連接體可以包含SEQ ID NO22，相應(yīng)于全長(zhǎng)RAGE的氨基酸222-251?；蛘?，連接體可以包含具有天然RAGE序列的另外部分的肽。例如，可以利用包含SEQ ID NO22的上游和下游數(shù)個(gè)氨基酸(例如1-3、1-5、或1-10、或1-15個(gè)氨基酸)的連接體?；蛘?，可以利用從連接體的任何一端刪除例如1-3、1-5、或1-10、或1-15個(gè)氨基酸的SEQ ID NO22的片段。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，RAGE域間連接體可以包含SEQ ID NO24，相應(yīng)于氨基酸222-226。或者，域間連接體可以包含SEQ ID NO44，相應(yīng)于RAGE的氨基酸318-342。
例如，RAGE融合蛋白可以用于結(jié)合測(cè)定法中以鑒別潛在的RAGE配體。在此類(lèi)結(jié)合測(cè)定法的一個(gè)示例實(shí)施方案中，可以將已知的RAGE配體以約5微克/孔的濃度包被在固體基質(zhì)(例如Maxisorb板)上，其中每個(gè)孔包含約100微升(μL)的總體積。板可以在4℃孵育過(guò)夜以允許配體吸收?？商娲?，可以采用在更高溫度(例如室溫)下的更短孵育期。允許配體與基質(zhì)結(jié)合一段時(shí)間后，可以吸出測(cè)定孔中的液體并加入封閉緩沖液(例如含1％BSA的50mM咪唑(imidizole)緩沖液，pH 7.2)以封閉非特異性結(jié)合。例如，可以在室溫下將封閉緩沖液加入板中并保持1小時(shí)。隨后可以吸出板中液體和/或用洗滌緩沖液洗滌。在一個(gè)實(shí)施方案中，含有20mM咪唑、150mM NaCl、0.05％Tween-20、5mM CaCl2和5mM MgCl2的pH 7.2的緩沖液可以用作洗滌緩沖液。隨后以增加的稀釋度將融合蛋白加入測(cè)定孔中。然后可以允許RAGE融合蛋白與固定的配體一起在測(cè)定板中孵育，從而使得結(jié)合能夠達(dá)到平衡。在一個(gè)實(shí)施方案中，允許RAGE融合蛋白與固定的配體一起在37℃孵育約1小時(shí)。在可選實(shí)施方案中，可以采用在更低溫度下的更長(zhǎng)孵育期。在融合蛋白和固定的配體已經(jīng)孵育后，可以洗滌板以去除任何未結(jié)合的融合蛋白?？梢砸愿鞣N方式檢測(cè)與固定的配體結(jié)合的融合蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，采用ELISA進(jìn)行檢測(cè)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，可以向固定在測(cè)定板中的融合蛋白加入包含單克隆小鼠抗人IgG1、生物素化的山羊抗小鼠IgG和連接有抗生物素蛋白的堿性磷酸酶的免疫檢測(cè)復(fù)合物?？梢栽试S免疫檢測(cè)復(fù)合物與固定的融合蛋白結(jié)合，從而使得融合蛋白和免疫檢測(cè)復(fù)合物之間的結(jié)合達(dá)到平衡。例如，可以允許復(fù)合物在室溫下與融合蛋白結(jié)合1小時(shí)。在那時(shí)，可以通過(guò)用洗滌緩沖液洗滌測(cè)定孔來(lái)去除任何未結(jié)合的復(fù)合物。通過(guò)加入堿性磷酸酶底物磷酸對(duì)硝基苯酯(PNPP)，并以在405nm處吸光度的增加來(lái)測(cè)量PNPP至對(duì)硝基苯酚(PNP)的轉(zhuǎn)化，可以檢測(cè)結(jié)合的復(fù)合物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，RAGE配體以納摩爾濃度(nM)或微摩爾濃度(μM)的親和力結(jié)合RAGE融合蛋白。圖7中顯示了圖解說(shuō)明RAGE配體與本發(fā)明的RAGE融合蛋白結(jié)合的實(shí)驗(yàn)。制備起始濃度分別為1.082mg/mL和370μg/mL的TTP-3000(TT3)和TTP-4000(TT4)溶液。如圖7中所示，在各種稀釋度下，融合蛋白TTP-3000和TTP-4000能夠結(jié)合固定的RAGE配體即淀粉樣蛋白-β(Abeta)(來(lái)自Biosource的Amyloid Beta(1-40))、S100b(S100)和兩性蛋白(Ampho)，導(dǎo)致吸光度增加。在沒(méi)有配體時(shí)(即僅用BSA包被)，沒(méi)有吸光度的增加。
本發(fā)明的結(jié)合測(cè)定法可以用于量化與RAGE結(jié)合的配體。在可選實(shí)施方案中，RAGE配體可以以0.1-1000納摩爾濃度(nM)、或1-500nM、或10-80nM的結(jié)合親和力與本發(fā)明的融合蛋白結(jié)合。
本發(fā)明的融合蛋白還可用于鑒別具有結(jié)合RAGE的能力的化合物。如圖8和9中分別顯示的，可以評(píng)測(cè)RAGE配體與固定的淀粉樣蛋白β競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合TTP-4000(TT4)或TTP-3000(TT3)融合蛋白的能力。因此，可以看出，在起始TTP-4000溶液(圖8)或TTP-3000(圖9)的濃度為1∶3、1∶10、1∶30和1∶100時(shí)，最終測(cè)定濃度(FAC)為10μM的RAGE配體可以取代RAGE融合蛋白與淀粉樣蛋白-β的結(jié)合。
細(xì)胞效應(yīng)物的調(diào)節(jié)本發(fā)明融合蛋白的實(shí)施方案可以用于調(diào)節(jié)由RAGE介導(dǎo)的生物應(yīng)答。例如，可以設(shè)計(jì)融合蛋白以調(diào)節(jié)RAGE誘導(dǎo)的基因表達(dá)的增加。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白可以用于調(diào)節(jié)生物酶的功能。例如，RAGE與其配體之間的相互作用可以產(chǎn)生氧化應(yīng)激，并激活NF-κB，以及NF-κB調(diào)節(jié)的基因，例如細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α等。另外，已顯示幾種其他的調(diào)節(jié)途徑，例如涉及p21ras、MAP激酶、ERK1和ERK2的那些，被AGEs和其他配體與RAGE的結(jié)合激活。
圖10中顯示了本發(fā)明融合蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞效應(yīng)物TNF-α的表達(dá)的用途?？梢栽谘a(bǔ)充有10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)THP-1骨髓細(xì)胞，并且用S100b誘導(dǎo)其經(jīng)由RAGE的刺激而分泌TNF-α。當(dāng)此類(lèi)刺激發(fā)生在RAGE融合蛋白存在下時(shí)，由S100b結(jié)合RAGE而對(duì)TNF-α的誘導(dǎo)可以得到抑制。因此，如圖10中所示，10μg TTP-3000(TT3)或TTP-4000(TT4)RAGE融合蛋白的加入使TNF-α的S100b誘導(dǎo)減少了約50％-75％。融合蛋白TTP-4000在阻斷TNF-α的S100b誘導(dǎo)方面至少與sRAGE一樣有效(圖10)。將IgG單獨(dú)加入到經(jīng)S100b刺激的細(xì)胞中的實(shí)驗(yàn)顯示了對(duì)于TTP-4000和TTP-3000的RAGE序列的抑制特異性。IgG和S100b加入到該測(cè)定中顯示與S100b單獨(dú)時(shí)相同的TNF-α水平。
RAGE融合蛋白的生理學(xué)特征盡管sRAGE在調(diào)節(jié)RAGE介導(dǎo)的疾病方面可以具有治療益處，但基于sRAGE在血漿中相對(duì)較短的半壽期，人sRAGE作為獨(dú)立治療劑可能有限制。例如，當(dāng)通過(guò)sRAGE免疫反應(yīng)性保留進(jìn)行評(píng)估時(shí)，雖然嚙齒類(lèi)動(dòng)物的sRAGE在正常和糖尿病大鼠中的半壽期為大約20小時(shí)，但人sRAGE的半壽期小于2小時(shí)(Renard等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.，2901458-1466(1999))。
為了產(chǎn)生具有與sRAGE類(lèi)似的結(jié)合特征但具有更穩(wěn)定的藥代動(dòng)力學(xué)特性的RAGE治療劑，可以使用包含與一個(gè)或多個(gè)人免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域連接的RAGE配體結(jié)合位點(diǎn)的RAGE融合蛋白。如本領(lǐng)域已知的，免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域可以包含免疫球蛋白重鏈的Fc部分。
免疫球蛋白的Fc部分可以賦予融合蛋白數(shù)種屬性。例如，F(xiàn)c融合蛋白通?？梢詫⒋祟?lèi)融合蛋白的血清半壽期從數(shù)小時(shí)增加到數(shù)日。藥代動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性的增加一般是Fc片段的CH2和CH3區(qū)域之間的連接體與FcRn受體相互作用的結(jié)果(Wines等人，J.Immunol.，1645313-5318(2000))。
盡管包含免疫球蛋白Fc多肽的融合蛋白可以提供穩(wěn)定性增加的優(yōu)點(diǎn)，但當(dāng)引入宿主中時(shí)免疫球蛋白融合蛋白可以引起炎癥應(yīng)答。炎癥應(yīng)答在很大程度上可能是由于融合蛋白的免疫球蛋白的Fc部分。如果靶表達(dá)在需要被清除的患病細(xì)胞類(lèi)型(例如，癌細(xì)胞、導(dǎo)致自身免疫疾病的淋巴細(xì)胞或淋巴細(xì)胞群)上，那么促炎癥應(yīng)答可以是所希望的特征。如果靶為可溶性蛋白，由于大多數(shù)可溶性蛋白不激活免疫球蛋白，那么促炎癥應(yīng)答可以是中性的特征。然而，如果靶表達(dá)在其破壞將導(dǎo)致不利副作用的細(xì)胞類(lèi)型上，那么促炎癥應(yīng)答可以是負(fù)面的特征。此外，如果在融合蛋白與組織靶結(jié)合的位點(diǎn)處炎性級(jí)聯(lián)是確定的，那么促炎癥應(yīng)答可以是負(fù)面的特征，因?yàn)樵S多炎癥的介質(zhì)對(duì)周?chē)M織可能是有害的，和/或可能導(dǎo)致全身效應(yīng)。
免疫球蛋白Fc片段上的主要促炎癥位點(diǎn)位于CH1和CH2之間的鉸鏈區(qū)。這個(gè)鉸鏈區(qū)與各種白細(xì)胞上的FcR1-3相互作用并引發(fā)這些細(xì)胞攻擊靶。(Wines等人，J.Immunol.，1645313-5318(2000))。
作為RAGE介導(dǎo)的疾病的治療劑，RAGE融合蛋白可以不需要炎癥應(yīng)答的產(chǎn)生。因此，本發(fā)明RAGE融合蛋白的實(shí)施方案可以包括包含與免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域連接的RAGE多肽的融合蛋白，其中Fc鉸鏈區(qū)從該免疫球蛋白中去除并用RAGE多肽代替。這樣，可以將RAGE融合蛋白與炎性細(xì)胞上的Fc受體之間的相互作用降到最低。然而，重要的是維持融合蛋白的各種免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域之間的正確堆疊及其他三維結(jié)構(gòu)的相互作用。因此，本發(fā)明融合蛋白的實(shí)施方案可以用生物學(xué)惰性但結(jié)構(gòu)上類(lèi)似的將RAGE的V和C1結(jié)構(gòu)域隔開(kāi)的RAGE域間連接體，或?qū)AGE的C1和C2結(jié)構(gòu)域隔開(kāi)的連接體，來(lái)代替免疫球蛋白重鏈的正常鉸鏈區(qū)。因此，融合蛋白的RAGE多肽可以包含在RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域下游天然發(fā)現(xiàn)的域間連接體序列以形成RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域/連接體片段。這樣，可以維持由RAGE或免疫球蛋白支持的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域之間的三維相互作用。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的RAGE融合蛋白與sRAGE比較可以具有藥代動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性的實(shí)質(zhì)增加。例如，圖11顯示，一旦RAGE融合蛋白TTP-4000飽和了其配體，它就可以保留大于300個(gè)小時(shí)的半壽期。這可以與sRAGE在人血漿中僅幾小時(shí)的半壽期形成對(duì)照。
因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的RAGE融合蛋白可以用于拮抗生理學(xué)配體與RAGE的結(jié)合，以作為治療RAGE介導(dǎo)的疾病的手段而不產(chǎn)生不可接受的量的炎癥。本發(fā)明的融合蛋白與IgG比較可以顯示出在產(chǎn)生促炎癥應(yīng)答方面的實(shí)質(zhì)減少。例如，如圖12中所示，在檢測(cè)到人IgG刺激TNF-α釋放的情況下，RAGE融合蛋白TTP-4000不刺激TNF-α從細(xì)胞中釋放。
用RAGE融合蛋白治療疾病本發(fā)明還包括治療人類(lèi)受試者中RAGE介導(dǎo)的病癥的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法可以包括對(duì)受試者施用包含RAGE多肽的融合蛋白，所述RAGE多肽包含RAGE配體結(jié)合位點(diǎn)且與第二種非RAGE多肽連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，融合蛋白可以包含RAGE配體結(jié)合位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，配體結(jié)合位點(diǎn)包含融合蛋白的最N-末端結(jié)構(gòu)域。RAGE配體結(jié)合位點(diǎn)可以包含RAGE的V結(jié)構(gòu)域或其部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，RAGE配體結(jié)合位點(diǎn)包含SEQ ID NO9或與其90％同一的序列，或者SEQ ID NO10或與其90％同一的序列。
在一個(gè)實(shí)施方案中，RAGE多肽可以與包含免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域或免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的部分(例如，其片段)的多肽連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的多肽包含人IgG的CH2或CH3結(jié)構(gòu)域中至少一個(gè)的至少一部分。
RAGE蛋白或多肽可以包含全長(zhǎng)的人RAGE(例如，SEQ ID NO1)或人RAGE的片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，RAGE多肽不包含任何信號(hào)序列殘基。RAGE的信號(hào)序列可以包含全長(zhǎng)RAGE(SEQ ID NO1)的殘基1-22或殘基1-23。在可選實(shí)施方案中，RAGE多肽可以包含與人RAGE或其片段70％、80％、或90％同一的序列。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，RAGE多肽可以包含以甘氨酸而不是甲硫氨酸作為第一個(gè)殘基的人RAGE或其片段(參見(jiàn)，例如Neeper等人，(1992))?；蛘?，人RAGE可以包含去除信號(hào)序列的全長(zhǎng)RAGE(例如，SEQ ID NO2或SEQ ID NO3)(圖1A和1B)或那個(gè)氨基酸序列的一部分。本發(fā)明的融合蛋白還可以包含sRAGE(例如SEQ ID NO4)、與sRAGE或sRAGE片段90％同一的多肽。例如，RAGE多肽可以包含以甘氨酸而不是甲硫氨酸作為第一個(gè)殘基的人sRAGE或其片段(參見(jiàn)，例如Neeper等人，(1992))?；蛘撸薘AGE可以包含去除信號(hào)序列的sRAGE(例如，SEQ ID NO5或SEQ ID NO6)(圖1C)或那個(gè)氨基酸序列的一部分。在其他實(shí)施方案中，RAGE蛋白可以包含V結(jié)構(gòu)域(例如SEQ ID NO7或SEQ ID NO8；圖1D)?；蛘撸梢允褂门cV結(jié)構(gòu)域或其片段90％同一的序列。或者，RAGE蛋白可以包含含有部分V結(jié)構(gòu)域的RAGE片段(例如SEQ ID NO9或SEQ ID NO10；圖1D)。在一個(gè)實(shí)施方案中，配體結(jié)合位點(diǎn)可以包含SEQ ID NO9或與其90％同一的序列，或者SEQ ID NO10或與其90％同一的序列。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，RAGE片段是合成肽。
融合蛋白可以包含不來(lái)源于RAGE或其片段的幾種類(lèi)型的肽。融合蛋白的第二種多肽可以包含來(lái)源于免疫球蛋白的多肽。重鏈(或其部分)可以來(lái)源于任何一個(gè)已知的重鏈同種型IgG(γ)、IgM(μ)、IgD(δ)、IgE(ε)或IgA(α)。此外，重鏈(或其部分)可以來(lái)源于任何一個(gè)已知的重鏈亞型IgG1(γ1)、IgG2(γ2)、IgG3(γ3)、IgG4(γ4)、IgA1(α1)、IgA2(α2)，或這些同種型或亞型的改變生物學(xué)活性的突變。第二種多肽可以包含人IgG1的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域或這些結(jié)構(gòu)域中任何一個(gè)或兩個(gè)的一部分。作為一個(gè)示例實(shí)施方案，包含人IgG1的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域或其部分的多肽可以包含SEQ ID NO38或SEQ ID NO40。免疫球蛋白肽可以由SEQ ID NO39或SEQ ID NO41的核酸序列編碼。
例如，RAGE多肽可以包含人RAGE的氨基酸23-116(SEQ ID NO7)或與其90％同一的序列，或人RAGE的氨基酸24-116(SEQ ID NO8)或與其90％同一的序列，相應(yīng)于RAGE的V結(jié)構(gòu)域?；蛘?，RAGE多肽可以包含人RAGE的氨基酸124-221(SEQ ID NO11)或與其90％同一的序列，相應(yīng)于RAGE的C1結(jié)構(gòu)域。在另一實(shí)施方案中，RAGE多肽可以包含人RAGE的氨基酸227-317(SEQ ID NO12)或與其90％同一的序列，相應(yīng)于RAGE的C2結(jié)構(gòu)域。或者，RAGE多肽可以包含人RAGE的氨基酸23-123(SEQ ID NO13)或與其90％同一的序列，或人RAGE的氨基酸24-123(SEQ ID NO14)或與其90％同一的序列，相應(yīng)于RAGE的V結(jié)構(gòu)域以及下游的域間連接體?；蛘撸琑AGE多肽可以包含人RAGE的氨基酸23-226(SEQ ID NO17)或與其90％同一的序列，或人RAGE的氨基酸24-226(SEQ ID NO18)或與其90％同一的序列，相應(yīng)于V-結(jié)構(gòu)域、C1結(jié)構(gòu)域以及連接這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的域間連接體?；蛘?，RAGE多肽可以包含人RAGE的氨基酸23-339(SEQ ID NO5)或與其90％同一的序列，或人RAGE的24-339(SEQ ID NO6)或與其90％同一的序列，相應(yīng)于sRAGE(即，編碼V、C1和C2結(jié)構(gòu)域以及域間連接體)?；蛘撸梢岳眠@些序列中每一個(gè)的片段。
免疫球蛋白鏈的Fc部分在體內(nèi)可以是促炎癥的。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的RAGE融合蛋白包含來(lái)源于RAGE的域間連接體而不是來(lái)源于免疫球蛋白的域間鉸鏈多肽。
因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，融合蛋白可以進(jìn)一步包含直接與包含免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域或其片段的多肽連接的RAGE多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，CH2結(jié)構(gòu)域或其片段包含SEQ ID NO42。
在一個(gè)實(shí)施方案中，RAGE多肽包含與RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域連接的RAGE域間連接體，從而使得RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的C-末端氨基酸連接至域間連接體的N-末端氨基酸，并且RAGE域間連接體的C-末端氨基酸直接連接至包含免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域或其片段的多肽的N-末端氨基酸。包含免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域的多肽可以包含人IgG1的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。作為一個(gè)示例實(shí)施方案，包含人IgG1的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的多肽可以包含SEQ ID NO38或SEQ ID NO40。
本發(fā)明的融合蛋白可以包含單個(gè)或多個(gè)來(lái)自RAGE的結(jié)構(gòu)域。此外，包含與RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域連接的域間連接體的RAGE多肽可以包含全長(zhǎng)RAGE蛋白的片段。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，融合蛋白可以包含兩個(gè)來(lái)源于RAGE蛋白的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域以及兩個(gè)來(lái)源于人Fc多肽的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。融合蛋白可以包含第一個(gè)RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域和連接第二個(gè)RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的第一個(gè)RAGE域間連接體以及第二個(gè)RAGE域間連接體，從而使得第一個(gè)域間連接體的N-末端氨基酸連接至第一個(gè)RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的C-末端氨基酸，第二個(gè)RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的N-末端氨基酸連接至第一個(gè)域間連接體的C-末端氨基酸，第二個(gè)域間連接體的N-末端氨基酸連接至RAGE第二個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的C-末端氨基酸，以及RAGE第二個(gè)域間連接體的C-末端氨基酸直接連接至包含CH2免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域或其片段的多肽的N-末端氨基酸。例如，RAGE多肽可以包含人RAGE的氨基酸23-251(SEQ ID NO19)或與其90％同一的序列，或人RAGE的氨基酸24-251(SEQ ID NO20)或與其90％同一的序列，相應(yīng)于V-結(jié)構(gòu)域、C1結(jié)構(gòu)域、連接這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的域間連接體以及C1下游的第二個(gè)域間連接體。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含SEQ ID NO30或其片段的核酸構(gòu)建體可以編碼四結(jié)構(gòu)域的RAGE融合蛋白。
可替代地，三結(jié)構(gòu)域的融合蛋白可以包含一個(gè)來(lái)源于RAGE的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域以及兩個(gè)來(lái)源于人Fc多肽的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。例如，融合蛋白可以包含經(jīng)由RAGE域間連接體與包含CH2免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域或其片段的多肽的N-末端氨基酸連接的單個(gè)RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。例如，RAGE多肽可以包含人RAGE的氨基酸23-136(SEQ ID NO15)或與其90％同一的序列，或人RAGE的氨基酸24-136(SEQ ID NO16)或與其90％同一的序列，相應(yīng)于RAGE的V結(jié)構(gòu)域以及下游的域間連接體。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含SEQ ID NO31或其片段的核酸構(gòu)建體可以編碼三結(jié)構(gòu)域的RAGE融合蛋白。
RAGE域間連接體片段可以包含天然地位于RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域下游并因此與之連接的肽序列。例如，對(duì)于RAGE V結(jié)構(gòu)域，域間連接體可以包含天然地位于V結(jié)構(gòu)域下游的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，連接體可以包含SEQ ID NO21，相應(yīng)于全長(zhǎng)RAGE的氨基酸117-123?；蛘撸B接體可以包含具有天然RAGE序列的另外部分的肽。例如，可以利用包含SEQ ID NO21的上游和下游數(shù)個(gè)氨基酸(例如1-3、1-5、或1-10、或1-15個(gè)氨基酸)的域間連接體。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，域間連接體包含SEQ ID NO23，其包含全長(zhǎng)RAGE的氨基酸117-136?；蛘?，可以利用從連接體的任何一端刪除例如1、2或3個(gè)氨基酸的SEQ ID NO21的片段。在可選實(shí)施方案中，連接體可以包含與SEQ ID NO21或SEQ ID NO23 70％同一、或80％同一、或90％同一的序列。
對(duì)于RAGE C1結(jié)構(gòu)域，連接體可以包含天然地位于C1結(jié)構(gòu)域下游的肽序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，連接體可以包含SEQ ID NO22，相應(yīng)于全長(zhǎng)RAGE的氨基酸222-251?；蛘?，連接體可以包含具有天然RAGE序列的另外部分的肽。例如，可以利用包含SEQ ID NO22的上游和下游數(shù)個(gè)氨基酸(例如1-3、1-5、或1-10、或1-15個(gè)氨基酸)的連接體?；蛘?，可以利用從連接體的任何一端刪除例如1-3、1-5、或1-10、或1-15個(gè)氨基酸的SEQ ID NO22的片段。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，RAGE域間連接體可以包含SEQ ID NO24，相應(yīng)于氨基酸222-226。或者，域間連接體可以包含SEQ ID NO44，相應(yīng)于RAGE的氨基酸318-342。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白可以通過(guò)各種途徑施用。本發(fā)明RAGE融合蛋白的施用可以采用腹膜內(nèi)(IP)注射。可替代地，RAGE融合蛋白可以口服、鼻內(nèi)或作為氣霧劑施用。在另一實(shí)施方案中，施用是靜脈內(nèi)的(IV)。RAGE融合蛋白還可以皮下注射。在另一實(shí)施方案中，融合蛋白的施用是動(dòng)脈內(nèi)的。在另一實(shí)施方案中，施用是舌下的。此外，施用還可以采用定時(shí)釋放膠囊。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，施用可以是經(jīng)直腸的，例如通過(guò)栓劑等。例如，當(dāng)希望自我給藥時(shí)，皮下施用可以用于治療慢性病癥。
各種動(dòng)物模型已經(jīng)用于驗(yàn)證作為治療劑調(diào)節(jié)RAGE的化合物的用途。這些模型的實(shí)例如下a)在糖尿病和正常大鼠中，通過(guò)抑制經(jīng)由RAGE的內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌和巨噬細(xì)胞的激活，sRAGE抑制在動(dòng)脈損傷后再狹窄的大鼠模型中的新生內(nèi)膜形成(Zhou等人，Circulation 1072238-2243(2003))；b)在全身性淀粉樣變性的小鼠模型中，利用sRAGE或抗RAGE抗體抑制RAGE/配體相互作用減少了淀粉樣蛋白斑的形成(Yan等人，Nat.Med，6643-651(2000))。在被治療的動(dòng)物中，伴隨淀粉樣蛋白斑減少的是炎性細(xì)胞因子白介素-6(IL-6)和巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)的減少以及NF-κB的活化的減少；c)在AD小鼠模型中，RAGE轉(zhuǎn)基因小鼠(RAGE過(guò)表達(dá)的小鼠和RAGE顯性失活表達(dá)的小鼠)顯示出斑形成和認(rèn)知缺陷(Arancio等人，EMBO J.，234096-4105(2004))；d)用sRAGE治療糖尿病大鼠降低了血管通透性(Bonnardel-Phu等人，Diabetes，482052-2058(1999))；e)用sRAGE治療減少了在載脂蛋白E缺陷的糖尿病小鼠中的動(dòng)脈粥樣硬化損傷，并在db/db小鼠中阻止了糖尿病性腎病的功能和形態(tài)學(xué)指征(Hudson等人，Arch.Biochem.Biophys.，41980-88(2003))；以及f)在膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎的小鼠模型(Hofmann等人，GenesImmunol.，3123-135(2002))、實(shí)驗(yàn)性過(guò)敏性腦脊髓炎的小鼠模型(Yan等人，Nat.Med.，928-293(2003))以及炎性腸病的小鼠模型(Hofmann等人，Cell，97889-901(1999))中，sRAGE減弱了炎癥的嚴(yán)重度。
因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白可以用于治療糖尿病的癥狀和/或經(jīng)RAGE介導(dǎo)的由糖尿病引起的并發(fā)癥。在可選實(shí)施方案中，糖尿病的癥狀或糖尿病的晚期并發(fā)癥可以包括糖尿病性腎病、糖尿病性視網(wǎng)膜病、糖尿病性足部潰瘍、糖尿病的心血管并發(fā)癥或糖尿病性神經(jīng)病變。
最初被鑒別為其表達(dá)與糖尿病病理相關(guān)的分子的受體，RAGE自身對(duì)于糖尿病并發(fā)癥的病理生理學(xué)是必要的。在體內(nèi)，在多個(gè)糖尿病并發(fā)癥和炎癥模型中已顯示，抑制RAGE與其配體的相互作用是有治療作用的(Hudson等人，Arch.Biochem.Biophys.，41980-88(2003))。例如，在糖尿病小鼠中，兩個(gè)月的抗RAGE抗體治療使腎功能正?；⑶覝p少了異常的腎組織病理(Flyvbjerg等人，Diabetes 53166-172(2004))。此外，用結(jié)合RAGE配體并抑制RAGE/配體相互作用的可溶形式的RAGE(sRAGE)進(jìn)行治療減少了在載脂蛋白E缺陷的糖尿病小鼠中的動(dòng)脈粥樣硬化損傷，并且在db/db小鼠中減弱了糖尿病性腎病的功能和形態(tài)學(xué)病理(Bucciarelli等人，Circulation 1062827-2835(2002))。
此外，還已顯示，在高血糖癥及與全身或局部氧化應(yīng)激相關(guān)的其他條件存在下，在腎衰竭中，在炎癥位置處，最終導(dǎo)致高級(jí)糖基化終產(chǎn)物(AGEs)形成的大分子非酶促糖氧化(glycoxidation)是增強(qiáng)的(Dyer等人，J.Clin.Invest.，912463-2469(1993)；Reddy等人，Biochem.，3410872-10878(1995)；Dyer等人，J.Biol.Chem.，26611654-11660(1991)；Degenhardt等人，Cell Mol.Biol.，441139-1145(1998))。AGEs在脈管系統(tǒng)中的積聚可以在灶部發(fā)生，如在發(fā)現(xiàn)于透析相關(guān)的淀粉樣變性患者中的由AEG-β2-微球蛋白組成的關(guān)節(jié)淀粉樣蛋白之中(Miyata等人，J.Clin.Invest.，921243-1252(1993)；Miyata等人，J.Clin.Invest.，981088-1094(1996))，或者一般地，如由糖尿病患者的脈管系統(tǒng)和組織所例證的(Schmidt等人，Nature Med.，11002-1004(1995))。糖尿病患者中AGEs隨著時(shí)間過(guò)去而漸進(jìn)的積聚提示，內(nèi)源性清除機(jī)制在AGE沉積位置處不能有效地發(fā)揮作用。此類(lèi)積聚的AGEs能夠通過(guò)眾多機(jī)制改變細(xì)胞特性。盡管在正常組織和脈管系統(tǒng)中RAGE以低水平表達(dá)，但已顯示在受體的配體積聚的環(huán)境中RAGE變成上調(diào)(Li等人，J.Biol.Chem.，27216498-16506(1997)；Li等人，J.Biol.Chem.，27330870-30878(1998)；Tanaka等人，J.Biol.Chem.，27525781-25790(2000))。在糖尿病的脈管系統(tǒng)中，RAGE的表達(dá)在內(nèi)皮、平滑肌細(xì)胞和浸潤(rùn)性單核吞噬細(xì)胞中是增加的。此外，細(xì)胞培養(yǎng)中研究也已證實(shí)，AGE-RAGE相互作用導(dǎo)致在血管內(nèi)穩(wěn)定中重要的細(xì)胞特性改變。
圖13中圖解說(shuō)明了RAGE融合蛋白在治療糖尿病相關(guān)病理中的用途。在再狹窄的糖尿病大鼠模型中評(píng)估RAGE融合蛋白TTP-4000，其中包括測(cè)量血管損傷后的平滑肌增殖和內(nèi)膜擴(kuò)張。如圖13中所圖解說(shuō)明的，在糖尿病相關(guān)的再狹窄中TTP-4000治療可以以劑量-響應(yīng)方式顯著地減少內(nèi)膜/中膜(I/M)比(圖13A；表1)。此外，TTP-4000治療還可以以劑量-響應(yīng)方式顯著地減少再狹窄相關(guān)的血管平滑肌細(xì)胞增殖。
表1TTP-4000在大鼠再狹窄模型中的作用
*P＜0.05**對(duì)于高和低劑量，均使用3mg/動(dòng)物的負(fù)荷劑量。
在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白還可用于治療或逆轉(zhuǎn)淀粉樣變性和阿爾茨海默病。RAGE是淀粉樣蛋白β(Aβ)以及其他淀粉樣變性原性(amyloidogenic)蛋白(包括SAA和糊精(amylin))的受體(Yan等人，Nature，382685-691(1996)；Yan等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，945296-5301(1997)；Yan等人，Nat.Med，6643-651(2000)；Sousa等人，Lab Invest.，801101-1110(2000))。此外，在男性老年斑周?chē)慕M織中也發(fā)現(xiàn)了RAGE配體，包括AGEs、S100b和Aβ蛋白(Luth等人，Cereb.Cortex 15211-220(2005)；Petzold等人，Neurosci.Lett.，336167-170(2003)；Sasaki等人，Brain Res.，12256-262(2001)；Yan等人，Restor.Neurol.Neruosci.，12167-173(1998))。已顯示，RAGE結(jié)合β-折疊纖維狀材料而不管亞基的組成(淀粉樣蛋白-β肽、糊精、血清淀粉樣蛋白A、朊蛋白起源的肽)(Yan等人，Nature，382685-691(1996)；Yan等人，Nat.Med，6643-651(2000))。此外，已顯示，淀粉樣蛋白的沉積導(dǎo)致RAGE表達(dá)增強(qiáng)。例如，在阿爾茨海默病(AD)患者的大腦中，在神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)中RAGE表達(dá)增加(Yan，等人，Nature 382685-691(1996))。與RAGE配體的表達(dá)同時(shí)發(fā)生的是，在患有AD的個(gè)體的海馬中的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中RAGE是上調(diào)的，但在沒(méi)有AD的個(gè)體中不是上調(diào)的(Lue等人，Exp.Neurol.，17129-45(2001))。這些發(fā)現(xiàn)提示，在老年斑附近，表達(dá)RAGE的細(xì)胞經(jīng)由RAGE/RAGE配體相互作用而被激活。此外，在體外，Aβ介導(dǎo)的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的活化也可以被針對(duì)RAGE的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體阻斷(Yan等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，945296-5301(1997))。還證實(shí)，RAGE可以充當(dāng)原纖維裝配的焦點(diǎn)(Deane等人，Nat.Med.9907-913(2003))。
此外，在全身性淀粉樣變性的小鼠模型中，利用sRAGE或抗RAGE抗體體內(nèi)抑制RAGE/配體相互作用可以減少淀粉樣蛋白斑的形成(Yan等人，Nat.Med.，6643-651(2000))。在神經(jīng)元中過(guò)量表達(dá)人RAGE以及含Swedish和London突變的人淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)(突變體hAPP)的雙轉(zhuǎn)基因小鼠，早于它們的單突變體hAPP轉(zhuǎn)基因?qū)?yīng)物形成學(xué)習(xí)缺陷和神經(jīng)病理學(xué)異常。與此相反，在相同的突變體hAPP背景下，雙轉(zhuǎn)基因小鼠由于神經(jīng)元表達(dá)顯性失活形式的RAGE而具有減少的Aβ信號(hào)傳導(dǎo)能力，其與它們的單APP轉(zhuǎn)基因?qū)?yīng)物相比顯示延遲的神經(jīng)病理學(xué)和學(xué)習(xí)異常的發(fā)作(Arancio等人，EMBO J.，234096-4105(2004))。
此外，RAGE-淀粉樣蛋白相互作用的抑制還已顯示減少了細(xì)胞RAGE和細(xì)胞應(yīng)激標(biāo)記物的表達(dá)(以及NF-κB活化)，并且減少了淀粉樣蛋白沉積(Yan等人，Nat.Med.，6643-651(2000))，提示在富含淀粉樣蛋白的環(huán)境中的細(xì)胞特性擾動(dòng)中(甚至在早期)以及在淀粉樣蛋白積聚中RAGE-淀粉樣蛋白相互作用均起著作用。
因此，本發(fā)明的RAGE融合蛋白還可用于治療淀粉樣變性，以及減少與阿爾茨海默病(AD)相關(guān)的淀粉樣蛋白斑和認(rèn)知障礙。如上所述，在AD動(dòng)物模型中，sRAGE已顯示減少大腦中淀粉樣蛋白斑的形成以及后續(xù)的炎性標(biāo)記物的增加。圖14A和14B顯示，與接受媒介物或人IgG陰性對(duì)照(IgG1)的動(dòng)物相比，患有AD并且用TTP-4000或小鼠sRAGE治療3個(gè)月的小鼠具有較少的淀粉樣蛋白β(Aβ)斑和較小的認(rèn)知障礙。像sRAGE一樣，TTP-4000也可減少與AD相關(guān)的炎性細(xì)胞因子IL-1和TNF-α(數(shù)據(jù)未顯示)。
此外，本發(fā)明的融合蛋白還可以用于治療動(dòng)脈粥樣硬化及其他心血管病癥。因此，已顯示，缺血性心臟病在糖尿病患者中特別高(Robertson等人，Lab Invest.，18538-551(1968)；Kannel等人，J.Am.Med.Assoc.，2412035-2038(1979)；Kannel等人，Diab.Care，2120-126(1979))。此外，研究已顯示，與不患有糖尿病的患者相比，糖尿病患者中的動(dòng)脈粥樣硬化是更加速且更廣泛的(參見(jiàn)，例如Waller等人，Am.J.Med.，69498-506(1980)；Crall等人，Am.J.Med.64221-230(1978)；Hamby等人，Chest，2251-257(1976)；以及Pyorala等人，Diab.Metab.Rev.，3463-524(1978))。盡管在糖尿病背景下動(dòng)脈粥樣硬化加速的原因有很多，但已顯示AGEs的減少可以減少斑的形成。
例如，本發(fā)明的RAGE融合蛋白還可用于治療中風(fēng)。當(dāng)在疾病相關(guān)的中風(fēng)動(dòng)物模型中比較TTP-4000與sRAGE時(shí)，發(fā)現(xiàn)TTP-4000在梗塞體積方面提供了明顯更大的減少。在這個(gè)模型中，結(jié)扎小鼠的頸中動(dòng)脈并隨后再灌注以形成梗塞。為了評(píng)估RAGE融合蛋白治療或預(yù)防中風(fēng)的有效性，在即將進(jìn)行再灌注之前用sRAGE或TTP-4000或?qū)φ彰庖咔虻鞍滋幚硇∈?。如可以從?中看出的，TTP-4000在限制這些動(dòng)物中的梗塞面積方面比sRAGE更有效，提示由于其在血漿中更佳的半壽期，TTP-4000能夠維持比sRAGE更大的保護(hù)。
表2中風(fēng)中梗塞的減少
*顯著至p＜0.001；*與鹽水比較在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白可以用于治療癌癥。在一個(gè)實(shí)施方案中，利用本發(fā)明的融合蛋白治療的癌癥包含表達(dá)RAGE的癌細(xì)胞。例如，可以用本發(fā)明的RAGE融合蛋白治療的癌癥包括某些肺癌、某些神經(jīng)膠質(zhì)瘤、某些乳突狀瘤等。兩性蛋白是已顯示與RAGE相互作用的高遷移率組I非組蛋白染色體DNA結(jié)合蛋白(Rauvala等人，J.Biol.Chem.，26216625-16635(1987)；Parkikinen等人，J.Biol.Chem.26819726-19738(1993))。已顯示，兩性蛋白促進(jìn)神經(jīng)突長(zhǎng)出，并且在纖維蛋白溶解系統(tǒng)中充當(dāng)?shù)鞍酌笍?fù)合體的裝配表面(還已知有助于細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性)。此外，在原發(fā)性腫瘤模型(C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤)、Lewis肺轉(zhuǎn)移模型(Taguchi等人，Nature 405354-360(2000))以及在表達(dá)v-Ha-ras轉(zhuǎn)基因的小鼠中自發(fā)出現(xiàn)的乳突狀瘤(Leder等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，879178-9182(1990))之中觀(guān)察到阻斷RAGE具有局部腫瘤生長(zhǎng)抑制作用。
在另外一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白可以用于治療炎癥。例如，在可選實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白被用于治療與自身免疫相關(guān)的炎癥、與炎性腸病相關(guān)的炎癥、與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的炎癥、與牛皮癬相關(guān)的炎癥、與多發(fā)性硬化癥相關(guān)的炎癥、與缺氧相關(guān)的炎癥、與中風(fēng)相關(guān)的炎癥、與心臟病發(fā)作相關(guān)的炎癥、與出血性休克相關(guān)的炎癥、與敗血病相關(guān)的炎癥、與器官移植相關(guān)的炎癥或與傷口愈合不良相關(guān)的炎癥。
例如，在溶栓治療后，炎性細(xì)胞例如粒細(xì)胞滲入局部缺血的組織中并產(chǎn)生氧自由基，它可以破壞的細(xì)胞比缺氧殺死的細(xì)胞更多。用抗體或其他蛋白質(zhì)拮抗劑抑制嗜中性粒細(xì)胞上負(fù)責(zé)嗜中性粒細(xì)胞能夠滲入組織的受體已顯示出可改善應(yīng)答。因?yàn)镽AGE是這種嗜中性粒細(xì)胞受體的配體，所以包含RAGE片段的融合蛋白可以充當(dāng)誘餌，和阻止嗜中性粒細(xì)胞輸送至再灌注位點(diǎn)并從而阻止進(jìn)一步的組織破壞。通過(guò)研究可以表明RAGE在防止炎癥中的作用，所述研究顯示在糖尿病和正常大鼠中，sRAGE抑制在動(dòng)脈損傷后再狹窄的大鼠模型中的新生內(nèi)膜擴(kuò)張，推測(cè)通過(guò)抑制經(jīng)由RAGE的內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞增殖和巨噬細(xì)胞激活(Zhou等人，Circulation，1072238-2243(2003))。此外，sRAGE抑制炎癥的模型，包括遲發(fā)型超敏反應(yīng)、實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦炎和炎性腸病(Hofman等人，Cell，97889-901(1999))。
此外，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白還可以用于治療基于自身免疫的病癥。例如，本發(fā)明的融合蛋白可以用于治療腎衰竭。因此，本發(fā)明的融合蛋白可以用于治療全身性狼瘡腎炎或炎性狼瘡腎炎。例如，S100/鈣粒蛋白已顯示出包括緊密相關(guān)的鈣結(jié)合多肽家族，其特征為由連接肽相連的兩個(gè)EF-手區(qū)(Schafer等人，TIBS，21134-140(1996)；Zimmer等人，Brain Res.Bull.，37417-429(1995)；Rammes等人，J.Biol.Chem.，2729496-9502(1997)；Luger ing等人，Eur.J.Clin.Invest.，25659-664(1995))。盡管S100/鈣粒蛋白缺少信號(hào)肽，但早就知道它們可以進(jìn)入細(xì)胞外間隙，特別是在慢性免疫/炎性應(yīng)答的部位，如在囊性纖維病和類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中。RAGE是S100/鈣粒蛋白家族中許多成員的受體，介導(dǎo)它們對(duì)細(xì)胞例如淋巴細(xì)胞和單核吞噬細(xì)胞的促炎癥作用。此外，對(duì)于遲發(fā)型超敏反應(yīng)應(yīng)答、IL-10缺陷小鼠中的結(jié)腸炎、膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎以及實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦炎模型的研究還提示，RAGE-配體相互作用(推測(cè)與S100/鈣粒蛋白)在炎癥級(jí)聯(lián)中具有接近的作用。
因此，在各種所選擇的實(shí)施方案中，本發(fā)明可以提供通過(guò)對(duì)受試者施用治療上有效量的本發(fā)明融合蛋白來(lái)抑制受試者中AGE與RAGE相互作用的方法。利用本發(fā)明RAGE融合蛋白治療的受試者可以是動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，受試者是人。受試者可以患有AGE相關(guān)的疾病，例如糖尿病，糖尿病并發(fā)癥例如腎病、神經(jīng)病變、視網(wǎng)膜病、足部潰瘍、淀粉樣變性或腎衰竭，以及炎癥?；蛘?，受試者可以是患有阿爾茨海默病的個(gè)體。在一個(gè)可選實(shí)施方案中，受試者可以是患有癌癥的個(gè)體。在另外其他的實(shí)施方案中，受試者可以患有全身性紅斑狼瘡或炎性狼瘡腎炎。其他疾病可以由RAGE介導(dǎo)，因此可以利用本發(fā)明的融合蛋白進(jìn)行治療。因此，在本發(fā)明的另外的可選實(shí)施方案中，融合蛋白可以用于治療人或動(dòng)物受試者中的克羅恩病、關(guān)節(jié)炎、脈管炎、腎病、視網(wǎng)膜病和神經(jīng)病變。
治療上有效量可以包括能夠阻止受試者中RAGE與AGE或其他類(lèi)型的內(nèi)源性RAGE配體相互作用的量。相應(yīng)地，所述量將依被治療的受試者而改變?；衔锏氖┯每梢允敲啃r(shí)1次、每天1次、每周1次、每月1次、每年1次或作為單獨(dú)事件。在各種可選實(shí)施方案中，融合蛋白的有效量范圍可以是約1ng/kg體重-約100mg/kg體重，或約10μg/kg體重-約50mg/kg體重，或約100μg/kg體重-約10mg/kg體重。利用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)劑量/響應(yīng)測(cè)定法可以確定實(shí)際的有效量(Johnson等人，Diabetes.421179，(1993))。因此，如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，有效量可以取決于化合物的生物利用度、生物活性和生物降解性。
組合物本發(fā)明可以包括包含與藥物學(xué)上可接受的載體混合的本發(fā)明融合蛋白的組合物。融合蛋白可以包含與第二種非RAGE多肽連接的RAGE多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，融合蛋白可以包含RAGE配體結(jié)合位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，配體結(jié)合位點(diǎn)包含融合蛋白的最N-末端結(jié)構(gòu)域。RAGE配體結(jié)合位點(diǎn)可以包含RAGE的V結(jié)構(gòu)域或其部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，RAGE配體結(jié)合位點(diǎn)包含SEQ ID NO9或與其90％同一的序列，或者SEQ ID NO10或其90％同一的序列。
在一個(gè)實(shí)施方案中，RAGE多肽可以與包含免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域或免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的部分(例如其片段)的多肽連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的多肽包含人IgG的CH2或CH3結(jié)構(gòu)域中至少一個(gè)的至少一部分。
RAGE蛋白或多肽可以包含全長(zhǎng)的人RAGE(例如，SEQ ID NO1)或人RAGE的片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，RAGE多肽不包含任何信號(hào)序列殘基。RAGE的信號(hào)序列可以包含全長(zhǎng)RAGE(SEQ ID NO1)的殘基1-22或殘基1-23。在可選實(shí)施方案中，RAGE多肽可以包含與人RAGE或其片段70％、80％、或90％同一的序列。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，RAGE多肽可以包含以甘氨酸而不是甲硫氨酸作為第一個(gè)殘基的人RAGE或其片段(參見(jiàn)，例如Neeper等人，(1992))?；蛘?，人RAGE可以包含去除信號(hào)序列的全長(zhǎng)RAGE(例如，SEQ ID NO2或SEQ ID NO3)(圖1A和1B)或那個(gè)氨基酸序列的一部分。本發(fā)明的融合蛋白還可以包含sRAGE(例如SEQ ID NO4)、與sRAGE或sRAGE片段90％同一的多肽。例如，RAGE多肽可以包含以甘氨酸而不是甲硫氨酸作為第一個(gè)殘基的人sRAGE或其片段(參見(jiàn)，例如Neeper等人，(1992))。或者，人RAGE可以包含去除信號(hào)序列的sRAGE(例如，SEQ ID NO5或SEQ ID NO6)(圖1C)或那個(gè)氨基酸序列的一部分。在其他實(shí)施方案中，RAGE蛋白可以包含V結(jié)構(gòu)域(例如SEQ ID NO7或SEQ ID NO8；圖1D)?；蛘?，可以使用與V結(jié)構(gòu)域或其片段90％同一的序列?；蛘?，RAGE蛋白可以包含含有部分V結(jié)構(gòu)域的RAGE片段(例如SEQ ID NO9或SEQ ID NO10；圖1D)。在一個(gè)實(shí)施方案中，配體結(jié)合位點(diǎn)可以包含SEQ ID NO9或與其90％同一的序列，或者SEQ ID NO10或與其90％同一的序列。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，RAGE片段是合成肽。
例如，RAGE多肽可以包含人RAGE的氨基酸23-116(SEQ ID NO7)或與其90％同一的序列，或人RAGE的氨基酸24-116(SEQ ID NO8)或與其90％同一的序列，相應(yīng)于RAGE的V結(jié)構(gòu)域?；蛘撸琑AGE多肽可以包含人RAGE的氨基酸124-221(SEQ ID NO11)或與其90％同一的序列，相應(yīng)于RAGE的C1結(jié)構(gòu)域。在另一實(shí)施方案中，RAGE多肽可以包含人RAGE的氨基酸227-317(SEQ ID NO12)或與其90％同一的序列，相應(yīng)于RAGE的C2結(jié)構(gòu)域?；蛘撸琑AGE多肽可以包含人RAGE的氨基酸23-123(SEQ ID NO13)或與其90％同一的序列，或人RAGE的氨基酸24-123(SEQ ID NO14)或與其90％同一的序列，相應(yīng)于RAGE的V結(jié)構(gòu)域以及下游的域間連接體?；蛘撸琑AGE多肽可以包含人RAGE的氨基酸23-226(SEQ ID NO17)或與其90％同一的序列，或人RAGE的氨基酸24-226(SEQ ID NO18)或與其90％同一的序列，相應(yīng)于V結(jié)構(gòu)域、C1結(jié)構(gòu)域以及連接這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的域間連接體?；蛘撸琑AGE多肽可以包含人RAGE的氨基酸23-339(SEQ ID NO5)或與其90％同一的序列，或人RAGE的24-339(SEQ ID NO6)或與其90％同一的序列，相應(yīng)于sRAGE(即，編碼V、C1和C2結(jié)構(gòu)域以及域間連接體)?；蛘?，可以利用這些序列中每一個(gè)的片段。
融合蛋白可以包含不來(lái)源于RAGE或其片段的幾種類(lèi)型的肽。融合蛋白的第二種多肽可以包括來(lái)源于免疫球蛋白的多肽。重鏈(或其部分)可以來(lái)源于任何一個(gè)已知的重鏈同種型IgG(γ)、IgM(μ)、IgD(δ)、IgE(ε)或IgA(α)。此外，重鏈(或其部分)可以來(lái)源于任何一個(gè)已知的重鏈亞型IgG1(γ1)、IgG2(γ2)、IgG3(γ3)、IgG4(γ4)、IgA1(α1)、IgA2(α2)，或這些同種型或亞型的改變生物學(xué)活性的突變。第二種多肽可以包含人IgG1的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域或這些結(jié)構(gòu)域中任何一個(gè)或兩個(gè)的一部分。作為一個(gè)示例實(shí)施方案，包含人IgG1的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域或其部分的多肽可以包含SEQ ID NO38或SEQ ID NO40。免疫球蛋白肽可以由SEQ ID NO39或SEQ ID NO41的核酸序列編碼。
免疫球蛋白鏈的Fc部分在體內(nèi)可以是促炎癥的。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的RAGE融合蛋白包含來(lái)源于RAGE的域間連接體而不是來(lái)源于免疫球蛋白的域間鉸鏈多肽。
因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，融合蛋白可以進(jìn)一步包含直接與包含免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域或其片段的多肽連接的RAGE多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，CH2結(jié)構(gòu)域或其片段包含SEQ ID NO42。
在一個(gè)實(shí)施方案中，RAGE多肽包含與RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域連接的RAGE域間連接體，從而使得RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的C-末端氨基酸連接至域間連接體的N-末端氨基酸，并且RAGE域間連接體的C-末端氨基酸直接連接至包含免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域或其片段的多肽的N-末端氨基酸。包含免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域或其部分的多肽可以包含人IgG1的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。作為一個(gè)示例實(shí)施方案，包含人IgG1的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的多肽可以包含SEQ ID NO38或SEQ ID NO40。
本發(fā)明的融合蛋白可以包含單個(gè)或多個(gè)來(lái)自RAGE的結(jié)構(gòu)域。此外，包含與RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域連接的域間連接體的RAGE多肽可以包含全長(zhǎng)RAGE蛋白的片段。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，融合蛋白可以包含兩個(gè)來(lái)源于RAGE蛋白的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域以及兩個(gè)來(lái)源于人Fc多肽的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。融合蛋白可以包含第一個(gè)RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域和連接第二個(gè)RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的第一個(gè)RAGE域間連接體以及第二個(gè)RAGE域間連接體，從而使得第一個(gè)域間連接體的N-末端氨基酸連接至第一個(gè)RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的C-末端氨基酸，第二個(gè)RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的N-末端氨基酸連接至第一個(gè)域間連接體的C-末端氨基酸，第二個(gè)域間連接體的N-末端氨基酸連接至RAGE第二個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的C-末端氨基酸，以及RAGE第二個(gè)域間連接體的C-末端氨基酸直接連接至包含CH2免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域或其片段的多肽的N-末端氨基酸。例如，RAGE多肽可以包含人RAGE的氨基酸23-251(SEQ ID NO19)或與其90％同一的序列，或人RAGE的氨基酸24-251(SEQ ID NO20)或與其90％同一的序列，相應(yīng)于V-結(jié)構(gòu)域、C1結(jié)構(gòu)域、連接這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的域間連接體以及C1下游的第二個(gè)域間連接體。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含SEQ ID NO30或其片段的核酸構(gòu)建體可以編碼四結(jié)構(gòu)域的RAGE融合蛋白。
可替代地，三結(jié)構(gòu)域的融合蛋白可以包含一個(gè)來(lái)源于RAGE的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域以及兩個(gè)來(lái)源于人Fc多肽的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。例如，融合蛋白可以包含經(jīng)由RAGE域間連接體與包含CH2免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域或其片段的多肽的N-末端氨基酸連接的單個(gè)RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。例如，RAGE多肽可以包含人RAGE的氨基酸23-136(SEQ ID NO15)或與其90％同一的序列，或人RAGE的氨基酸24-136(SEQ ID NO16)或與其90％同一的序列，相應(yīng)于RAGE的V結(jié)構(gòu)域以及下游的域間連接體。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含SEQ ID NO31或其片段的核酸構(gòu)建體可以編碼三結(jié)構(gòu)域的RAGE融合蛋白。
RAGE域間連接體片段可以包含天然地位于RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域下游并因此與之連接的肽序列。例如，對(duì)于RAGE V結(jié)構(gòu)域，域間連接體可以包含天然地位于V結(jié)構(gòu)域下游的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，連接體可以包含SEQ ID NO21，相應(yīng)于全長(zhǎng)RAGE的氨基酸117-123?；蛘撸B接體可以包含具有天然RAGE序列的另外部分的肽。例如，可以利用包含SEQ ID NO21的上游和下游數(shù)個(gè)氨基酸(例如1-3、1-5、或1-10、或1-15個(gè)氨基酸)的域間連接體。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，域間連接體包含SEQ ID NO23，其包含全長(zhǎng)RAGE的氨基酸117-136?；蛘撸梢岳脧倪B接體的任何一端刪除例如1、2或3個(gè)氨基酸的SEQ ID NO21的片段。在可選實(shí)施方案中，連接體可以包含與SEQ ID NO21或SEQ ID NO23 70％同一、或80％同一、或90％同一的序列。
對(duì)于RAGE C1結(jié)構(gòu)域，連接體可以包含天然地位于C1結(jié)構(gòu)域下游的肽序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，連接體可以包含SEQ ID NO22，相應(yīng)于全長(zhǎng)RAGE的氨基酸222-251?；蛘?，連接體可以包含具有天然RAGE序列的另外部分的肽。例如，可以利用包含SEQ ID NO22的上游和下游數(shù)個(gè)氨基酸(例如1-3、1-5、或1-10、或1-15個(gè)氨基酸)的連接體?；蛘撸梢岳脧倪B接體的任何一端刪除例如1-3、1-5、或1-10、或1-15個(gè)氨基酸的SEQ ID NO22的片段。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，RAGE域間連接體可以包含SEQ ID NO24，相應(yīng)于氨基酸222-226。或者，域間連接體可以包含SEQ ID NO44，相應(yīng)于RAGE的氨基酸318-342。
藥物學(xué)上可接受的載體可以包括任何一種本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)的藥物學(xué)上可接受的載體。載體可以包括稀釋劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物載體可以是液體，和融合蛋白或核酸構(gòu)建體可以是溶液形式。在另一實(shí)施方案中，藥物學(xué)上可接受的載體可以是粉末、凍干粉末或片劑形式的固體。或者，藥物載體可以是凝膠、栓劑或乳膏。在可選實(shí)施方案中，載體可以包括脂質(zhì)體、微膠囊、聚合物包封的細(xì)胞、或病毒。因此，藥物學(xué)上可接受的載體涵蓋，但不限于，任何一種標(biāo)準(zhǔn)的藥物學(xué)上可接受的載體，例如水、醇、磷酸鹽緩沖鹽水溶液、糖(例如蔗糖或甘露醇)、油或乳狀液例如油/水乳狀液或甘油三脂乳狀液、各種類(lèi)型的濕潤(rùn)劑、片劑、包衣片劑以及膠囊。
本發(fā)明RAGE融合蛋白的施用可以采用各種途徑。因此，本發(fā)明RAGE融合蛋白的施用可以采用腹膜內(nèi)(IP)注射。可替代地，RAGE融合蛋白可以口服、鼻內(nèi)或作為氣霧劑施用。在另一實(shí)施方案中，施用是靜脈內(nèi)的(IV)。RAGE融合蛋白還可以皮下注射。在另一實(shí)施方案中，融合蛋白的施用是動(dòng)脈內(nèi)的。在另一實(shí)施方案中，施用是舌下的。此外，施用還可以采用定時(shí)釋放膠囊。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，施用可以是經(jīng)直腸的，例如通過(guò)栓劑等。例如，當(dāng)希望自我給藥時(shí)，皮下施用可以用于治療慢性病癥。
藥物組合物可以是在無(wú)毒的腸胃外可接受的溶劑或媒介物中的無(wú)菌注射液形式。可以采用的可接受的媒介物和溶劑包括水、林格氏溶液、3-丁二醇、等滲氯化鈉溶液或水性緩沖液，例如，生理學(xué)上可接受的檸檬酸鹽、乙酸鹽、甘氨酸、組氨酸、磷酸鹽、tris或琥珀酸鹽緩沖液。注射液可以包含穩(wěn)定劑以防止化學(xué)降解和聚集物形成。穩(wěn)定劑可以包括抗氧化劑例如丁基化羥基苯甲醚(BHA)和丁基化羥基甲苯(BHT)，緩沖質(zhì)(檸檬酸鹽、甘氨酸、組氨酸)或表面活性劑(聚山梨酯80、泊洛沙姆)。該溶液還可包含抗微生物性防腐劑，例如苯甲醇和對(duì)羥基苯甲酸酯。該溶液還可包含表面活性劑以減少聚集，例如聚山梨酯80、泊洛沙姆或本領(lǐng)域已知的其他表面活性劑。該溶液還可包含其他添加劑，例如糖或鹽水，以將組合物的滲透壓調(diào)整至與人類(lèi)血液相似。
藥物組合物可以是無(wú)菌凍干粉劑形式，其用稀釋劑重構(gòu)后可用于注射。稀釋劑可以是注射用水、抑菌性注射用水或無(wú)菌鹽水。通過(guò)將融合蛋白溶液冷凍干燥以產(chǎn)生干燥形式的蛋白質(zhì)，可以生產(chǎn)凍干粉劑。如本領(lǐng)域已知的，與蛋白質(zhì)的液體溶液相比，凍干的蛋白質(zhì)一般具有增加的穩(wěn)定性和更長(zhǎng)的保存期。凍干粉劑(塊狀物)可以包含緩沖質(zhì)以調(diào)整pH，所述緩沖質(zhì)例如為生理學(xué)上可接受的檸檬酸鹽、乙酸鹽、甘氨酸、組氨酸、磷酸鹽、tris或琥珀酸鹽緩沖質(zhì)。凍干粉劑還可包含冷凍保護(hù)劑(lyoprotectant)以維持其物理和化學(xué)穩(wěn)定性。通常使用的冷凍保護(hù)劑是非還原性糖和二糖例如蔗糖、甘露醇或海藻糖。凍干粉劑可以包含穩(wěn)定劑以防止化學(xué)降解和聚集物形成。穩(wěn)定劑可以包括，但不限于，抗氧化劑(BHA、BHT)、緩沖質(zhì)(檸檬酸鹽、甘氨酸、組氨酸)或表面活性劑(聚山梨酯80、泊洛沙姆)。凍干粉劑還可包含抗微生物性防腐劑，例如苯甲醇和對(duì)羥基苯甲酸酯。凍干粉劑還可包含表面活性劑以減少聚集，例如，但不限于，聚山梨酯80和泊洛沙姆。凍干粉劑還可包含添加劑(例如糖或鹽水)以在對(duì)粉末進(jìn)行重構(gòu)后將滲透壓調(diào)整至與人類(lèi)血液相似。凍干粉劑還可包含填充劑，例如糖和二糖。
注射用的藥物組合物還可以是油性懸浮液的形式。利用上述合適的分散劑或濕潤(rùn)劑和懸浮劑，根據(jù)已知方法可以配制這種懸浮液。此外，無(wú)菌的固定油很方便用作溶劑或懸浮介質(zhì)。為了這個(gè)目的，利用合成的甘油單酯或甘油二酯，可以采用任何溫和的固定油。此外，還可以通過(guò)將活性成分懸浮在植物油例如花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油，或者礦物油例如液體石蠟中來(lái)配制油性懸浮液。例如，脂肪酸例如油酸可用于制備注射劑。油性懸浮液可以包含增稠劑例如蜂蠟、固體石蠟或鯨蠟醇。通過(guò)添加抗氧化劑例如抗壞血酸可以保存這些組合物。
本發(fā)明的藥物組合物還可以是水包油乳狀液或水性懸浮液形式。油相可以是植物油例如橄欖油或花生油，或礦物油例如液體石蠟，或其混合物。合適的乳化劑可以是天然存在的樹(shù)膠例如阿拉伯膠或黃蓍膠，天然存在的磷脂例如大豆、卵磷脂，以及來(lái)源于脂肪酸和己糖醇脫水物的酯或偏酯例如脫水山梨糖醇單油酸酯，和所述偏酯與環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物，例如聚氧乙烯脫水山梨糖醇。
水性懸浮液還可包含與賦形劑混合的活性化合物。此類(lèi)賦形劑可以包括懸浮劑例如羥甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、黃蓍膠和阿拉伯膠；分散劑或濕潤(rùn)劑，例如天然存在的磷脂例如卵磷脂，或氧化烯與脂肪酸的縮合產(chǎn)物例如聚氧乙烯硬脂酸酯，或環(huán)氧乙烷與長(zhǎng)鏈脂肪醇的縮合產(chǎn)物例如十七乙烯氧鯨蠟醇(heptadecaethyleneoxycetanol)，或環(huán)氧乙烷與來(lái)源于脂肪酸和己糖醇的偏酯的縮合產(chǎn)物例如聚氧乙烯山梨糖醇單油酸酯，或環(huán)氧乙烷與來(lái)源于脂肪酸和己糖醇脫水物的偏酯的縮合產(chǎn)物例如聚乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯。
適合于通過(guò)添加水制備水性懸浮液的可分散的粉劑和顆粒可以提供與分散劑、懸浮劑和一種或多種防腐劑混合的活性化合物。合適的防腐劑、分散劑和懸浮劑在上文中得到描述。
所述組合物還可以是用于本發(fā)明化合物的直腸給藥的栓劑形式。通過(guò)將藥物與合適的非刺激性賦形劑混合可以制備這些組合物，所述賦形劑在常溫下是固體但在直腸溫度下是液體，并因此將會(huì)在直腸中熔化以釋放藥物。此類(lèi)材料包括例如可可脂和聚乙二醇。
對(duì)于局部使用，可以采用包含本發(fā)明化合物的乳膏、軟膏、膠凍劑、溶液或懸浮液。局部應(yīng)用還可包括口腔洗劑和漱口劑?？梢允褂煤线m的防腐劑、抗氧化劑例如BHA和BHT、分散劑、表面活性劑或緩沖質(zhì)。
本發(fā)明的化合物還可以以脂質(zhì)體遞藥系統(tǒng)的形式施用，例如小單層囊泡、大單層囊泡和多層囊泡。脂質(zhì)體可以由各種磷脂例如膽固醇、硬脂胺或磷脂酰膽堿形成。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物可以被修飾以進(jìn)一步延緩被代謝酶從循環(huán)中清除。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述化合物可以通過(guò)共價(jià)連接水溶性聚合物進(jìn)行修飾，所述水溶性聚合物例如為聚乙二醇(PEG)、PEG和聚丙二醇的共聚物、聚乙烯吡咯烷酮或聚脯氨酸、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇等。此類(lèi)修飾還可以增加化合物在水性溶液中的溶解度。聚合物例如PEG可以與一種或多種反應(yīng)性氨基殘基、巰基殘基或羧基殘基共價(jià)連接。已經(jīng)描述了眾多活化形式的PEG，包括羧酸的活性酯類(lèi)或碳酸酯衍生物，特別是其中離去基團(tuán)為下列的那些用于與氨基基團(tuán)反應(yīng)的N-羥基琥珀酰亞胺、對(duì)硝基苯酚、咪唑或1-羥基-2-硝基苯-3-砜，用于與巰基基團(tuán)反應(yīng)的多模態(tài)(multimode)或鹵素乙?；苌?，以及用于與碳水化合物基團(tuán)反應(yīng)的氨基肼或酰肼衍生物。
制備可以與本發(fā)明融合蛋白進(jìn)行使用的蛋白質(zhì)制劑的另外方法在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,267,958和5,567,677中得到描述。
在本發(fā)明的進(jìn)一步的方面，以輔助治療性處理或與其他已知治療劑的組合治療性處理的形式利用本發(fā)明的RAGE調(diào)節(jié)劑。下述為可以與本發(fā)明的RAGE融合蛋白調(diào)節(jié)劑組合使用的佐劑和另外的治療劑的非詳盡列表抗癌劑的藥理學(xué)分類(lèi)1.烷化劑環(huán)磷酰胺、亞硝基脲、卡鉑、順鉑、丙卡巴肼2.抗生素博來(lái)霉素、柔紅霉素、多柔比星3.抗代謝藥甲氨蝶呤、阿糖胞苷、氟尿嘧啶4.植物生物堿長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、依托泊苷、紫杉醇5.激素他莫昔芬、醋酸奧曲肽、非那雄胺、氟他胺6.生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑干擾素、白細(xì)胞介素類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療的藥理學(xué)分類(lèi)1.止痛劑阿司匹林2.NSAIDs(非甾體抗炎藥)布洛芬、萘普生、雙氯芬酸3.DMARDs(緩解疾病的抗風(fēng)濕藥)甲氨蝶呤、金制劑、羥氯喹、柳氮磺吡啶4.生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑，DMARDs依那西普、英夫利昔單抗、糖皮質(zhì)激素糖尿病治療的藥理學(xué)分類(lèi)1.磺脲類(lèi)甲苯磺丁脲、妥拉磺脲、格列本脲、格列吡嗪2.雙胍類(lèi)二甲雙胍3.其他的口服藥劑阿卡波糖、曲格列酮4.胰島素阿爾茨海默病治療的藥理學(xué)分類(lèi)1.膽堿酯酶抑制劑他克林、多奈哌齊2.抗精神病藥氟哌啶醇、硫利達(dá)嗪3.抗抑郁藥地昔帕明、氟西汀、曲唑酮、帕羅西汀4.抗驚厥藥卡馬西平、丙戊酸在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明因此可以提供治療RAGE介導(dǎo)的疾病的方法，該方法包括對(duì)有此需要的受試者施用與治療劑組合的治療上有效量的RAGE融合蛋白，所述治療劑選自烷化劑、抗代謝藥、植物生物堿、抗生素、激素、生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑、止痛劑、NSAIDs、DMARDs、糖皮質(zhì)激素、磺脲類(lèi)、雙胍類(lèi)、胰島素、膽堿酯酶抑制劑、抗精神病藥、抗抑郁藥以及抗驚厥藥。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了如上所述的本發(fā)明藥物組合物，其進(jìn)一步包含一種或多種治療劑，所述治療劑選自烷化劑、抗代謝藥、植物生物堿、抗生素、激素、生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑、止痛劑、NSAIDs、DMARDs、糖皮質(zhì)激素、磺脲類(lèi)、雙胍類(lèi)、胰島素、膽堿酯酶抑制劑、抗精神病藥、抗抑郁藥以及抗驚厥藥。
實(shí)施例在接下來(lái)的實(shí)施例中進(jìn)一步舉例說(shuō)明了本發(fā)明所涵蓋的發(fā)明構(gòu)思的特征和優(yōu)點(diǎn)。
實(shí)施例1RAGE-IgG Fc融合蛋白的產(chǎn)生構(gòu)建兩種質(zhì)粒用于表達(dá)RAGE-IgG Fc融合蛋白。通過(guò)將不同長(zhǎng)度的來(lái)自人RAGE的5’cDNA序列與來(lái)自人IgG Fc(γ1)的相同的3’cDNA序列進(jìn)行連接來(lái)構(gòu)建這兩種質(zhì)粒。然后將這些表達(dá)序列(即連接產(chǎn)物)插入到pcDNA3.1表達(dá)載體(Invitrogen，CA)中。圖2和3中顯示了編碼融合蛋白編碼區(qū)的核酸序列。對(duì)于TTP-4000融合蛋白，核酸序列1-753(以粗體突出)編碼RAGE N-末端蛋白質(zhì)序列，而核酸序列754-1386編碼IgG Fc蛋白質(zhì)序列(圖2)。對(duì)于TTP-3000，核酸序列1-408(以粗體突出)編碼RAGE N-末端蛋白質(zhì)序列，而核酸序列409-1041編碼IgG Fc蛋白質(zhì)序列(圖3)。
為了產(chǎn)生RAGE融合蛋白，將包含SEQ ID NO30或SEQ ID NO31的核酸序列的表達(dá)載體穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞中。就由質(zhì)粒所賦予的新霉素抗性挑選出陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子并進(jìn)行克隆。將通過(guò)上清液的Western印跡分析而檢測(cè)為高產(chǎn)克隆進(jìn)行擴(kuò)增，并利用A蛋白柱通過(guò)親和層析純化基因產(chǎn)物。對(duì)表達(dá)進(jìn)行優(yōu)化從而使得細(xì)胞以約1.3克/升的水平產(chǎn)生重組TTP-4000。
圖4-6中圖解說(shuō)明了表達(dá)出的編碼這兩種融合蛋白的多肽。對(duì)于TTP-4000的四結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，最初的251個(gè)氨基酸(在圖4中以粗體顯示)包含人RAGE蛋白的信號(hào)序列(1-22/23)、V免疫球蛋白(和配體結(jié)合)結(jié)構(gòu)域(23/24-116)、第二個(gè)域間連接體(117-123)、第二個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域(CH1)(124-221)以及第二個(gè)連接體(222-251)(圖4，6B)。序列252-461包含IgG CH2和CH3免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。
對(duì)于TTP-3000的三結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，最初的136個(gè)氨基酸(以粗體顯示)包含人RAGE蛋白的信號(hào)序列(1-22/23)、V免疫球蛋白(和配體結(jié)合)結(jié)構(gòu)域(23/24-116)以及域間連接體序列(117-136)(圖5，6B)。此外，對(duì)于TT3，序列137-346包含IgG的CH2和CH3免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。
實(shí)施例2測(cè)試RAGE-IgG1融合蛋白的活性的方法A.體外配體結(jié)合將已知的RAGE配體以5克/孔的濃度包被在Maxisorb板表面上。板在4℃孵育過(guò)夜。配體孵育后，吸出板中的液體，和在室溫下向板中加入含1％BSA的50mM咪唑緩沖液(pH 7.2)這樣的封閉緩沖液并保持1小時(shí)。然后吸出板中液體和/或用洗滌緩沖液(20mM咪唑、150mM NaCl、0.05％ Tween-20、5mM CaCl2和5mM MgCl2，pH 7.2)洗滌。制備起始濃度為1.082mg/mL的TTP-3000(TT3)溶液和起始濃度為370μg/mL的TTP-4000(TT4)溶液。以增加的起始樣品的稀釋度加入融合蛋白。允許RAGE融合蛋白與固定的配體一起在37℃孵育1小時(shí)，孵育后對(duì)板進(jìn)行洗滌并就融合蛋白的結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)添加免疫檢測(cè)復(fù)合物來(lái)檢測(cè)結(jié)合，所述免疫檢測(cè)復(fù)合物包含以1∶11,000稀釋至最終測(cè)定濃度(FAC)為21ng/100μL的單克隆小鼠抗人IgG1、以1∶500稀釋至FAC為500ng/μL的生物素化的山羊抗小鼠IgG以及連接有抗生物素蛋白的堿性磷酸酶。所述復(fù)合物與所述固定的融合蛋白一起在室溫下孵育1小時(shí)，隨后對(duì)板進(jìn)行洗滌并加入堿性磷酸酶底物磷酸對(duì)硝基苯酯(PNPP)。通過(guò)測(cè)量PNPP至對(duì)硝基苯酚(PNP)的轉(zhuǎn)化，可以量化所述復(fù)合物與所述固定的融合蛋白的結(jié)合，所述轉(zhuǎn)化通過(guò)分光光度法在405nm處進(jìn)行測(cè)量。
如圖7中圖解說(shuō)明的，融合蛋白TTP-4000(TT4)和TTP-3000(TT3)與已知的RAGE配體淀粉樣蛋白-β(Abeta)、S100b(S100)和兩性蛋白(Ampho)特異性地相互作用。在不存在配體時(shí)，即僅用BSA包被(BSA或BSA+洗滌)時(shí)，吸光度沒(méi)有增加而超過(guò)由免疫檢測(cè)復(fù)合物非特異性結(jié)合引起的水平。當(dāng)?shù)矸蹣拥鞍爪掠米鳂?biāo)記的配體時(shí)，可能需要在測(cè)定前預(yù)孵育淀粉樣蛋白β。預(yù)孵育可以允許淀粉樣蛋白β自聚集成褶狀片形式，因?yàn)轳逘钇问降牡矸蹣拥鞍爪驴梢詢(xún)?yōu)先與RAGE結(jié)合。
RAGE融合蛋白TTP-4000和TTP-3000與RAGE配體之間特異性相互作用的另外證據(jù)在顯示RAGE配體能夠與已知的RAGE配體有效地競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合融合蛋白的研究中例證。在這些研究中，如上所述將淀粉樣蛋白-β(A-β)固定在Maxisorb板上并加入融合蛋白。此外，將RAGE配體與融合蛋白同時(shí)加入到某些孔中。
發(fā)現(xiàn)當(dāng)TTP-4000以123μg/mL存在時(shí)(1∶3稀釋?zhuān)瑘D8)，RAGE配體可以以約25％-30％的程度阻斷TTP-4000(TT4)結(jié)合。當(dāng)TTP-4000起始溶液以10或30倍進(jìn)行稀釋時(shí)(1∶10或1∶30)，融合蛋白與固定的配體的結(jié)合被RAGE配體完全抑制。類(lèi)似地，當(dāng)TTP-3000以360μg/mL存在時(shí)(1∶3稀釋?zhuān)瑘D9)，RAGE配體以約50％的程度阻斷TTP-3000(TT3)結(jié)合。當(dāng)TTP-3000起始溶液以10倍進(jìn)行稀釋時(shí)(1∶10)，融合蛋白與固定的配體的結(jié)合被RAGE配體完全抑制。因此，RAGE融合蛋白與RAGE配體的特異性結(jié)合是劑量依賴(lài)性的。此外，如圖8和9中所示，在不存在融合蛋白時(shí)，即只使用免疫檢測(cè)復(fù)合物(“單獨(dú)的復(fù)合物”)，基本上檢測(cè)不到結(jié)合。
B.RAGE融合蛋白在基于細(xì)胞的測(cè)定中的效用先前的工作已顯示，骨髓THP-1細(xì)胞可以響應(yīng)RAGE配體而分泌TNF-α。在這個(gè)測(cè)定中，利用ATCC提供的規(guī)程，在補(bǔ)充有10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)THP-1細(xì)胞。在不存在和存在融合蛋白TTP-3000(TT3)或TTP-4000(TT4)(10μg)、sRAGE(10μg)和人IgG(10μg)(即，作為陰性對(duì)照)的情況下，使用0.1mg/ml S100b誘導(dǎo)細(xì)胞經(jīng)由RAGE的刺激而分泌TNF-α。在蛋白質(zhì)加到細(xì)胞培養(yǎng)物中之后24小時(shí)，利用商業(yè)上可獲得的用于TNF-α的ELISA試劑盒(R&DSystems，Minneapolis，MN)測(cè)量由THP-1細(xì)胞分泌的TNF-α的量。圖10中的結(jié)果證實(shí)，融合蛋白在這些細(xì)胞中抑制S100b/RAGE誘導(dǎo)的TNF-α的產(chǎn)生。如圖10中所示，加入10μg TTP-3000或TTP-4000RAGE融合蛋白后，由S100b(0.1mg/ml FAC)對(duì)TNF-α的誘導(dǎo)分別減少了約45％-70％。融合蛋白TTP-4000在阻斷TNF-α的S100b誘導(dǎo)方面至少與sRAGE一樣有效(圖10)。將IgG單獨(dú)加入到經(jīng)S100b刺激的細(xì)胞中的實(shí)驗(yàn)顯示了對(duì)于TTP-4000和TTP-3000的RAGE序列的抑制特異性。IgG和S100b加入到該測(cè)定中顯示與S100b單獨(dú)時(shí)相同的TNF-α水平。將IgG單獨(dú)加入到經(jīng)S100b刺激的細(xì)胞中的實(shí)驗(yàn)顯示了，就融合蛋白的RAGE序列來(lái)說(shuō)TTP-4000和TTP-3000抑制TNF-α誘導(dǎo)的特異性?？梢钥闯?，在測(cè)定中加入IgG即沒(méi)有RAGE序列的人IgG(以10μg/孔加入Sigma人IgG)和S100b顯示與S100b單獨(dú)時(shí)相同的TNF-α水平。
實(shí)施例3TTP-4000的藥代動(dòng)力學(xué)特性為了確定TTP-4000與人sRAGE比較是否具有更優(yōu)良的藥代動(dòng)力學(xué)特性，對(duì)大鼠和非人靈長(zhǎng)類(lèi)給予TTP-4000靜脈內(nèi)(IV)注射(5mg/kg)，并隨后就TTP-4000的存在對(duì)血漿進(jìn)行評(píng)估。在這些實(shí)驗(yàn)中，兩只首次用于實(shí)驗(yàn)的雄猴在外周靜脈中接受了單次IV大劑量的TTP-4000(5mg/ml/kg)，隨后為大約1.0毫升(mL)的鹽水沖洗(flush)。在按劑量給藥前(即，注射TTP-4000之前)或在按劑量給藥后0.083、0.25、0.5、2、4、8、12、24、48、72、96、120、168、240、288和336小時(shí)將血液樣品(大約1.0mL)收集到含肝素鋰的管中。收集后，將管放置在濕冰上(最多30分鐘)直至在冷卻(在2-8℃)下以1500×g離心15分鐘。然后將每個(gè)收獲的血漿樣品冷凍貯存(-70℃±10℃)直至如實(shí)施例6中所述利用ELISA在注射后的不同時(shí)間點(diǎn)上就RAGE多肽進(jìn)行測(cè)定。
圖11中所示的動(dòng)力學(xué)特性曲線(xiàn)顯示，一旦TTP-4000已使其配體飽和(如在兩個(gè)動(dòng)物中由α階段的相當(dāng)陡的斜率所證明的)，它就保持大于300小時(shí)的終末半壽期。這個(gè)半壽期明顯大于人sRAGE在血漿中的半壽期(一般約2小時(shí))，并提供了對(duì)于急性和半慢性適應(yīng)癥進(jìn)行單次注射的機(jī)會(huì)。在圖11中，每條曲線(xiàn)代表在相同實(shí)驗(yàn)條件下的不同的動(dòng)物。
實(shí)施例4TTP-4000 Fc激活進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以測(cè)量與人IgG相比較RAGE融合蛋白TTP-4000對(duì)于Fc受體的激活。通過(guò)測(cè)量表達(dá)Fc受體的THP-1細(xì)胞的TNF-α分泌來(lái)測(cè)量Fc受體的激活。在這些實(shí)驗(yàn)中，用10μg/孔的TTP-4000或人IgG包被96孔板。Fc刺激導(dǎo)致TNF-α分泌。通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)測(cè)量TNF-α的量。
因此，在這個(gè)測(cè)定中，根據(jù)ATCC的指導(dǎo)在補(bǔ)充有10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中維持骨髓細(xì)胞株THP-1(ATTC # TIB-202)。一般地，通過(guò)用10μg/孔的熱聚集的(63℃，30分鐘)TTP-4000或人IgG1預(yù)包被孔，經(jīng)由Fc受體刺激來(lái)誘導(dǎo)每孔40,000-80,000個(gè)細(xì)胞分泌TNF-α。利用商業(yè)上可獲得的TNF ELISA試劑盒(R&D Systems，Minneapolis，MN # DTA00C)并根據(jù)用法說(shuō)明書(shū)，在從經(jīng)處理的孔中的24小時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)物收集的上清液之中測(cè)量由THP-1細(xì)胞分泌的TNF-α的量。
結(jié)果顯示于圖12中，其中可以看出TTP-4000產(chǎn)生少于2ng/孔的TNF，和IgG產(chǎn)生大于40ng/孔的TNF。
實(shí)施例5TTP-4000的體內(nèi)活性在幾種人類(lèi)疾病的體內(nèi)模型中將TTP-4000的活性與sRAGE進(jìn)行比較。
A.在再狹窄動(dòng)物模型中的TTP-4000在再狹窄的糖尿病大鼠模型中評(píng)估RAGE融合蛋白TTP-4000，其中涉及在血管損傷21天后測(cè)量平滑肌增殖和內(nèi)膜擴(kuò)張。在這些實(shí)驗(yàn)中，使用標(biāo)準(zhǔn)操作程序在Zucker糖尿病和非糖尿病大鼠中進(jìn)行左頸總動(dòng)脈的球囊損傷(balloon injury)。在損傷前1天腹膜內(nèi)施用負(fù)荷劑量(3mg/大鼠)的IgG、TTP-4000或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。損傷后每隔1天輸送維持劑量直至第7天(即，在損傷后第1、3、5和7天)。維持劑量對(duì)于一個(gè)組高至1mg/動(dòng)物，對(duì)于第二個(gè)組低至0.3mg/動(dòng)物。為了測(cè)量血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)增殖，在損傷后4天和21天處死動(dòng)物。
為了測(cè)量細(xì)胞增殖，4天的動(dòng)物在安樂(lè)死前18、12和2小時(shí)接受50mg/kg的溴脫氧尿苷(BrDdU)的腹膜內(nèi)注射。處死后，收獲整個(gè)左和右頸動(dòng)脈。包埋前樣本在Histochoice中貯存至少24小時(shí)。利用小鼠抗BrdU單克隆抗體進(jìn)行VSMC增殖的評(píng)估。應(yīng)用熒光標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗。由對(duì)治療方案毫不知情的兩名觀(guān)測(cè)者對(duì)每個(gè)切片的BrdU-陽(yáng)性細(xì)胞核數(shù)目進(jìn)行記數(shù)。
剩余的大鼠在21天時(shí)被處死用于形態(tài)測(cè)定分析。由對(duì)研究組毫不知情的觀(guān)測(cè)者利用計(jì)算機(jī)化的數(shù)字顯微鏡測(cè)面積法軟件Image-ProPlus對(duì)經(jīng)Van Gieson染色法染色的頸動(dòng)脈連續(xù)切片(相隔5mm)進(jìn)行形態(tài)測(cè)定分析。所有數(shù)據(jù)表示為平均值±SD。使用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。使用不成對(duì)t檢驗(yàn)比較連續(xù)變量。P≤0.05的值被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。
如圖13A和13B中所示，TTP-4000處理以劑量-響應(yīng)的方式顯著減少了內(nèi)膜/中膜比以及血管平滑肌細(xì)胞增殖。在圖13B中，y軸代表BrdU增殖性細(xì)胞的數(shù)目。
B.在AD動(dòng)物模型中的TTP-4000進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以評(píng)估TTP-4000在AD小鼠模型中是否能影響淀粉樣蛋白形成和認(rèn)知障礙。實(shí)驗(yàn)采用在PDGF-B鏈啟動(dòng)子控制下表達(dá)人Swedish突變型淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)的轉(zhuǎn)基因小鼠。隨著時(shí)間過(guò)去，這些小鼠產(chǎn)生高水平的RAGE配體、淀粉樣蛋白β(Aβ)。早先，3個(gè)月的sRAGE處理已顯示減少了大腦中淀粉樣蛋白斑的形成并且在這個(gè)模型中減少了炎性標(biāo)記物的相關(guān)增加。
通過(guò)在血小板衍生生長(zhǎng)因子B(PDGF-B)鏈基因啟動(dòng)子控制下將人APP基因(含Swedish和London突變)微注射到小鼠卵細(xì)胞中來(lái)設(shè)計(jì)在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中使用的APP小鼠(雄性)。小鼠在C57BL/6背景下產(chǎn)生并由Molecular Therapeutics Inc.培育。讓動(dòng)物隨意取食并通過(guò)兄弟姐妹交配進(jìn)行維持。從這個(gè)構(gòu)建體產(chǎn)生的小鼠在6個(gè)月大時(shí)開(kāi)始形成淀粉樣蛋白沉積物。讓動(dòng)物活6個(gè)月，然后維持90天并處死用于定量淀粉樣蛋白。
6個(gè)月大時(shí)開(kāi)始每隔1天[qod(i.p.)]對(duì)APP轉(zhuǎn)基因小鼠施用媒介物或TTP-4000至90天。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，處死動(dòng)物并檢查大腦中的Aβ斑負(fù)荷量(即，斑數(shù)目)。使用6個(gè)月的對(duì)照APP組來(lái)確定淀粉樣蛋白沉積物的基線(xiàn)。此外，在研究結(jié)束時(shí)，對(duì)動(dòng)物實(shí)施行為(Morris水迷宮)分析。調(diào)查者對(duì)研究化合物毫不知情。樣品以0.25ml/小鼠/每隔1天的方式給予小鼠。此外，一組小鼠給予200μg/天的人sRAGE。
1.淀粉樣蛋白β沉積關(guān)于組織學(xué)檢查，通過(guò)腹膜內(nèi)注射(IP)戊巴比妥鈉(50mg/kg)來(lái)麻醉動(dòng)物。動(dòng)物經(jīng)頸動(dòng)脈灌注4℃的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)隨后為4％的低聚甲醛。取出大腦并放置在4％的低聚甲醛中過(guò)夜。用石蠟處理大腦并進(jìn)行包埋。獲得10個(gè)穿過(guò)大腦的厚度為30μm的連續(xù)切片。在4℃對(duì)切片施加一抗過(guò)夜(Aβ肽抗體)以便檢測(cè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物大腦中的淀粉樣蛋白沉積物(Guo等人，J.Neurosci.，225900-5909(2002))。用Tris緩沖鹽水(TBS)洗滌切片，和加入二抗并在室溫下孵育1小時(shí)。洗滌后，如Vector ABC Elite試劑盒(VectorLaboratories)中所指導(dǎo)的對(duì)切片進(jìn)行孵育，并用二氨基苯甲酸(DAB)染色。在水中停止反應(yīng)，并在用二甲苯處理后蓋上蓋玻片。用計(jì)算機(jī)輔助圖像分析系統(tǒng)測(cè)定每個(gè)切片中的淀粉樣蛋白面積，所述系統(tǒng)由裝備有Quick Capture幀接收卡的Power Macintosh計(jì)算機(jī)、架在Olympus顯微鏡上的Hitachi CCD照相機(jī)以及相機(jī)架組成。使用NIHImage Analysis Software，v.1.55。捕獲圖像并測(cè)定10個(gè)切片上淀粉樣蛋白的總面積。由對(duì)處理狀況毫不知情的單名操作者進(jìn)行所有測(cè)量。對(duì)切片的淀粉樣蛋白體積進(jìn)行總計(jì)并除以切片總數(shù)，以計(jì)算淀粉樣蛋白體積。
對(duì)于定量分析，利用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)來(lái)測(cè)量APP轉(zhuǎn)基因小鼠大腦中的人總Aβ、Aβ總和Aβ1-42的水平(BiosourceInternational，Camarillo，CA)。如廠(chǎng)商所述，通過(guò)鹽酸胍從小鼠大腦中提取Aβ總和Aβ1-42并進(jìn)行定量。這個(gè)測(cè)定從大腦中提取了總Aβ肽(溶解的和聚集的)。
2.認(rèn)知功能Morris水迷宮測(cè)試如下進(jìn)行在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)在Morris水迷宮測(cè)試中對(duì)所有小鼠進(jìn)行一次測(cè)試。在1.2m開(kāi)放場(chǎng)所水迷宮中訓(xùn)練小鼠。池中裝入30cm深的水并保持在25℃。逃離平臺(tái)(10平方厘米)放置在水面下方1厘米。在試驗(yàn)過(guò)程中，從池中移開(kāi)平臺(tái)。在用白幕環(huán)繞以隱藏任何迷宮外線(xiàn)索(extra-maze cue)的池中進(jìn)行經(jīng)提示的測(cè)試。所有動(dòng)物接受連續(xù)3天的非空間預(yù)訓(xùn)練(NSP)。這些試驗(yàn)是為了準(zhǔn)備動(dòng)物以用于最終的行為測(cè)試作，從而確定找到平臺(tái)的記憶保留。這些試驗(yàn)沒(méi)有被記錄，而是僅用于訓(xùn)練目的。對(duì)于訓(xùn)練和學(xué)習(xí)研究，為了迷宮外線(xiàn)索去除幕布(這允許鑒別有游泳障礙的動(dòng)物)。在第1天，將小鼠放置在隱藏的平臺(tái)上20秒(試驗(yàn)1)，對(duì)于試驗(yàn)2-3在水中在距離提示的平臺(tái)或隱藏的平臺(tái)(試驗(yàn)4)10厘米處釋放動(dòng)物并允許游泳至平臺(tái)。在試驗(yàn)的第2天，隱藏的平臺(tái)在池中心或每個(gè)四分之一區(qū)的中心之間隨機(jī)移動(dòng)。將動(dòng)物釋放到池中，隨機(jī)面對(duì)壁，并允許60秒到達(dá)平臺(tái)(3次試驗(yàn))。在第3次試驗(yàn)中，動(dòng)物給予3次試驗(yàn)，2次用隱藏的平臺(tái)而1次用提示的平臺(tái)。NSP之后2天，對(duì)動(dòng)物實(shí)施最后的行為試驗(yàn)(Morris水迷宮測(cè)試)。對(duì)于這些試驗(yàn)(3次/動(dòng)物)，將平臺(tái)放置在池的一個(gè)四分之一區(qū)的中心，并隨機(jī)地以面對(duì)壁的方式釋放動(dòng)物。允許動(dòng)物有60秒(潛伏期，發(fā)現(xiàn)平臺(tái)花費(fèi)的時(shí)間)的時(shí)間發(fā)現(xiàn)平臺(tái)或游泳。在4-6小時(shí)的按劑量給藥中測(cè)試所有動(dòng)物，并由對(duì)測(cè)試組毫不知情的操作者隨機(jī)選擇用于測(cè)試。
結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。利用t-檢驗(yàn)分析淀粉樣蛋白研究和行為研究中的差異顯著性。在6個(gè)月大的APP對(duì)照組和TTP-4000處理的動(dòng)物之間，以及9個(gè)月大的APP媒介物處理組和TTP-4000處理組之間進(jìn)行比較。小于0.05的差異被認(rèn)為是顯著的。通過(guò)獲取每組數(shù)據(jù)的總和并除以比較(即，1，i.p./6個(gè)月的對(duì)照＝％變化)來(lái)確定淀粉樣蛋白和行為的變化百分?jǐn)?shù)。
圖14A和14B顯示，與經(jīng)媒介物和陰性對(duì)照人IgG1(IgG1)處理的動(dòng)物相比，用TTP-4000或小鼠sRAGE處理3個(gè)月的小鼠具有較少的Aβ斑和較少的認(rèn)知障礙。這個(gè)數(shù)據(jù)提示，TTP-4000在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中于減少AD病理方面是有效的。還發(fā)現(xiàn)，與sRAGE相似，TTP-4000可以減少炎性細(xì)胞因子IL-1和TNF-α(數(shù)據(jù)未顯示)。
C.TTP-4000在中風(fēng)動(dòng)物模型中的有效性TTP-4000還在疾病相關(guān)的中風(fēng)動(dòng)物模型中與sRAGE進(jìn)行比較。在這個(gè)模型中，結(jié)扎小鼠的頸中動(dòng)脈1小時(shí)隨后再灌注23小時(shí)，在那時(shí)處死小鼠并評(píng)估大腦中的梗塞面積。在即將進(jìn)行再灌注之前用sRAGE或TTP-4000或?qū)φ彰庖咔虻鞍滋幚硇∈蟆?br> 在這些實(shí)驗(yàn)中，對(duì)雄性C57BL/6注射250μl/小鼠的媒介物或TTP測(cè)試品(250μl/小鼠的TTP-3000、TTP-4000)。在局部缺血開(kāi)始后1小時(shí)，小鼠接受腹膜內(nèi)注射。對(duì)小鼠實(shí)施1小時(shí)的腦缺血，隨后為24小時(shí)的再灌注。為了誘導(dǎo)局部缺血，將每只小鼠進(jìn)行麻醉并通過(guò)外部加溫將體溫維持在36-37℃。通過(guò)在頸部的中線(xiàn)切口暴露左頸總動(dòng)脈(CCA)。將微型手術(shù)夾放置在頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)的起點(diǎn)周?chē)?。用絲線(xiàn)結(jié)扎ECA遠(yuǎn)端并進(jìn)行橫切。將6-0絲線(xiàn)松散地系在ECA殘干周?chē)?。將尼龍縫線(xiàn)的用火燒過(guò)而變光的末端輕輕地插入ECA殘干中。將6-0絲線(xiàn)圈在殘干周?chē)站o，并使尼龍縫線(xiàn)向前進(jìn)入并穿過(guò)頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)，直至其停留在大腦前動(dòng)脈中，從而堵塞大腦前交通動(dòng)脈和大腦中動(dòng)脈。尼龍縫線(xiàn)放置1小時(shí)后，將動(dòng)物再次麻醉，記錄直腸溫度并去除縫線(xiàn)和閉合切口。
通過(guò)腹膜內(nèi)注射戊巴比妥鈉(50mg/kg)麻醉動(dòng)物并隨后取出大腦，來(lái)測(cè)定梗塞體積。然后將大腦切成4個(gè)穿過(guò)梗塞區(qū)的2毫米切片，并在2％的氯化三苯基四氮唑(TTC)中放置30分鐘。此后，將切片放置在4％低聚甲醛中過(guò)夜。用計(jì)算機(jī)輔助圖像分析系統(tǒng)確定每個(gè)切片中的梗塞面積，所述系統(tǒng)由裝備有Quick Capture幀接收卡的PowerMacintosh計(jì)算機(jī)、架在相機(jī)架上的Hitachi CCD照相機(jī)組成。使用NIH Image Analysis Software，v.1.55。捕獲圖像并確定所述切片上的梗塞總面積。由對(duì)處理狀況毫不知情的單名操作者進(jìn)行所有測(cè)量。對(duì)切片的梗塞體積進(jìn)行總計(jì)從而計(jì)算出總梗塞體積。結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。利用t-檢驗(yàn)分析梗塞體積的差異顯著性。
如表2中的數(shù)據(jù)所舉例說(shuō)明的，TTP-4000在限制這些動(dòng)物的梗塞面積方面比sRAGE更有效，提示TTP-4000由于其在血漿中更佳的半壽期，從而能夠在這些小鼠中維持更大的保護(hù)。
實(shí)施例6通過(guò)ELISA檢測(cè)RAGE融合蛋白最初，50μl RAGE特異性單克隆抗體1HB1011以在1×PBS pH 7.3中10μg/mL的濃度經(jīng)由過(guò)夜孵育而包被在板上。當(dāng)準(zhǔn)備使用時(shí)，用300μL的1×咪唑-Tween洗滌緩沖液將板洗滌3次并用1％BSA封閉。以100μL的終體積加入樣品(稀釋的)和標(biāo)準(zhǔn)稀釋度的已知TTP-4000稀釋物。允許樣品在室溫下孵育1小時(shí)。孵育后，將板洗滌3次。加入在含1％BSA的1×PBS中的山羊抗人IgG1(Sigma A3312)AP綴合物并允許在室溫下孵育1小時(shí)。將板洗滌3次。用磷酸對(duì)硝基苯酯顯示顏色。
實(shí)施例7與RAGE融合蛋白結(jié)合的RAGE配體的定量圖15顯示TTP-4000與各種固定的已知RAGE配體的飽和結(jié)合曲線(xiàn)。將配體固定在微量滴定板上，并在濃度從0增加到360nM的融合蛋白存在下進(jìn)行孵育。利用與堿性磷酸酶綴合的多克隆抗體來(lái)檢測(cè)融合蛋白-配體相互作用，所述多克隆抗體對(duì)融合嵌合體的IgG部分特異。利用Graphpad Prizm軟件并與RAGE-RAGE配體值的確定文獻(xiàn)值進(jìn)行相比，從而計(jì)算出相對(duì)的Kds。HMG1B＝Ampoterin，CML＝羧甲基賴(lài)氨酸，A beta＝淀粉樣蛋白β1-40。
以上所述被視為僅例證本發(fā)明的原則。因?yàn)楸姸嘈薷暮妥兓瘜?duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將是很容易想到的，所以并不希望將本發(fā)明限制于所顯示和描述的確切實(shí)施方案，并且包括在所附權(quán)利要求書(shū)范圍內(nèi)的所有合適的修改方案和等價(jià)方案均被視為在本發(fā)明的構(gòu)思之內(nèi)。
序列表<110>TransTech Pharma，Inc.
<120>RAGE融合蛋白及使用方法<130>41305-318492<150>US 60/598,555<151>2004-08-03<160>44<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>404<212>PRT<213>智人<400>1Met Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Ala Trp Val Leu Val Leu Ser Leu1 5 10 15Trp Gly Ala Val Val Gly Ala Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu20 25 30Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg35 40 45Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu50 55 60Ser Pro Gln Gly Gly Gly Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro65 70 75 80Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile85 90 95
Phe Arg Cys Gln Ala Met Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn100 105 110Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp115 120 125Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys130 135 140Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp145 150 155 160Gly Lys Pro Leu Val Pro Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gln165 170 175Thr Arg Arg His Pro Glu Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gln Ser Glu Leu180 185 190Met Val Thr Pro Ala Arg Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys195 200 205Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro210 215 220Ile Gln Pro Arg Val Trp Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gln Leu225 230 235 240Val Val Glu Pro Glu Gly Gly Ala Val Ala Pro Gly Gly Thr Val Thr245 250 255Leu Thr Cys Glu Val Pro Ala Gln Pro Ser Pro Gln Ile His Trp Met260 265 270
Lys Asp Gly Val Pro Leu Pro Leu Pro Pro Ser Pro Val Leu Ile Leu275 280 285Pro Glu Ile Gly Pro Gln Asp Gln Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Thr290 295 300His Ser Ser His Gly Pro Gln Glu Ser Arg Ala Val Ser Ile Ser Ile305 310 315 320Ile Glu Pro Gly Glu Glu Gly Pro Thr Ala Gly Ser Val Gly Gly Ser325 330 335Gly Leu Gly Thr Leu Ala Leu Ala Leu Gly Ile Leu Gly Gly Leu Gly340 345 350Thr Ala Ala Leu Leu Ile Gly Val Ile Leu Trp Gln Arg Arg Gln Arg355 360 365Arg Gly Glu Glu Arg Lys Ala Pro Glu Asn Gln Glu Glu Glu Glu Glu370 375 380Arg Ala Glu Leu Asn Gln Ser Glu Glu Pro Glu Ala Gly Glu Ser Ser385 390 395 400Thr Gly Gly Pro<210>2<211>382<212>PRT<213>智人<400>2
Ala Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys1 5 10 15Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn20 25 30Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gln Gly Gly Gly35 40 45Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu50 55 60Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile Phe Arg Cys Gln Ala Met65 70 75 80Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr85 90 95Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr100 105 110Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr115 120 125Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro130 135 140Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gln Thr Arg Arg His Pro Glu145 150 155 160Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gln Ser Glu Leu Met Val Thr Pro Ala Arg165 170 175
Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu180 185 190Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro Ile Gln Pro Arg Val Trp195 200 205Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gln Leu Val Val Glu Pro Glu Gly210 215 220Gly Ala Val Ala Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Glu Val Pro225 230 235 240Ala Gln Pro Ser Pro Gln Ile His Trp Met Lys Asp Gly Val Pro Leu245 250 255Pro Leu Pro Pro Ser Pro Val Leu Ile Leu Pro Glu Ile Gly Pro Gln260 265 270Asp Gln Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Thr His Ser Ser His Gly Pro275 280 285Gln Glu Ser Arg Ala Val Ser Ile Ser Ile Ile Glu Pro Gly Glu Glu290 295 300Gly Pro Thr Ala Gly Ser Val Gly Gly Ser Gly Leu Gly Thr Leu Ala305 310 315 320Leu Ala Leu Gly Ile Leu Gly Gly Leu Gly Thr Ala Ala Leu Leu Ile325 330 335Gly Val Ile Leu Trp Gln Arg Arg Gln Arg Arg Gly Glu Glu Arg Lys340 345 350
Ala Pro Glu Asn Gln Glu Glu Glu Glu Glu Arg Ala Glu Leu Asn Gln355 360 365Ser Glu Glu Pro Glu Ala Gly Glu Ser Ser Thr Gly Gly Pro370 375 380<210>3<211>381<212>PRT<213>智人<400>3Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys1 5 10 15Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr20 25 30Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gln Gly Gly Gly Pro35 40 45Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro50 55 60Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile Phe Arg Cys Gln Ala Met Asn65 70 75 80Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gln85 90 95Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala100 105 110
Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro115 120 125Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro Asn130 135 140Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gln Thr Arg Arg His Pro Glu Thr145 150 155 160Gly Leu Phe Thr Leu Gln Ser Glu Leu Met Val Thr Pro Ala Arg Gly165 170 175Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro180 185 190Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro Ile Gln Pro Arg Val Trp Glu195 200 205Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gln Leu Val Val Glu Pro Glu Gly Gly210 215 220Ala Val Ala Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Glu Val Pro Ala225 230 235 240Gln Pro Ser Pro Gln Ile His Trp Met Lys Asp Gly Val Pro Leu Pro245 250 255Leu Pro Pro Ser Pro Val Leu Ile Leu Pro Glu Ile Gly Pro Gln Asp260 265 270Gln Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Thr His Ser Ser His Gly Pro Gln275 280 285
Glu Ser Arg Ala Val Ser Ile Ser Ile Ile Glu Pro Gly Glu Glu Gly290 295 300Pro Thr Ala Gly Ser Val Gly Gly Ser Gly Leu Gly Thr Leu Ala Leu305 310 315 320Ala Leu Gly Ile Leu Gly Gly Leu Gly Thr Ala Ala Leu Leu Ile Gly325 330 335Val Ile Leu Trp Gln Arg Arg Gln Arg Arg Gly Glu Glu Arg Lys Ala340 345 350Pro Glu Asn Gln Glu Glu Glu Glu Glu Arg Ala Glu Leu Asn Gln Ser355 360 365Glu Glu Pro Glu Ala Gly Glu Ser Ser Thr Gly Gly Pro370 375 380<210>4<211>339<212>PRT<213>智人<400>4Met Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Ala Trp Val Leu Val Leu Ser Leu1 5 10 15Trp Gly Ala Val Val Gly Ala Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu20 25 30Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg35 40 45Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu
50 55 60Ser Pro Gln Gly Gly Gly Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro65 70 75 80Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile85 90 95Phe Arg Cys Gln Ala Met Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn100 105 110Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp115 120 125Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys130 135 140Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp145 150 155 160Gly Lys Pro Leu Val Pro Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gln165 170 175Thr Arg Arg His Pro Glu Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gln Ser Glu Leu180 185 190Met Val Thr Pro Ala Arg Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys195 200 205Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro210 215 220Ile Gln Pro Arg Val Trp Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gln Leu
225 230 235 240Val Val Glu Pro Glu Gly Gly Ala Val Ala Pro Gly Gly Thr Val Thr245 250 255Leu Thr Cys Glu Val Pro Ala Gln Pro Ser Pro Gln Ile His Trp Met260 265 270Lys Asp Gly Val Pro Leu Pro Leu Pro Pro Ser Pro Val Leu Ile Leu275 280 285Pro Glu Ile Gly Pro Gln Asp Gln Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Thr290 295 300His Ser Ser His Gly Pro Gln Glu Ser Arg Ala Val Ser Ile Ser Ile305 310 315 320Ile Glu Pro Gly Glu Glu Gly Pro Thr Ala Gly Ser Val Gly Gly Ser325 330 335Gly Leu Gly<210>5<211>317<212>PRT<213>智人<400>5Ala Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys1 5 10 15Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn20 25 30
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<223>智人<400>33Ala Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys1 5 10 15Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn20 25 30
Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gln Gly Gly Gly35 40 45Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu50 55 60Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile Phe Arg Cys Gln Ala Met65 70 75 80Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr85 90 95Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr100 105 110Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr115 120 125Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro130 135 140Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gln Thr Arg Arg His Pro Glu145 150 155 160Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gln Ser Glu Leu Met Val Thr Pro Ala Arg165 170 175Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu180 185 190Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro Ile Gln Pro Arg Val Trp195 200 205
Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gln Leu Val Val Glu Pro Glu Gly210 215 220Gly Ala Val Ala Pro Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys225 230 235 240Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val245 250 255Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp260 265 270Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr275 280 285Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp290 295 300Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu305 310 315 320Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg325 330 335Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys340 345 350Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp355 360 365Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys370 375 380
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser385 390 395 400Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser405 410 415Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser420 425 430Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys435<210>34<211>438<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列<400>34Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys1 5 10 15Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr20 25 30Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gln Gly Gly Gly Pro35 40 45Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro50 55 60Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile Phe Arg Cys Gln Ala Met Asn65 70 75 80
Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gln85 90 95Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala100 105 110Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro115 120 125Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro Asn130 135 140Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gln Thr Arg Arg His Pro Glu Thr145 150 155 160Gly Leu Phe Thr Leu Gln Ser Glu Leu Met Val Thr Pro Ala Arg Gly165 170 175Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro180 185 190Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro Ile Gln Pro Arg Val Trp Glu195 200 205Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gln Leu Val Val Glu Pro Glu Gly Gly210 215 220Ala Val Ala Pro Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp225 230 235 240Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp245 250 255
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly260 265 270Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn275 280 285Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp290 295 300Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro305 310 315 320Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu325 330 335Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn340 345 350Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile355 360 365Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr370 375 380Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys385 390 395 400Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys405 410 415Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu420 425 430
Ser Leu Ser Pro Gly Lys435<210>35<211>346<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>智人<400>35Met Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Ala Trp Val Leu Val Leu Ser Leu1 5 10 15Trp Gly Ala Val Val Gly Ala Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu20 25 30Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg35 40 45Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu50 55 60Ser Pro Gln Gly Gly Gly Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro65 70 75 80Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile85 90 95Phe Arg Cys Gln Ala Met Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn100 105 110
Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp115 120 125Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro130 135 140Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys145 150 155 160Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp165 170 175Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu180 185 190Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu195 200 205His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn210 215 220Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly225 230 235 240Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu245 250 255Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr260 265 270Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn275 280 285
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe290 295 300Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn305 310 315 320Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr325 330 335Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys340 345<210>36<211>324<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>智人<400>36Ala Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys1 5 10 15Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn20 25 30Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gln Gly Gly Gly35 40 45Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu50 55 60Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile Phe Arg Cys Gln Ala Met65 70 75 80
Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr85 90 95Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr100 105 110Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu115 120 125Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser130 135 140His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu145 150 155 160Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr165 170 175Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn180 185 190Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro195 200 205Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln210 215 220Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val225 230 235 240Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val245 250 255
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro260 265 270Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr275 280 285Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val290 295 300Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu305 310 315 320Ser Pro Gly Lys<210>37<211>323<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>智人<400>37Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys1 5 10 15Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr20 25 30Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gln Gly Gly Gly Pro35 40 45
Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro50 55 60Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile Phe Arg Cys Gln Ala Met Asn65 70 75 80Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gln85 90 95Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala100 105 110Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met115 120 125Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His130 135 140Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val145 150 155 160His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr165 170 175Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly180 185 190Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile195 200 205Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val210 215 220
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser225 230 235 240Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu245 250 255Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro260 265 270Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val275 280 285Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met290 295 300His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser305 310 315 320Pro Gly Lys<210>38<211>210<212>PRT<213>智人<400>38Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile1 5 10 15Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu20 25 30Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
35 40 45Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg50 55 60Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys65 70 75 80Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu85 90 95Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr100 105 110Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu115 120 125Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp130 135 140Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val145 150 155 160Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp165 170 175Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His180 185 190Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro195 200 205Gly Lys
210<210>39<211>633<212>DNA<213>智人<400>39ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 60gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 120tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 180agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 240gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 300aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 360ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 420gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 480ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 540cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 600cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 633<210>40<211>220<212>PRT<213>智人<400>40Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe1 5 10 15Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
20 25 30Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe35 40 45Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro50 55 60Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr65 70 75 80Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val85 90 95Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala100 105 110Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg115 120 125Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly130 135 140Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro145 150 155 160Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser165 170 175Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln180 185 190Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
195 200 205Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys210 215 220<210>41<211>663<212>DNA<213>智人<400>41ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc 60aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 120cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 180aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 240gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc 300ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 360gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 420ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 480gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 540agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 600atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 660tga663<210>42<211>113<212>PRT<213>智人<400>42
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe1 5 10 15Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val20 25 30Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe35 40 45Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro50 55 60Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr65 70 75 80Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val85 90 95Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala100 105 110Lys<210>43<211>107<212>PRT<213>智人<400>43Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe20 25 30Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu35 40 45Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe50 55 60Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly65 70 75 80Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr85 90 95Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys100 105<210>44<211>25<212>PRT<213>智人<400>44Ile Ser Ile Ile Glu Pro Gly Glu Glu Gly Pro Thr Ala Gly Ser Val1 5 10 15Gly Gly Ser Gly Leu Gly Thr Leu Ala20 2權(quán)利要求
1.一種包含RAGE多肽的融合蛋白，其中所述RAGE多肽直接連接包含免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域或部分免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域的多肽。
2.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所述RAGE多肽包含與RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域連接的RAGE域間連接體，從而使得所述RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的C-末端氨基酸連接至所述域間連接體的N-末端氨基酸，并且所述RAGE域間連接體的C-末端氨基酸直接連接至包含免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域或其部分的多肽的N-末端氨基酸。
3.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所述RAGE多肽包含配體結(jié)合位點(diǎn)。
4.權(quán)利要求3的融合蛋白，其中所述RAGE配體結(jié)合位點(diǎn)包含SEQID NO9或與其90％同一的序列，或者SEQ ID NO10或與其90％同一的序列。
5.權(quán)利要求2的融合蛋白，其中包含與RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域連接的域間連接體的所述RAGE多肽包含全長(zhǎng)RAGE蛋白的片段。
6.權(quán)利要求5的融合蛋白，其進(jìn)一步包含第一個(gè)RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域和連接第二個(gè)RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的第一個(gè)RAGE域間連接體以及第二個(gè)RAGE域間連接體，從而使得第一個(gè)域間連接體的N-末端氨基酸連接至第一個(gè)RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的C-末端氨基酸，第二個(gè)RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的N-末端氨基酸連接至第一個(gè)域間連接體的C-末端氨基酸，第二個(gè)域間連接體的N-末端氨基酸連接至第二個(gè)RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的C-末端氨基酸，以及RAGE第二個(gè)域間連接體的C-末端氨基酸直接連接至CH2免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域或部分免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域的N-末端氨基酸。
7.權(quán)利要求6的融合蛋白，其包含氨基酸序列SEQ ID NO33或SEQ ID NO34。
8.權(quán)利要求6的融合蛋白，其包含氨基酸序列SEQ ID NO32。
9.權(quán)利要求6的融合蛋白，其中直接與免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域或其部分連接的所述RAGE域間連接體包含SEQ ID NO22或與其90％同一的序列，或者SEQ ID NO24或與其90％同一的序列。
10.權(quán)利要求5的融合蛋白，其包含經(jīng)由RAGE域間連接體與包含CH2免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域或部分免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域的多肽的N-末端氨基酸連接的單個(gè)RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。
11.權(quán)利要求10的融合蛋白，其包含氨基酸序列SEQ ID NO36或SEQ ID NO37。
12.權(quán)利要求10的融合蛋白，其包含氨基酸序列SEQ ID NO35。
13.權(quán)利要求10的融合蛋白，其中直接與免疫球蛋白CH2連接的所述RAGE連接體包含SEQ ID NO21或與其90％同一的序列，或者SEQID NO23或與其90％同一的序列。
14.一種編碼融合蛋白的分離的核酸序列，其中所述融合蛋白包含直接與包含免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域或部分免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域的多肽連接的RAGE多肽。
15.權(quán)利要求14的分離的核酸序列，其中所述RAGE多肽包含與RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域連接的RAGE域間連接體，從而使得所述RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的C-末端氨基酸連接至所述域間連接體的N-末端氨基酸，并且所述RAGE域間連接體的C-末端氨基酸直接連接至包含免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域或其部分的多肽的N-末端氨基酸。
16.權(quán)利要求15的核酸序列，其包含SEQ ID NO30或其片段，或者SEQ ID NO31或其片段。
17.一種編碼融合蛋白的表達(dá)載體，其中所述融合蛋白包含直接與包含免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域或部分免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域的多肽連接的RAGE多肽。
18.權(quán)利要求17的表達(dá)載體，其中所述RAGE多肽包含與RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域連接的RAGE域間連接體，從而使得所述RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的C-末端氨基酸連接至所述域間連接體的N-末端氨基酸，并且所述RAGE域間連接體的C-末端氨基酸直接連接至包含免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域或其部分的多肽的N-末端氨基酸。
19.權(quán)利要求17的表達(dá)載體，其包含核酸序列SEQ ID NO30或其片段，或者SEQ ID NO31或其片段。
20.一種用權(quán)利要求17的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，從而使得所述細(xì)胞表達(dá)包含RAGE多肽的融合蛋白，所述RAGE多肽直接連接至包含免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域或部分免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域的多肽。
21.一種在藥物載體中包含治療上有效量的RAGE融合蛋白的組合物，其中所述RAGE融合蛋白包含直接連接至包含免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域或部分免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域的多肽的RAGE多肽。
22.權(quán)利要求21的組合物，其中所述RAGE多肽包含與RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域連接的RAGE域間連接體，從而使得所述RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的C-末端氨基酸連接至所述域間連接體的N-末端氨基酸，并且所述RAGE域間連接體的C-末端氨基酸直接連接至包含免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域或其部分的多肽的N-末端氨基酸。
23.權(quán)利要求21的組合物，其中所述RAGE多肽包含配體結(jié)合位點(diǎn)。
24.權(quán)利要求23的組合物，其中所述RAGE配體結(jié)合位點(diǎn)包含SEQID NO9或與其90％同一的序列，或者SEQ ID NO10或與其90％同一的序列。
25.權(quán)利要求22的組合物，其中包含與RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域連接的域間連接體的所述RAGE多肽包含全長(zhǎng)RAGE蛋白的片段。
26.權(quán)利要求25的組合物，其中所述RAGE多肽包含第一個(gè)RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域和連接第二個(gè)RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的第一個(gè)RAGE域間連接體以及第二個(gè)RAGE域間連接體，從而使得第一個(gè)域間連接體的N-末端氨基酸連接至第一個(gè)RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的C-末端氨基酸，第二個(gè)RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的N-末端氨基酸連接至第一個(gè)域間連接體的C-末端氨基酸，第二個(gè)域間連接體的N-末端氨基酸連接至第二個(gè)RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的C-末端氨基酸，以及RAGE第二個(gè)域間連接體的C-末端氨基酸直接連接至CH2免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域或部分免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域的N-末端氨基酸。
27.權(quán)利要求26的組合物，其中所述RAGE融合蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO33或SEQ ID NO34。
28.權(quán)利要求25的組合物，其中所述融合蛋白包含經(jīng)由RAGE域間連接體與包含CH2免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域或部分免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域的多肽的N-末端氨基酸連接的單個(gè)RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。
29.權(quán)利要求28的組合物，其中所述RAGE融合蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO36或SEQ ID NO37。
30.權(quán)利要求21的組合物，其中所述RAGE融合蛋白被配制為可注射的溶液。
31.權(quán)利要求21的組合物，其中所述RAGE融合蛋白被配制為無(wú)菌凍干粉劑。
32.一種制造RAGE融合蛋白的方法，其包括將RAGE多肽與包含免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域或部分免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域的多肽共價(jià)連接的步驟。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述RAGE多肽包含與RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域連接的RAGE域間連接體，從而使得所述RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的C-末端氨基酸連接至所述域間連接體的N-末端氨基酸，并且所述RAGE域間連接體的C-末端氨基酸直接連接至包含免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域或其部分的多肽的N-末端氨基酸。
34.權(quán)利要求32的方法，其中所述RAGE多肽包含配體結(jié)合位點(diǎn)。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述RAGE配體結(jié)合位點(diǎn)包含SEQ IDNO9或與其90％同一的序列，或者SEQ ID NO10或與其90％同一的序列。
36.權(quán)利要求33的方法，其中包含與RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域連接的域間連接體的所述RAGE多肽包含全長(zhǎng)RAGE蛋白的片段。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述RAGE多肽包含第一個(gè)RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域和連接第二個(gè)RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的第一個(gè)RAGE域間連接體以及第二個(gè)RAGE域間連接體，從而使得第一個(gè)域間連接體的N-末端氨基酸連接至第一個(gè)RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的C-末端氨基酸，第二個(gè)RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的N-末端氨基酸連接至第一個(gè)域間連接體的C-末端氨基酸，第二個(gè)域間連接體的N-末端氨基酸連接至第二個(gè)RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的C-末端氨基酸，以及RAGE第二個(gè)域間連接體的C-末端氨基酸直接連接至CH2免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域或部分免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域的N-末端氨基酸。
38.權(quán)利要求36的方法，其中所述RAGE多肽包含經(jīng)由RAGE域間連接體與包含CH2免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域或部分免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域的多肽的N-末端氨基酸連接的單個(gè)RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。
39.權(quán)利要求32的方法，其中所述融合蛋白由重組DNA構(gòu)建體編碼。
40.權(quán)利要求32的方法，其進(jìn)一步包括將DNA構(gòu)建體整合到表達(dá)載體中的步驟。
41.權(quán)利要求40的方法，其進(jìn)一步包括將表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中。
42.一種治療受試者中RAGE介導(dǎo)的病癥的方法，其包括對(duì)受試者施用包含RAGE多肽的RAGE融合蛋白，所述RAGE多肽直接連接至包含免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域或部分免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域的多肽。
43.權(quán)利要求42的方法，其中所述RAGE多肽包含與RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域連接的RAGE域間連接體，從而使得所述RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的C-末端氨基酸連接至所述域間連接體的N-末端氨基酸，并且所述RAGE域間連接體的C-末端氨基酸直接連接至包含免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域或其部分的多肽的N-末端氨基酸。
44.權(quán)利要求42的方法，其中所述RAGE配體結(jié)合位點(diǎn)包含SEQ IDNO9或與其90％同一的序列，或者SEQ ID NO10或與其90％同一的序列。
45.權(quán)利要求43的方法，其中包含與RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域連接的域間連接體的所述RAGE多肽包含全長(zhǎng)RAGE蛋白的片段。
46.權(quán)利要求45的方法，其進(jìn)一步包括第一個(gè)RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域和連接第二個(gè)RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的第一個(gè)RAGE域間連接體以及第二個(gè)RAGE域間連接體，從而使得第一個(gè)域間連接體的N-末端氨基酸連接至第一個(gè)RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的C-末端氨基酸，第二個(gè)RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的N-末端氨基酸連接至第一個(gè)域間連接體的C-末端氨基酸，第二個(gè)域間連接體的N-末端氨基酸連接至第二個(gè)RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的C-末端氨基酸，以及RAGE第二個(gè)域間連接體的C-末端氨基酸直接連接至CH2免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域或部分免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域的N-末端氨基酸。
47.權(quán)利要求46的方法，其中所述RAGE融合蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO33或SEQ ID NO34。
48.權(quán)利要求46的方法，其中所述RAGE融合蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO35。
49.權(quán)利要求46的方法，其中直接與免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域或其部分連接的所述RAGE域間連接體包含SEQ ID NO22或與其90％同一的序列，或者SEQ ID NO24或與其90％同一的序列。
50.權(quán)利要求45的方法，其包括經(jīng)由RAGE域間連接體與包含CH2免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域或部分免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域的多肽的N-末端氨基酸連接的單個(gè)RAGE免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。
51.權(quán)利要求50的方法，其中所述RAGE融合蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO36或SEQ ID NO37。
52.權(quán)利要求50的方法，其中所述RAGE融合蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO35。
53.權(quán)利要求50的方法，其中直接與免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域或其部分連接的所述RAGE域間連接體包含SEQ ID NO21或與其90％同一的序列，或者SEQ ID NO23或與其90％同一的序列。
54.權(quán)利要求42的方法，其包括對(duì)受試者靜脈內(nèi)施用所述RAGE融合蛋白。
55.權(quán)利要求42的方法，其包括對(duì)受試者腹膜內(nèi)施用所述RAGE融合蛋白。
56.權(quán)利要求42的方法，其包括對(duì)受試者皮下施用所述RAGE融合蛋白。
57.權(quán)利要求42的方法，其中所述融合蛋白用于治療糖尿病的癥狀或糖尿病晚期并發(fā)癥的癥狀。
58.權(quán)利要求57的方法，其中所述糖尿病或糖尿病晚期并發(fā)癥的癥狀包含括糖尿病性腎病。
59.權(quán)利要求57的方法，其中所述糖尿病或糖尿病晚期并發(fā)癥的癥狀包括糖尿病性視網(wǎng)膜病。
60.權(quán)利要求57的方法，其中所述糖尿病或糖尿病晚期并發(fā)癥的癥狀包括糖尿病性足部潰瘍。
61.權(quán)利要求57的方法，其中所述糖尿病或糖尿病晚期并發(fā)癥的癥狀包括心血管并發(fā)癥。
62.權(quán)利要求57的方法，其中所述糖尿病或糖尿病晚期并發(fā)癥的癥狀包括糖尿病性神經(jīng)病變。
63.權(quán)利要求42的方法，其中所述融合蛋白用于治療淀粉樣變性。
64.權(quán)利要求42的方法，其中所述融合蛋白用于治療阿爾茨海默病。
65.權(quán)利要求42的方法，其中所述融合蛋白用于治療癌癥。
66.權(quán)利要求42的方法，其中所述融合蛋白用于治療與自身免疫相關(guān)的炎癥。
67.權(quán)利要求42的方法，其中所述融合蛋白用于治療與炎性腸病相關(guān)的炎癥。
68.權(quán)利要求42的方法，其中所述融合蛋白用于治療與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的炎癥。
69.權(quán)利要求42的方法，其中所述融合蛋白用于治療與牛皮癬相關(guān)的炎癥。
70.權(quán)利要求42的方法，其中所述融合蛋白用于治療與多發(fā)性硬化癥相關(guān)的炎癥。
71.權(quán)利要求42的方法，其中所述融合蛋白用于治療與缺氧相關(guān)的炎癥。
72.權(quán)利要求42的方法，其中所述融合蛋白用于治療與中風(fēng)相關(guān)的炎癥。
73.權(quán)利要求42的方法，其中所述融合蛋白用于治療與心臟病發(fā)作相關(guān)的炎癥。
74.權(quán)利要求42的方法，其中所述融合蛋白用于治療與出血性休克相關(guān)的炎癥。
75.權(quán)利要求42的方法，其中所述融合蛋白用于治療與敗血病相關(guān)的炎癥。
76.權(quán)利要求42的方法，其中所述融合蛋白用于治療與器官移植相關(guān)的炎癥。
77.權(quán)利要求42的方法，其中所述融合蛋白用于治療與傷口愈合不良相關(guān)的炎癥。
78.權(quán)利要求42的方法，其中所述融合蛋白用于治療腎衰竭。
全文摘要
公開(kāi)了包含RAGE多肽序列的RAGE融合蛋白，所述RAGE多肽序列與第二種非RAGE多肽連接。RAGE融合蛋白可以利用RAGE多肽結(jié)構(gòu)域，所述RAGE多肽結(jié)構(gòu)域包含RAGE配體結(jié)合位點(diǎn)以及直接與免疫球蛋白C
文檔編號(hào)C07K19/00GK1993378SQ200580025947
公開(kāi)日2007年7月4日 申請(qǐng)日期2005年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月3日
發(fā)明者A·M·M·瑪佳麗, Y·E·田, J·C·韋伯斯特, R·羅特萊因 申請(qǐng)人:轉(zhuǎn)化技術(shù)制藥公司