專利名稱：純化白蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于純化白蛋白、其變體或片段)，含白蛋白、其變體或片段的融合蛋白，或者含白蛋白、其變體或片段)的綴合物的方法。白蛋白可以是獲得自動(dòng)物或微生物如酵母的血清白蛋白，如人血清白蛋白。
背景技術(shù)：
白蛋白用于治療有嚴(yán)重?zé)齻?，休克或失血的病人。它也用于補(bǔ)充培養(yǎng)高等真核細(xì)胞的培養(yǎng)基和作為藥理學(xué)活性化合物(其中許多需要穩(wěn)定化)的賦形劑。白蛋白融合蛋白是一種蛋白與白蛋白或與其變體或片段的融合體，并且提高所述蛋白的半衰期，如增加的體內(nèi)半衰期。目前，白蛋白是從血液產(chǎn)品，如血清中獲得，或在微生物，如酵母中或由轉(zhuǎn)基因植物或動(dòng)物重組產(chǎn)生。為了提供足夠純的產(chǎn)品以滿足使用者的需要和/或獲得高產(chǎn)量的產(chǎn)品，白蛋白必須從生產(chǎn)源中純化出來。目前白蛋白產(chǎn)品的一個(gè)問題是所需的純化方法。能夠獲得高純度但是這需要多個(gè)費(fèi)時(shí)和/或昂貴的層析純化步驟。例如，WO 2000/044772中描述的純化方法包括三步驟的方法陽離子交換層析然后是陰離子交換層析然后是染料結(jié)合(親和)層析。因此，需要一種更簡(jiǎn)單的純化方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種更簡(jiǎn)單的白蛋白純化方法。因此本發(fā)明涉及一種用于純化白蛋白或其變體或片段、含白蛋白或其變體或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其變體或片段的綴合物的方法，該方法包括(i)用包含白蛋白或其變體或片段、含白蛋白或其變體或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其變體或片段的綴合物的水溶液上樣于包含結(jié)合在固體支持物上的白蛋白特異性配體的固體基質(zhì)；(ii)洗滌所述基質(zhì)以除去至少一些雜質(zhì)；并(iii)從基質(zhì)上洗脫白蛋白或其變體或片段、含白蛋白或其變體或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其變體或片段的綴合物，獲得純化的白蛋白或其變體或片段、含白蛋白或其變體或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其變體或片段的綴合物。發(fā)明人已鑒定了可以用一種單一親和步驟代替先前白蛋白純化中使用的公知的分離步驟，如陽離子交換和染料結(jié)合方法，所述單一親和步驟相對(duì)于這些公知步驟提高了不想要的蛋白的清除和/或提高了產(chǎn)量。在整個(gè)本說明書中，術(shù)語“白蛋白”包括天然存在的白蛋白、白蛋白相關(guān)蛋白和其變體，如天然的或工程化的變體。變體包括多態(tài)性，片段如結(jié)構(gòu)域和亞結(jié)構(gòu)域，片段和/或融合蛋白。白蛋白可與SEQ ID No. 1具有至少40，50，60，70，80，90，95，96，97，98，99%的相似性或同一性。附圖簡(jiǎn)述

圖1. Prosaptide白蛋白融合體純化的SDS-PAGE，見實(shí)施例2。
泳道樣品上樣
1.rHA1昭
2.上樣1/100
3.上樣1/1000
4.穿透(Flow Through)nt.
5.洗涂1nt.
6.洗滌2nt.
7.洗滌3nt.
8.洗滌4nt.
9.洗脫1/1000
10.rHA1昭圖2顯示T20白蛋白融合體純化的SDS-PAGE，見實(shí)施例2。
泳道樣品上樣
1.上樣1/100
2.上樣1/1000
3.穿透Nt
4.洗滌1Nt
5.洗滌2Nt
6.洗滌3Nt
7.洗滌4Nt
8.洗脫1/100
9.洗脫1/1000
10.rHA1昭圖3顯示ILlRA白蛋白融合體純化的SDS-PAGE，見實(shí)施例2。泳道樣品上樣
1.上樣1/100
2.上樣1/1000
3.穿透nt
4.洗滌1nt
5.洗涂2nt
6.洗涂3nt
7.洗滌4nt
8.洗脫1/100
9.洗脫1/1000
10.rHA1昭圖4顯示AlbuPureTM純化的動(dòng)物白蛋白的SDS-PAGE，見實(shí)施例8。
IB泳道 2B樣品3B上樣
_1__SeeBlue Plus2 MW 標(biāo)準(zhǔn)品__5|iL
2__兔血清白蛋白__2|ig3__小鼠血清白蛋白__2昭
_4__大鼠血清白蛋白__2\ig
5__狗血清白蛋白__2|ig
_6__人血清白蛋白__2μ§,_
_7_I SeeBlue Plus2 MW 標(biāo)準(zhǔn)品5|iL圖5顯示AlbuPureTM純化的白蛋白片段的SDS-PAGE，見實(shí)施例8。
泳道_樣品___
J__人血清白蛋白__Ipg
_2__人血清白蛋白結(jié)構(gòu)域1+2__l|igJ__人血清白蛋白結(jié)構(gòu)域2+3__l|ig
_4__人血清白蛋白結(jié)構(gòu)域1+3__l|ig
J__人血清白蛋白結(jié)構(gòu)域3__l|ig
_6_I SeeBlue Plus2 MW 標(biāo)準(zhǔn)品5|iL發(fā)明詳述本發(fā)明涉及一種純化白蛋白或其變體或片段、含白蛋白或其變體或片段的融合蛋
白或者含白蛋白或其變體或片段的綴合物的方法。在本申請(qǐng)和權(quán)利要求中，術(shù)語“純化”意
指一種方法，通過該方法至少一種不希望得到的化合物，如細(xì)胞碎片、其他血漿或宿主細(xì)胞
蛋白、鹽、脂質(zhì)碳水化合物等，相對(duì)于希望得到的化合物減少了。取決于用于此方法的起始
材料，可從希望得到的化合物，白蛋白或其變體或片段、含白蛋白或其變體或片段的融合蛋
白中完全地或部分地除去不希望得到的化合物。
作為血漿的最豐富的蛋白質(zhì)，白蛋白是本領(lǐng)域已知的，人們已經(jīng)從大量哺乳動(dòng)物和禽類中描述和表征了白蛋白，并認(rèn)為其在維持正確的滲透壓中具有作用并且其在轉(zhuǎn)運(yùn)血流中多種化合物中也具有作用。原則上本發(fā)明的方法可用于純化任何已知白蛋白，例如源自人、狗、綿羊、山羊、牛 (bovine)、奶牛(cow)、驢、兔、小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠和雞(chicken)的白蛋白。優(yōu)選的白蛋白是人血清白蛋白，尤其是具有SEQ ID NO 1中公開的序列的人血清白蛋白。本發(fā)明所述的白蛋白變體意指具有白蛋白整體結(jié)構(gòu)但與親本白蛋白相比已改變了至少一個(gè)氨基酸殘基的化合物。其中親本白蛋白是理解為天然的未改變的白蛋白化合物。變體可與親本白蛋白在多于一個(gè)位置上不同，而且原則上只要變體保持白蛋白的整體結(jié)構(gòu)，對(duì)于改變的數(shù)目沒有確定的上限，所述改變包括氨基酸殘基的取代、缺失或插入以及化學(xué)修飾。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，與親本白蛋白相比白蛋白變體包含1個(gè)改變，優(yōu)選地至少2個(gè)改變，更優(yōu)選至少5個(gè)改變，更優(yōu)選至少10個(gè)改變，甚至更優(yōu)選至少20個(gè)改變，以及最優(yōu)選具有至少25個(gè)改變。白蛋白變體與親本白蛋白優(yōu)選地具有至少60%的序列同一性，優(yōu)選地至少70% 的序列同一性，更優(yōu)選至少80%的序列同一性，甚至更優(yōu)選至少90%的序列同一性，甚至更優(yōu)選至少95%的序列同一性，最優(yōu)選與親本白蛋白具有至少98%的序列同一性。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，白蛋白或其片段或變體與SEQ ID No. 1具有至少40，50， 60，70，80，90，95，96，97，98，99% 的序列同一性。同一性兩條氨基酸序列之間或兩條核苷酸序列之間的相關(guān)性由參數(shù)“同一性”來描述。就本發(fā)明而言，兩條氨基酸序列之間的同一性的程度是使用如EMBOSS程序包 (EMBOSS :The European Molecular Biology Open SoftwareSuite, Rice 等，2000, Trends in Genetics 16 :276-277)(優(yōu)選版本3. 0. 0或更新的版本)中的Needle程序所執(zhí)行的 Needleman-Wunsch 算法(Needleman 和 Wunsch，1970，J. Mol. Biol. 48 :443-453)來確定的。 使用的可選參數(shù)是缺口產(chǎn)生罰分為10，缺口延伸罰分為0. 5，以及EBL0SUM62(BL0SUM62的 EMBOSS版本)取代矩陣。將標(biāo)記為“最長(zhǎng)同一性”的Needle輸出(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)用作百分比同一性，其是如下計(jì)算的(相同的殘基數(shù)XlOO)/(比對(duì)的長(zhǎng)度-比對(duì)中的缺口總數(shù))。在描述本發(fā)明的多種變體時(shí)，應(yīng)用下述的命名法以便參考。在所有的情況中，應(yīng)用了公認(rèn)的IUPAC單字母或三字母氨基酸縮寫。取代對(duì)于氨基酸取代，采用了如下的命名法[原始氨基酸，位置，取代的氨基酸]。因此，蘇氨酸在位置2 用丙氨酸取代記為“Thr2^Ala”或“T226A”。多個(gè)位置突變通過加入標(biāo)記(“ + ”)分開，例如，“Gly205Arg+kr411Phe”或“G205R+S411F”，代表分別在位置205用精氨酸(R)取代甘氨酸(G)和在位置411用苯丙氨酸(F)取代絲氨酸( 的突變。缺失對(duì)于氨基酸缺失，采用了如下命名法[原始氨基酸，位置 。因此，在位置 195缺失甘氨酸記為“Glyl95*”或“G195*”。多個(gè)缺失通過加入標(biāo)記(“ +，，)分開，例如， "Glyl95*+Ser4ir” 或 “G195*+S411*，，。插入對(duì)于氨基酸插入，采用了如下的命名法[原始氨基酸，位置，原始氨基酸，新插入的氨基酸]。因此，在位置195的甘氨酸之后插入賴氨酸記為“Glyl95GlyLys”或 “G195GK”。多個(gè)氨基酸插入記為[原始氨基酸，位置，原始氨基酸，新插入的氨基酸#1， 新插入的氨基酸#2 ；等等]。例如，在位置195的甘氨酸之后插入賴氨酸和丙氨酸記為 “Glyl95GlyLysAla” 或 “G195GKA，，。在此情況下，通過在插入的氨基酸殘基前的氨基酸殘基的位置號(hào)添加小寫字母而對(duì)插入的氨基酸殘基進(jìn)行編號(hào)。因此，在上一例子中序列為
權(quán)利要求
1.一種用于純化白蛋白或其變體或片段、含白蛋白或其變體或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其變體或片段的綴合物的方法，所述方法包括(i)用含白蛋白或其變體或片段、含白蛋白或其變體或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其變體或片段的綴合物的水溶液上樣包含結(jié)合在固體支持物上的白蛋白特異性配體的固體基質(zhì)；( )洗滌所述基質(zhì)以除去至少一些雜質(zhì)；并(iii)從所述基質(zhì)上洗脫白蛋白或其變體或片段、含白蛋白或其變體或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其變體或片段的綴合物，以提供純化的白蛋白或其變體或片段、含白蛋白或其變體或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其變體或片段的綴合物。
2.依照權(quán)利要求1所述的方法，其中所述白蛋白源自哺乳動(dòng)物，如人、兔、小鼠、山羊、 綿羊、牛；或者源自禽類，如雞。
3.依照權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述白蛋白或其變體或片段、含白蛋白或其變體或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其變體或片段的綴合物含有與HSA的序列(SEQ ID NO 1)具有至少60 %序列同一性，優(yōu)選至少70 %，優(yōu)選至少80 %，優(yōu)選至少85 %同一性，更優(yōu)選至少90%同一性，甚至更優(yōu)選至少95%同一性，甚至更優(yōu)選至少97%的序列同一性， 以及最優(yōu)選至少99%序列同一性的序列。
4.依照權(quán)利要求3所述的方法，其中與HSA具有至少80%序列同一性的序列包含至少10個(gè)連續(xù)的氨基酸，更優(yōu)選至少25個(gè)氨基酸，更優(yōu)選至少50個(gè)氨基酸，以及最優(yōu)選至少 100個(gè)氨基酸。
5.依照權(quán)利要求1所述的方法，其中所述白蛋白特異性配體是2-氯-4，6-二O’-硫代苯胺)-S-三嗪。
6.依照權(quán)利要求1所述的方法，其中所述包含白蛋白或其變體或片段、含白蛋白(或其變體或片段)的融合蛋白或者含白蛋白(或其變體或片段)的綴合物的水溶液選自發(fā)酵上清液、部分純化的發(fā)酵上清液、血清、血清級(jí)分或者部分純化的血清或血清級(jí)分、轉(zhuǎn)基因原料的乳或者轉(zhuǎn)基因植物的提取物。
7.依照權(quán)利要求1或權(quán)利要求6所述的方法，其中上樣到所述基質(zhì)上的包含白蛋白或其變體或片段、含白蛋白或其變體或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其變體或片段的綴合物的水溶液具有4-9. 5，更優(yōu)選pH4-9，甚至更優(yōu)選4-8，以及最優(yōu)選4_7的pH。
8.依照權(quán)利要求1所述的方法，其中所述洗滌是通過具有連續(xù)升高的PH的一次或多次洗滌進(jìn)行的。
9.依照權(quán)利要求8所述的方法，其中第一次洗滌具有在pH4.0-6.0的范圍內(nèi)的pH。
10.依照權(quán)利要求8或9所述的方法，其中最后一次洗滌具有在pH7.0-8. 0的范圍內(nèi)的pH。
11.依照權(quán)利要求8-10所述的方法，其中在第一次和最后一次洗滌步驟之間具有至少一次額外的洗滌步驟。
12.依照權(quán)利要求1所述的方法，其中使用含有脂肪酸的鹽或硫氰酸鹽的水溶液，或者在PHlO或更高的條件下，從所述基質(zhì)上洗脫所述白蛋白或其變體或片段、含白蛋白或其變體或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其變體或片段的綴合物。
13.依照權(quán)利要求12所述的方法，其中所述的脂肪酸的鹽在水中具有大于IOmM的溶解度。
14.依照權(quán)利要求13所述的方法，其中所述的脂肪酸鹽是選自丁酸、戊酸、己酸、庚酸、 辛酸、壬酸、癸酸的鹽。
15.依照權(quán)利要求12-14所述的方法，其中洗脫緩沖液中所述脂肪酸鹽的濃度是在 5mM-0. 5mM的范圍內(nèi)，優(yōu)選在IOmM-IOOmM的范圍內(nèi)。
16.依照權(quán)利要求12所述的方法，其中所述硫氰酸鹽是選自鈉、鉀、銨、鋇或其他1族或 2族堿金屬的鹽。
17.依照權(quán)利要求12或16所述的方法，其中所述硫氰酸鹽以5mM-lM的范圍內(nèi)，優(yōu)選 10mM-500mM的范圍內(nèi)的濃度使用。
全文摘要
公開了一種改進(jìn)的純化白蛋白(或其變體或片段)、含白蛋白(或其變體或片段)的融合蛋白或者含白蛋白(或其變體或片段)的綴合物的方法。
文檔編號(hào)C07K14/765GK102549012SQ201080019924
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2010年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月7日
發(fā)明者J.卡梅隆, L.E.布拉克威爾, M.J.伯頓, P.H.莫頓, R.A.多德, S.J.伯頓 申請(qǐng)人:普羅米蒂克生物科學(xué)有限公司, 諾維信生物制藥丹麥公司